7_Jurnal FKH_Eksplorasi Bakteri Selulolitik

Jurnal Ilmiah Kedokteran Hewan Vol. 4, No. 1, Februari 2011
Eksplorasi Bakteri Selulolitik Asal Cairan Rumen Sapi Potong sebagai Bahan Inokulum Limbah
Pertanian
Exploration Cellulolytic of Bacterium of Rumen Liquid Beef Cattle As Inoculum of Waste Agriculture
Mirni Lamid, Tri Prasetyo Nugroho, Sri Chusniati, Kusriningrum Rochiman
Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga
Kampus C, Mulyorejo, Surabaya 60115
Telp. 031-5992785, Fax. 031-5993015
Email : [email protected]
Abstract
This research was conducted to isolation and identify bacterium of cellulolytic of rumen liquid beef cattle by
using media of Carboxil Methile Cellulose ( CMC). Intake of sample done by three times with accomodating dilution
of rumen beef cattle , packed into the bottle. After that was done by thinning 102, then taken by 1 ml was inoculated to
containing of petridish with CMC using pour plate method for three days incubation. Identification to be conducted by
macroskopis and microscopic which continued with biochemical test with consist of Triple Sugar Iron (TSIA),
Sulfide Indol Motility ( SIM), Manitol, Citrat, Urea and Glucose Test (Lactose, Dextrose, Sucrose, Saccarosa and
maltose). The result of research obtained by seven bacterium species consist of : Nitrosomonas europae, Bacillus
sphaericus, Cellulomonas cellulans, Cytophaga hutchinsoi , Acidothermus cellulyticus, Lactobacillus acidophilus,
dan Cellvibrio mixtus. All of this cellulolytic bacterium had potential to be used fermented waste agriculture for feed
of ruminants.
Keywords : Bacterium of cellulolytic, Carboxil Methile Cellulose, Waste Agriculture
Pendahuluan
Tidak semua bakteri dapat mengakibatkan
penyakit. Dalam keadaan tertentu spesies bakteri
merupakan bagian penting dalam kehidupan
manusia, baik secara langsung maupun tidak
langsung. Bakteri mempunyai peran dalam
memecahkan masalah lingkungan. Fungsi vital
bakteri adalah untuk mengurai sampah organik dan
organisme yang telah mati (Campbell,1994).
Jerami padi merupakan limbah organik
hasil dari pertanian padi. Jerami padi masih dapat
dimanfaatkan untuk pakan ternak, media
pertumbuhan jamur merang, dan dapat dikembalikan
ketanah sebagai pupuk dengan cara dibakar. Jerami
padi memiliki kandungan lignin, selulosa dan
hemiselulosa yang sukar untuk dicerna tanpa bantuan
enzim selulase dan hemiselulase.
Di dalam rumen ternak ruminansia
mengandung bakteri dan fungi yang mampu
memecah lignoselulosa dan lignohemiselulosa,
sehingga jerami padi dapat dimanfaatkan sebagai
pakan ternak ruminansia. Rumen merupakan
lingkungan yang cocok untuk sejumlah
mikroorganisme. Jumlah bakteri di rumen bervariasi
tergantung pakan yang dikonsumsi, waktu
pengambilan sampel setelah pemberian pakan,
spesies hewan yang berbeda, individu yang berbeda,
musim dan ketersediaan hijauan pakan (Arthur,
1987). Populasi bakteri di dalam rumen ternak
ruminansia terdapat sekitar 1010 – 1012 bakteri pada
tiap gram isi rumen (Ogimoto,1981).
Selulosa adalah komponen terbesar dari
tanaman. Selulosa merupakan suatu
homopolisakarida linier yang tersusun atas 100-4000
unit monosakarida β-glukosa melalui ikatan β-1,4glikosidik (Tillman et al, 1991 dan Mc Donald et al,
1995). Selulosa merupakan komponen penyusun
dinding sel tanaman, jumlahnya berlimpah pada
tanaman, umumnya memiliki kecernaan yang rendah
dibanding hijauan pakan ternak lain. Hewan
ruminansia seperti sapi, domba, kambing dan kerbau
tidak memiliki kemampuan mendegradasikan
selulosa. Selulosa dapat dihidrolisis dengan proses
tertentu menjadi glukosa (Aklyosov, 2004).
Daya cerna limbah jerami padi dapat
ditingkatkan dengan perlakuan khusus diantaranya
dengan perlakuan biologis. Glass (1991) menjelaskan
bahwa penanganan limbah secara biologi adalah
penanganan limbah pertnaian dengan bantuan
mikroba baik aerob maupun anaerob. Penanganan
limbah pertnaian dengan metode biologis ini sangat
tergantung pada kemampuan metabolisme mikroba
untuk memanfaatkan senyawa kimia sebagai sumber
karbon dan energi dengan bantuan katalisator
biologis yang disebut enzim.
Salah satu genus bakteri yang hidup di
rumen diantaranya adalah bakteri selulolitik yang
memiliki kemampuan mendegradasikan selulosa
37
Eksplorasi Bakteri Selulolitik ......
pada tanaman dengan menghasilkan enzim selulase.
Bakteri rumen yang yang terdapat pada cairan rumen
di Rumah Potong Hewan (RPH) terbuang percuma
karena tidak dimanfaatkan dan dapat mencemari
lingkungan. Isolat bakteri seluolitik mempunyai
aktivitas spesifik, sehingga mempunyai penggunaan
fungsi komersil tertentu seperti : pengolahan limbah
jerami dan pembuatan kertas koran (Singleton,
2001).
Berdasarkan hal diatas tujuan penelitian ini
adalah untuk mengisolasi dan mengidentifikasi
bakteri rumen dari sapi potong yang mampu
mencerna selulosa dengan tujuan membuktikan
bahwa mikroba selulolitik masih mampu
mendegradasikan komponen selulosa limbah
pertanian diluar lingkungan alaminya.
Materi dan Metode Penelitian
Bahan Penelitian
Sampel yang digunakan untuk isolasi
bakteri selulolitik adalah limbah cairan rumen dari
Rumah Potong Hewan Pegirian Surabaya. Media
yang digunakan dalam penelitian ini adalah Carboxil
Methil Cellulosa (CMC) Agar, Carboxil Methil
Cellulosa CMC cair, Czapex Modification (ditambah
dengan Malt Extract) dan Sulfit Indole Motility
(SIM).
Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan adalah : Petridish,
Erlenmeyer, tabung reaksi, Water Bath, Ultra
Sentrifuge, timbangan analitik, shaking incubator,
Magnetic Stirer dilengkapi dengan pemanas,
Fotomikroskop Olympus, Spektrofotometer,
Indikator pH, Inkubator, Autoklav.
Prosedur Penelitian
Pengambilan Sampel
Limbah cairan rumen adalah cairan yang
berasal dari rumen sapi yang telah disembelih yang
masih bercampur dengan pakan yang masih belum
tercerna sempurna. Pengambilan sampel
dilaksanakan sebanyak 3 kali ulangan secara random.
Pengambilan sampel dengan cara memeras isi rumen
untuk dimasukkan ke dalam ember sebanyak kurang
lebih 500 ml untuk isolasi bakteri selulolitik.
Cara Isolasi
Sampel limbah cairan rumen dibuat
pengenceran 10-2 dengan cara 1 ml sampel diencerkan
dengan 99 ml aquadest steril. Hasil pengenceran 10-2
diambil 1 ml untuk diinokulasikan kedalam media
38
CMC agar yang bersuhu kurang lebih 450C sebanyak
kurang lebih 15 ml dengan metode tuang (pour
plate). Pencampuran dilaksanakan dengan memutar
cawan petri. Setelah dingin cawan petri
diinkubasikan pada suhu ruang selama 3 hari.
Setelah koloni bakteri selulolitik tumbuh
dimurnikan dengan membuat streak pada media
Czapex Modification. Koloni yang telah murni
dipindahkan kedalam media biakan miring dan
diinkubasikan pada suhu ruang sebagai stok bakteri.
Tiap jenis isolat diidentifikasi melalui uji morfologis,
uji motilitas dan uji biokimia.
Tahap Identifikasi
Uji Morfologis
Uji morfologis secara makroskopis dengan
melihat bentuk dan warna koloni yang dihasilkan
sedang untuk uji morfologis secara mikroskopis
dilakukan dengan menggunakan pengecatan Gram
dengan prosedur:
a. Diambil satu ose dari setiap jenis koloni dari
media isolasi.
b. Dibuat film dan dibiarkan kering angin.
c. Difiksasi dengan cara dilewatkan di atas nyala api
lampu spirtus beberapa kali.
d. Dideteksi dengan Gram A (Gention Violet) dan
dibiarkan 2 –3 menit.
e. Larutan Gram A dibu\ang, lalu ditetesi dengan
Gram B ( larutan Jodium Lugol) dan dibiarkan 2 –
3 menit.
f. Dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan kering.
g. K e m u d i a n d i t e t e s i d e n g a n G r a m C
(AlkoholAceton) sedikit demi sedikit sampai
larutan yang mengalir tidak berwarna, dan
dibiarkan kering.
h. Ditetesi dengan Gram D (Safranin) dan dibiarkan
selama 2 –3 menit.
I. Dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan kering.
j. Diamati dengan menggunakan minyak emersi di
bawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 100.
Sel yang telah terwarnai bersifat gram
positif jika sel berwarna biru gelap atau ungu dan
bersifat gram negatif bila sel berwarna merah muda.
Uji Motilitas
Satu ose dari setiap jenis koloni dalam
media isolasi diinokulasikan dengan cara tusukan ke
dalam media SIM. Diinkubasikan pada suhu 250 C –
300 C selama 24 – 48 jam. Uji dikatakan positif jika
ada pertumbuhan yang menyebar dari garis inokulasi,
yang berarti ada motilitas.
Jurnal Ilmiah Kedokteran Hewan Vol. 4, No. 1, Februari 2011
Uji Fisiologis
Uji Gula - Gula
Uji Gula-Gula meliputi uji Glukosa, uji
Lactosa, uji Dextrosa, uji Sukrosa, uji Sakarosa dan
uji Maltosa. Prosedur pelaksanaan uji Gula – Gula
adalah dengan Mengambil sedikit bakteri dari media
biakan isolasi untuk diinokulasikan ke dalam media
uji Gula – Gula, diinkubasikan pada suhu 250 C – 300
C selama 24 jam. Uji dikatakan positif jika
perubahan warna pada media uji.
Uji Urea
Satu ose dari media biakan isolasi
diinokulasikan ke dalam glukosa Broth.
Diinkubsikan pada suhu 25C 30 C selama 24 jam.uji
dikatakan negatif jika tidak ada perubahan warna dan
uji dikatakan positif jika erjadi perubahan warna
terhadap kontrol.
Uji Sitrat
Satu ose needle dari media biakan isolasi
ditusukkan ke dalam Sitrat agar. Diinkubasikan pada
suhu250C – 300Cselama 24 jam. Uji dikatakan positif
jika terjadi perubahan warna terhadap kontrol.
Uji Manitol
Satu ose needle dari media biakan isolasi
ditusukkan ke dalam Manitol agar. Diinkubasikan
pada suhu250C – 300Cselama 24 jam. Uji dikatakan
positif jika terjadi perubahan warna terhadap kontrol.
miring tabung untuk selanjutnya dituang pada 45
ml media cair Czapek Modification. Inkubasi suhu
kamar pada sacker selama 2 hari.
• 50 ml suspensi bakteri pada media cair Czapek
Modification dimasukkan kedalam 450 ml media
cair CMC yang telah ditambah Malt Ekstrak.
Inkubasi dengan suhu kamar pada sacker selama 2
hari.
• Suspensi siap diinokulasikan pada jerami padi.
Hasil dan Pembahasan
Hasil isolasi bakteri selulolitik dari cairan
rumen sapi diperoleh 7 macam spesies bakteri
selulolitik aerob. Semua bakteri tersebut mampu
tumbuh pada media padat CMC, media cair CMC
dan Czapek Modification. Ketujuh spesies bakteri
yang didapatkan adalah: Nitrosomonas europae,
Bacillus sphaericus, Cellulomonas cellulans,
Cytophaga hutchinsoi, Acidothermus cellulyticus,
Lactobacillus acidophilus, dan Cellvibrio mixtus.
Isolat Bakteri Selulolitik dari Cairan Rumen, dengan
Pembesaran 1000x
Lactobacillus acidophilus
Acidothermus cellulyticus
Cellvibro mixtus
Bacillus sphaericus
Nitrosomonas europaea
Cellulomonas cellulans
Uji SIM
Satu ose needle dari media biakan isolasi
ditusukkan ke dalam SIM agar. Diinkubasikan pada
suhu250C – 300Cselama 24 jam. Uji dikatakan positif
jika terjadi kekeruhan pada tempat sekitar tusukan.
Pada uji Indol Akan terbentuk cincin merah setelah
ditetesi reagen Covacs.
Uji TSIA
Satu ose jarum dari media biakan isolasi
ditusukkan ke dalam TSIA agar. Diinkubasikan pada
suhu250C – 300Cselama 24 jam. Uji dikatakan positif
jika terjadi perubahan warna pada tempat sekitar
tusukan. H2S dikatakan positif jika terbentuk warna
hitam, media yang pecah menunjukkan terbentuknya
gas.
Pembuatan Bahan Inokulum
• Dari stok bakteri pada media miring ditambah
aquadest steril 5 ml, divertex selama 1 menit
untuk membuat suspensi bakteri dari media
Cytophoga hutchinsoi
39
Eksplorasi Bakteri Selulolitik ......
Tabel 1. Hasil Isolat Bakteri Selulolitik Aerob dari
Cairan Rumen
Genus
Bakteri
Spesies Bakteri
Sifat
Gram
1.
Acidothermus
Acidotehrmus
cellulolyticus
Gram
negatif
2.
Bacillus
Bacillus sphaericu
Gram
positif
3.
Cellulomonas
Cellulomonas
cellulans
Gram
positif
4.
Cellvibrio
Cellvibrio mixtus
Gram
negatif
5.
Cytophoga
Cytophoga
hutchinsoni
6.
Lactobacillus
7.
Nitrosomonas
No.
dengan melihat Optical Density untuk melihat
jumlah penyerapan cahaya dari suspensi bakteri pada
media.
Tabel 3. Hasil Isolat Bakteri Selulolitik Aerob
dari Cairan Rumen Beserta Optical
Density Selama Tiga Hari Pertama
Nilai Optical Density
(Absorben)
Bakteri
Hari
Ke-1
Hari
Ke-2
Hari
Ke-3
Acidotehrmus
cellulolyticus
0,2
1,1
1
Gram
negatif
Bacillus sphaericu
0,2
0,9
0,8
Lactobacillus
acidophilus
Gram
negatif
Cellulomonas
cellulans
0,12
0,9
0,9
Nitrosomonas
europaea
Gram
negatif
Cellvibrio mixtus
0,1
1
0,9
Cytophoga
hutchinsoni
0,1
1
1
Lactobacillus
acidophilus
0,1
0,9
0,9
Nitrosomonas
europaea
0,1
1,1
1
Pertumbuhan bakteri pada media CMC cair
dapat ditunjukkan dengan terjadinya perubahan
warna menjadi keruh setelah penanaman bakteri dan
diinkubasi. Kekeruhan yang terjadi dapat diukur
Tabel 2. Uji Fisiologis Dari Isolat Bakteri
Uji
Fisiologis
Bacillus
Lactobacillus
Cellulomonas
Cellvibrio
Acidothermus
Cytophoga
Nitrosomonas
TSIA
Slant
Alkali
Alkali
Alkali
Alkali
Alkali
Alkali
Alkali
Alkali
-
Alkali
-
Alkali
-
Alkali
-
Alkali
-
Alkali
-
Alkali
-
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
Deep
H2S
Gas
SIM
Indole
Motilitas
Sitrat
Monitol
Lactosa
Glukosa
Dextrosa
Sukrosa
Sakarosa
Maltosa
Urea
40
Jurnal Ilmiah Kedokteran Hewan Vol. 4, No. 1, Februari 2011
Hasil isolasi bakteri selulolitik aerob dari
cairan rumen sapi diperoleh 7 spesies bakteri yaitu:
Nitrosomonas europae, Bacillus sphaericus,
Cellulomonas cellulans, Cytophaga hutchinsoi,
Acidothermus cellulyticus, Lactobacillus acidophilus,
dan Cellvibrio mixtus.
Ketujuh spesies bakteri yang diperoleh
menunjukkan sifat positif dalam uji kemampuan
selulolitik, sehingga dapat diduga ketujuh isolat
tersebut mampu mengekskresikan enzim selulase
yang mampu memecah ikatan 1,4 β-glukosida dalam
media uji. Kemampuan selulolitik dapat dilihat dari
pertumbuhan koloni pada media CMC padat dan
mampu tumbuh pada media CMC cair. Pertumbuhan
bakteri selulolitik pada media CMC cair dapat dilihat
dari perubahan warna media yang menjadi keruh.
Degradasi selulosa dilakukan dengan
bantuan enzim selulase menjadi hasil akhir glukosa.
Berdasarkan hasil penelitian Alexander (1976),
akibat hidrolisis selulosa menjadi glukosa dalam
media padat CMC, disekitar koloni tampak daerah
yang lebih terang, dan daerah ini disebut sebagai
zona terang (Cleared zone). Kemampuan isolat
tersebut tumbuh pada media selulosa membuktikan
bahwa isolat tersebut mampu memanfaatkan selulosa
sebagai salah satu sumber nutriennya. Menurut Atlas
(1981), selulosa dapat dijadikan sebagai sumber
karbon dan energi bagi mikroba. Masing-masing
jenis bakteri selulolitik mempunyai kemampuan
tersendiri dalam mendegradasi selulosa. Bakteri
genus Cytophaga menduduki peringkat paling utama
dalam mendegradasi selulosa ( Alexander, 1977 ;
Campbell, 1985 ).
Bakteri selulolitik merupakan bakteri
heterotrop yang termasuk golongan saprofit. Bakteri
saprofit adalah bakteri yang dapat memanfaatkan
sisa-sisa tumbuhan yang telah mati untuk memenuhi
kebutuhan sel. Bakteri saprofit ini memerlukan gula
(karbohidrat) dalam jumlah tertentu, nitrogen
organik, fosfor dan garam-garam mineral sebagai
sumber energi, beberapa asam amino, vitamin, sterol
dan sebagainya untuk memenuhi kebutuhan sel
(Campbell, 1985). Pertumbuhan bakteri selulolitik
dalam media CMC melalui fase-fase tertentu. Pada
fase eksponensial terjadi pertambhan sel maksimal.
Dimana nutrien masih dapat mendukung
pertumbuhan bakteri sampai fase stasioner. Pada
akhir fase ini kandungan nutrien berkurang yang
menandakan proses metabolisme menurun.
Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian dapat
disimpulkan bahwa diperoleh tujuh isolat bakteri dari
rumen sapi potong yang terdiri dari: Nitrosomonas
europae, Bacillus sphaericus, Cellulomonas
cellulans, Cytophaga hutchinsoi, Acidothermus
cellulyticus, Lactobacillus acidophilus, dan
Cellvibrio mixtus. Ketujuh bakteri selulolitik yang
diisolasi dari cairan rumen tersebut mampu tumbuh
pada media CMC agar dan CMC cair. Ketujuh
bakteri selulolitik tersebut mampu membentuk koloni
pada CMC agar dan tumbuh pada CMC cair yang
ditandai dengan perubahan warna media yamg
menjadi keruh.
Daftar Pustaka
Aklyosov, 2004, Cellulase Enzyme That Degrades
Celulose From Fungi, Application of
Microbial, 522-529.
Alexander, M., 1976, Introduction to Soil
Microbiology, Second Edition, Jhon &
Sons, New York.
Atlas, M. R. 1988. Microbiologi Fundamental and
Aplications. Second Edition. Macmillan
Publishing Company. New York. USA.
Campbell, R,. 1985. Plant Microbiology. Edward
Arnold Publisher. London.
Glass, D.J. 1991. Waste Management : Biological
t r e a t m e n t o f H a z a r d o u s Wa s t e s .
Enviroment. Heldreff Publication. New
York.
Ogimoto, K., Imai, S. 1981. Atlas Of Rumen
Microbiologi, Japan Scientific Societies
Prees. Tokyo.
Mc Donald, P., R.A. Edwards and J.F.D. Greenhalgh,
1995, Animal Nutrition, Third Edition,
Logman, London and New York.
Singleton, P., D. Sainsbury, 2001, Dictionary of
Biology and Molecular Biology, 3th edition,
John Wiley & Sons ltd, Baffins Lane,
Chichester west Sussex PO19 IUD, UK,
70-72, 679.
41
Eksplorasi Bakteri Selulolitik ......
Tillman, A.D.H. Hartadi, S. Reksohadiprodjo, S.
Prawirokusumo dan S. Labdosukojo, 1991,
Ilmu Makanan Ternak Dasar, Cetakan
kelima, Gajah Mada University Press,
Yogyakarta.
42