STUDI PENDAHULUAN GEN PENGKODE LUMBROKINASE DARI
advertisement
STUDI PENDAHULUAN GEN PENGKODE LUMBROKINASE DARI CACING TANAH Lumbricus rubellus TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat Untuk memperoleh gelar Magíster Dari Institut Teknologi Bandung Oleh : INDIRA LANTI KAYAPUTRI NIM : 20505003 Program Studi Kimia INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2008 STUDI PENDAHULUAN GEN PENGKODE LUMBROKINASE DARI CACING TANAH Lumbricus rubellus Oleh : Indira Lanti Kayaputri NIM : 20505003 Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung Bandung, Tanggal................. Mengetahui / Menyetujui, Pembimbing I, Pembimbing II, Zeily Nurachman D.Sc NIP. 131 835 236 Dr. Dessy Natalia NIP. 131 923 763 Surat Pernyataan Pelimpahan Hak Cipta dan Keaslian Karya Tulis Yang bertanda tangan di bawah ini: Nama NIM : Indira Lanti K : 20505003 Menyatakan bahwa Penulis Tesis dengan judul: Studi Pendahuluan Gen Pengkode Lumbrokinase Dari Cacing Tanah Lumbricus rubellus Di bawah bimbingan Zeily Nurachman D.Sc dan Dr. Dessy Natalia. Adalah benar-benar tesis tersebut hasil karya tulis berdasarkan data eksperimen perhitungan/permodelan Penulis selama melakukan Tugas Akhir Magister di Program Studi Kimia ITB. Bandung, 6 Mei 2008 Indira Lanti K ABSTRAK STUDI PENDAHULUAN GEN PENGODE LUMBROKINASE DARI CACING TANAH Lumbricus rubellus Oleh Indira Lanti Kayaputri 20505003 Cacing tanah Lumbricus rubellus (Red Word) sejak zaman dahulu banyak digunakan sebagai obat tradisional untuk mengobati stroke. Lumbrokinase yang diproduksi oleh cacing tanah spesies L. rubellus memiliki aktifitas fibrinolitik. Lumbrokinase terbagi menjadi enam kelompok, yaitu F-III-2, F-III-1, F-II, F-I-2, F-I-1, and F-I-0. Enzim yang memiliki aktivitas fibrinolitik dengan aktivitas mirip protease serin, yaitu kelompok F-III. Adapun karakterisitik dari enzim ini, yaitu stabil pada suhu 60oC dan memiliki rentang pH antara 2 dan 11. Cacing tanah spesies L. rubellus sangat bermanfaat bagi manusia. Namun perlu diperhatikan pula, jumlah produksi lumbrokinase dari setiap ekor cacing tanah sangat terbatas, sehingga diperlukan teknik khusus untuk meningkatkan jumlah produksi lumbrokinase, seperti teknik DNA rekombinan. Tujuan dari penelitian ini, adalah untuk mengisolasi gen lumbrokinase dari L. rubellus galur lokal untuk ditentukan urutan nukleotidanya. Dalam penelitian ini, telah diisolasi RNA total, mRNA, dan DNA kromosom dari L rubellus galur lokal. Kemudian, DNA dan RNA yang dihasilkan digunakan sebagai templat dalam proses PCR dan RT-PCR sehingga dapat dihasilkan DNA dan cDNA yang mengode gen lumbrokinase. Primer yang digunakan merupakan hasil perancangan dengan menggunakan urutan nukleotida yang telah dipublikasikan dengan nomor akses AF304199, ABO45719, dan ABO45720 yang diperoleh dari Gene Bank. Program yang digunakan pada perancangan primer, yaitu Clustal X, DNA Star, dan Gene Doc program Primer Select serta Edit Seq. Proses amplifikasi menggunakan metode PCR dan RT-PCR menghasilkan fragmen DNA berukuran sekitar 300 pb. Hasil produk amplifikasi yang diharapkan, yaitu sekitar 500 sampai 800 pb. Elektroforegram urutan nukleotida menunjukkan bahwa produk PCR merupakan campuran fragmen DNA. Hasil ini menunjukkan bahwa rancangan primer tidak menempel secara spesifik pada gen target lumbrokinase. Pada masa yang akan datang, sangat diperlukan perancangan degenerate primer berdasarkan residu asam amino dari lumbrokinase yang diperoleh dari L. rubellus galur lokal. Kata kunci: Lumbricus rubellus, lumbrokinase, mRNA, DNA kromosom, RTPCR, PCR i ABSTRACT PRELIMINARY STUDY OF LUMBROKINASE GENE FROM EARTHWORM Lumbricus rubellus By Indira Lanti Kayaputri 20505003 Earthworm Lumbricus rubellus (Red Worm) has been used as a traditional medicine for combating stroke. Lumbrokinase produced by earthworm species of L. rubellus shows fibrinolytic activity. Lumbrokinase consists of 6 (six) cluster, which are defined as F-III-2, F-III-1, F-II, F-I-2, F-I-1, and F-I-0. The enzyme possessing serine-like-protease activity is F-III cluster. The F-III cluster are stable at 60oC and has wide range of pH between 2 and 11. Earthworm species of L. rubellus is very useful for human being. However it should be noticed that the amount of lumbrokinase produced from each worm is very limited, hence special technique for increasing the amount of protein, such as recombinant DNA technique, is required. The aim of the research was to isolate lumbrokinase gene from local L. rubellus and to determine its nucleotide sequence. Total RNA, mRNA, and chromosomal DNA of L. rubellus have been isolated. The resulted DNA and RNA were the used as templates in PCR and RT-PCR process to produce DNA and cDNA coding lumbrokinase gene. The primers used were designed based on published sequences with accession numbers of AF304199, ABO45719, and ABO45720 obtained from Gene Bank. Clustal X, DNA Star, and Gene Doc program Primer Select, Edit Seq, and Seqman, were used in the primer design. Amplification process using PCR and RT-PCR methods produced DNA fragments with the size of about 300 bp. The expected size of the amplified product was between 500 and 800 bp. Electrophoregram of nucleotide sequencing analysis showed that the PCR products were a mixture of DNA fragments. These results indicate that the designed primers could not bind specifically to the targeted lumbrokinase gene. In the future it is necessary to design a degenerate primer based on amino acid residues of lumbrokinase purified from local L. rubellus. Keywords : Lumbricus rubellus, lumbrokinase, mRNA, chromosomal DNA, RTPCR, PCR ii PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS Tesis S2 yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya. Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin Dekan Sekolah Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung. iii KATA PENGANTAR Dengan memanjatkan puji dan syukur kehadirat Illahi, atas berkat rahmat dan karunia-Nya, penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul ”Isolasi dan Penentuan urutan Gen Pengode Lumbrokinase dari Cacing Tanah Lumbricus rubellus”, sebagai syarat dalam meraih gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Bapak Zeily Nurachman D.Sc, atas segala bimbingan dan masukkannya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini. Kepada Ibu Dr. Dessy Natalia, sebagai Ketua Program Studi Magister Kimia Institut Teknologi Bandung yang telah memberikan waktu untuk penulis, juga atas segala bimbingan dan masukannya. Ucapan terima kasih juga disampaikan sebesar-besarnya kepada: 1. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Dr. Akhmaloka sekaligus sebagai Dosen Wali penulis pada semester 1 dan 2, atas segala bimbingannya. 2. Ketua Program Studi S1 Kimia Institut Teknologi Bandung Dr. Indra Noviandri. 3. Seluruh staf pengajar Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung, atas segala bimbingannya dan masukannya. 4. Bu Sony, Bu Tini, Pak Handi, Pak Wandi, dan Pak Aep, serta seluruh staf administrasi Program Studi Institut Teknologi Bandung 5. Bapak Dwi Cipto B M.Si dan Bapak Hermawan M.Si, sebagai dosen penulis ketika menempuh kuliah di jurusan Teknologi Hasil Ternak Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran 6. Pak Yayat, Pak Edi, Pak Dadan, dan Bu Eshar atas segala bantuannya. 7. Papa, Mama, dan adik-adik tercinta atas doa, semangat, dan dukungannya. iv 8. Teman-teman Magister Kimia Angkatan 2005, terima kasih buat kebersamaannya. 9. Teman-teman seperguruan. Dyah, Mba Dini, Frisda, Anggi, Dian, Syifa, Edo, Iman, Ferra. 10. Elfira, Puti, dan Anton, teman seperjuangan Biokimia 2005. 11. Dwita, Rina, Teh Neneng, Tina, Uciek, terima kasih selalu menemani saat suka duka di laboratorium. 12. Teman-teman laboratorium Biokimia, Bu Prima, Bu, Hira, Bu Fernita, Bu Ati, Bu Lulus, Bu Heni, Bu Puspa, Bu Vera, Bu Santi, Pak Savante, Pak Tanto, Pak Purkan, Muchtar, Tunjung, Bambang, Dea, Mira, Sisi, Keni, Ana, Iman, Belinda, Septin, Edu, Ogi, Ryan. 13. Anitya, Atin, Danang, Ela, Lusy, dan Adhitya. Terima kasih buat dukungan dan semangatnya. Beribu terima kasih, penulis ucapkan atas segala masukan, dukungan, semangat, dan bantuannya, sungguh merupakan sesuatu yang tak ternilai. Mohon maaf apabila tidak disebutkan satu - persatu karena keterbatasan tempat. Namun sekali lagi penulis ucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya, semoga mendapat balasan yang setimpal dari Allah SWT. Bandung, Mei 2008 Hormat, Penulis v DAFTAR ISI ABSTRAK ............................................................................................................ i ABSTRACT ......................................................................................................... ii PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS................................................................... iii KATA PENGANTAR .......................................................................................... iv DAFTAR ISI ......................................................................................................... vi DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ viii DAFTAR TABEL ................................................................................................. ix DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... x DAFTAR SINGKATAN DAN ISTILAH ............................................................ xi Bab I Pendahuluan ............................................................................................. 1 I.1 Latar Belakang .......................................................................................... 1 I.2 Rumusan Masalah ..................................................................................... 2 I.3 Maksud dan Tujuan Penelitian ................................................................. 2 I.4 Metode Penelitian ..................................................................................... 3 I.5 Sistematika Penulisan ............................................................................... 3 Bab II Tinjauan Pustaka ....................................................................................... 4 II.1 Stroke ....................................................................................................... 4 II.2 Pembekuan Darah.................................................................................... 6 II.3 Cacing Tanah L. rubellus ........................................................................ 7 II.3.1 Anatomi dan Taksonomi ...................................................................... 7 II.3.2 Lumbrokinase ....................................................................................... 8 II.3.3 Aktifitas L. Rubellus dalam Perombakan Bahan Organik ....................11 II.4 Deoxyribonucleic Acid (DNA) ...............................................................12 II.5 Ribonucleic Acid (RNA) ........................................................................13 II.6 Mekanisme Transkripsi dan Translasi ....................................................15 II.7 Metode Polymerase Chain Reaction ......................................................17 Bab III Bahan dan Metode ..................................................................................20 III.1 Bahan penelitian .....................................................................................20 III.2 Alat Penelitian ........................................................................................20 III.3 Metode Penelitian..................................................................................21 vi III.3.1 Perancangan Primer ...........................................................................21 III.3.2 Persiapan Sampel Cacing Tanah L. Rubellus ....................................21 III.3.3 Isolasi RNA Total ..............................................................................22 III.3.4 Isolasi mRNA .....................................................................................22 III.3.5 Isolasi DNA Kromosom.....................................................................23 III.3.6 Proses PCR .........................................................................................24 III.3.7 Penentuan Urutan ...............................................................................24 Bab IV Hasil dan Pembahasan ...........................................................................25 IV.1. Penanaman Cacing ...............................................................................25 IV.2 Perancangan Primer ..............................................................................27 IV.3 Isolasi RNA Total .................................................................................28 IV.4 Isolasi mRNA .......................................................................................29 IV.5 Isolasi DNA Kromosom .......................................................................30 IV.6 Amplifikasi Gen Lumbrokinase dengan Berbagai Templat .................31 IV.7 Penentuan Urutan Hasil Amplifikasi Gen Lumbrokinase ....................34 Bab V Kesimpulan dan Saran .............................................................................36 V.1 Kesimpulan ............................................................................................36 V.2 Saran .......................................................................................................36 DAFTAR PUSTAKA ...........................................................................................37 LAMPIRAN ..........................................................................................................39 vii DAFTAR GAMBAR Gambar II.1 Mekanisme Pembentukkan Fiber dari Monomer Fibrin ............. 7 Gambar II.2 Cacing tanah Lumbricus rubellus ............................................... 9 Gambar II.3 Struktur DNA dan basa penyusun DNA ..................................... 13 Gambar II.4 Struktur RNA dan basa penyusun RNA...................................... 14 Gambar II.5 Mekanisme pada proses transkripsi ............................................ 16 Gambar II.6 Mekanisme pada proses translasi ................................................ 17 Gambar II.7 Aktifitas yang terjadi pada proses PCR ...................................... 18 Gambar IV.1 Perkembangbiakan cacing tanah ................................................. 26 Gambar IV.2 Daerah perancangan primer maju dan mundur ........................... 28 Gambar IV.3 Hasil isolasi RNA total menggunakan penanda pUC19/Hinf1... 29 Gambar IV.4 Hasil elektroforesis DNA kromosom menggunakan marker DNAλ/ Hind III ........................................................................... 30 Gambar IV.5 Elektroforesis amplifikasi gen pengode lumbrokinase dengan menggunakan templat RNA total dan mRNA ............................ 31 Gambar IV.6 Elektroforesis amplifikasi gen pengode lumbrokinase dengan menggunakan templat DNA kromosom primer FL1 .................. 33 Gambar IV.7 Elektroforesis amplifikasi gen pengode lumbrokinase dengan menggunakan templat DNA kromosom primer ZN1.................. 34 viii DAFTAR TABEL Tabel IV.1 Variasi Suhu RT-PCR ................................................................. 43 Tabel IV.2 Variasi Suhu PCR ....................................................................... 44 ix DAFTAR LAMPIRAN Lampiran A Hasil penjajaran database gen pengode lumbrokinase ................ 39 Lampiran B Kurva kalibrasi penentuan urutan basa DNA gen pengode lumbrokinase ............................................................................... 41 Lampiran C Penentuan urutan cDNA gen pengode lumbrokinase menggunakan primer ZN1 .......................................................... 42 Lampiran D Penentuan urutan cDNA gen pengode lumbrokinase menggunakan primer FL1 ........................................................... 44 x DAFTAR SINGKATAN DAN ISTILAH Singkatan Pertama kali digunakan halaman DNA Deoxyribonucleic Acid 2 mRNA messenger Ribonucleic Acid 2 PCR Polymerase Chain Reaction 2 RNA Ribonucleic Acid 2 RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain reaction 2 t-PA tissue Plasminogen Activator 6 tRNA transfer Ribonucleic Acid 14 rRNA ribosom Ribonucleic Acid 14 xi
