Isolasi Dan Karakterisasi Gen pol Simian Retrovirus

2
TINJAUAN PUSTAKA
Gen Pol SRV
Gen pol pada SRV 2 menyandikan
poliprotein yang terbagi menjadi tiga enzim
yaitu reverse transkriptase, RNase-H dan
integrase. Gen pol ini menyandikan asam
amino yang terdiri dari 867 asam amino.
Reverse transcriptase tersusun atas asam
amino nomor 55-243. Enzim ini berperan
untuk mensintesis utas DNA dari RNA virus.
Rnase H tersusun atas asam amino nomor
457-588. Enzim ini berperan untuk memecah
hibrid RNA/DNA. Integrase tersusun atas
asam amino nomor 646-807. Enzim ini
berperan mengintegrasikan provirus pada
genom sel inang ([UniProt Consortium]
2010). Sekuen asam amino dari gen pol yang
ada pada SRV 2 memiliki kesamaan homologi
50% dengan gen pol pada mouse mammary
tumor virus (MMTV), sejenis Retrovirus tipe
B (Thayer et al. 1987).
Partikel retrovirus terdiri dari 50 – 100
molekul reverse transkriptase. Studi dari
reverse transkriptase endogenus menunjukkan
bahwa sintesis DNA berlangsung setelah
selubung (envelope) dipisahkan (uncoating)
dan tersedianya dNTP dari inangnya. Proses
transkripsi terbalik pada virus berlangsung di
sitoplasma sebelum DNA viral memasuki
nukleus. Reverse transkriptase pada retrovirus
merupakan kompleks yang terdiri atas bagian
yang dapat bergerak dan memiliki banyak
aktivitas (Flint et al. 2009).
Enzim reverse transkriptase termasuk ke
dalam famili RT. Famili RT merupakan
kelompok enzim DNA polimerase yang unik
karena enzim yang dihasilkan untuk
mensintesis DNA berupa enzim reverse
transkriptase. Organisme yang memiliki
enzim ini biasanya terdiri atas organisme dari
kelompok retrovirus. Enzim polimerase ini
menggunakan RNA sebagai cetakan untuk
mensintesis utas DNA. Salah satu virus yang
memiliki enzim ini adalah Simian Retrovirus
(SRV). Enzim polimerase SRV termasuk ke
dalam golongan DNA dependent RNA
polymerase, yaitu golongan enzim yang
mensintesis DNA dari RNA (Skalka et al
1997).
Daerah
polimerase
dari
reverse
transkriptase dalam struktur tiga dimensinya
membentuk konformasi tangan kanan. Daerah
ini terhubung dengan ujung C dari daerah
RNase-H. Daerah dari reverse transkriptase
dapat dibagi menjadi empat subdomain yaitu,
fingers, palm, thumb, dan connection.
Subdomain connection terhubung dengan
daerah RNase-H dan masing-masing dari
subdomain diduga memiliki fungsi tersendiri
dalam sintesis DNA. Reverse transkriptase
(RT) dari retrovirus mensintesis salinan DNA
beruntai ganda dari genom RNA virus
beruntai tunggal. Reverese Transkriptase
berisi dua domain katalitik, yaitu daerah DNA
dependent RNA polymerase yang dapat
menggunakan RNA atau DNA sebagai
cetakan dan daerah RNase H yang diperlukan
untuk mendegradasi genom RNA dalam
hibrid RNA / DNA (Lim et al. 2006).
Reverse transkriptase dapat melakukan
amplifikasi dengan substrat RNA maupun
DNA. Enzim tersebut membutuhkan cetakan
dan primer sama seperti enzim polimerase
lainnya. Proses polimerisasi terjadi dengan
memanjangkan ujung 3’ hidroksil (-OH) dari
primer dengan dNTP satu demi satu. Primer
yang tidak memiliki ujung 3’-OH bebas atau
molekul DNA dengan analog dNTP tanpa 3’OH tidak dapat dipanjangkan oleh enzim ini.
Berdasarkan mekanisme tersebut banyak
digunakan nukleosida/nukleotida analog tanpa
3’-OH
untuk
menginhibisi
reverse
transkriptase HIV-1 pada penderita AIDS
(Herschhorn & Hizi 2010).
Selain enzim reverse transkriptase terdapat
juga enzim RNase-H dalam gen pol SRV.
Retroviral RNase-H merupakan endonuklease
yang bekerja secara bertahap memecah RNA
dari hibrid DNA/RNA. RNase-H bergantung
pada kation divalen Mg2+ untuk menghasilkan
5’fosfat dan ujung 3’-OH. RNase H
memainkan peran penting pada beberapa
tahapan transkripsi balik. RNase H diperlukan
untuk
menghilangkan
primer
tRNA,
pembentukan dan penghapusan Polypurine
tract (PPT), serta menghilangkan genom RNA
dari hibrid RNA/DNA untuk menghasilkan
DNA beruntai tunggal (Schultz & Champoux
2009).
Daerah RNase-H yang diisolasi dari
reverse transkriptase M-MLV merupakan
enzim yang aktif, tetapi aktifitasnya rendah
dan substrat spesifiknya juga rendah. Domain
RNase-H yang diisolasi dari reverse
transkriptase HIV-1 merupakan enzim yang
inaktif. Reverse transkriptase dari M-MLV
berukuran 76 kilodalton. Struktur kristal
reverse transkriptase dari HIV-1 menunjukkan
bahwa jarak antara polimerase dan sisi aktif
RNase H adalah tujuh belas nukleotida untuk
substrat DNA/DNA dan delapan belas
nukleotida untuk substrat RNA/DNA (Schultz
& Champoux 2009).
Beberapa struktur dari RNase-H telah
ditentukan seperti dari Escherichia coli,
3
human immunodeficiency virus tipe 1 (HIV1), Thermus thermophilus HB8, dan Bacillus
halodurans. Struktur dari enzim tersebut
memiliki kemiripan satu dengan lainnya.
Struktur kristal dari enzim lain yang memiliki
aktifitas nuklease juga menunjukkan pelipatan
struktur tersier yang serupa dengan RNase-H.
Retroviral RNase-H dari virus yang berbeda
memiliki aktifitas serupa, tetapi terdapat
perbedaan penting seperti struktur pengenalan
substrat dan perbedaan substrat (Lim et al.
2006). RNase-H memiliki empat residu asam
amino yang dilestarikan. Asam amino ini
mengkoordinasi pengikatan kation divalen,
walaupun hanya tiga residu pertama yang
diperlukan untuk aktifitasnya. Struktur kokristal menunjukkan dua ion magnesium yang
berikatan dengan sisi aktifnya (Nowotny et al.
2005).
Retrovirus
Retrovirus merupakan golongan virus yang
memiliki dua utas tunggal RNA yang identik
sebagai genom. Molekul RNA dari virus ini
akan disintesis menjadi DNA oleh enzim
reverse transkriptase yang dimiliki oleh semua
virus keluarga ini. Molekul DNA yang telah
disintesis oleh enzim reverse transkriptase
akan masuk ke dalam inti sel inang dan
berintegrasi ke dalam kromosom sel inang
dengan bantuan enzim integrase. Molekul
DNA ini bersifat stabil dalam bentuk provirus
dan dapat ditransfer ke dalam organisme
inang turunannya (Fridman 2002).
Bentuk
partikel
virion
retrovirus
menyerupai bola dengan diameter sekitar 100
nm dan dikelilingi oleh selubung virus yang
mengandung
membran
lipid
bilayer.
Permukaan selubung virus terdapat tonjolantonjolan yang tersusun atas glikoprotein
(Gambar 1). Nukleokapsid internal yang
terdapat di bawah membran dengan bentuk
bervariasi merupakan dasar klasifikasi
retrovirus yang secara morfologi dibagi ke
dalam tipe A, B, C, dan D. Klasifikasi lain
dalam famili retroviridae ditetapkan pada
tahun 2002 oleh International Comitte on
Taxonomy of Viruses (ICTV). Klasifikasi ini
menetapkan famili retroviridae dibagi ke
dalam tujuh genus, lima genus berpotensi
onkogenik yaitu alfaretrovirus; betaretrovirus;
gamaretrovirus;
deltarerovirus;
dan
epsilonretrovirus, dua genus lain adalah
lentivirus, dan spumavirus (Carter & Saunders
2007). Genom retrovirus berupa RNA utas
tunggal ganda yang bersifat identik.
Organisasi
genom
RNA
retrovirus
digambarkan dalam bentuk blok sekuens yang
penting (Gambar 2). Ujung 5’RNA berupa
penutup (capped).
Ujung 3’ mengandung untaian poli (A)
sebesar 200 basa. Setelah ujung 5’dan
sebelum poli(A) terdapat sekuen R (repeat).
Sekuen U5 merupakan sekuen unik 5’ yang di
dalamnya mengandung sisi att yang
diperlukan untuk integrasi provirus dan yang
pertama mengalami transkipsi balik. Setelah
daerah U5 terdapat sekuens primer binding
site (PBS), sekuens ini merupakan tempat
tRNA inang terhibridisasi dengan genom.
Daerah setelah PBS mengandung sinyal utama
untuk enkapsidasi RNA virus ke dalam
partikel virion yang dikenal dengan elemen
Psi (Coffin et al. 1997).
Retrovirus memiliki tiga gen utama yaitu
gag untuk group-specific antigen, pol untuk
polimerase, dan env untuk envelope.
Polypurine tract (ppt) berada setelah gen
utama mengandung paling sedikit sembilan
residu A atau G, berperan dalam inisiasi
selama proses transkipsi balik. Daerah U3
mengandung sejumlah cis-acting element
untuk ekspresi gen virus dan satu sisi att
untuk integrasi DNA (Coffin 1997).
Simian Retrovirus
Simian Retrovirus merupakan virus yang
termasuk ke dalam genus betaretrovirus
famili Retriviridae yang secara etiologi
berhubungan dengan terjadinya sindrom
penurunan kekebalan tubuh pada satwa
primata (simian acquired immunedeficiency
syndrome, SAIDS) dengan berbagai tingkat
Gambar 1 Struktur virion retrovirus
(http://www.epidemic.org)
PPT U3 R
R U5 PBS Leader
gag
Cap
pol
env
A(n)
Gambar 2 Organisasi genom RNA retrovirus
(Carter &Saunders 2007)