186 ABSTRACT Dengue infection in Indonesia has a high

FARMASAINS Vol 2 No. 4, Oktober 2014
AMPLIFIKASI GEN PENYANDI PROTEIN NON-STRUKTURAL 1 (NS1) VIRUS DENGUE SEROTIPE 4 STRAIN
INDONESIA DARI SERUM PASIEN DENGUE HAEMORRAGHIC FEVER (DHF) IDS 96/10
Full-Length Amplification of Non-Structural 1 (NS1) Encoding Gene of Dengue Virus Serotype 4 Strain Indonesia
Full-Length Amplification from Dengue Haemorraghic Fever (DHF) Patient Sera IDS 96/10
Wahyu Hidayati1*, Andi Yasmon2, Mirawati Tjahjani Sudiro2, Beti Ernawati Dewi2
Fakultas Farmasi dan Sains UHAMKA. Jakarta
Departemen Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia
1
2
Naskah diterima tanggal 2 Oktober 2014
ABSTRACT
Dengue infection in Indonesia has a high rate of case infection and mortality. A good health
management is important to save patient lives. There are several methods included in
health management of dengue, but the most important is development of dengue vaccine
and early diagnostic kit. These reseach aim was to obtain a full-length of NS1 encoding
gene of Dengue virus serotype 4 strain Indonesia from DHF patient sera IDS96/10. We
extracted the viral RNA from sera and constructed a complementary DNA of DENV-4 by
reverse-complement PCR (RT-PCR). Full-length of DENV-4 strain Indonesia were amplified
from cDNA using of specific NS1 encoding gene primers. Amplification product, then
analyzed their DNA sequence and followed by bioinformatics analysis to find the similarities
of its sequence with other sequences in GeneBank. We got that our amplification product
was Indonesia strain after compare to several DENV-4 from Asia.
Keywords : Dengue, DHF, NS1, amplification, reverse-transcription PCR.
ABSTRAK
Angka kejadian infeksi dengue dan tingkat kematian pasien dengue yang tinggi di Indonesia
menyebabkan pentingnya suatu manajemen kesehatan yang baik untuk pasien dengue.
Pengembangan vaksin dan pendeteksian dini dengue penting untuk menyelamatkan pasien
dengue. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan gen penyandi protein NS1 virus dengue
serotipe 4 (DENV-4) strain Indonesia secara utuh yang berasal dari serum pasien DHF
IDS96/10. Metode yang dilakukan adalah dengan mengisolasi RNA virus dengue dari serum
pasien IDS96/10, dilanjutkan dengan konstruksi cDNA virus dengan teknik reverse
transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) menggunakan random primer. Molekul
cDNA digunakan sebagai cetakan untuk mendapatkan gen penyandi protein NS1 melalui
proses amplifikasi PCR dengan primer spesifik. Hasil amplifikasi dibaca urutan basanya
melalui proses sekuensing dan kemudian dipastikan kebenarannya melalui program blastn
pada GenBank. Gen penyandi protein NS1 DENV-4 strain Indonesia berhasil diperoleh secara
utuh pada penelitian ini. Analsis sekuens memperlihatkan bahwa gen tersebut adalah isolat
Indonesia. Hasil amplifikasi dapat digunakan pada penelitian pengembangan vaksin berbasis
protein subunit maupun pengembangan kit diagnostik dengue.
PENDAHULUAN
Infeksi dengue menyebabkan penyakit
dengue dengan beragam gejala yaitu ringan (demam
dengue/DD) hingga berat (demam berdarah dengue)
bahkan dapat menyebabkan kematian. Penyakit ini
menjadi penyakit endemis di berbagai negara baik
tropis maupun subtropis. Tingginya angka kematian
pada negara-negara tesebut akibat infeksi dengue
menyebabkan penyakit akibat infeksi dengue menjadi
salah satu penyakit utama yang menjadi perhatian
Organisasi Kesehatan Dunia atau World Health
Organization/WHO (WHO, 2009). Penyakit Dengue
mulai terdeteksi di Indonesia pada tahun 1973 di kota
Surabaya (Soedarmo, 1993). Hingga saat ini penyakit
dengue telah tersebar secara merata di seluruh propinsi
di Indonesia dengan tingkat kejadian (Infection Rate/
IR) dan kematian (Case fatality Rate/CFR) yang beragam
(Setiati, et al., 2006).
Penyakit Dengue disebabkan oleh virus dengue
yang merupakan virus RNA dengan ukuran genom 11
kpb. Genom tersebut menyandikan sepuluh protein baik
protein struktural maupun non-struktural (NS). Protein
Alamat korespondensi:
Jl. Delima II/IV Perumnas Klender, Jakarta Timur, 13460
email : [email protected]
186
Amplifikasi Gen Penyandi Protein ..... (Wahyu Hidayati, dkk)
struktural yang dikodekan meliputi : protein capsid (C),
membran (prM), dan envelope (E). Sedangkan protein
non-struktral (NS) adalah NS1, NS2A, NS2B, NS3,
NS4A, NS4B, dan NS5. Protein nonstruktural 1 (NS1)
merupakan suatu glikoprotein berukuran 42- 50 kDa
dengan asam amino berjumlah 353-354 aa. Protein
NS1 berperan sebagai pengarah pada proses
pematangan virion atau morfogenesis virus. Selain itu,
protein NS1 yang terekspresi pada permukaan
membran sel akan menyebabkan sel yang terinfeksi
menjadi target sel imun untuk proses sitolisis (Beasley
dan Barrett, 2008; Chang, 1997).
Virus dengue memiliki empat serotipe, yaitu
serotipe 1 (DENV-1), 2 (DENV-2), 3 (DENV-3), dan 4
(DENV-4). Keempat serotipe ini telah menjadi penyebab
penyakit Dengue di Indonesia. Infeksi virus dengue
menyebabkan tingkat keparahan infeksi yang beragam
dari gejala ringan (Demam dengue/DD) hingga parah
(demam dengue dengan manifestasi perdarahan/DHF;
demam dengue disertai syok/ DSS). Tingkat keparahan
infeksi disebabkan oleh perbedaan serotipe saat infeksi
primer dengan infeksi sekunder (Farrar, 2008). Di
Jakarta, antara tahun 2009 hingga 2010 kejadian infeksi
Dengue dengan gejala parah sebanyak 5% disebabkan
oleh virus Dengue serotipe 4 (Dewi dan Sudiro, 2010).
Tingginya angka kematian akibat infeksi
dengue menyebabkan perlu adanya manajemen
kesehatan yang baik untuk menangani pasien. Ada
dua hal yang dapat dijadikan sebagai manajemen
kesehatan dengue, yaitu pendeteksian dini dan
pemberian vaksin dengue. Pendeteksian dengue dapat
dilakukan dengan beberapa metode, salah satunya
adalah pendeteksian antigen maupun pendeteksian
antibodi pada serum pasien (Shu et al., 2004; Tripathi
et al, 2011). Vaksin dengue yang dapat diberikan dapat
berupa protein subunit maupun vaksin DNA (Coller et
al., 2011). Protein NS1 dapat dimanfaatkan pada
pengembangan kedua metode manajemen kesehatan
dengue.
Penelitian ini merupakan penelitian awal dari
suatu proyek pengembangan pendeteksian dini dengue
dan vaksin dengue subunit. Penelitian ini bertujuan
mendapatkan gen penyandi protein NS1 virus dengue
serotipe 4 strain Indonesia yang berasal dari serum
pasien terinfeksi virus DEN-4.
METODOLOGI
Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah
mesin Thermal Cycler (Applied Biosystem), laminar
air flow BSL2 (ESCO), minisentrifuge, perlengkapan
elektroforesis (MUPID), Gel Documentation (BIO-RAD),
microwave, mikropipet, tips beragam ukuran (0,1-1000
µl), dan peralatan gelas yang biasa digunakan di
laboratorium.
Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini
adalah QIAamp Viral RNA Kit (QIAGEN), enzim SSRT
(Invitrogen), RNAse inhibitor (Invitrogen), enzim Platinum
187
Taq Polymerase High Fidelity (Invitrogen), random
primer, primer F-NS1-D4, primer R-NS1-D4,
Isolasi RNA virus dengue serotipe 4 strain
Indonesia dari serum pasien IDS96/10
Ekstraksi RNA menggunakan QIAamp Viral
RNA Kit (QIAGEN) dilakukan sesuai dengan prosedur
yang tersedia pada kit. Sebanyak 560 µl buffer AVL
dan 140 µl serum dimasukkan ke dalam tabung 1,5
ml kemudian dihomogenkan selama 15 detik dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Sebanyak
560 µl ethanol jenuh ditambahkan ke dalam tabung
tersebut dan segera homogenkan selama 15 detik
dilanjutkan dengan pemindahan supernatan ke dalam
QIAamp Mini column (yang telah terpasang pada
tabung microsentrifuge kosong) dan disentrifugasi
kembali dengan kecepatan sebesar 8000 rpm selama
1 menit.
QIAamp Mini column dipindahkan ke tabung
microsentrifuge kosong baru dan dilak ukan
pengulangan prosedur ini hingga seluruh supernatan
pada tahap sebelumnya habis. Setelah itu ditambahkan
500 µl buffer AW1 dan disentrifugasi dengan kecepatan
sebesar 8000 rpm selama 1 menit. Sebanyak 500 µl
buffer AW2 ditambahkan ke dalam QIAamp Mini
column setelah dipindahkan ke tabung microsentrifuge
kosong dan disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm
selama 3 menit. QIAamp Mini column dipindahkan ke
tabung microsentrifuge kosong kemudian ditambahkan
60 µl buffer AVE dan disentrifugasi pada kecepatan
8000 rpm selama 1 menit.
Konstruksi cDNA dari RNA virus Dengue pasien
IDS96/10
Pembuatan cDNA dilakukan dengan teknik
transkripsi balik (reverse transcription) menggunakan
RNA hasil ekstraksi pada tahap sebelumnya. Proses
pembuatan cDNA dilakukan dengan 2 reaksi, yaitu
reaksi 1 yang terdiri atas campuran random primer,
dNTPs, RNAse inhibitor, dan sampel RNA, sedangkan
reaksi 2 terdiri atas 1x Buffer FS, DTT, RNAse inhibitor,
enzim SSRT (Invitrogen). Proses RT-PCR dilakukan
dengan suhu 65 oC selama 5 menit, 25 oC selama 5
menit, 50 oC selama 1 jam, dan reaksi dihentikan pada
suhu 70 oC selama 15 detik. Reaksi 2 dimasukkan
sebelum memasuki suhu 50 o C dengan cara
menghentikan sebentar proses RT-PCR (pause).
Setelah proses pembuatan cDNA selesai, cDNA yang
diperoleh dianalisa hasilnya dengan melakukan
amplifikasi menggunakan primer LanD1 (forward primer)
dan LanD2 (reverse primer) dengan siklus sebagai
berikut : pre-denaturasi 94 oC selama 5 menit,
denaturasi 94 oC selama 25 menit, annealing 58 oC
selama 30 menit, polimerisasi 72 oC selama 2 menit
30 detik, dan polimerasasi lanjutan 72 oC selama 7
menit.
Amplifikasi gen penyandi protein NS1 virus
dengue serotipe 4 strain Indonesia dari cDNA
IDS96/10
Campuran reaksi yang digunakan untuk PCR
gradien adalah: 10x High Fidelity PCR buffer, 10 mM
dNTP mix, 50 mM MgSO4, 10 µM primer Forward, 10
FARMASAINS Vol 2 No. 4, Oktober 2014
µM primer Reverse, ddH2O, enzim Platinum Taq
Polymerase High Fidelity (Invitrogen), dan cetakan
cDNA IDS 96/10. Amplifikasi gen NS1 dilakukan
menggunakan mesin Thermal Cycler (Applied
Biosystem). Adapun tahapan-tahapan PCR gradien
yang dilakukan yaitu denaturasi awal pada suhu 95 oC
selama 5 menit, denaturasi pada 95 oC selama 1 menit,
annealing pada suhu 58oC selama 1 menit, polimerisasi
pada suhu 72 oC selama 1 menit, dan polimerisasi final
pada 72 oC selama 7 menit. Proses denaturasi hingga
polimerisasi dilakukan sebanyak 35 siklus. Amplikon
DNA hasil PCR Gradien dan PCR yang dihasilkan
dianalisis menggunakan elektroforesis jel agarosa
0.8% dilanjutkan dengan visualisasi menggunakan
Etidium Bromida (EtBr).
Analisis urutan basa gen NS1 hasil proses
amplifikasi
Fragmen hasil amplifikasi dibaca urutan basa
nuk leotidanya melalui proses sekuensing
menggunakan primer D4-2412s sebagai primer forward
dan D4-3551c primer reverse yang telah didesain
menggunakan program PRIMER dengan didasarkan
pada informasi urutan basa nukleotida virus dengue
serotipe 4 pada GenBank dengan accession number
GQ398256. Proses sekuensing dilakukan di Lembaga
Eijkmann, Jakarta dan kemudian dianalisis
menggunakan perangkat lunak BIOEDIT dan
GENEIOUS R8.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Infeksi dengue telah tersebar merata di seluruh
propinsi di Indonesia dengan persentase kasus dan
angka kematian yang beragam pada setiap propinsi.
Pengembangan vaksin dan pendeteksian dini dengue
spesifik terhadap keempat serotipe dengue penting
dilakukan sebagai upaya penyelamatan pasien dengue.
Hal ini disebabkan keempat serotipe dengue menjadi
penyebab penyakit dengue di Indonesia (Muhadir,
2013). Pada pengembangan vaksin dengue, ada
beberapa metode pembuatan vaksin dengue yang telah
dikembangk an diantaranya adalah vaksin
menggunakan virus dengue yang dilemahkan, vaksin
chimeric, vaksin dengan vektor virus, vaksin DNA dan
antigen protein rekombinan (Coller et. al., 2011).
Sedangkan pendeteksian infeksi dengue dapat
dilakukan dengan isolasi virus, deteksi asam nukleat
virus, deteksi antibodi atau antigen, bahkan kombinasi
teknik pendeteksian (Shu et al., 2004; Tripathi et al.,
2011) . Pendeteksian antigen dengan metode PCR
mulai banyak diterapkan di beberapa rumah sakit di
Indonesia. Akan tetapi hal ini terkendala pada mahalnya
biaya pemeriksaan. Salah satu alternatif deteksi yang
cepat dan murah adalah pendeteksian antigen NS1
dengue pada serum pasien (Hidayati dkk, 2014).
Penelitian ini merupakan tahap awal dari
serangkaian proses pengembangan vaksin dan
pendeteksian dini dengue dengan memanfaatakn
teknik rekayasa genetika. Di antara sepuluh protein
yang diproduksi oleh virus dengue, protein NS1 menjadi
target penelitian kami. Hal ini didasarkan pada peran
protein ini pada perkembangan virus dan keberadaan
protein ini dalam tubuh pasien. Protein NS1 berperan
sebagai pengarah pada proses pematangan virion atau
morfogenesis virus. Dalam tubuh pasien, protein NS1
ditemukan dalam dua bentuk, yaitu berasosiasi dengan
membran sel dan disekresikan keluar sel. Protein NS1
yang tersekresi dalam jumlah besar hanya ditemukan
pada sel mamalia, tidak pada sel nyamuk (Beasley
dan Barrett, 2008; Chang, 1997).
Gen NS1 DENV4 strain Indonesia berhasil
diperoleh dalam bentuk utuh sebesar 1.162 pb melalui
proses PCR pada suhu annealing 58 oC dengan
menggunakan cDNA IDS96/10 sebagai cetakan
(template) (gambar 2). Proses PCR merupakan proses
replikasi DNA yang dilakukan secara in vitro.
Sebagaimana proses replikasi pada sel, proses PCR
terdiri atas tiga tahapan, yaitu pemisahan dua untai
ganda DNA, penempelan primer, dan pemanjangan
untai DNA baru (Watson et al., 2008; Sambrook dan
Russel, 2001; Stansfield et al., 1996; Davis et al.,
1994).
Gambar 1. Hasil amplifikasic DNAdengan primer LanD1 dan
LanD2.Lajur1.DNA penandastandar 100 pb.Lajur 2.
Produk PCR cDNA IDS96/10
188
Amplifikasi Gen Penyandi Protein ..... (Wahyu Hidayati, dkk)
Gambar 2. Hasil amplifikasi gen NS1 DENV4 dari cDNA IDS96/10.
Lajur 1: Lambda/Hind III DNA ladder. Lajur 2: Gen NS1
Cetakan yang digunakan pada penelitian ini
adalah cDNA yang berasal dari proses reversetranscription PCR. Molekul cDNA tidak dapat
divisualisasi langsung menggunak an metode
elektroforesis jel agarosa karena berupa untai tunggal
yang berasal dari RNA (Davis etal., 1994). Keberhasilan
pembuatan cDNA DENV4 dari RNA IDS96/10 diketahui
dengan melakukan PCR terhadap cDNA DENV4 IDS
96/10 menggunakan primer LanD1 dan LanD2 (gambar
1).
Setelah dilakukan analisa sekuens gen NS1
DENV4 hasil penelitian ini dengan membandingkannya
terhadap gen NS1 DENV4 strain Malaysia
(JF262780.1), Singapura (JX024758.1), dan Thailand
(AY618993.1) diketahui adanya perbedaaan basa
antara sekuens gen NS1 DENV4 yang diperoleh dengan
ketiga strain tersebut (gambar 3). Nilai perbedaan yang
diperoleh dari analisa sekuens terhadap DENV4 strain
Malaysia, Thailand, dan Singapura secara berurutan
adalah 14%, 4%, dan 3%. Perbedaan tersebut
menunjukkan bahwa gen NS1 DENV4 yang diperoleh
dari serum IDS96/10 berasal dari virus asli Indonesia.
Kemiripan (similarity) sekuens antar satu
organisme dengan organisme lain dapat diketahui
dengan melakukan analisa sekuens melalui proses
#Alignment of 2 sequences: DENV-4 Malaysia, NS1 DENV4 IDS96/10
Score = 3528.284, Identities = 989/1149 (86%),
Positives = 989/1149 (86%), Gaps = 18/1149 (1%)
#Alignment of 2 sequences: DENV-4 Thailand, NS1 DENV4 IDS96/10
Score = 5186.032, Identities = 1104/1141 (96%),
Positives = 1104/1141 (96%), Gaps = 0/1141 (0%)
#Alignment of 2 sequences: DENV-4 Singapura, NS1 DENV4IDS96/10
Score = 5256.163, Identities = 1109/1141 (97%),
Positives = 1109/1141 (97%), Gaps = 0/1141 (0%)
Gambar 3. Hasil analisa perbandingan gen NS1 DENV-4 IDS 96/10 dengan
gen NS1 DENV-4 strain Malaysia, Thailand, Singapura
189
FARMASAINS Vol 2 No. 4, Oktober 2014
allignment. Kemiripan yang muncul dapat dijadikan
sebagai dasar hubungan kekerabatan di antara
keduanya, hal ini dapat dilihat dari semakin kecilnya
persentase gaps yang muncul dan semakin tingginya
persentase nilai positives pada hasil allignment
(Atwood dan Parry-Smith, 1999). Gen NS1 DENV-4
strain Indonesia yang diperoleh pada penelitian ini
dapat digunakan sebagai komponen pengembangan
vaksin dan pendeteksian dini infeksi dengue di
Indonesia.
KESIMPULAN
Gen penyandi protein NS1 DENV-4 strain
Indonesia berhasil diperoleh secara utuh dangan ukuran
sebesar 1.162 pb melalui proses amplifikasi dan hasil
homologi sekuens menunjukkan gen NS1 DENV4 yang
diperoleh dari serum IDS96/10 berasal dari virus asli
Indonesia.
DAFTAR PUSTAKA
Beasley DWC, Barrett ADT. The Infectious Agent,
dalam Halstead SB (Ed). Dengue Tropical
Medicine: Science and Practice (Vol. 5). 2008.
London: Imperial College Press. 29-73
Chang GJ. Molecular Biology of Dengue Viruses, dalam
Gubler DJ, Kuno G (Ed).Dengue and Dengue
Haemoraghic Hever. 1997. Cambridge: CAB
international.
Coller BAG, Clement DE, Bett AJ, Sagar SL, ter Meulen
JH. The development of recombinant subunit
envelope-based vaccines to protect against
dengue virus induced disease. Vaccine. 2011;
29(42): 7267-7275.
Davis L, Kuehl M, Battey J. Basic Methods in Molecular
Biology (2nd Ed). 1994. Amerika: Appleton &
Lange. P 135
Dewi BE, Sudiro MT. Epidemiologi dengue di Jakarta
pada tahun 2010. Unpublished. Fakultas
Kedokteran, Universitas Indonesia.
Farrar J. Clinical Features of Dengue, dalam Halstead
SB (Ed). Dengue. 2008. London: Imperial
College Press.
Gupta P, Khare V, Tripathi S, Nag VL, Kumar R, Khan
MY, Dhole TKNC. 2010. Assessment of World
Health Organizataion Definition of Dengue
Hemorraghic Fever in North India. Jornal of
Infectious Diseases Development Countries.
2010; 4(3):150-5.
Guzman MG, Halstead SB, Artsob H, Buchy P, Farrar
J, Gubler DJ, et al. Dengue: A Continuing Global
Threat. Nature Review Microbiology. 2010: s7s16.
Hidayati W, Yasmon A, Sudiro MT, Dewi BE.
Construction And Identification Of Yeast
Shuttle Vectors Containing Non Structural 1
(NS1) Dengue Serotype 4 Strain Indonesia
Gene. International Symposium on Drug and
Vaccine Development in Post MDGs Era.
Yogyakarta, 20-21 Juni 2014.
Muhadir A. Epidemiology of dengue in Indonesia.
Dengue Vaccine Meeting. Brazil, 9-11 April
2013.
Sambrook J, Russel DW. Molecular Cloning, A
Laboratory Manual (Vol. 3). 2001. New York:
Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Setiati TE, Wagenaar JFP, de Krui MD, Mairuhu ATA,
van Gorp ECM, Soemantri A. Changing
Epidemiology Of Dengue Haemoraghic Fever
In Indonesia. Dengue Bulletin. 2006; 30: 1-14.
Shu PY, Huang JH. Current Advances in Dengue
Diagnosis. Clinical and Diagnostic Laboratory
Immunology. 2004; 11(4):642-50
Soedarmo SP. The Epidemiology, Control, And
Prevention Of Dengue Haemoraghic Fever In
Indonesia. Journal of Tropical Medicine. 1993;
35(4): 161-72.
Stansfield W D, Jaime S Colome, Raul J Cano.
Schaum’s Outlines Molecular and Cell Biology.
1996. New York: McGraw-Hill
Tripathi NK, Shrivastava A, Dash PK, Jana AM.
Detection Of Dengue Virus. Methods of
Molecular Biology. 2011; 665:51-64.
Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M,
Losick R. Molecular Biologi of The Gene, 6th
ed. 2008. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
World Health Organization. Dengue: guidelines for
diagnosis, treatment, prevention and controlNew edition. 2009. Jenewa: WHO Press.
190