ANALISIS EKSPRESI KLON GEN CVPD DALAM SEL

Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013
ANALISIS EKSPRESI KLON GEN CVPDr DALAM SEL Escherichia coli
A.A. Putu Sri Mahayani
UNTAG Surabaya
[email protected]
ABSTRACT
The effort to control CVPD was done, but it did not fulfil the expectation
properly. One of the new approach to control the CVPD plant diseases were
genetics approach expedient i.e. by isolating and resistant gene cloning or
resistant against CVPD.
Jeruk kingkit was far family of citrus plant which was resistant to CVPD.
One of genetics transformation technique by Agrobacterium vector , have been
isolated and cloned from DNA fragments successfully that were contain genes for
resistance against CVPD disease (CVPDr gene) from Triphasia trifolia (Jeruk
kingkit). Those DNA fragments were cloned in plasmid of pUC18 vector and were
cared in the Escherichia coli JM109 cell, so that this research aims to detect
CVPDr gene expression in the Escherichia coli JM109 cell, to compare CVPDr gene
expression in the Escherichia coli JM109 cell with proteins which were isolated
from T. trifolia and Siamese citrus.
The bacteria were cultivated at liquid LB medium by adding agarose gel
1.5 g that contain ampicillin 100 ppm, and those bacteria were cultured at
agarose gel LB medium that contain ampicillin 100 ppm. Colonies of growth
bacterium were taken to be isolated their plasmids with the DNA agarose gel
electrophoresis 1%. Obtainable DNA were cut by restriction enzymes endonuclease
EcoRI and BamHI. Bacteria proteins were compared with the citrus plan proteins.
Protein molecules which were yield from CVPDr gene cloning in the Escherichia
coli JM109more or less 17 kDa its large. The similar large molecules exist at the
sample proteins which were isolated from T. trifolia (Jeruk kingkit) .
Kata kunci: Bakteri Escherichia coli JM109, CVPD, Jeruk kingkit., T. trifolia.
PENDAHULUAN
Di Indonesia penyakit yang
menimbulkan kerusakan dan kerugian
tanaman jeruk yang paling penting
adalah
CVPD
(Setiawan
dan
Trisnawati, 1999).
CVPD (Citrus Vein Phloem
Degeneration) merupakan penyakit
terpenting dan penyebab utama
kehilangan hasil perkebunan jeruk di
hampir semua negara terutama Asia
dan Afrika. CVPD disebabkan oleh
bakteri gram negatif Liberobacter
asiaticum yang ditularkan serangga
vektor Diaphorina citri (Subandiyah,
2001) .
Gejala khas CVPD adalah daun
terlihat menguning dengan tulangtulang daun menjadi lebih hijau. Daun
tidak dapat berkembang dengan baik
sehingga daun menjadi lebih kecil,
buah menjadi kecil-kecil, keras, dan
kulitnya menjadi menguning. Daun
tanaman
yang
terserang
CVPD
mengalami klorosis dengan gejala
menyerupai defisiensi unsur nitrogen,
seng, mangan dan zat besi (Setiawan
dan Trisnawati, 1999).
Penyebab
penyakit
CVPD
awalnya diperkirakan adalah virus.
Sejalan
dengan
perkembangan
ISSN 2302-2612
33
Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013
penguasaan ilmu dan teknologi serta
penelitian
lebih
lanjut
tentang
penyebab penyakit CVPD, diketahui
bahwa penyebab
penyakit CVPD
adalah bakteri (Sandrine et al.,
1996). Berdasarkan analogi terhadap
MLO, penyebab CVPD disebut BLO
(bacterium like organism) atau GO
(greening organism) (Nakashima et
al., 1996).
Kondisi lingkungan pertanaman
jeruk di Indonesia yang beragam,
diduga dapat menyebabkan mutasi
dan variasi genetik pada bakteri
CVPD, karena mutasi dan variasi
genetik pada makhluk hidup dapat
dipengaruhi
lingkungan
(Gardner,
1991), sehingga pengendalian CVPD
dilakukan
terhadap
vektor
dan
patogen.
Pengendalian
vektor
dilakukan
dengan
menggunakan
insektisida dan pengendalian hayati.
Pengendalian patogen pada pohon
terinfeksi dilakukan dengan injeksi
tanaman dengan antibiotik seperti
tetrasiklin hidroklorida, pemotongan
bagian
tanaman
bergejala,
pembongkaran tanaman sakit dan
menggantinya dengan tanaman sehat
(Da Graca, 1991).
Semua tanaman jeruk budidaya
rentan terhadap serangan penyakit
CVPD. Berbagai usaha pengendalian
telah dilakukan tetapi belum memberi
harapan yang memadai, salah satu
pendekatan
baru
dalam
usaha
pengendalian penyakit CVPD adalah
upaya pendekatan secara genetik
yaitu
dengan
mengisolasi
dan
mengklon gen ketahanan terhadap
CVPD (Wirawan & Subandiyah, 2000).
Fragmen DNA tersebut diklon
dalam plasmid vektor pUC18 dan
dipelihara dalam sel E. coli JM109.
Klon plasmid rekombinan itu disebut
pWR27 (Wirawan et al., 1998).
Jeruk kinkit (Triphasia trifolia)
berasal dari Cina. Di Indonesia di
tanam di pekarangan mempunyai daun
majemuk ganda tiga, anak daun
berbentuk
bulat
telur,
tepinya
beringgit, pada ketiak daun terdapat
duri lurus, agak panjang, bunga
berwarna putih berbau harum. Buah
buni, berongga tiga masing-masing
berisi satu biji pipih (Anonim, 1988).
Hasil penelitian Wirawan &
Subandiyah
(2000)
menunjukkan
bahwa
tanaman
jeruk
kinkit
menunjukkan tanda potensial sebagai
tanaman
yang
tahan
terhadap
serangan penyakit CVPD, sedangkan
jeruk siam tidak tahan CVPD.
Beberapa jenis tanaman daun
jeruk terserang CVPD dapat dilihat
pada Gambar 1.
Gambar 1.
Beberapa Jenis Daun
Jeruk
a. Daun jeruk siam tersera ng
CVPD (sakit)
b. Daun
jer uk
sia m
tida k
terserang CVPD (sehat)
c. Daun jeruk kink it
Bakteri
Escherichia
coli
digunakan dalam kloning sebagai
organisme inang untuk rekombinan
molekul DNA. Salah satu langkah
dalam kloning adalah pemulihan
vektor. Vektor adalah wahana dimana
DNA asing dipindahkan ke organisme
inang baru dan dapat diekspresikan
dari DNA asing di dalam inang baru
(Brown, 1991).
Molekul DNA sel E. coli hampir
1000 kali lebih panjang dari selnya
sendiri dan karenanya harus betulbetul berlipat untuk dapat masuk ke
dalam badan inti yang biasanya
berukuran 1 mm. Dinding luar sel E.
coli dilapisi oleh selongsong atau
kapsul yang terbentuk dari senyawa
berlendir (Sambrook et al., 2001).
Bakteri E. coli biasanya hidup
pada usus pencernaan manusia dan
hewan
berdarah
panas.
Pertumbuhannya membutuhkan zat
makanan berupa unsur bahan organik
seperti karbon, hidrogen, nitrogen,
ISSN 2302-2612
34
Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013
fosfor,
belerang,
oksigen,
ion
anorganik seperti kalium, natrium,
besi, magnesium, kalsium klorida, dan
vitamin. Kebutuhan gizi dan sumbersumber
energi
metabolik
pada
berbagai bakteri sangat beragam.
Bakteri yang sedang tumbuh salah
satu unsur tersebut harus ada. Ciri
khas bakteri E. coli antara lain
kemampuan perlekatan pada sel inang
dan invasi sel pada jaringan inang
(Jawetz et al., 1996).
Faktor pertumbuhan adalah
suatu senyawa organik yang harus ada
dalam sel supaya sel tersebut dapat
tumbuh, tetapi sel tidak dapat
mensintesisnya. Faktor-faktor yang
harus
diperhatikan
selama
pertumbuhan bakteri E. coli adalah
zat makanan, pH, suhu, udara, serta
adanya ion-ion anorganik (Sambrook
et al., 2001).
MATERI DAN METODA
Penelitian
ini
nenggunakan
metode
survei
dan
test
yang
dilakukan
terhadap
obyek
dan
penelitian.
Adapun
rancangan
prosedurnya dibuat sebagai berikut ini
:
1. Pengambilan sample terhadap
daun jeruk kinkit dan daun
jeruk siam.
2. Dilakukan uji di labolatrium
bioteknologi pertanian jurusan
hama dan penyakit tumbuhan
fakultas pertanian universitas
Udayana Denpasar .
3. Dari hasil labolatrium kita
dapat mengetahui bahwa daun
jeruk kinkit tahan terhadap
serangan CVPD
PEMBAHASAN
Gambar 2. Kerangka Konsep
Penelitian
Pembiakan Bakteri
Hasil pembiakan bakteri E.
coli JM109 yang membawa gen CVPD r
yang diklon pada pUC18 (pWR27) dan
pUC18 yang dipelihara pada sel E. coli
JM109
dapat
terlihat
dengan
tumbuhnya koloni pada media LB agar
yang mengandung 100 ppm ampicillin.
Koloni-koloni yang tumbuh
merupakan gen CVPD r yang diklon
pada pUC18 dalam sel E. coli JM109
(pWR27). Bakteri tersebut membawa
plasmid yang menyandi gen tahan
terhadap ampicillin. Koloni-koloni
yang tumbuh merupakan pUC18 yang
dipelihara pada sel E. coli JM109.
pUC18 merupakan vektor kloning
membawa paling sedikit satu gen yang
memberikan
resistensi
terhadap
ampicillin pada sel tuan rumah dan
seleksi untuk transformasi dengan
menanam sel pada medium agar yang
mengandung ampicillin (Brown, 1991).
Bakteri dapat ditumbuhkan
tanpa
banyak
kesulitan
karena
campuran
nutrien
penting
yang
seimbang pada konsentrasi yang tepat
dan penggunaan antibiotik yang sesuai
menyebabkan
bakteri
tersebut
ISSN 2302-2612
35
Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013
tumbuh. Bakteri E. coli adalah bakteri
berbentuk batang dengan ukuran
panjang 1 – 3 mm serta lebar 0,4 – 0,7
mm, bersifat gram negatif, tidak
berkapsul,
dapat bergerak aktif
karena mempunyai flagela peritrik,
bersifat
aerob.
Suhu
untuk
pertumbuhan
berkisar
4 0 C-46 0 C
dengan
suhu
optimum
37 0 C.
Sedangkan
pH
optimum
untuk
pertumbuhan adalah 7,0 – 7,5
(minimum 4,0 dan maksimum 8,5).
Bakteri E. coli relatif peka terhadap
suhu dan pemanasan (Jawetz et al.,
1996).
Isolasi DNA Plasmid Bakteri
Hasil isolasi DNA plasmid
bakteri
E.
coli
JM109
yang
r
mengandung gen CVPD yang diklon
pada pUC18 (pWR27) dan pUC18 yang
dipelihara pada sel E. coli JM109
dapat terlihat dengan terbentuknya
pita DNA pada elektroforesis 1 %
agarose.
Hal ini menunjukkan bahwa
memisahnya kedua jenis DNA yaitu
DNA plasmid dan DNA kromosom
bakteri
yang
besar
jumlahnya
terdapat dalam sel. Plasmid yang
paling besar ukurannya hanya 8%
ukuran
kromosom
E.
coli
dan
kebanyakan plasmid lebih kecil dari
ukuran tersebut, oleh karena itu
pemecahan
sel
harus
dilakukan
dengan pelan-pelan untuk mencegah
pemecahan
DNA
bakteri
secara
menyeluruh (Brown, 1991).
Kebanyakan plasmid terdapat
dalam bentuk molekul DNA berunting
rangkap.
Kedua
unting
DNA
merupakan
lingkaran
utuh,
molekulnya digambarkan sebagai CCC
(Covalenthy Closed Circular) DNA
yang
berarti
lingkaran
tertutup
kovalen. Covalenthy Closed Circular
DNA bila satu unting yang utuh
molekulnya digambarkan sebagai OC
DNA atau lingkaran terbuka (open
circles), sedangkan DNA kromosom
lebih longgar dan mempunyai ukuran yang
sangat
panjang,
sehingga
mudah
dipisahkan
sewaktu
isolasi.
Covalenthy Closed Circular (CCC) DNA
yang mempunyai struktur terteir yang
tahan terhadap denaturasi maka utas
tunggal akan melekat bersama lebih
erat, sehingga berasosiasi kembali
lebih
cepat
sehingga
mudah
terdenaturasi, oleh karena itu bila
denaturasi diterapkan maka DNA
kromosom akan terdenaturasi dan
berpresipitasi sehingga DNA plasmid
akan tetap utuh (Sambrook et al.,
2001).
Pemotongan DNA Plasmid dengan
Enzim Endonuklease Restriksi
Hasil
pemotongan
DNA
plasmid bakteri E. coli JM109 yang
mengandung gen CVPD r yang diklon
pada pUC18 (pWR27) dan pUC18 yang
dipelihara pada sel E. coli JM109
dengan enzim endonuklease restriksi
Pemberian enzim endonuklease
restriksi
untuk
memotong
DNA
menjadi
fragmen-fragmen
dengan
panjang yang berbeda-beda. Enzim
endonuklease
restriksi
akan
menempati suatu molekul DNA dan
bergeser sepanjang heliks DNA hingga
mengenali urutan pasangan basa
spesifik untuk berhenti bergeser,
kemudian
enzim
endonuklease
restriksi akan memotong DNA pada
urutan
pasangan
basa
spesifik.
Tempat urutan pasangan basa spesifik
ini disebut juga situs restriksi.
Pemotongan
DNA
dengan
enzim
endonuklease
restriksi
mengenal
urutan spesifik pada molekul DNA
yang dipotong. Enzim Eco RI yang
disintesis oleh E. coli mempunyai
urutan pengenal GAATTC. Enzim Bam
HI yang disintesis oleh Bacillus
amynololique
faciens
mempunyai
urutan pengenal GGATCC. Ujungujung hasil pemotongan dengan enzim
endonuklease restriksi Eco RI dan Bam
HI . Ujung-ujung Pemotongan Enzim
Eco RI dan Bam HI
Pemotongan
molekul
DNA
dengan
tepat
perlu
pada
pembentukan
DNA
rekombinan
(kloning gen). Vektor dipotong posisi
tunggal untuk membuka lingkaran
ISSN 2302-2612
36
Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013
sehingga molekul DNA baru dapat
diinsersikan. Vektor harus dipotong
pada
posisi
yang
sama
sebab
pemotongan secara random tidak
memuaskan DNA pUC18 (Sambrook et
al., 2001).
Tempat pemotongan enzim
restriksi
pada
molekul
DNA,
meninggalkan
bekasnya
berupa
tonjolan ujung 5’. Ujung-ujung ini
dapat mengadakan ikatan hidrogen
dengan ujung DNA lainnya yang
dipotong oleh enzim yang sama.
Potongan
enzim
restriksi
atau
fragmen restriksi yang ujungnya tidak
rata atau menonjol dinamakan ujung
lengket, tetapi ada pula enzim
endonuklease
restriksi
yang
memotong membentuk ujung tumpul
(Brown, 1991). DNA pUC18 (Sambrook
et al., 2001)
Analisis Total Protein Bakteri
Analisis total protein bakteri
dilakukan
dengan
teknik
elektroforesis
menggunakan
gel
poliakrilamid sebagai pemisah. Gel
poliakrilamid
dapat
memisahkan
protein
berdasarkan
massanya.
Protein dalam gel dapat dilihat
setelah
diwarnai
dengan
biru
coomassie yang ditandai oleh adanya
pita. Hasil analisis protein bakteri E.
coli JM109 yang mengandung gen
CVPD r yang diklon pada pUC18
(pWR27) dan pUC18 yang dipelihara
pada sel E. coli JM109
Berdasarkan analisis protein
tersebut,
dapat
terlihat
bahwa
protein khas terlihat lebih kurang 17
kDa yaitu pada CVPD r yang diklon
pada pUC18 dalam sel E. coli JM109
(pWR27 ,sedangkan pada pUC18 tidak
terlihat adanya gen tahan CVPD
Hal ini disebabkan karena
bakteri
patogen
mempunyai
kemampuan perlekatan pada sel
kloning, dimana untuk pertumbuhan
bakteri membutuhkan zat molekul
berupa unsur bahan organik yaitu
karbon, hidrogen, nitrogen, fosfor,
belerang, oksigen, ion anorganik
seperti
kalium, natrium, besi,
magnesium, kalsium
(Jawetz et al., 1996).
dan
vitamin
Analisis
Total
Protein
Bakteri
dengan Total Protein Daun Jeruk
Kinkit dan Jeruk Siam
Analisis total protein bakteri
dengan total protein daun jeruk kinkit
dan daun jeruk siam dilakukan dengan
teknik elektroforesis menggunakan gel
poliakrilamid sebagai pemisah. Gel
poliakrilamid
dapat
memisahkan
protein
berdasarkan
massanya.
Protein dalam gel dapat dilihat
setelah
diwarnai
dengan
biru
coomassie yang ditandai oleh adanya
pita. Hasil analisis protein bakteri
dengan protein tanaman jeruk kinkit
dan daun jeruk siam dapat dilihat
pada Gambar 3.
Gambar 3. Analisis Total Protein
Bakteri dengan Jeruk Kinkit dan Jeruk
Siam
Ket: M (Marker Protein) Lajur 1,2 pWR27
Lajur 3,4 Jeruk Kinkit, Lajur 5 jeruk siam
sehat, Lajur 6,7 jeruk siam sakit. Tanda
panah menunjukkan pita protein tahan
CVPD.
Protein khas terdapat lebih
kurang pada 17 kDa yang merupakan
protein tahan terhadap CVPD yang
terdapat pada jeruk kinkit dan
pWR27. Hal ini disebabkan jeruk
kinkit mempunyai ketahanan terhadap
CVPD.
Perbedaan
pembentukan
molekul
protein
tersebut
kemungkinan
merupakan
reaksi
molekuler tanaman, pada jeruk siam
sehat maupun sakit tidak terlihat
adanya pita lebih kurang pada 17 kDa
sebab jeruk siam tidak memiliki
ketahanan
terhadap
serangan
ISSN 2302-2612
37
Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013
penyakit CVPD. Akibatnya protein
transpot ion sel tanaman akan
terganggu yang mengakibatkan sel
tanaman kekurangan mineral atau
unsur hara tertentu (Setiawan dan
Trisnawati, 1999).
Jeruk siam yang terserang
CVPD agar protein dapat berfungsi
dengan baik maka protein yang
berperan sebagai protein transpot
akan mengikat senyawa spesifik.
Menurut Toha (2001) suatu senyawa
yang akan ditranspot harus berikatan
terlebih
dahulu
dengan
protein
transpot spesifik sehingga nantinya
senyawa tersebut akan mampu dibawa
melewati membran.
KESIMPULAN
1. Klon
gen
CVPD r
dapat
diekspresikan dalam sel E. coli
JM109.
2. Molekul protein yang dihasilkan
dari klon gen CVPD r dalam sel E.
coli JM109 mempunyai besar
molekul lebih kurang 17 kDa.
3. Molekul protein dengan besar
molekul yang sama juga ditemukan
pada sampel protein yang diisolasi
dari jeruk kinkit.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 1988. Ensiklopedi Indonesia.
PT. Ichtiar Baru – Van Hoeve
Jakarta.
Brown, T.A.1991. Pengantar
Kloning
Gen. Alih Bahasa : Soemiati,
A.M. Yayasan Essentia Medika.
Yogyakarta.
Da Graca, J.V. 1991 Citrus greening
disease. Phytopathol 29 : 10936. Departemen of Microbiology
and Plant Pathology. University
of Natal. Platermaritzburg south
Africa.
Gardner, E.J 1991. Principles of Genetic.
New York : John Wiley & Sons.
Jawetz, E. J. L. Melnik, E. A. Adelberg,
G.F. Brooks, J. S. Butel , and L.
N.
Omston.
1996
Medika
Microbiology. Edisi 20. Buku
Kedokteran EGC. Jakarta.
Setiawan, A. I. & Y. Trisnawati. 1999.
Peluang
Usaha
dan
Pembudidayaan Jeruk Siem.
Penebar Swadaya. Jakarta.
Sambrook, J., E. F. Miniatis, T. 2001.
Molecular
Cloning.
A
Laboratorium Manual. 3nd. ED.
Cold Spring Harbour Laboratory
Press, New York.
Subandiyah, S. 2001. Bioteknologi untuk
identifikasi dan deteksi patogen
tumbuhan. Makalah Seminar
Regional VPFI Komda Jateng dan
DIY di Universitas
Wangsa
Menggala, Yogyakarta. 3 Pebruari
2001.
Tjitrosoepomo, G. 1981. Taksonomi
Tumbuhan.
Bhratara
Karya
Aksara. Jakarta.
Toha. A. A. H. 2001 Deoxyribo Nucleac
Acid.
Keanekaragaman,
Ekspresi, Rekayasa dan Efek
Pemanfaatannya. Seri Biokimia.
Penerbit Alfabeta. Bandung.
Wirawan, I. G. P. 1996. Molekular
Mechanism of Grown Gall
Tumor
Induction
by
Agrobacterium
Tumefaciens.
Graduate Course of Biochemical
regulation, Graduate Scholl of
Agriculture
Sciences
Nagoya
University, Nagoya Japan.
Wirawan, I. G. P., N. Arya., S.
Subandiyah. 1998. Isolasi Loci
Resisten terhadap CVPD dengan
Metode
Transformasi
Menggunakan
Agrobacterium
Tumefaciens. Laporan Riset
Unggulan Terpadu V. Kantor
Menteri Negara Riset Teknologi.
Dewan Riset Nasional. Jakarta.
Wirawan, I. G. P., & S. Subandiyah. 2000.
Penelitian
Aspek
Biologi
Molekul
Penyakit
CVPD
Tanaman Jeruk. Seminar Sehari
Perhimpunan
Fotopatologi
Indonesia. Malang.
ISSN 2302-2612
38