USULAN PENELITIAN STUDI IN VITRO SENYAWA ALKALOID DARI EKSTRAK BUAH SIRSAK (ANNONA MURICATA L.) SEBAGAI INHIBITOR XANTHINE OXIDASE OLEH: ARUM MARIFATUN DYAH LIFYANTI Ig. SATRIO WICAKSONO K PUTRI PERTIWI SYAHIDA NUR AULIA DIAJUKAN KEPADA PROF. DR. IVANDINI TRIBIDASARI M.SI SEBAGAI SALAH SATU KRITERIA DALAM MATA KULIAH PENGANTAR PENELITIAN DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS INDONESIA DEPOK 2019 Penanggung Jawab: Prof. Dr. Ivandini Tribidasari. M.Si Kurun Waktu Penelitian: 10 Agustus - 30 Desember 2019 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Indonesia adalah negara berkembang dengan jumlah penderita asam urat tertinggi di Asia. Sekitar 1,7% dari populasi Indonesia menderita gout. Asam urat disebabkan oleh kadar serum asam urat (SUA) yang melebihi kondisi normal. Ketika kadar asam urat dalam darah melebihi 6,8 mg / dL, kristal monosodium urat (MSU) akan terbentuk dan menumpuk di sendi, tendon, dan jaringan lainnya. Tumpukan kristal itu menyebabkan asam urat. Selain itu, kadar SUA yang abnormal berkorelasi dengan penyakit kardiovaskular, hipertensi dan penyakit ginjal. Beberapa terapi dapat dicoba untuk mengobati encok. Terapi yang paling efektif adalah menurunkan kadar asam urat, salah satunya yang bisa digunakan adalah xanthine oxidase inhibitor. XOI bertindak dengan memblokir biosintesis asam urat dari purin dalam tubuh (Unno et al., 2004) dan diyakini bahwa dengan meningkatkan ekskresi asam urat atau mengurangi produksi asam urat membantu mengurangi risiko asam urat (Umamaheswari et al., 2007). Annona muricata (Annonaceae) biasa disebut Sirsak. Ini adalah tanaman semak yang terletak terutama di wilayah hutan hujan Nigeria, di mana ia digunakan secara lokal untuk beberapa tujuan etnomedisinal — sebagai pencahar, penyembuhan luka, dll. Manfaat kesehatan dari tanaman ini telah dikaitkan dengan komposisi fitokimia unik mereka. (Agu, Okolie, Eze, et al., 2017; Agu, Okolie, Falodun, et al., 2017; Okolie et al., 2013; Okwu & Omodamiro, 2005; Vit et al., 2014). Banyak senyawa bioaktif dan fitokimia, terutama acetogenins annonaceous dan minyak atsiri, telah diisolasi dan dijelaskan dari A. muricata (Agu, Okolie, Falodun, et al., 2017; Gleye, Laurensa, Laprevoteb, Seranib, & Hocquemiller, 1999) dan banyak kegunaannya dalam pengobatan alami telah divalidasi oleh penelitian ilmiah (Weniger et al., 1986). Investigasi kimia intensif terhadap daun, buah, dan biji dari berbagai spesies tanaman ini telah menghasilkan isolasi sejumlah besar acetogenin. Fitokimia yang hadir dalam Annona muricata adalah alkaloid, flavonoid, karbohidrat, glikosida jantung, saponin, tanin, fitosterol, terpenoid, dan protein (Edeoga, Okwu, & Mbaebie, 2005). Agu, Okolie, Eze, dkk. (2017) melaporkan adanya alkaloid, flavonoid, dan fenol dalam jumlah tinggi terutama pada buah dan daun. 1.2 Rumusan Masalah Masalah utama dari penelitian ini adalah mencari senyawa alkaloid terbaik yang memiliki kemampuan sebagai inhibitor xanthine oxidase secara in vitro untuk dijadikan sebagai kandidat obat asam urat. Sementara itu, sub-masalah dari penelitian ini adalah: a) Apakah terdapat senyawa alkaloid dalam buah yang dapat dijadikan inhibitor xanthine oxidase untuk dijadikan kandidat obat asam urat? b) Bagaimana interaksi yang terjadi antara xanthine oksidase dengan senyawa alkaloid tersebut? c) Bagaimana aktivitas senyawa alkaloid tersebut pada uji aktivitas anti-inhibitor? 1.3 Hipotesis Penelitian Adapun hasil yang diharapkan dari penelitian ini adalah: Senyawa alkaloid dapat menjadi inhibitor Xanthine Oxidase a) Terdapat Senyawa alaklaoid yang dijadikan sebagai inhibitor. b) Senyawa alkaloid dan enzim xanthine oksidase menunjukkan interaksi yang baik dengan energi pengikatan dan kestabilan yang baik. c) Senyawa alkaloid dan enzim xanthine oksidase memiliki aktivitas yang baik pada uji in vitro. 1.4 Kontribusi Penelitian Indonesia merupakan satu dari sepuluh negara dengan jumlah penderita asam urat tertinggi di dunia. Dalam proses penanganannya, asam urat dapat dilakukan melalui peroses inhbibisi enzim xanthine oksidase Potensi kekayaan alam Indonesia menjadi ladang yang besar untuk menemukan senyawa bahan alam yang memiliki kemampuan dalam menghambat kerja enzim xanthine oksidase. Pada penelitian ini akan dilakukan melalui metode in vitro untuk menguji aktifitasnya. 1.5 Batasan Penelitian Senyawa alkaloid yang digunakan dalam penelitian ini dibatasi hanya untuk senyawa alkaloid yang berasal dari buah sirsak asli Indonesia yang telah ditemukan pada penelitian sebelumnya (data terlampir). 1.6 Esensi Penelitian Penelitian ini berkontribusi dalam pengembangan potensi kekayaan bahan alam Indonesia untuk dijadikan sebagai kandidat obat asam urat. 1.7 Tujuan Penelitian 1. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya efek penghambatan aktivitas enzim xantin oxidase pada ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.). 2. Pemanfaatan ekstrak daun sirsak oleh masyarakat luas sebagai bahan pengobatan asam urat. 1.8 Manfaat Penelitian 1.8.1Manfaat bagi Mahasiswa Menambah pengetahuan mengenai bahan alam serta maafaat untuk dikelola oleh kreativitas mahasiswa. Menumbuh rasa kecintaan akan alam tempat kita tinggal, bersedia untuk selalu menjaga dan merawatnya demi kelangsungan hidup di masa yang akan datang. Serta menjadi bahan kajian bagi mahasiswa yang ingin lebih jauh malakukan penelitian. 1.8.2 Manfaatnya bagi Perguruan Tinggi Menambah hasil penelitian yang dilakukan oleh para mahasiswanya, serta dapat menjadi bahan penelitian lebih lanjut untuk uiniversitas. Dapat menggerkana para mahasiswanya untuk selalu berfikir kreatif serta menghasilkan produk yang inovatif untuk masyarakat. 1.8.3 Manfaat bagi Masyarakat Masyarakat akan dapat merasakan hasil atau produk yang berasal dari bahan alam untuk para penderita penyakit tertentu dalam proses penyembuhannya. Akan menjadi budi daya yang bermaafat untuk tanaman sirsak. Serta yang terpenting adalah menumbuhkan rasa kecintaan terhadap alam dan lingkungan mereka tinggal. Bab II Tinjauan Pustaka 2.1 Hiperuisemia Hipereusemia adalah keadaan dimana terjadi peningkatan keadaan asam urat diatas keadaan normal (Rudi Hidayat, 2009). Atau suatu penyakit akibat penimbunan kristal monosodium urat di dalam tubuh sehingga menyebabkan nyeri sendi (Gout Arthritis) dan benjolan pada bagianbagian tertentu dari tubuh dan batu pada saluran kemih. 2.2 Allopurinol Allopurinol (nama merek Allohexal, Allosig, Progout, Zyloprim) adalah obat yang digunakan untuk mengobati penyakit asam urat, yang merupakan jenis penyakit artritis yang disebabkan oleh penumpukan kristal asam urat pada sendi. Asam urat diproduksi alami dalam sel, tetapi pada tubuh gout tidak dikeluarkan dengan cukup cepat. Dan allopurinol disini akan bekerja mengurangi jumlah asam urat yang dikeluarkan oleh sel-sel tubuh. 2.3 Annona muricata (Sirsak) 2.3.1 Klasifikasi Tanaman Sirsak Kingdom : Plantae ( Tumbuhan ) Subkingdom : Tracheobionta ( Tumbuhan berpembuluh ) Super Divisio : Spermatophyta ( Menghasilkan biji ) Divisio : Magnoliophyta ( Tumbuhan berbunga ) Kelas : Magnoliopsida ( Dikotil / berkeping dua ) Sub Kelas : Magnoliidae Ordo : Magnoliales Famili : Annonaceae Genus : Annona Spesies : Annona muricata 2.3.2 Morfologi Tumbuhan ini berbentuk pohon, berwarna coklat tua, batang berkayu (lignosus), silindris, permukaan kasar, percabangan simpodial. Arah tumbuh batang tegak lurus, arah tumbuh cabang ada yang condong ke atas dan ada yang mendatar. Memiliki daun berbentuk jorong (ovalis atau ellipticus). Permukaan daun licin (laevis) dan mengkilat (nitidus), tepi daun rata (integer), daging daun tebal dan kaku seperti kulit/belulang (coriaceus). Pangkal daun runcing daun ujung daun tumpul (obtusus). 2.4 Enzim Enzim merupakan katalisator protein yang mengatur kecepatan berlangsungnya berbagai macam proses fisiologis (Rodwell, 2003). Suatu reaksi kimia yang berlangsung dengan bantuan enzim memerlukan energi yang lebih rendah. Jadi enzim juga berfungsi menurunkan energi aktivasi. Suatu enzim (holoenzim) tersusun atas bagian protein dan bukan protein. Bagian protein disebut apoenzim, dan bagian non protein disebut kofaktor. Kofaktor dapat berupa ion logam (Cu, Mg, K, Fe, Na), atau koenzim yang berupa bahan organik, misalkan vitamin B (B1, B2). Sebagai suatu bahan yang penting dalam metabolisme, enzim memiliki sifat-sebagai berikut: kerja enzim bersifat spesifik/khusus enzim bekerja pada suhu tertentu enzim berkerja pada derajat keasaman (pH) tertentu kerja enzim dapat bolak-balik. Hal-hal yang dapat mempengaruhi kerja enzim di antaranya adalah: suhu derajat keasaman (pH) konsentrasi enzim jenis substrat penimbunan hasil akhir pengaruh aktivator/penggiat pengaruh inhibitor/penghambat Enzim bekerja berdasar prinsip ‘kunci dan anak kunci’ (lock and key). Pada salah satu sisi enzim terdapat tempat aktif yang memiliki bentuk yang dapat berpasangan tepat sama dengan bentuk permukaan substrat. Akibatnya satu enzim hanya dapat digunakan untuk satu jenis substrat. 2.5 Xantine Oxidase Xantin oksidase biasanya terdapat pada spesies mamalia, yang utamanya didistribusikan dalam sel endotel vaskuler, hepatosit, sel-sel epitel usus, dan sel-sel sekretori dari kelenjar susu. Ekpresi aktivitas enzim ini tergantung dari spesies mamalianya. Aktivitas enzim ini dalam darah tikus pasti lebih lambat dari aktivitasnya di darah manusia karena bagaimanapun enzim ini kebanyakan dari jaringan manusia terutama sel endotel. Dilihat kondisi fisiologis enzim ini dapat berbentuk xantine dehidrogenase (XD), yang memanfaatkan NAD+ sebagai koenzim dan dikonversi menjadi xantin oksidase (XO) yang memanfaatkan O2 sebagai akseptor elektron. Selain itu, xantin oksidase juga dapat mengkatalis metabolisme hipoxantin dan xantin menjadi asam urat atau senyawa alami lainnya yang berbentuk heterocyclic. Xantin disini bukan hanya hasil reaksi dari hipoxantin saja, melainkan juga substrat untuk pembuatan asam urat. Gambar 1. Reaksi Terbentuknya Asam Urat BAB III Metode Penelitian Bahan 1. Bahan utama buah sirsak, dihaluskan menjadi potongan-potongan kecil menggunakan blender. 2. Bahan kimia terdiri dari DMSO (Sigma), K2HPO4 (Sigma P 0662), NaOH (Sigma 221465), HCl (Merck), xantin (X0626), xantin oksidase (Sigma X4375) pelarut perkolasi etanol 96% allopurinol, aquadest bebas CO2 Alat : Peralatan ekstraksi perkolasi (perkolator) dari Buchi Pump Controller C610 dan Buchi Pump Module C-610. Peralatan Spektrofotometer Shimadzu Pharmaspec UV 1700. Identifikasi Tanaman. Buah sirsak yang dideterminasi di Lembaga Penelitian Indonesia (LIPI). 3.1 Pembuatan Ekstrak Sirsak 3.1.1 Pembuatan Ekstrak. a) Buah sirsak dibersihkan, dikeringkan dalam oven pada suhu 55o C dan dihaluskan. Pengeringan dihentikan bila kadar air telah mencapai sekitar 3%. b) Simplisia ditimbang sebanyak 20 gram, dibungkus kertas saring sepanjang tabung perkolator bercorong (panjang 28 cm diameter 4 cm). Masukkan bungkusan simplisia tersebut dengan cara disumbat (kertas saring pembungkus diikat atau digulung) di bagian bawah supaya simplisia tidak keluar ketika alat perkolasi dijalankan, selanjutnya alat perkolasi tersebut ditutup. c) Pelarut dimasukkan ke dalam wadah (bejana), pipa palstik kecil dipasangkan dari bejana ke mesin motor perkolator d) Mesin motor perkolator dinyalakan sampai simplisia terendam larutan, selanjutnya mesin motor dimatikan dan biarkan perendaman berlangsung selama ½ jam. e) Mesin motor dinyalakan kembali da biarkan perkolator bekerja selama 11/2 jam sampai diperoleh ekstrak yang diharapkan. 3.2 Pembuatan larutan dapar kalium fosfat pH 7,5 (50 mM) Timbang K2HPO4 (40,6 mL) = 40,6 mL x 174,18 g/1000 mL = 7,071 g Timbang K2HPO4 (9,4 mL) = 9,4 mL x 136,09 g/1000 mL = 1,279 g Kedalam beaker gelas 1 L, masukkan kedua bahan kimia tersebut, tambah dengan 900 mL aqua bidestilata (yang sudah dipanaskan bebas O2 dan CO2). Aduk hingga larut. Tetapkan pH hingga 7,5 dengan penambahan NaOH 0,1 M/HCl 0,1 M. Baru di tambahkan dengan aqua bidestilata hingga 1 L. Catatan: untuk membuat 500 mL berat K2HPO4 = 3,536 g (=7,071:2) berat KH2PO4 = 0,639 g (=1,279 : 2). K2HPO4 (BM=174,18) KH2PO4 (BM=136,09) 3.3 Pembuatan larutan substrat 0,75 mM (xantin, BM 152,11) (dibuat fresh). Ditimbang sejumlah 22,8 mg + 300 µL NaOH encer. Kocok hingga larut dalam tabung eppendrof. Tambahkan dengan aquadest hingga 18 mL, tentukan pH hingga 7,5 dengan menggunakan larutan HCl/NaOH encer. Tambahkan dengan aquadest hingga 20 mL. Larutan kerja dibuat dengan mengencerkan stok menjadi 1/10x-nya. 3.4 Pembuatan larutan enzim -Pembuatan larutan stok enzim Ditimbang sejumlah 10 mg (~0,12 unit per mg padatan) enzim kemudian dilarutkan dalam 1 mL dapar fosfat pH 7,5, suhu kamar. Kocok hingga homogen dan dibagi dalam 10 microtube (1,2 unit/ml), simpan dalam frezzer. Yang sudah dicairkan tidak boleh dimasukkan ke dalam freezer kembali. -Pembuatan larutan kerja enzim 0,3 unit/ml Larutan kerja adalah mengencerkan larutan stok dengan perbandingan 1:4 dengan dapar fosfat pH 7,5. -Pembuatan larutan sampel Larutan Stok (LS): Ditimbang sejumlah 10 mg ekstrak, tambahkan 200 µl DMSO (20xberat ekstrak) à vortek hingga larut. Kemudian tambahkan 300 µl dapar fosfat (30x berat extract) à vortex hingga larut, diperoleh larutan uji dengan konsentrasi 20.000 ppm (LS=larutan stok1). Larutan kerja (LK). LS diencerkan 1/20x dengan dapar fosfat pH 7,5 hingga diperoleh larutan kerja (LK) dengan konsentrasi 1000 ppm.0,05 mL LS1 + 0,95 mL dapar fosfatpH 7,5 à konsentrasi 1.000 ppm -Pembuatan larutan pembanding (Allopurinol) Satu tablet allopurinol (100 mg) digerus hingga halus, kemudian dimasukan ke dalam labu ukur 5 mL dan ditambah dengan dapar fosfat hingga batas. Disonikasi selama 5 menit pada suhu kamar à dipindahkan dalam ependrof 1 mL à disentrifuse hingga didapatkan supernatant, konsentrasi larutan ialah 2x104 ppm. Diencerkan 1/20 x à 0,05 mL stok + 0,95 mL dapar fosfat à 1.000 ppm. 3.5 Uji Aktifitas Inhibitor Xanthin Oksidase Senyawa alkaloid yang terpilih pada pengujian in silico dan ektrak metanol, kloroform dan aseton dari tanaman dilakukan analisa lebih lanjut untuk menentukan daya inhibisinya. Masing-masing sebanyak 250 μL alkaloid dan ekstrak tanaman (1,25-10 mg/mL) dimasukkan dalam tabung dan ditambahkan 250μL buffer natrium fosfat (pH 6,9) 0,02 M yang mengandung 0,5 mg/mL xanthin oxidase. Larutan diinkubasi pada suhu 25 °C selama 10 menit. Setelah itu, 250 μL larutan pati 1% dalam buffer natrium fosfat 0,02 M ditambahkan ke masing-masing tabung kemudian diinkubasi pada suhu 25 °C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 500 μL dinitrosalicylic acid (DNS). Masing-masing tabung diinkubasi dalam air mendidih selama 5 menit dan didinginkan pada suhu kamar. Campuran reaksi diencerkan dengan menambahkan 5 mLakuades dan absorbansi diukur pada 540 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Aktivitas penghambatan α-amilase dihitung sebagai persentase inhibisi menggunakan rumus: 3.6 Uji Aktivitas Inhibitor DPP-4 Aktivitas penghambatan enzim secara in vitro dilakukan melalui pengujian berbasis fluoresensi yang menggunakan substrat fluorogenik (Gly-Pro-Aminomethylcoumarin (AMC), untuk mengukur aktivitas DPP. Ikatan peptida yang putus pada DPP-4 melepaskan AMC bebas yang menghasilkan fluoresensi, sehingga dapat dianalisis pada panjang gelombang eksitasi 350-360 nm dan panjang gelombang emisi 450-465 nm. Untuk menguji aktivitas inhibitor, masing-masing sampel senyawa alkalod dan ekstrak metanol, kloroform dan aseton tanaman yang akan diuji disiapkan dengan cara melarutkan 1 mg sampel dalam 10% DMSO. Beberapa campuran disiapkan untuk diuji menggunakan flouresensi. Campuran untuk uji aktivitas awal (100%) adalah 10 ml DMSO, 30 ml buffer uji encer, dan 10ml DPP-4 encer. Untuk kontrol positif, 10 ml sitagliptin, 30 ml buffer uji encer dan 10ml DPP-4 encer. Sedangkan untuk kontrol negatif, 10 ml DMSO dicampurkan dengan 40ml buffer uji encer. Pengujian sampel melalui campuran 10 mlsampel, 30 ml buffer uji encer dan 10 ml DPP-4 encer. Masing-masing campuran ditambahkan ke 96-well microplate dan ditambahkan 50 ml larutan substrat untuk menginisiasi reaksi. Pelat ditutup dan diinkubasi dengan suhu 37℃ selama 30 menit sebelum dibaca menggunakan fluorosensi. Semua pengukuran dilakukan sebanyak tiga kali dan konsentrasi half maximal (IC50) dihitung dari persentase penghambatan berdasarkan analisis regresi linier dengan menggunakan persamaan berikut. BAB IV BIAYA DAN JADWAL KEGIATAN 4.1 Anggaran Biaya No Jenis Pengeluaran Biaya 1 Perlengkapan yang diperlukan Rp. 3.740.000 2 Bahan Habis Pakai Rp. 8.570.000 3 Perjalanan Rp. 140.000 4 Lain-lain Rp. 50.000 Total Rp. 12.500.000 4.2 Jadwal Kegiatan Bulan Kegiatan 1 2 3 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 Tahap I: Persiapan Studi Literatur Persiapan Alat Penyediaan Bahan Baku Tahap II: Penelitian Preparasi Isolasi Ekstrak Daun Sirsak Uji Aktifitas Inhibitor Xanthin Oksidase Uji Aktivitas Inhibitor DPP-4 Tahap III: Analisis dan Pembuatan Laporan Akhir Pembuatan Laporan Akhir DAFTAR PUSTAKA Hideharu Shintani, 2013 “Pharmaceutica Analytica Acta-Patient Information On Allopurinol” http://ebook-kings.com/pdf/determination-of-xanthine-oxidase--7256 7960.html. Diakses pada 3 Oktober 2016 pukul 08.45 WIB 2. Tanpa Nama, 2010 Australian Rheumatology Association http://ebook-kings.com/pdf/patient-information-on-allopurinol-rheumatology-25328438.html Diakses pada 3 Oktober 2016 pukul 09.00 WIB 3. Tanpa Nama, 2013 “Klasifikasi Tanaman-Artikel Biologi Lengkap” http://www.klasifikasitanaman.com/2013/05/klasifikasi-tanaman-sirsa k.html Diakses pada 4 Oktober 2016 pukul 08.00 WIB 4. Tanpa Nama, 2012 “Biologi Media Centre-Referensi Pelajaran Biologi” http://biologimediacentre.com/enzim/ Diakses pada 4 Oktober 2016 pukul 09.00 WIB 1.
