ii. materi dan metode penelitian - Fakultas Biologi

II.
MATERI DAN METODE PENELITIAN
A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian
1. Materi Penelitian
1.1. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah labu Erlenmeyer,
beaker glass, tabung reaksi, cawan petri, tangkai Drugalsky, pipet ukur,
filler, spatula, jarum inokulasi, kompor gas, timbangan analitik, hot plate,
magnetic stirrer, kulkas standar, autoclave, oven, inkubator, alat penggiling,
ayakan, evaporator, pembakar spirtus, spuit, gunting, mikroskop, pipet
tetes,
pipet
ukur,
sprayer
alkohol,
tabung
eppendorf,
baki,
spektrofotometer, dan pH meter.
1.2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan terdiri dari kultur bakteri asam laktat
(isolat Bifidobacterium sp. koleksi laboratorium Mikrobiologi Fak. Biologi
UNSOED), NaOH 1 N, indikator fenolftalein, glukosa, etanol 96%, reagen
Arsenomolibdat, reagen Nelson,Talas (C. esculenta), media MRS Agar dan
media MRS Broth, alumunium foil, spirtus, kapas, tissue, label, wrapper,
akuades steril, alkohol 70 %.
2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi
Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto selama bulan April - Agustus 2014.
B. Metode Penelitian
1. Rancangan Percobaan
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimental dengan
menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial dan setiap perlakuan
diulang tiga kali. Faktor pertama yaitu media MRSB dengan konsentrasi ekstrak talas
(C. esculenta) dan faktor kedua adalah waktu inkubasi.
a.
Media MRSBdan penambahan ekstrak talas (C. esculenta):
I0 = media MRSB + 0% Ekstrak Talas (C. esculenta) dari volume MRSB
I1 = media MRSB + 1 % Ekstrak Talas (C. esculenta) dari volume MRSB
I2 = media MRSB + 2 % Ekstrak Talas (C. esculenta) dari volume MRSB
I3 = media MRSB + 3 % Ekstrak Talas (C. esculenta) dari volume MRSB
b.
Waktu inkubasi
5
K1
= Inkubasi 48 Jam
K2
= Inkubasi 96 Jam
K3
= Inkubasi 144 jam
Sehingga menghasilkan 12 kombinasi perlakuan yaitu:
I0K1, I1K1, I2K1, I3K1, I0K2, I1K2, I2K2, I3K2, I0K3, I1K3, I2K3, I3K3. Masingmasing perlakuan diulang 3 kali sehingga terdapat 36 unit percobaan.
2.Variabel dan parameter penelitian
Variabel bebas yang digunakan adalah konsentrasi ekstrak talas (C.
esculenta) dalam media MRSB dan lama inkubasi, adapun variabel tergantung
adalah populasi bakteri Bifidobacterium sp. Parameter utama yang diamati adalah
jumlah Bifidobacterium sp., dan parameter pendukungnya adalah total asam laktat,
total gula reduksi dan pH.
3.
Cara Kerja
3.1. Sterilisasi Alat (Hadioetomo, 1990)
Alat-alat laboratorium yang digunakan disterilisasi dengan menggunakan
autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.2. Pembuatan tepung talas (Nuraida, 2006)
Pembuatan tepung talas diawali dengan pengupasan umbi talas segar dan
pencucian yang dilanjutkan dengan pengirisan dan perendaman dalam air
untuk mencegah proses pencoklatan. Kemudian dilakukan pengeringan
menggunakan oven pada suhu ±75° C selama 24 jam. Hasil pengeringan berupa
keripik talas kemudian digiling untuk menghasilkan tepung talas dan diayak
dengan ayakan.
3.3. Pembuatan Ekstrak Talas (C. esculenta)
Tepung talas diekstraksi menggunakan etanol 96% dengan pengadukan selama
24 jam menggunakan shakerorbital pada suhu ruang. Larutan disaring dan
residu pada kertas saring dicuci dengan etanol 96%. Larutan yang telah disaring
dipisahkan dari etanol menggunakan evaporator sehingga diperoleh larutan
oligosakarida pekat. Larutan stok tersebut disimpan dalam lemari es.
3.4. Pembuatan Media (Bridson, 1998)
Lampiran 2 dan 3.
3.5. Peremajaan Isolat Bifidobacterium sp.
6
Disiapkan media miring MRSA sebagai media tumbuh bakteri Bifidobacterium
sp. yang akan diremajakan. Isolat Bifidobacterium sp. diambil dengan
menggunakan jarum inokulum, lalu di streak pada media miring MRSA untuk
diremajakan kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 37 oC.
3.6. Pembuatan Kultur Bifidobacterium sp.
Pembuatan
kultur
dilakukan
dengan
mengambil
kultur
cair
isolat
Bifidobacterium sp. sebanyak 1 ml (± 2,13 x 108 cfu/ml) kemudian dimasukkan
ke dalam 24 ml media MRS Broth lalu diinkubasikan selama 24 jam pada suhu
37oC.
3.7. Pengujian ekstrak talas untuk menstimulir pertumbuhan
Bifidobacterium sp.
Sebanyak 0,1 ml kultur Bifidobacterium sp. ditambahkan pada tabung reaksi
berisi 10 ml media yang ditambahkan dengan ekstrak talas sebanyak 0%
(kontrol), 1 %, 2 %, dan 3 %. Inkubasi dilakukan pada suhu 37°C selama 48 jam,
96jam, dan 144 jam. Pengukuran pertumbuhan dilakukan dengan mengukur
absorbansi suspensi bakteri pada panjang gelombang 600 nm. Sebagai blanko
digunakan medium yang tidak diinokulasi kultur Bifidobacterium sp.
3.8. Pengukuran Total Asam Laktat (Apriyanto et al., 1989)
Medium pertumbuhan diambil sebanyak 2 ml, kemudian dimasukkan ke dalam
labu Erlenmeyer, selanjutnya diencerkan dengan akuades sebanyak 20 ml dan
dikocok, diberi 3 tetes indikator pp, kemudian dititrasi dengan larutan NaOH 1
N hingga tepat terbentuk warna merah muda. Perhitungan total asam laktat
dilakukan menggunakan rumus:
( )
Keterangan :
V :Volume Larutan NaOH (ml)
N : Normalitas Larutan NaOH
B : Volume Sampel (ml)
BM asam laktat : 90
Satuan total asam laktat dalam %
3.9. Penghitungan Jumlah Sel dengan Menggunakan Total Plate Count
(TPC) (Lay, 1994)
Penghitungan menggunakan metode TPC dilakukan menggunakan teknik pour
plate. Bakteri yang diinkubasi selama 48 jam, 96 jam, dan 144 jam diambil 1 ml
dengan pipet ukur, dilakukan pengenceran pada 9 ml akuades hingga
pengenceran 10-6, plating duplo pada dua pengenceran terakhir, yaitu 10-5 dan
7
10-6 sebanyak 1 ml pada cawan secara pour plate kemudian diinkubasi pada
suhu 37oC selama 2x24 jam. Jumlah sel dihitung berdasarkan jumlah koloni lalu
dikalikan dengan faktor pengenceran dengan rumus sebagai berikut :
Keterangan :
Fp : faktor pengenceran
pp : pour plate (1 ml)
Satuan jumlah sel TPC adalah CFU/ml
3.10. Pengukuran Derajat Keasaman (pH) Medium (Hadioetomo, 1990)
Nilai pH medium diukur menggunakan pH meter digital dengan cara sebagai
berikut: pH dikalibrasi menggunakan larutan buffer 7, 4 dan 10, lalu elektroda
pH meter dicelupkan ke dalam medium selama 10 menit atau sampai pH
meter menunjukkan angka yang konstan, nilai pH yang tercantum pada pH
meter merupakan nilai pH medium yang diukur.
3.11. Pengukuran kadar gula reduksi dilakukan dengan metode NelsonSomogyi (Sudarmadji et al., 1989)
Pengukuran kadar gula reduksi dilakukan untuk mengetahui kadar gula reduksi
awal dan akhir fermentasi. Pengukuran dilakukan dengan menyiapkan kurva
standar terlebih dahulu kemudian dilanjutkan dengan pengukuran kadar gula
reduksi sampel.
1. Penyiapan kurva standar
Larutan glukosa standar 10% dibuat dengan cara mencampurkan 10 mg
glukosa anhidrat dengan 100 ml akuades, dilakukan pengenceran dari
larutan glukosa standar tersebut sehingga diperoleh larutan glukosa dengan
konsentrasi 2, 4, 6, 8 mg dalam 100 ml akuades. Larutan glukosa standar
dimasukkan kedalam tabung reaksi, masing-masing diisi sebanyak 1 ml, dan
satu tabung diisi 1 ml akuades sebagai blanko. Masing-masing tabung
ditambahkan 1 ml reagen Nelson dan dipanaskan pada penangas air
mendidih selama 20 menit. Tabung diambil dan segera didinginkan
bersama-sama dalam gelas piala yang berisi air dingin hingga suhu
mencapai 25oC. reagen Arsenomolibdat ditambahkan kedalam tabung
sebanyak 1 ml, dikocokhingga semua endapan Cu2O larut kemudian
ditambahkan 7 ml akuades setelah semua endapan Cu2O larut sempurna
dan dikocok hingga homogen, lalu diambil 3 ml dan dimasukkan ke dalam
8
kuvet.
Penghitungan
Optical
Density
(OD)
dilakukan
dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Kurva standar yang
menunjukkan hubungan antara konsentrasi glukosa dan OD dibuat dengan
menggunakan rumus
.
2. Penentuan kadar gula reduksi sampel
Kadar gula reduksi larutan sampel ditentukan dengan cara disiapkan
sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, dilakukan
pengenceran hingga 10-4 dan pengenceran terakhir diambil 1 ml kemudian
ditambahkan reagen Nelson dan dipanaskan pada penangas air mendidih
selama 20 menit. Tabung diambil dan didinginkan dalam gelas piala yang
berisi air dingin hingga suhu mencapai 25oC lalu ditambah 1 ml reagen
Arsenomolibdat, dikocok sampai semua endapan Cu2O larut. Endapan Cu2O
yang telah larut sempurna ditambah 7 ml akuades dan dikocok hingga
homogen, lalu diambil 3 ml dan dimasukkan ke dalam kuvet. Absorbansi
larutan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.
Jumlah gula reduksi ditentukan berdasarkan absorbansi larutan sampel
yang diplotkan ke dalam kurva standar larutan glukosa.
C. Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA) atau uji F
pada tingkat kesalahan 5% dan 1%, perlakuan berpengaruh tidak nyata sehingga
tidak dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Jujur (BNJ) (Steel dan Torrie, 1993).
9