metode penelitian

9
METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah Spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu),
dan IR (Brucker), multiwell plates, evaporator, pelat KLT silika gel GF254 dan
pelat KLT preparatif, kolom kromatografi silika gel (Merck; 70-230 mesh; 1x25
cm), pipet mikro, tip pipet mikro, pipet Mohr.
Bahan yang digunakan adalah buah mahkota dewa yang diperoleh dari
kebun percobaan Pusat Studi Biofarmaka (PSB), pelarut MeOH, CHCl3, EtOAc,
Artemia salina Leach, dan air laut.
Preparasi dan Ekstraksi Sampel (Hartati et al. 2005)
Preparasi sampel ekstrak buah mahkota dewa dilakukan dengan cara
mengeringanginkan daging buah mahkota dewa yang telah diiris tipis, kemudian
dibuat serbuk berukuran 80 mesh. Sampel serbuk kering ditentukan kadar airnya.
Sampel diekstraksi dengan cara refluks menggunakan pelarut metanol pada suhu
600C. Semua ekstrak yang diperoleh disaring dengan menggunakan kertas saring
Whatman no. 1 dan dipekatkan dengan penguap putar pada suhu 300C kemudian
dihitung rendemennya. Selanjutnya ekstrak metanol dipartisi menggunakan
kloroform untuk memisahkan komponen yang bersifat semipolar, masing-masing
ekstrak diuji flavonoid, fenol, dan triterpenoid dan steroid.
Penentuan Kadar Air (AOAC 2006)
Cawan dikeringkan terlebih dahulu selama 30 menit dalam oven pada suhu
1050C, lalu didinginkan dalam eksikator kemudian beratnya ditimbang. Sampel
ditimbang seberat 5 gram dan dimasukkan ke dalam cawan, kemudian sampel
dimasukkan kedalam oven selama 3 jam pada suhu 1050C, lalu didinginkan dalam
eksikator selama 30 menit kemudian ditimbang kembali sampai diperoleh bobot
yang konstan (AOAC 2006). Persen kadar air dihitung dengan persamaan:
Kadar air (%) : a-b x 100 %
a
a adalah bobot sebelum dikeringkan (g)
b adalah bobot sampel setelah dikeringkan (g)
10
Uji Fitokimia (Harborne 1987)
Uji Flavonoid. Sebanyak 1 gram ekstrak ditambah 100 ml air panas kemudian
dididihkan selama 5 menit dan disaring. Filtrat yang diperoleh diambil sebanyak 5
ml ditambah 0,05 g serbuk magnesium, 1 ml HCl pekat dan 1 ml amil alkohol
kemudian dikocok kuat-kuat, terbentuknya warna merah, kuning dan jingga pada
lapisan amil akohol menunjukkan adanya flavonoid.
Uji Triterpenoid dan Steroid. Ekstrak mahkota dewa dilarutkan dalam 25 ml
etanol panas (500C) kemudian disaring dalam cawan porselin dan diuapkan
sampai kering. Residu ditambahkan eter dan ekstrak eter dipindahkan ke dalam
lempeng, lalu ditambahkan 3 tetes anhidrida asam asetat dan 1 tetes H2SO4 pekat
(uji Lieberman-Burchard), warna merah atau ungu menunjukkan adanya
triterpenoid dan warna hijau atau biru menunjukkan adanya steroid.
Uji Fenol. Ekstrak mahkota dewa dengan bobot tertentu dimasukkan ke dalam
tabung reaksi. Kemudian ditambahkan FeCl3 dan bila terbentuk warna ungu, biru
atau hijau menunjukkan adanya senyawa golongan fenol.
Penentuan Eluen Terbaik pada KLT
Ekstrak pekat dari sampel ditotolkan pada pelat KLT. Setelah kering
langsung dielusi dalam ruang elusi yang telah dijenuhkan oleh uap eluen
pengembang. Eluen yang digunakan adalah metanol, etil asetat, kloroform, aseton
butanol, diklorometana,dan n-heksana, lalu dilakukan perbandingan pada eluen
yang menghasilkan spot yang banyak dan terpisah. Eluen akan diperbaiki lebih
lanjut apabila pemisahan belum baik. Noda hasil elusi diamati di bawah lampu
UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm.
Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom (Rouessac & Rouessac 2007)
Fraksinasi dilakukan menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam
berupa silika gel Merck dengan ukuran 70-230 mesh dan fase gerak berupa nheksana, etil asetat, metanol dengan peningkatan kepolaran. Eluat ditampung
setiap 5 ml dalam tabung reaksi, kemudian eluat diuji dengan KLT. Eluat yang
memiliki jumlah bercak dan nilai Rf yang sama atau hampir sama digabung
menjadi satu fraksi. Bercak dideteksi di bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm.
11
Fraksi-fraksi hasil kolom yang diduga mengandung senyawa golongan
benzofenon diuji toksisitas melalui uji BSLT. Selanjutnya fraksi yang paling
toksik difraksinasi dengan KLT preparatif, noda yang diperoleh kemudian
dideteksi di bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm. Fraksi hasil KLT preparatif
diuji BSLT dan uji kualitatif senyawa golongan benzofenon, fraksi yang paling
toksik dan positif mengandung benzofenon diidentifikasi menggunakan
spektrofotometer UV-Vis dan IR. Diagram alir penelitian dapat dilihat pada
Lampiran 1.
Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (Meyer et al. 1982)
Uji toksisitas dilakukan dengan menentukan nilai Lethal Concentration
(LC50) menngunakan larva udang Artemia salina L. Telur udang ditetaskan dalam
gelas piala yang berisi air laut, penetasan dilakukan selama 48 jam dan diaerasi
agar kadar oksigen tercukupi sehingga telur udang menetas menjadi larva. Ke
dalam masing-masing sumur dimasukkan 10 ekor larva udang dan larutan fraksi
yang akan diuji dengan konsentrasi 10 sampai 1.000 ppm (masing-masing 3 kali
ulangan), diinkubasi selama 24 jam dan dihitung jumlah larva yang mati. LC50
ditentukan dengan membuat kurva hubungan antara % kematian larva dan log
konsentrasi ekstrak. Apabila pada kontrol ada larva yang mati maka % kematian
larva udang ditentukan dengan rumus Abbot.
% kematian larva : T – K
x 100 %
S
Keterangan : T : jumlah larva uji yang mati
K : jumlah larva kontrol yang mati
S : jumlah larva uji
Uji Kualitatif Golongan Benzofenon (Nedialkov P & Kitanov G 2001)
Untuk mendeteksi adanya senyawa benzofenon dalam suatu sampel dapat
dilakukan dengan cara menyemprotkan reagen Fast Blue Salt B dalam
MeOH:H2O (1:1). Bila terjadi perubahan warna spot pada plat KLT menjadi ungu
kemerahan diduga positif mengandung senyawa golongan benzofenon.
12
Identifikasi Senyawa Benzofenon dengan Spektrofotometer UV-Vis
Identifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis dilakukan dengan mengukur
spektrum serapan dalam larutan blanko yang sangat encer dengan pembanding
blanko pelarut, pelarut yang digunakan dalam pengukuran adalah pelarut sampel
yaitu metanol (Harborne, 1987). Senyawa dalam sampel diukur pada panjang
gelombang 200-800 nm. Analisis dilakukan dengan metode baku di Laboratorium
Pusat Studi Biofarmaka, IPB.
Identifikasi Senyawa Benzofenon dengan Spektrofotometer IR
Identifikasi
menggunakan
spektrofotometer
IR
dilakukan
dengan
menimbang sebanyak ± 0,8000 mg sampel dihaluskan bersamaan dengan 0,2004
gram KBr dalam mortar agat. Setelah dihaluskan dan bercampur, serbuk ini
dimasukkan ke dalam alat pencetak pelat KBr, sehingga diperoleh serbuk lempeng
yang
transparan.
Lempeng
spektrofotometer IR (Bruker).
yang
diperoleh
dimasukkan
ke
dalam
Analisis dilakukan dengan metode baku di
Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, IPB.