9 uji kuantitatif karbohidrat -e-learning IX - 8 Des 14

UJI KARBOHIDRAT
SECARA KUANTITATIF
Analisa Karbohidrat

Uji Kualitatif
o
o
o
o
o
o
o
o
Uji
Uji
Uji
Uji
Uji
Uji
Uji
Uji
Molisch
 Uji Kuantitatif
Seliwanoff
o Cara Kimiawi
Anthrone
o Cara Enzimatis
Benedict
o Cara kromatografi
Barfoed
o Cara Optic (fisis)
Iodin
Pembentukan Osason
Fehling
Uji Karbohidrat secara Kuantitatif
Penentuan karbohidrat dari kelompok polisarida dan
oligisakarida, perlu perlakuan pendahuluan , yaitu
hidrolisa sehingga diperoleh monosakarida.
Hidrolisa
Oligo / polisakarida

monosakarida
(Pati)
Asam atau enzim (glukosa)
Penentuan monosakarida:

kimiawi

fisik

enzimatik

kromatografi
Cara Kimiawi
1. Metoda oksidasi dengan kupri
Dasar : reduksi kuprioksida menjadi kuprooksida karena
adanya gula reduksi
Reagen :
- Reagen Luff (campuran CuSO4, Na2CO3, dan asam sitrat)
- Reagen soxhlet (campuran CuSO4 dengan K – Na –tartrat)
K-Na tartrat : pencegah pengendapan CuSO4 dalam reagen
kuprioksida  - sebagai oksidator
- direduksi oleh gula reduksi membentuk
kuprooksida (endapan merah bata)
Penentuan kuprooksida yang terbentuk:
 Menimbang setelah dikeringkan
 Melarutkan kembali, kemudian dititrasi
 Menentukan selisih kuprioksida sebelum dan
sesudah direaksikan dengan gula reduksi
Penentuan gula reduksi dalam larutan:
 Cara luff Schoorl
 Cara Munson Walker
 Cara Lane-Eynon
Cara Luff Schoorl
Yang ditentukan adalah CuO sebelum dan sesudah
direaksikan dengan gula reduksi
= (titrasi blanko – titrasi sampel)
Reaksi :
R – COH + CuO  Cu2O + R – COOH
H2SO4 + CuO  CuSO4 + H2O
CuSO4 + 2KI  CuI2 + K2SO4
2CuI2  Cu2I2 + I2
I2 + Na2S2O3  Na2S4O6 + NaI
I2 + amilum : biru
Metode oksidasi dengan larutan Ferisianida alkalis
Dasar : reduksi ferisianida  ferrosianida oleh gula reduksi.
2K3Fe(CN)6 + 2KI  2K4Fe(CN)6 + I2
2K4Fe(CN)6 + 3 ZnSO4  K2Zn2[Fe(CN)6]2 + 3 K2SO4
Gula reduksi ditentukan :
o berdasar  I2
o berdasar  NaS2O3 untuk titrasi
Indikator : amilum (warna biru hilang)
K4Fe(CN)6 yang terbentuk dihitung dari selisih antara
K3Fe(CN)6 sebelum dan sesudah reaksi reduksi.
Perlu dilakukan percobaan standarisasi
Metoda Iodometri
 Kelebihan I2 dititrasi dengan Na2S2O3
 Reaksi : Sampel Spesifik untuk
aldosa, ketosa hanya sedikit yang
teroksidasi
 Harus dihilangkan zat yang dapat
bereaksi dengan Iodin : etanol,
aseton, mannitol, gliserin, Na laktat,
Na format dan Urea
Laktosa secara kimiawi
 25 ml susu + reagen  filtrat
 5 ml filtrat + reagen  titrasi dengan Na2S2O3
100
A = (Tb – Ts) x N x 0,171 x 
5
A = Kadar Laktosa (g/100 ml)
Tb = titrasi blanko
Ts = titrasi sampel
 Susu dengan kadar protein = 3,2%, lemak = 3,5%
dari 100 ml susu  48,4 ml filtrat
48,4 100
Kadar laktosa/100 ml susu = A x  x 
100
25
Penentuan Sukrosa
 Langsung dengan Polirimeter/refraktometer
 Kimia : hidrolisa (tentukan jumlah gula reduksi)
C6H12O11 + H2O  C6H12O6 + C6H12O6
Sukrosa
fruktosa
glukosa
(342)
(180)
(180)
 Sukrosa = 0,95 x  gula reduksi

BM Sukrosa
342
FK =  = 
2 BM gula reduksi
360
Penting : Cek dulu kemungkinan adanya gula reduksi
dalam sampel sebelum hidrolisa.
Penentuan pati
Prinsip : pati dihidrolisa dengan asam/enzim 
gula reduksi  ditera jumlahnya
[C6H10O25] m + mH2O  m C6H12O6
pati
glukosa
BM = m.162
BM = 180 m
BM pati
FK = 
m . BM gula reduksi
m x 162
=  = 0,9
m x 180
Cara Enzimatis
 Terutama untuk penentuan gula dalam campuran
 karena enzim bersifat spesifik
Misal: penentuan glukosa dan fruktosa
 Dasar :
glukosa dan fruktosa difosforilasi menjadi
glu–6-fosfat (G6P) dan fruktosa-6-fosfat (F6P)
dengan bantuan enzim heksokinase dan
Adenosin–5-trifosfat (ATP)
Glu + ATP  G-6-P + ADP
Fruk + ATP  F-6-P + ADP
G-6-P-DH
G-6-P + NADP  glukonat 6P + NADPH + H+
NADPH yang terbentuk setara dengan glukosa yang bereaksi 
diukur dengan spektrofotometer ( = 334, 340, 365 nm)
PGI
F-6-P  G-6-P
G-6P-DH
G-6-P + NADP  glukonat-6-P + NADPH + H+

Ditera
Penentuan Laktosa
dan Galaktosa
Dasar :
 galaktosidase
Laktosa + H2O
Glukosa +  galaktosa
Gal DH
 galaktosa + NAD  asam galatonat + NADH + H+

ditera (I) pada = 334, 340, 365 nm
C. Cara Khromatografi
Khromatografi kertas/TLC : diukur besarnya Rf tiap
komponoen karbohidrat
Jarak perpindahan molekul zat
Rf = 
Jarak perpindahan pelarut
Harga Rf
tiap jenis gula tertentu untuk perlakuan yang sama
dipengaruhi :
- Macam zat pelarut
- Ukuran bejana
- Suhu
- Macam fase tetap/stasioner
- Sifat zat yang dianalisa
Kromatografi kertas untuk karbohidrat
 Zat penyangga : kertas yang tersusun
oleh selulosa murni (misal: kertas
whatman no.1 kecepatan merambat zat
sedang), dipotong sesuai kebutuhan.
 Teteskan sampel (sekecil mungkin),
penetesan 3-4 x (tetesan besar  terjadi
tailing/pemisah tidak sempurna)
 Masukkan kertas ke dalam wadah berisi
pelarut  pelarut merambat pada kertas
sampai tanda (Solvent front)
Identifikasi :
 Cara fisis : menyinari kertas dengan sinar UV
pada : 254 – 370 nm
 Kimiawi : semprot dengan larutan kimia misal:
o gula reduksi: anilinpthalat, AgNO3
o gula non reduksi: naphtoresorcinol dalam
asam fosfat.
Larutan khloroglusional dan HCl dapat
digunakan untuk:
 Aldosa pentosa (violet)
 Ketosa pentosa (hijau tua)
 Ketoheksosa (kuning coklat)
 Metil pentosa (hijau )
Uap Iodin
Semprotkan pada kertas diruang asam
Setelah kering akan timbul noda berwarna
Hitung Rf, bandingkan dengan standar
 Zat pelarut: zat murni atau campuran
 Untuk penentuan gula sederhana:
Campuran butanol : asetat : air atau
asam asetat : pyridin : air (4:1:5)
Cara fisis (Cara optic)
 Penentuan index bias dengan refraktometer
 tiap jenis gula punya index bias tertentu.
 Keuntungan:
• interval skala index bias cukup besar 1,30 – 1,75
• sampel sangat sedikit (beberapa tetes)
• ketelitian :  0,0002
 dinyatakan dengan
n
20
D
= pengukuran pada t = 20oC dengan sinar Natrium
sebagai sumber sinar monokromatis.
 Pengaruh konsentrasi terhadap () sangat
kecil  diabaikan
 Suhu berpengaruh  perlu koreksi :
 
D
t
    1  0,000184t  20 
D
t
Penentuan karbohidrat dengan polarimeter
Dasar: Karbohidrat bersifat optis aktif (mampu memutar
bidang sinar terpolarisasi), karena mempunyai C asimetri
Keuntungan
 Sampel tidak mengalami kerusakan
 Dapat dilakukan cepat
Agar hasil teliti, maka:
 Larutan harus jernih dan tidak berwarna
 Larutan tidak mengandung bahan asing
yang bersifat optis aktif
 Konsentrasi sampel yang optimum: tidak
terlalu pekat amupun encer
Penentuan dengan polarimeter
Hukum biot: kapasitas rotasi tiap individu gula
sebanding dengan konsentrasi larutan
dan panjang cairan dalam tabung
100
  
: putaran/ritasi spesifik lC
D
t
[]
t
D

C
I
: suhu pengukuran (oC)
: sinar Na (589 nm)
: sdf putar yang diamati
: konsentrasi (g sampel/100 ml pelarut)
: panjang tabung (dm)
Penentuan Serat Kasar
 Serat kasar :
Senyawa yang tidak dapat dicerna dalam
organ pencernaan manusia maupun
binatang.
 Dalam analisa : diperhitungkan
banyaknya zat yang tidak larut dalam
asam/basa encer pada kondisi tertentu.
Langkah penentuan serat kasar
1. Defatting : menghilangkan lemak dalam
sampel dengan pelarut lemak
2. Digestion :
- pelarutan dengan asam
- pelarutan dengan basa
 dalam keadaan tertutup pada temperatur
terkontrol (mendidih)
 segera dilakukan penyaringan untuk
mencegah kerusakan lebih lanjut
 Protein menyulitkan penyaringan  perlu digesti
pendahuluan dengan enzim proteolitik
 Residu = serat kasar yang mengandung 97%
selulosa dan lignin  sisanya adalah senyawa
yang belum dapat diidentifikasi