MIKROBIOLOGI UMUM

MIKROBIOLOGI UMUM
SKS : 3 ( 2 – 3 )
Deskripsi Matakuliah :
Mempelajari sejarah mikrobiologi, struktur mikroorganisme, penggolongan
dan karakteristik umum mikroorganisme, nutrisi, metabolisme, genetik dan mikroskopi.
Sifat-sifat virus, bakteri , kapang, kamir, protozoa dan parasit. Perkembangan
mikrobiologi dalam hubungannya dengan pertanian, lingkungan, kesehatan dan
bioteknologi.
OUTLINE PERKULIAHAN
1. Pedahuluan, membahas sejarah dan perkembangan mikrobiologi, kedudukan
mikroorganisme di alam, sel dan strukturnya, sel prokariotik dan sel eukariotik,
dan mikroskop.
2. Biosintesa makromolekul, metabolisme energi, genetika mikroorganisme dan
pertumbuhan mikroorganisme
3. Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan, sterilisasi dan desinfeksi
4. Bakteri : Struktur sel bakteri, pewarnaan bakteri, klasifikasi dan identifikasi,dan
pertumbuhan bakteri.
5. Kapang : Sifat-sifat dan fisiologi kapang, klassifikasi kapang, penggunaan kapang
dalam industri.
6. Kamir : Morfologi kamir, sistem reproduksi kamir, sifat-safat fisiologi kamir dan
penggunaan kamir dalam industri pangan.
7. Virus : Penyebaran dal struktur, virus bakteri ( bakteriofag ), multiplikasi fag
virulen ( siklus litik ), perkembangan fag temperenter ( lisogeni ).
8. Mikroorganisme dan lingkungan
1
PENDAHULUAN
Mikrobiologi adalah suatu ilmu yang mempelajari kehidupan makhluk hidup
yang bersifat mikroskopik yang disebut mikroorganisme atau jasad renik, yaitu makhluk
yang mempunyai ukuran sangat kecil dimana setiap selnya hanya dapat dilihat dengan
pertolongan mikroskop. Mikrobiologi merupakan salah satu cabang ilmu dalam biologi.
Banyak cabang ilmu lain yang bersifat terapan yang memerlukan pengetahuan dasar
mikrobiologi. Pada saat ini dengan kemajuan yang pesat dalam ilmu dan teknologi,
terutama dalam era laju pengetahuan bioteknologi, mikrobiologi yang bersifat dasar
sangat diperlukan sebagai ilmu penunjang.
Mikrobiologi seperti juga ilmu pengetahuan lainnya diawali oleh rasa ingin
tahu mengenai sifat serta aktivitas mikroorganisme. Pada mulanya mikroorganisme
dianggap tidak perlu dipelajari oleh karena ukurannya sangat kecil.
Dalam teknologi pangan, mikrobiologi merupakan ilmu yang sangat penting,
misalnya dalam hubungannya dengan kerusakan atau kebusukan makanan, sehingga
dapat diketahui tindakan pencegahan atau pengawetan yang paling tepat untuk
menghindari terjadinya kerusakan tersebut. Disamping itu mikrobiologi juga penting
dalam fermentasi makanan, sanitasi, pengawasan mutu pangan, dan sebagainya. Adanya
mikroorganisme dalam makanan mungkin tidak diingikan jika mikroorganisme tersebut
dapat menyebabkan keracunan bagi yang mengkonsumsinya. Tetapi dalam fermentasi
makanan dan minuman, pertumbuhan mikroorganisme justri dirangsang untuk mengubah
komponen-komponen di dalam bahan pangan tersebut menjadi produk-produk yang
diinginkan.
Sejarah mikrobiologi dimulai tahun 1674 ketika Anton van Leewenhoek
(1632 – 1723 ) menemukan adanya kehidupan dalam setetes air air danau yang diamati
dengan menggunakan lensa gelas . Benda-benda yang diamati tersebut disebut dengan
animalculs terlihat dalam berbagai bentuk, ukuran dan warna. Leweenhoek kemudian
mengamati adanya makhluk hidup pada berbagai lainnya menggunakan mikroskop
sederhana yang diciptakannya, dan menyimpulkan bahwa sel-sel hidup selalu berasal dari
benih ( germ ).
Pada mulanya penyakit diperkirakan disebabkan oleh bencana alam seperti
banjir atau gempa bumi . Penelitian Pasteur yang melibatkan mikroorganisme dalam
proses fermentasi dan pembusukan mengilhami seorang ahli bedah Inggris yaitu Lister.
Pengaruh Pasteur terlihat dari tata cara Lister dalam proses pembedahan, yang kemudian
dikenal dengan teknik aseptik, yaitu, strelisasi panas dari alat bedah, penggunaan asam
karbol ( fenol ) pada bekas luka.
2
SEL PROKARIOT DAN EUKARIOT
Makhluk hidup dapat dibedakan atas tiga kategori yaitu , tanaman, hewan dan
protista. Pada tanaman dan hewan setiap sel tidak dapat berfungsi secara terpisah tetapi
merupakan unit terkecil dari suatu organisme multiselluler. Yang termasuk organisme
protista adalah semua makhluk hidup yang tidak tergolong hewan dan tumbuhan, yang
dapat dibedakan atas dua kelompok yaitu, protista tingkat rendah atau prokariot, dan
protista tingkat tinggi atau eukariot. Organisme yang tergolong dalam prokariot dan
eukariot adalah sebagai berikut :
1. Protista rendah ( prokariot )
Bakteri
Riickettsia da Chlamydia
Mikoplasma
Ganggang biru-hijau
2. Protista tinggi ( eukariotik )
Fungi (kapang, kamir, jamur )
Ganggang
Protozoa
Virus tidak digolongkan ke dalam salah satu kelompok di atas karena tidak
mempunyai ciri-ciri yang dapat dikategorikan sebagai sel pada umumnya. Suatu partikel
virus merupakan struktur yang bersifat statis, stabil, dan tidak dapat melakukan
metabolisme maupun biosintesa. Virus baru dapat digunakan sebagai makhluk hidup jika
terdapat di dalam sel organisme inang tersebut yang melakukan proses metabolisme yang
diperlukan virus untuk memperbanyak diri. Dalam keadaan ini virus digolongkan dalam
kelompok protista.
Mikroorganisme yang penting dalam mikrobiologi pangan adalah yang
tergolong dalam bakteri, kapang dan kamir.
Perbedaan sel prokariot dan eukariot
Perbedaan penting antara sel prokariot dan eukariot adalah dalam struktur inti
selnya. Kata eukariot berasal dari bahasa Latin eu yang bereti sejati, dan karyo, yaitu
keseluruhan inti sel. Oleh karena itu sel yang tergolong eukariot mempunyai inti sel
( nukleus ) yang dikelilingi membran inti dimana di dalamnya terdapat kromosom yang
mengandung komponen keturunan. Sbaliknya sel prokariot tidak mempunyai inti sel
sejati, dan komponen keturunannya terdapat di dalam molekul DNA tunggal atau
kromosom yang letaknya bebas di dalam sitoplasma.
MIKROSKOP
Mikroskop pertama sekali ditemukan oleh Antony van Leewenhoek pada
tahun 1675, dan juga merupakan orang yang pertama sekali melihat bakteri dengan
menggunakan alat ini. Sebelum penemuan Leeuwenhoek sebenarnya telah ada beberapa
ilmuwan yang menemukan sistem pembesaran, diantaranya Rogen Bacon ( 1214 – 1294 )
yang pertama kali membuat lensa sederhana untuk melihat benda-benda yang berukuran
kecil, dan juga ada beberapa peneliti lain.
3
Mikroskop dapat dibedakan atas beberapa jenis, tetapi mekanisme bekerjanya
pada prinsipnya sama, yaitu terdiri dari, sistem optik atau sistem perbesaran, dan sistem
iluminasi yang menyebabkan terlihatnya suatu objek.
METABOLISME ENERGI
Seperti halnya organisme lain, mikroorganisme memerlukan energi untuk
kelangsungan hidupnya. Energi diperlukan oleh mikroorganisme untuk berbagai kegiatan,
yaitu: 1. mempertahankan kehidupan sel, 2. pertumbuhan dan perkembang biakan sel, 3.
untuk pergerakan pada mikroorganisme yang bersifat motil.
Sumber energi
Berdasarkan sumber energi yang digunakan mikroorganisme dapat dibedakan
atas dua grup yaitu :
1. Organisme fototrof, yaitu organisme yang menggunakan sinar matahari untuk
menghasilkan energi . Berdasarkan sumber karbon yang digunakan, organisme
fototrof dibedakan lagi sebagai berikut :
 Organisme fotoototrof, yaitu mikroorganisme yang sumber energi dari
matahari dan sumber karbon dari CO2 , contoh tanaman
 Organisme fotoheterotrof, yaitu mikroorganisme yang sumber energi
dari matahari dan sumber karbon dari senyawa-senyawa organik, contoh
ganggang hijau biru
2. Organisme kimotrof, yaitu organisme yang menggunakan senyawa kimia untuk
menghasilkan energi. Berdasarkan sumber karbon yang digunakan, organisme
kimotrof dapat dibedakan lagi sebagai berikut :
 Organisme kimoototrof, yaitu organisme yang menggunakan senyawa
kimia sebagai sumber energi dan CO2 sebagai sumber karbon.
 Organisme kimoheterotrof , yaitu organisme yang menggunakan
senyawa kimia sebagai sumber energi dan senyawa organik sebagai
sumber karbon, contoh hewan, protozoa, fungi, bakteri.
Reaksi respirasi dan fermentasi adalah reaksi yang menunjukkan perbedaan
dalam aseptor hidrogen ( penerima elektron ). Respirasi adalah reaksi oksidasi yang
menggunakan senyawa anorganik sebagai oksidan ( penerima elektron ), sedangkan
fermentasi adalah reaksi oksidasi yang menggunakan senyawa organik baik sebagai
oksidan maupun sebagai reduktan ( donor elekteron ). Mikroorganisme yang biasanya
tumbuh dalam makanan adalah umumnya bersifat kimoorganotrof, dimana sebagai
sumber energi dan sumber karbon digunakan senyawa organik.
4
Respirasi
Respirasi adalah reaksi yang menggunakan senyawa anorganik dan senyawa
organik sebagai donor elektron dan senyawa anorganik sebagai aseptor elektron.
Respirasi yang menggunakan oksigen sebagai penerima elektron disebur sebagai respirasi
aerobik , sedangkan yang menggunakan senyawa anorganik sebagai penerima elektron
disebut respirasi anaerobik.
Fermetasi
Fermentasi sering didefenisikan sebagai proses pemecahan karbohidrat dan
asam amino secara anaerobik, yaitu tanpa memerlukan oksigen. Senyawa yang dapat
dipecah dalam proses fermentasi terutama adalah karbohidrat, sedangkan asam amino
hanya dapat difermentasi oleh beberapa jenis bakteri tertentu.
Fermentasi karbohidrat
Karbohidrat merupakan substrat utama yang dipecah dalam proses fermentasi.
Polisakarida terlebih dahulu dipecah menjadi gula-gula sederhana sebelumdifermentasi,
misalnya hidrolisa pati menjadi unit – unit glukosa. Glukosa kemudian dipecah menjadi
senyawa lain tergantung dari jenis fermentasinya.
Pada bakteri paling sedikit terdapat tujuh proses fermentasi yang berbeda
terhadap glukosa. Masing-masing proses menghasilkan produk-produk yang berbeda, dan
masing-masing spesifik terhadap grup bakteri tertentu.
Fermentasi glukosa pada prinsipnya terdiri dari dua tahap yaitu:
1. Pemecahan rantai karbon dari glukosa dan pelepasan paling sedikit dua pasang
atom hidrogen, menghasilkan senyawa karbon lainnya yang lebih teroksidasi
daripada glukosa.
2. Senyawa yang teroksidasi tersebut direduksi kembali oleh atom hidrogen yang
dilepaskan tahap pertama, membentuk senyawa lain sebagai hasil fermentasi.
Reaksi oksidasi tidak dapat berlangsung tanpa reaksi reduksi yang seimbang, oleh
karena itu jumlah atom hidrogen yang dilepaskan dalam tahap pertama fermentasi
selalu seimbang dengan jumlah yang digunakan tahap kedua.
Dalam tahap pertama fermentasi glukosa selalu terbentu asam piruvat. Pada
mikroorganisme dikenal paling sedikit empat jalur pemecahan glukosa menjadi asam
piruvat, yaitu ;
1. Jalur Embden- Meyerhof_Parnas ( EMP ) atau glikolisa, ditemukan pada fungi
dan kebanyakan bakteri, serta pada hewan dan manusia.
2. Jalur Entner-Duodoroff ( ED ), hanya ditemukan pada beberapa bakteri.
3. Jalur Heksosamonofosfat ( HMF ) , ditemukan pada berbagai organisme
4. Jalur Fosfoketolase ( FK ) , hanya ditemukan pada bakteri yang tergolong
laktobasii heterofermentatif.
5
BIOSINTESA MAKROMOLEKUL
Mikroorganisme yang memegang peranan penting dalam mikrobiologi
pangan terutama adalah yang tergolong kimoorganotrof, karena mikroorganisme
tersebut menggunakan senyawa organik yang terdapat di dalam bahan pangan. Beberapa
bakteri patogen bahkan tidak dapat mensintesa vitamin, purin maupun pirimidin sehingga
harus memperoleh unsur-unsur tersebut dari substrat atau bahan pangan tempat tubuhnya.
Untuk menumbuhkan bakteri patogen tersebut di dalam medium laboratorium, kedalam
medium harus ditambahkan bahan-bahan yang mengandung unsur-unsur tersebut,
misalnya darah, ekstrak sapi, atau ekstrak kamir.
Komposisi makromolekul
Sel mikroorganisme mengandung senyawa-senyawa penyusun sel seperti
protein, asam nukleat, karbohidrat dan sebagainya. Komponen yang terbanyak jumlahnya
adalah air, yaitu mencapai kira-kira 70% pada sel bakteri atau mungkin lebih tinggi. Kirakira setengah dari bagian padatan sel atau kira-kira 15% dari berat sel adalah protein.
Sebagian dari protein tersebut merupakan enzim, yaitu biokatalis yang berperan dalam
metabolisme energi dan biosintesa.
Senyawa-senyawa makromolekul di dalam sel pada umumnya berupa
polimer yang terdiri dari unit-unit yang lebih kecil, dimana unit-unit tersebut terbentuk
dari unsur-unsur yang diperoleh dari katabolisme senyawa-senyawa yang terdapat di
dalam substrat tempat tumbuhnya
Proses biosintesa makromolekul pada prinsipnya terdiri dari dua tahap utama,
yaitu :
1. Biosintesa unit-unit makromolekul seperti asam amino, asam lemak, gula
(monosakarida), nukleosida dan nukleotida, menggunakan ATP dan senyawa
tereduksi yaitu NADH2 atau NADPH2 yang diproduksi dalam proses katabolisme.
2. Biosintesa makromolekul dari unit-unit monomer, menghasilkan makromolekul
seperti protein, lemak, polisakarida dan asam nukleat. Dalam tahap kedua ini
masih dibuthkan energi dalam bentuk ATP dan senyawa tereduksi yaitu NADH2
atau NADPH2.
Genetika mikroorganisme
Sifat-sifat yang terdapat pada mikroorganisme dipengaruhi oleh dua faktor
yaitu :
1. Faktor genetika yang dipengaruhi oleh sifat-sifat gennya
2. Faktor lingkungan disekitar tempat hidupnya.
Sifat-sifat mikroorganisme yang disebabkan oleh sifat-sifat gen yang terdapat di dalam
kromosom (genom) disebut genotip, sedangkan sifat-sifat yang timbul karena pengaruh
lingkungan disebut fenotipe.
Variasi genetika yang timbul di dalam mikroorganisme dapat disebabkan
mutasi. Mutasi adalah perubahan di dalam gen yang berakibat perubahan morfologi dan
6
biokimia di dalam sel. Mutasi pada sel mikroorganisme dapat terjadi secara spontan atau
dengan pemberian suatu gen yaitu komponen yang bersifat mutagenik.
Mutasi dapat menyebabkan perubahan sifat-sifat dan morfologi
mikroorganisme, misalnya pembentukan kapsul, flagella, ukuran sel, kemampuan untuk
membentuk spora, pembentukan pigmen, pergerakan (motilitas), sifat-sifat biokimia, sifat
antigenik, kemampuan memproduksi toksin, dan ketahanan terhadap obat dan virus.
Pemindahan DNA pada bakteri
Bakteri mempunyai beberapa cara untuk memindahkan DNA yang berakibat
terjadinya rekombinasi genetika antara satu sel dengan sel lainnya. Karena mekanisme
pemindahan DNA yang unik ini, sel bakteri banyak digunakan dalam penelitian genetika
molekuler. Proses pemindahan DNA pada bakteri dapat dilakukan melalui satu atau dua
cara daru tiga cara sebagai berikut : transformasi, transduksi, dan konjugasi.
Transformasi
Transformasi adalah pemindahan sifat-sifat dari satu mikroorganisme ke
mikroorganisme lainnya melalui bagian-bagian DNA tertentu dari mikroorganisme yang
pertama.
Transduksi
Transduksi adalah pemindahan DNA dari satu bakteri ke bakteri lainnya
dengan pertolongan virus yang disebut temperate phage. Beberapa sifat biokimia dan
antigenik dapat dipindahkan melalui transduksi diantara galur-galur bakteri yang terdekat.
Sebagai contoh ketahanan terhadap berbagai obat atau antibiotik pada stapilokoki dapat
dipindahkan melalui transduksi.
Konyugasi
Beberapa bakteri termasuk Escherichia coli dan bakteri enterik gram negatif
mempunyai struktur genetika yang melakukan replikasi dan berfungsi tanpa tergantung
pada kromosoma. Struktur ini disebut plasmid dan dapat dipindahkan dari satu sel ke sel
lainnya melalui konyugasi atau transduksi. Plasmid bukan merupakan struktur yang
harus ada di dalam sel, dan kadang-kadang dapat hilang selama pertumbuhan.
Selama konyugasi, plasmid dapat dipindahkan dari satu sel ke sel lainnya
melalui suatu pilus yang disebut pilus seks atau pilus F. Plasmid yang dipindahkan
dengan cara ini mempunyai gen yang dapat memulai pembentukan pilus dan terdiri dari
beberapa plasmid yang disebut plasmid kesuburan (F), plasmid kolisinokogenik (Kol)
dan plasmid pembawa sifat ketahanan terhadap antibiotik (R).
Pertumbuhan bakteri
Pertumbuhan di seringkali dinyatakan secara singkat sebagai kemampuan
untuk menghasilkan 2 sel baru dan hidup. Sel dinyatakan hidup bila menghasilkan sel
baru.
Bakteri berkembang biak dengan cara pembelahan diri yang disebut
pembelahan biner, yaitu perkembangan biak dari 1 sel induk menjadi 2 sel anak. Bakteri
7
yang tidak memiliki dinding sel seperti Mycoplasma berkembang biak secara aseksual
melalui pertunasan (budding).
Siklus Pertumbuhan Sel
Pertumbuhan sel prokariot berjalsn secara geometrik. Ini berarti bahwa
pembelahan sel terlihat sebagai berikut :
1----2----4----8----16----32----64----128----256----n
20---21---22---23---24----25-----26-----27------28-----2n
Oleh karena jumlah sel merupakan fungsi dari 2, maka akan lebih baik bila
pertumbuhan sel digambarkan dengan sumbu Y dalam skala log. Jika kemudian sumbu X
adalah waktu yang diperlukan untuk menghasilkan jumlah sel, maka akan dihasilkan
suatu garis lurus.
Kurva pertumbuhan bakteri
Jika bakteri dipindahkan ke dalam biakan kaldu segar maka pertumbuhan
bakteri memperlihatkan ciri seperti terlihat pada gambar berikut.
Fase adaptasi
Kurun waktu ini merupakan penyesuaian bakteri ke suatu lingkungan baru.
Pada fase ini tidak ada kenaikan jumlah sel, melainkan peningkatan ukuran atau besar sel.
Peningkatan juga terlihat pada protein sel, DNA, dan metabolisme.
Peningkatan metabolisme ini penting bagi penyesuaian sel bakteri yang harus
menyesuaikan diri dengan pH atau kekeuatan megoksidasi reduksikan media biakan.
Lamanya fase ini bervariasi, dapat cepat atau lambat tergantung dari kecepatan
penyesuaian diri dengan lingkungan sekitarnya.
Lamanya fase adaptasi dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain:
1. Medium dan lingkungan pertumbuhan
2. Jumlah inokulum. Jumlah sel awal yang semakin tinggi akan mempercepat fase
adaptasi
Fase pertumbuhan awal
Setelah mengalami fase adaptasi, sel mulai membelah dengan kecepatan yang
masih rendah karena baru selesai tahap penyesuaian diri
Fase pertumbuhan logaritmik
Pada fase ini sel membelah dengan kecepatan yang konstan, dimana
pertambahan jumlahnya mengikuti pertumbuhan logaritmik. Pada fase ini pertumbuhan
sangat dipengaruhi medium tempat tumbuhnya seperti pH dan kandungan nutrien, juga
kondisi lingkungan termasuk suhu dan kelembaban udara. Pada fase ini sel membutuhkan
energi lebih banyak dibandingkan dengan fase lainnya, selain itu sel sensitif terhadap
keadaan lingkungan.
8
Fase pertumbuhan lambat
Pada fase ini pertumbuhan populasi mikroorganisme diperlambat karena
beberapa sebab, misalnya :
1. zat nutrisi di dalam medium sudah sangat berkurang
2. adanya hasil-hasil metabolisme yang mungkin beracun atau dapat menghambat
pertumbuhan mikroorganisme. Pada fase ini pertumbuhan sel tidak stabil, tetapi
jumlah populasi masih naik karena jumlah sel yang tumbuh masih lebih banyak
daripada jumlah sel yang mati
Fase pertumbuhan tetap (statis)
Pada fase ini jumlah populasi sel tetap karena jumlah sel yang tumbuh sama
dengan jumlah sel yang mati. Ukuran sel pada fase ini menjadi lebih kecil karena sel
tetap membelah meskipun zat nutrisi sudah mulai habis. Karena kekurangan zat nutrisi
sel kemungkinan mempunyai komposisi yang berbeda dengan sel yang tumbuh pada fase
logaritmik. Pada fase ini sel-sel menjadi lebih tahan terhadap keadaan ekstrim seperti
panas, dingin, radiasi dan bahan kimia.
Fase menuju kematian dan fase kematian
Pada fase ini sebahagian populasi mikroorganisme mulai mengalami
kematian karena beberapa sebab yaitu:
1. nutrien di dalam medium sudah habis
2. energi cadangan di dalam sel habis
Jumlah sel yang mati semakin lama akan semakin banyak, dan kecepatan kematian
dipengaruhi kondisi nutrien, lingkungan, dan jenis mikroorganisme.
Nutrien mikroorganisme
Pertumbuhan mikroorganisme tergantung dari tersedianya air. Bahan-bahan
yang terlarut dalam air, yang digunakan mikroorganisme untuk membentuk bahan sel dan
memperoleh energi adalah bahan makanan. Tuntutan berbagai mikroorganisme yang
menyangkut susunan larutan makanan dan persyaratan lingkungan tertentu sangat
berbeda-beda. Oleh karena itu diperkenalkan banyak resep untuk membuat media biak
untuk mikroorganisme. Pada dasarnya sesuatu larutan biak sekurang-kurangnya harus
tersedia semua unsur yang ikut serta pada pembentukan bahan sel dalam bentuk berbagai
senyawa yang dapat diolah.
Kebutuhan nutrien pokok
Melihat susunan kimia sel, unsur-unsur dapat dibedakan dalam dua kelompok,
yaitu 10 unsur makro, karbon, oksigen hidrogen, nitrogen, belerang, fosfor, kalium,
kalsium, magnesium, besi (C, O, H, N,S, P, K, Ca, Mg, Fe) yang terkandung dalam
semua organisme dan unsur-unsur mikro atau unsur-unsur yang dibutuhkan dalam jumlah
kecil seperti mangan, molibden, seng, tembaga, kobalt, nikel, vanadium, brom, khlor,
natrium, selenium, silika, wolfram dan lain-lain yang tidak diperlukan semua organisme.
Sebagian besar unsur ditambahkan ke dalam medium dalam bentuk garam.
9
Sumber-sumber karbon dan energi
Bila energi berasal dari bahan kimia maka organisme bersifat kemotrofik,
sedangkan bila energi berasal dari sinar cahaya disebut fototrofik. Bila CO2 digunakan
sebagai satu-satunya sumber karbon maka organisme disebut ototrofik. Bila sumber
karbon adalah senyawa organik disebut heterotrofik
Zat-zat pelengkap
Beberapa organisme membutuhkan zat-zat tertentu disamping mineralmineral, sumber-sumber karbon dan energi untuk makanannya, yang disebut dengan zat
pelengkap atau suplemen. Ini menyangkut zat-zat yang termasuk komponen dasar sel dan
yang oleh beberapa mikroorganisme yang tidak dapat disintesa dari komponenkomponen sederhana. Termasuk dalam kelompok ini antara lain adalah : asam-asam
amino, senyawa purin, senyawa pirimidin dan vitamin-vitamin. Senyawa purin, senyawa
pirimidin dan asam amino merupakan bahagian dari protein dan asam nukleat dan oleh
sel diperlukan dalam jumlah yang sesuai, sebaliknya vitamin-vitamin merupakan bagian
dari koenzim-koenzim dan gugus prostetik, jadi merupakan bagian dari fungsi enzimatik
katalitik dan digunakan dalam jumlah kecil.
Pembiakan bakteri dalam laboratorium
Bila suatu media diketahui komposisi medianya secara terinci, maka media
tersebut disebut media sintetik. Mikroorganisme ototrof dapat tumbuh dalam medium
sederhana, oleh karena mikroba ini mempunyai kemampuan untuk mensintesis bahan
anorganik menjadi, protein, asam nukleat, lipidadan lipida dan vitamin, serta kompleks
organik lainnya.
Untuk bakteri heterotrof, biasanya digunakan media non sintetik. Seringkali
digunakan bahan mentah seperti pepton, ekstrak daging, ekstrak ragi, sehingga media
tersebut dapat digunakan oleh berbagai bakteri. Sebagai bahan pemadat agar
ditambahkan. Media non sintetik menggunakan bahan kaya akan zat hara yang tidak
diketahui kandungannya dengan pasti.
 Ekstrak daging : Mengandung karbohidrat, senyawa organik nitrogen dan vitamin
 Ekstrak ragi : sumber vitamin B, senyawa organik nitrogen dan karbon
 Pepton : Sumber utama senyawa organik nitrogen, vitamin, karbohidrat. Perlakuan
digesti protein adalah dengan asam atau enzim
 Agar : kompleks karbohidrat yang diperoleh dari ganggang laut. Digunakan sebagai
bahan pemadat, mengeras pada suhu 450C. Agar bukan merupakan sumber hara.
Jenis Media
1. Media diferensial
Merupakan media yang menunjang kehidupan beberapa bakteri dan juga
dapat membedakan berbagai kelompok bakteri. Sebagai contoh agar darah merupakan
media difrensial untuk mengetahui sifat lisis dari eritrosit. Media ini menunjang
pertumbuhan berbagai bakteri. Lisis eritrosit ini merupakan ciri bakteri tertentu. Pola lisis
eritrosi juga digunakan untuk difrensiasi bakteri.
Selain darah digunakan, digunakan berbagai petunjuk pH (pH indikator)
sebagai pembeda, contoh biru bromtimol, merah fenol, merah netral.
10
2. Media selektif
Media ini menghambat pertumbuhan bakteri tertentu dan juga
memungkinkan pertumbuhan bakteri tertentu. Sebagai bahan penghambat digunakan :
 Kristal violet, eosin Y, biru metilen dan brilliant green yang akan
menghambat bakteri Gram positip
 Garam empedu
 pH : Sabraud agar dengan pH5.6 khusus digunakan untuk fungi
 penambahan antibiotik, sikloheksimida, kanamisin, neomisin.
3. Media selektif dan diferensial
Media ini bersifat selektif dan diffrensial, biasanya digunakan untuk
identifikasi.
4. Media untuk bakteri Anaerob
Seberapa bahan kimia dapat ditambahkan ke dalam media untuk mengurangi
kandungan oksigen dengan cara pengikatan secara kimia, bahan tersebut adalah :
 Na thioglikolat
 Cystein
 Asam askorbat
Salah satu indikator anaerobik adalah resazurin. Bila terjadi oksidasi (aerob)
maka akan terjadi warna merah.
5. Media penyubur
Media ini akan mempercepat pertumbuhan organisme tertentu. Cara ini
digunakan bila diinginkan salah satu organisme tertentu dari suatu biakan campuran
bakteri. Pada umumnya media ini menggunakan bahan/zat hara yang serupa dengan
habitat mengisolasi bakteri tersebut.
Bila sewaktu mengisolasi diberi peluang yang lebih besar bagi organisme
tersebut oleh karena hanyalah keperluan bakteri tersebut yang dipenuhi, maka diharapkan
bahwa dakam biakan tersebut akan tumbuh mikroorganisme tertentu tersebut Cara
pembiakan seperti ini disebut selective enrichment. Selain menghambat zat hara tertentu
sering kali ditambahkan zat penghambat tertentu. Bahan ini tidak mengganggu
pertumbuhan mikroorganisme yang ingin diisolasi, akan tetapi menghambat pertumbuhan
mikroorganisme lain yang tidak diinginkan.
Selain menambahkan bahan penghambat ditambahkan pula indikator
sehingga dapat dibedakan kelompok bakteri yang mempunyai sifat-sifat tertentu,
misalnya membedakan bakteri yang memfermentasikan laktosa dan yang tidak
menfermentasikan laktosa, Dengan menggunakan indikator akan terlihat ada atau
tidaknya fermentasi suatu gula tertentu.
11
Zat-zat hara yang ditambahkan ke dalam media
Beberapa zat hara yang ditambahkan ke dalam media adalah :
Nitrogen
Pada umumny bakteri tidak dapat langsung menggunakan nitrogen (N2)
bebas dari udara, sehingga keperluannya diberikan dalam bentuk garam. Nitrogen
diperlukan sebagai bahan dasar untuk protein, asam nuleat dan vitamin. Dalam media
bahan yang mengandung N ini berupa :
 NH4Cl – N anorganik
 NaNO3
 Pepton – N organik
Karbon
Sebagai sumber karbon digunakan berbagai gula , pati, glikogen. Gula yang
dipakai berupa 5C, 6C atau disakarida (laktosa, sukrosa dan maltosa). Untuk dapat
menggunakan sumber karbon ini bakteri menguraikannya menjadi molekul yang lebih
kecil yang kemudian digunakannya untuk bahan dasar pembuatan protein, polisakarida,
lipida dan asam nukleat.
Vitamin dan faktor pertumbuhan
Berbagai vitamin yang diperlukan bakteri adalah thiamin, riboflavin, asam
nikotinat, asam pantotenat, biotin. Vitamin ini berfungsi sebagai koenzim atau bahan lain
dari bahan dasar sel. Koenzim adalh bagian aktif dari enzim dan berkaitan dengan bagian
protein dari enzim tersebut. Selain vitamin, bakteri juga memerlukan faktor pertumbuhan
seperti pemula (precussor) protein atau bahan lainnya. Termasuk dalam faktor
pertumbuhan adalah bahan kimiawi yang diperlukan untuk pertumbuham, tetapi tidak
dapat disintesa sendiri oleh bakteri, contoh asam pimelat pemula biotin, beta alanin,
pemula asam pantotenat, purin dan pirimidin untuk sintesis asam nukleat. Beberapa
bakteri memerlukan faktor pertumbuhan yang khusus, Hemophilus influenzae,
memerlukan bahan tertentu dari Hb untuk pertumbuhannya, selain NAD (Nikotin Adenin
Dinukleotida). Laktobacillus memerlukan vitamin B12, untuk pertumbuhannya, sehingga
kemudian sifat ini digunakan untuk menentukan konsentrasi vitamin dalam suatu sampel.
Cara ini disebut essai mikrobiologik. Ini berarti bahwa kecepatan pertumbuhan bakteri
akan sebanding dengan konsentrasi vitamin dalam sampel.
Garam dan mineral
Beberapa garam inorganik merupakan kebutuhan esensial. Termasuk ke
dalam kelompok ini adalah, Sulfur diberikan dalam bentuk NH4SO4, S ini diperlukan
sebagai koenzim, asam amino dan komponen sel lainnya.
Posfor ditemukan dalam asam nukleat dan fosfolipida dan juga ATP. P diberikan dalam
bentuk K2HPO4 dan KH2PO4.
K, Mg, Mn, Fe, dan Ca berfungsi sebagai kofaktor dalam berbagai enzim selain juga
diperlukan dalam pertumbuhan.
Fe merupakan bagian dari sitokrom, sedangkan CA dipakai dalam spora.
12
Ada beberapa bahan inorganik yang diperlukan dalam jumlah kecil, unsur sekelumit
(trace element), yaitu kobalt, molibdenum, Zn dan Cu. Bahan inorganik ini merupakan
bagian dari enzim tertentu yang diperlukan dalam kehidupan.
Air
Bakteri terdiri dari air sebanyak 80% sehingga air diperlukan untuk
pertumbuhan dan pembiakan bakteri. Air yang digunakan dalam pembuatan media adalah
aquadestilata oleh karena dalam air kran/leding terkandung bahan inorganik atau organik.
Selain itu bahan organik dan inorganik ini tidak selalu sama, sehingga pembuatan media
sebaiknya menggunakan aquadestilata.
Berbagai faktor yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri
Secara umum ada dua faktor yang dapat mempengaruhi pertumbuhan bakteri
yaitu faktor lingkungan dan zat hara. Termasuk dalan faktor lingkungan adalah, suhu, pH,
oksigen, dan tekanan osmotik.
Suhu
Pada umumnya bakteri tumbuh pada suhu di atas 350C, untuk setiap spesies
ada batasan suhu maksimum dan minimum untuk pertumbuhannya. Suhu optimum lebih
mendekati suhu maksimum sedangkan pada suhu minimum pertumbuhan lebih lambat.
Jika suhu lebuh tinggi daripada suhu maksimum maka pertumbuhan bakteri akan
menurun dengan cepat.
Hal ini sebenarnya menggambarkan bahwa suhu terutama mempengaruhi
enzim, makin tinggi suhu maka aktivitas enzim juga makin cepat. Apabila suhu terlalu
tinggi maka enzim akan terdenaturasikan sehingga sel kemudian akan mati.
Bakteri dibagi atas beberapa kelompok menurut suhu optimum pertumbuhan
yaitu:
1. Psikrofil: 50 – 300C, Kelompok bakteri ini menimbulkan kesulitan untuk makanan
yang disimpan dalam lemari es, oleh karena kelompok ini dapat tumbuh pada
0
s
u
h
u
4
C
.
0
0
2. Mesofil: 15 – 50 C, Bakteri pada umumnya termasuk ke dalam kelompok ini.
Bakteri patogen pada umumnya mempunyai suhu optimum sekitar 35 – 400C.
3. Termofil : 500 – 600C, dalam kelompok ini termasuk juga bakteri dalam sumber
air panas yang dapat tumbuh pada suhu 900C
Selain suhu faktor lingkungan lainnya dapat berpengaruh pada pertumbuhan
bakteri. Dalam keadaan asam kemampuan bakteri untuk dapat tumbuh pada suhu yang
tinggi akan berkurang. Pada sumber air panas yang bersifat asam , maka suhu tertinggi
bakteri yang dapat tumbuh adalah 800C. Sebaliknya pada keadaan basa, suhu tertinggi
dapat melebihi 900C.
Meskipun bukan suhu optimumnya beberapa bakteri tahan terhadap suhu
dingin, kelompok ini disebut psikodurik atau kriodurik. Sedangkan yang tahan pada suhu
panas disebut thermodurik.
Pertumbuhan pada suhu berbeda dapat memberikan karakteristik berbeda.
Jika Seratia marcescens diinkubasikan pada suhu 250C terlihat warna merah orange,
tetapi pada suhu 370C tidak terlihar pembentukan pigmen.
13
Lactobacillus plantarum tidak memerlukan fenilalanin bila ditumbuhkan
pada suhu 250C, tetapi bila ditumbuhkan pada suhu 370C asam amino ini harus
ditambahkan ke dalam media.
pH
Nilai pH medium sangat mempengaruhi jenis jasad renik yang dapat tumbuh.
Jasad renik pada umumnya dapat tumbuh pada kisaran pH 3 – 6 unit. Kebanyakan bakteri
mempunyai pH optimum, yaitu pH dimana pertumbuhannya maksimum, sekitar ph 6.5 –
7.5. Pada pH dibawah 5 dan di atas 8,5 bakteri tidak dapat tumbuh dengan baik, kecuali
bakteri asam asetat (Acetobacter suboxydans) dan bakteri oksidasi sulfur. Sebaliknya
kamir mempunyai pH 4 – 5 dan dapat tumbuh pada kisaran pH 2.5 – 8.5. Olek karena itu
kamir dapat tumbuh pada pH rendah dimana pertumbuhan bakteri terhambat, Kapang
mempunyai pH optimum 5 - &, tetapi seperti halnya khamir, kamir masih dapat hidup
pada pH sekitar 3 – 8.5.
Makanan yang mempunyai pH rendah ( di bawah 4.5) biasanya tidak dapat
ditumbuhi bakteri, tetapi rusak karena pertumbuhan khamir dan kapang. Oleh karena itu
makanan yang mempunyai pH rendah relatif lebih tahan dibandingkan dengan makanan
yang mempunyai pH netral atau mendekati netral.
Dalam pengolahan pangan makanan dapat dibedakan atas beberapa grup
berdasarkan pHnya. Pembagian makanan atas beberapa grup ini bertujuan untuk
mengetahui daya awet suatu makanan, dengan demikian memudahkan mencari perlakuan
yang harus diberikan untuk mengawetkan makanan tersebut. Semakin rendah pH
makanan, semakin berkurang perkakuan pengawetan yang harus diberikan kepada
makanan tersebut. Penggolongan makanan berdasarkan pHnya adalah sebagai berikut:
1. Makanan berasam rendah, yaitu makanan yang mempunyai pH di atas 5.3, misalnya
jagung, daging ikan dan susu.
2. Makanan berasam sedang, yaitu makanan yang mempunyai pH 5.3 sampai di atas 4.5,
misalnya bayam, asparagus, bit, dan waluh kuning.
3. Makanan asam, yaitu makanan yang mempunyai pH 4.5 sampai di atas 3.7, misalnya
tomat pear dan nanas.
4. Makanan berasam tinggi, yaitu makanan yang mempunyai pH 3.7 atau kurang,
misalnya buah-buahan yang tergolong asam (misalnya beries) dan acar-acaran (termasuk
sayur asin dan sauerkraut).
14
Oksigen
Bakteri dibagi 3 kelompok berdasarkan keperluannya atas oksigen:
1. Aerob obligat; Kelompok ini selalu memerlukan oksigen untuk pertumbuhannya.
Bakteri ditumbuhkan dalam bejana yang diletakkan pada shaker, sehingga oksigen selalu
tersedia.
2. Anaerob obligat : kelompok ini dapat tumbuh bila oksigen tidak ada. adanya oksigen
akan mematikan kelompok bakteri ini. Hal ini disebabkan oleh karena kelompok bakteri
ini tidak memiliki enzim yang dapat menguraikan hasil oksidasi dalam metabolisme
yang bersifat toksik. Beberapa bakteri memerlukan oksigen yang sangat rendah untuk
pertumbuhannya, oksigen di atmosfir tidak ditolerasi oleh kelompok bakteri ini .
Kelompok ini disebut mikroaerofilik. Aerotoleran anaerobik dapat tumbuh bila ada
oksigen meskipun oksigen ini tidak digunakan untuk metabolismenya ( Steptococcus).
Kepekaan terhadap oksigen disebabkan oleh pembentukan hidrogen peroksida H2O2
sewaktu metabolisme. Bahan ini merupakan racun dan dapat diuraikan menjadi H2O dan
O2 melalui enzim katalase. Obligat anaerob ini tidak memiliki enzim sehingga oksigen
dalam jumlah kecil saja akan mematikan bakteri ini.
Fakultatif anaerob
Kelompok bakteri ini dapat tumbuh dalam keadaan dengan atau tanpa
oksigen, meskipun pertumbuhannya jauh lebih cepat dibandingkan adanya oksigen
Pembiakan bakteri anaerob
Lingkungan anaerob dicapai dengan;
1. Media dengan bahan reduktor. Sewaktu disiapkan media direbus untuk mengusir
oksigen yang terlarut. Bahan yang memiliki kemampuan untuk mereduksi seperti sistin
ditambahkan untuk menurunkan kadar oksigen. N2 yang bersifat bebas-oksigen
ditambahkan ke dalam media dan kemudian disterilisasikan.
2. Ruang anaerobik yang merupakan plastik anaerobic glove box yang mengandung H2,
CO2 dan N2. Katalis yang digunakan adalah paladium. Di laboratorium digunakan
anaerobic jar yang dilengkapi dengan pembangkit gas untuk mengikat O2
15
ANALISIS KUANTITATIF MIKROBIOLOGI PADA BAHAN PANGAN
Analisis kuantitatif pada bahan pangan penting dilakukan untuk mengetahui
mutu bahan pangan, dan menghitung proses pengawetan yang akan diterapkan pada
bahan pangan tersebut. Beberapa cara dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur
jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan, yang dapat dibedakan atas
beberapa kelopmok yaitu,
A. Perhitungan jumlah sel
1. Hitungan mikroskopik
2. Hitungan cawan
3. MPN ( Most Probable Number)
B. Perhitungan massa sel secara langsung
1. Volumetrik
2. Gravimetrik
3. Kekeruhan (Turbidity)
C. Perhitungan massa sel secara tidak langsung
1. Analisis komponen sel (protein, DNA, ATP dan sebagainya)
2. Analisis produk katabolisme ( metabolit primer, atau sekunder, panas )
3. Analisis konsumsi nutrien ( karbon, nitrogenh, oksegen, asam amino,
mineral, dll ).
Perhitungan massa sel secara langsung maupun tidak langsung jarang
dilakukan dalam uji mikrobiologi bahan pangan, tetapi sering digunakan untuk mengukur
pertumbuhan sel selama proses fermentasi. Dalam perhitungan massa sel secara langsung,
jumlah sel mikroba dapat dihitung jika medium pertumbuhannya tidak mengganggu
pengukuran. Sebagai contoh, dalam metode volumetrik dan gravimetrik, pengukuran
volume dan berat sel dilakukan dengan terlebih dahulu menyaring sel-sel
mikroorganisme. Oleh karena itu jika substrat tempat tumbuhnya banyak mengandung
padatan, misalnya bahan pangan, sel jasad renik tidak dapat diukur menggunakan
volumetrik, gravimetrik maupun turbidimetri. Pertumbuhan massa sel secara tidak
langsung sering digunakan dalam mengamati pertumbuhan sel selama proses fermentasi,
dimana komposisi sunstrat atau bahan yang difermentasi dapat diamati dan diukur
dengan teliti.
Hitungan cawan
Prinsip metode hitungan cawan adalah jika sel mikroba yang masih hidup
pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk
koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakamn
mkroskop. Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk
menentukan jumlah mikroba karena beberapa hal, yaitu :
16
1. Hanya sel yang masih hidup yang dapat dihitung
2. Beberapa mikroba dapat sekaligus dihitung
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi karena koloni yang terbentuk mungkin
berasal dari satu jasad renik yang mempunyai penampakan pertumbuhan spesifik.
Selain keuntungan tersebut metode hitungan cawan juga mempunyai
kelemahan sebagai berikut:
1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya karena beberapa sel
yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni.
2. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda.
3. Jasad renik yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan
membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar.
4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan koloni
dapat dihitung.
Dalam hitungan cawan, bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih
dari 300 sel jasad renik per ml atau per gram atau per cm (jika pengambilan contoh
dilakukan pada permukaan), memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan
pada medium agar di dala cawan petri. Setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada
cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik di antara
30 – 300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1 : 10, 1: 100, 1:
1000 dan seterunnya, atau 1: 100, 1 : 10000, 1 : 1000 000 dan seterusnya. Larutan yang
digunakan untuk pengenceran dapat berupa larutan buffer fosfat, 0.85% NaCl, atau
larutan ringer.
Cara pemupukan dalam metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua
cara yaitu metode tuang (pour plate ) dan metode permukaan ( surface plate/spread plate
methode ). Dalam metode tuang sejumlah contoh ( 1 ml atau 0.1 ml ) dari pengenceran
yang dikehendaki dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian ditambahkan agar
sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya contoh menyebar rata. Pada pemupukan
dengan metode permukaan terlebih dahulu dibuat agar cawan kemudian sebanyak 0.1 ml
contoh yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar tersebut, dan diratakan
dengan batang gelas melengkung yang steril. Jumlah koloni dalam contoh dapat dihitung
sebagai berikut :
Koloni per ml atau pe gram = Jumlah koloni percawan x 1 faktor pengenceran
Metode MPN ( Most Probable Number )
Metode MPN menggunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana
perhitungan dilakukan dengan berdasarkan jumlah tabung yang positip yaitu yang
ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan
tabung yang positip dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau
terbentuknya gas di dalam tabung kecil ( Durham ) yang diletakkan pada posisi terbalik,
yaitu untuk mikroba pembentuk gas. Untuk setiap pengenceran digunakan 3 atau 5 seri
tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi,
tetapi alat gelas yang digunakan lebih banyak.
17
Dalam metode MPN pengenceran harus dilakukan lebih tinggi dari
pengenceran dalam hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair
yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung satu sel
jasad renik, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari satu sel jasad renik,
sedangkan tabung lain tidak mengandung sel. Dengan demikia, setelah inkubasi
diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung
positip, sedankan lainnya tabung negatif.
Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah sel jasad renik
di dalam contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh yang
berbentu padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1 : 10 dari contoh tersebut.
Dalam metode MPN , dari setiap pengenceran dimasukkan 1 ml masingmasing ke dalam tabung yang berisi medium, dimana untuk setiap pengenceran
digunakan 3 seri tabung atau 5 seri tabung. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu
dihitung jumlah tabung yang positip yaitu tabung yang ditumbuhi jasad renik yang dapat
ditandai dengan timbulnya kekeruhan. Misalnya pada pengenceran pertama ketiga
tabung menghasilkan pertumbuhan positip, pada pengenceran kedua kedua tabung
menghasilkan dua tabung positip, pada pengenceran ketiga satu tabung positip dan pada
pengenceran terakhir tidak ada tabung yang positip. Kombinasinya menjadi 3, 2, 1, 0 dan
jika yang diambil tiga pengenceran pertama maka kombinasinya akan menjadi 3, 2, 1.
Angka ini kemudian dicocokkan dengan Tabel MPN, dan nilai MPN contoh dapat
dihitung sebagai berikut:
MPN contoh = Nilai MPN Tabel x 1/pengenceran tabung tengah
Tabel yang digunakan untuk menentukan nilai MPN dari tiga seri tabung
berbeda dengan untuk lima seri tabung. kombinasi yang dipilih dimulai daqri
pengenceran tertinggi yang masih menghasilkan semua tabung yang masih positip,
sedangkan pada pengenceran yang berikitnya ada tabung yang negatif. Kombinasi yang
diambil terdiri dari tiga pengenceran. Jika pada pengenceran yang keempat atau
seterusnya masih ditemukan tabung yang hasilnya positip, maka jumlah tabung yang
positip tersebut harus ditambahkan pada angka kombinasi yang ketiga sampai mencapai
jumlah maksimum.
Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme
tertentu yang terdapat diantara campuran mikroorganisme lainnya. Sebagai contoh, jika
digunakan Lactosa Broth maka adanya bakteri yang dapat menfermentasi laktosa
ditunjukkan dengan terbentuknya gas di dalam tabung Durham. Cara ini biasa digunakan
untuk menentukan MPN koliform terhadap air atau minuman karena bakteri koliform
termasuk bakteri yang dapaqt menfermentasi laktosa.
Metode hitungan tidak langsung
Salah satu cara untuk menghitung jumlah sel di dalam suatu bahan secara
tidak langsung adalah dengan uji biru metilen. Uji biru metilen (BM) biasanya dilakukan
terhadap susu, dan dapat memberi perkiraan jumlah bakteri di dalam susu. Dalam uji ini
ditambahkan sejumlah biru metilen kedalam susu, kemudian diamati kemampuaqn
18
bakteri di dalam susu untuk tumbuh dan menggunakan oksigen yang terlarut, sehingga
menyebabkan penurunan kekuatan oksidasi reduksi dari campuran tersebut. Akibatnya
biru metilen yang ditambahkan akan tereduksi menjadi putih metilen. Waktu reduksi
yaitu perubahan warna biru menjadi putih, dianggap selesai jika kira-kira empat perlima
dari contoh susu yang terdapat dalam tabung ( sebanyak 10 ml ) telah berwarna putih.
beberapa penelitian melaporkan perkiraan jumlah koloni yang diperoleh dengan metode
hitungan cawan dengan waktu reduksi menggunakan metode hitungan cawan dengan
waktu reduksi menggunakan metode biru metilen dapat dilihat pada tabel berikut.
Semakin tinggi jumlah bakteri dalam susu, semakin cepat terjadinya perubahan warna
dari biru menjadi putih.
Tabel.
Hubungan antara jumlah koloni menggunakan metode cawan dengan waktu reduksi dalam uji biru metilen
Waktu reduksi biru metilen (jam)
0.5 – 3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5 – 8
8
Perkiraan jumlah koloni (x 104)
80 atau lebih
40
25
15
10
6
2.5
1
Metode biru metilen merupakan cara yang lebih cepat dibandingkan dengan
metode hitungan cawan, dan lebih teliti karena bakteri yang terdapat dalam keadaan
berkelompok dimana dalam metode hitungan cawa dihitung sebagai satu koloni, dalam
metode BM hal ini tidak terpengaruh terhadap perhitungan jumlah bakteri.
Kelemahan metode BM adalah cara ini tridak proktis dilakukan terhadap susu
yang mengandung bakteri hidup dalam jumlah sedikit, misalnya susu yang mengalami
pasteurisasi, dimana dibutuhkan waktu lama sekali untuk mereduiksi biru metilen.
Kelemahan lain adalah karena dalam uji biru metilen diperlukan waktu pengamatan yang
terus menerus, yaitu paling sedikit selama 6 jam. Dengan metode ini juga tidak dapat
dibedakan jenis bakteri yang terdapat di dalam susu, misalnya bakteri gram positip atau
negatif, pembentuk spora, khamir dan sebagainya.
19