aplikasi dna barcode pada penentuan spesies ikan
advertisement
APLIKASI DNA BARCODE PADA PENENTUAN SPESIES IKAN DANAU LAUT TAWAR, NANGGROE ACEH DARUSSALAM YANTI ARIYANTI DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012 ABSTRAK YANTI ARIYANTI. Aplikasi DNA Barcode pada Penentuan Spesies Ikan Danau Laut Tawar, Nanggroe Aceh Darussalam. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan R.R. DYAH PERWITASARI. Danau Laut Tawar merupakan danau purba yang terisolasi tanpa inlet dan outlet sungai dengan laut sehingga mempengaruhi asal-usul spesies ikan yang saat ini beragam di danau tersebut. Kesalahan identifikasi morfologi dapat disebabkan oleh fenomena cryptic species maupun siblings species. Fenomena tersebut dapat menyebabkan masalah sinonim yaitu terdapat nama ganda pada satu spesies yang sama atau sebaliknya. Penelitian ini menerapkan teknik DNA barcode dengan analisis perbedaan nukleotida dan jarak genetik untuk penentuan spesies beberapa spesies ikan air tawar yang terdapat di Danau Laut Tawar. Tujuh sampel berhasil diidentifikasi dengan baik secara morfologi, Ketujuh sampel tersebut terdiri atas lima spesies yang termasuk ke dalam empat famili. Setelah dilakukan barcode secara molekuler menggunakan gen COI, maka dapat dipastikan hanya terdapat empat spesies yaitu Channa gachua, Xiphoporus helleri, Oreochromis sp. KM 2006, Trichopsis vittata. Satu spesies yang pada identifikasi morfologi diduga Poecilia latipinna, dapat dipastikan Xiphoporus helleri. Kata kunci : Ikan, Air tawar, Danau Laut Tawar, DNA barcode, penentuan spesies ABSTRACT YANTI ARIYANTI. DNA Barcode Application for Fish Species Determination of Lake Laut Tawar, Nanggroe Aceh Darussalam. Supervised by ACHMAD FARAJALLAH and R.R. DYAH PERWITASARI. Lake Laut Tawar is an isolated ancient lake without inlet and outlet streams that affect the origin of fish species. Morphological identification errors occured due to the phenomenon of cryptic or siblings species. Both of them could cause problems on synonym that are multiple names on one species or vice versa. This study applied the DNA barcoding technique with nucleotides differences and genetic distance for determining some species of freshwater fishes that found in Lake Laut Tawar. Seven samples were morphologically identified as five species which were included in four families. Based on COI gene analyses, those five species have been successfully identified into four species: Channa gachua, Xiphoporus helleri, Oreochromis sp. KM 2006, and Trichopsis vittata. One species that had been expected as Poecilia latipinna, turns out to be Xiphoporus helleri. Key word : Fish, Fresh water, Lake Laut Tawar, DNA barcode, determination of certain species APLIKASI DNA BARCODE PADA PENENTUAN SPESIES IKAN DANAU LAUT TAWAR, NANGGROE ACEH DARUSSALAM YANTI ARIYANTI Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012 Judul Skripsi : Aplikasi DNA Barcode pada Penentuan Spesies Ikan Danau Laut Tawar, Nangroe Aceh Darussalam. Nama : Yanti Ariyanti NIM : G34080045 Disetujui Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si Pembimbing I Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc Pembimbing II Diketahui Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. Ketua Departemen Biologi Tanggal lulus: v PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan hidayah-Nya sehingga dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul Aplikasi DNA Barcode pada Penentuan Spesies Ikan dari Danau Laut Tawar, Nanggroe Aceh Darussalam. Penelitian dilaksanakan mulai bulan Februari hingga April 2012 di laboratorium zoologi bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si dan Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc selaku pembimbing, yang telah memberikan ilmu, pengarahan dan bimbingannya kepada penulis. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ibu Ria Ibrahim M.Si dari Jurusan Budidaya Perairan, Fakultas Pertanian, Universitas Gajah Putih, Aceh Tengah, selaku kolektor sampel dalam penelitian ini, serta kepada Dr. Nunik Sri Ariyanti, M.Si. selaku penguji yang telah memberikan saran dan kritik dalam penyusunan skripsi ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada keluarga tercinta terutama apa (Ridwan Hermawan) dan mamah (Aam Sutiamah) atas segala doa, kasih sayang, dan dukungannya yang tiada henti. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh keluarga besar zoologi (Mba Tini, Mba Kanthi, Kak Sarah Nila, Ibu Taruni, Mba Ani, Pak Adi, Mas Wildan, Mba Dea, Kak Upi, Kak Eni, Kak Gina, Esa, Shinta, Ammar, Agus Heryanto, Puspa, Traya, dan Tami) yang telah berbagi ilmu serta segala dukungannya, kepada sahabat seperjuangan (Liliani Isna Devi, Delfi Riana, Akhmad Nasokha, Dalfit, Agus Supriadi, dan Adit) atas segala bantuan, nasehat, dan semangat yang selalu diberikan selama penelitian, dan kepada teman di Wisma Andaleb I (Silva Dwika M, Riska, dan seluruh Andalebers), UKM LISES Gentra Kaheman IPB serta kepada teman-teman seperjuangan Biologi angkatan 45 khususnya Prima Novitasari, Galuh Permata Sari dan ALGA (Aldi, Abdi, Raka, dan Hafiz) atas persahabatan, keceriaan, dan segala dukungan yang telah mereka berikan kepada penulis. Karya ilmiah ini hanya sebagai persembahan kecil dalam peristiwa kehidupan berharga penulis, semoga bermanfaat dan menambah khasanah ilmu pengetahuan kita semua. Bogor, September 2012 Yanti Ariyanti vi RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Ciamis pada tanggal 2 Maret 1990, merupakan anak semata wayang dari Bapak Ridwan Hermawan dan Ibu Aam Sutiamah. Penulis lulus dari SMAN 1 Ciamis pada tahun 2008. Pada tahun yang sama penulis diterima di IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama studi penulis aktif di berbagai organisasi mahasiswa. Tahun 2009 sebagai staf Paguyuban Mahasiswa Biologi (Pamabi) Himpunan Mahasiswa Biologi IPB, tahun 2010 sebagai sekretaris umum Unit Kegiatan Mahasiswa LISES Gentra Kaheman serta terlibat dalam beberapa kepanitiaan kegiatan kampus seperti IPB Art Contest, Pesta Sains, Biologi Interaktif, dan Masa Perkenalan Departemen. Penulis pernah menjadi asisten praktikum Biologi Dasar Tingkat Persiapan Bersama, Botani Umum, dan Struktur Hewan. Penulis telah melakukan praktik lapangan pada bulan Juli 2011 di tempat Konservasi Penyu Kelompok Pelestari Biota Laut (KPBL) Pantai Batu Hiu, Ciamis, Jawa Barat. Selama studi penulis juga menerima beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA). vii DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL .............................................................................................................................viii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................................................viii DAFTAR LAMPIRAN .....................................................................................................................viii PENDAHULUAN ............................................................................................................................... 1 Latar Belakang........................................................................................................................ 1 Tujuan ..................................................................................................................................... 1 BAHAN DAN METODE ................................................................................................................... 1 Bahan ...................................................................................................................................... 1 Sortir dan Identifikasi Sampel ................................................................................................ 1 Ekstraksi dan Isolasi DNA...................................................................................................... 1 Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA ........................................................................... 1 Perunutan Amplikon dan Analisis DNA ................................................................................ 2 HASIL ................................................................................................................................................ 2 Sortir dan Identifikasi Sampel ................................................................................................ 2 Amplifikasi dan Visualisasi DNA .......................................................................................... 3 Analisis DNA dan Filogeni .................................................................................................... 3 PEMBAHASAN ................................................................................................................................. 5 SIMPULAN ........................................................................................................................................ 6 SARAN ............................................................................................................................................... 6 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................................................... 7 LAMPIRAN ........................................................................................................................................ 8 viii DAFTAR TABEL Halaman 1 Tabel 1 Hasil identifikasi morfologi spesimen ikan .......................................................................... 2 2 Tabel 2 Hasil identifikasi morfologi dan barcode ............................................................................. 3 3 Tabel 3 Jumlah perbedaan nukleotida dan jarak genetik gen COI antar spesies ............................... 4 DAFTAR GAMBAR 1 Gambar 1 Produk PCR berupa pita tunggal yang diuji dengan menggunakan polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% .............................................................................................................. 3 2 Gambar 2 Hasil rekonstruksi pohon filogeni pengelompokan sampel berdasarkan ruas COI mtDNA menggunakan metode NJ dengan bootstrap 1000x ............................................................ 4 DAFTAR LAMPIRAN 1 Lampiran 1 Gambar spesimen ikan yang disortir dan diidentifikasi secara morfologi dan barcode. 9 2 Lampiran 2 Ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode GeneAid .................................................. 10 3 Lampiran 3 Hasil Visualisasi fragmen DNA (penyajian produk PCR) ........................................... 11 4 Lampiran 4 Hasil pensejajaran tujuh runutan DNA sampel dengan referensi GenBank sepanjang 605 nt .............................................................................................................................................. 12 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Indonesia memiliki kekayaan spesies ikan yang sangat tinggi. Diperkirakan 8500 spesies ikan hidup di perairan Indonesia bagian barat dan merupakan 45% dari jumlah spesies global di dunia (Budiman et al. 2002). Kottelat et al. (1993) mencatat 272 spesies ikan air tawar di Sumatera dan 30 spesies termasuk ikan endemik. Menurut Wargasasmita (2002), dari 589 spesies ikan air tawar yang tercatat sebagai penghuni ekosistem perairan tawar Sumatera, 58 spesies termasuk kelompok ikan endemik. Tempattempat yang kaya akan ikan air tawar meliputi sungai baik di dataran tinggi maupun dataran rendah, rawa gambut dan danau termasuk Danau Laut Tawar yang menjadi tempat asal pengambilan sampel dalam penelitian ini. Danau Laut Tawar merupakan danau kaldera purba yang terbentuk dari proses vulkanik (Muchlisin et al. 2010). Secara astronomis Danau Laut Tawar berada pada 4050’ LU dan 96050’ BT, terletak pada elevasi 1230 m di atas permukaan laut dan merupakan danau terbesar di Provinsi Nanggroe Aceh Darussalam. Merujuk letak dan proses pembentukan, Danau Laut Tawar merupakan danau purba yang terisolasi tanpa inlet dan outlet sungai dengan laut sehingga mempengaruhi asal-usul spesies ikan yang saat ini beragam di danau tersebut. Pesatnya perkembangan taksonomi ikan dari Indonesia bagian Barat dan Sulawesi meyebabkan pertambahan hampir dua kali lipat spesies ikan spesies baru pada kurun waktu 19932002. Namun hal tersebut tidak terlepas dari kemungkinan kesalahan peneliti yang mengidentifikasi spesies secara morfologi saja. Kesalahan identifikasi dapat disebabkan oleh fenomena cryptic species maupun siblings species. Kedua fenomena tersebut dapat menyebabkan masalah sinonim yaitu terdapat nama ganda pada satu spesies yang sama atau sebaliknya (Bickford et al. 2006). Penggunaan DNA mitokondria (mtDNA) dalam analisis biogeografi dan sistematik pada hewan sering tidak sejalan dengan analisis morfologi. Salah satu penyebabnya yaitu karakter morfologi seringkali memperlihatkan fenomena species cryptic. Teknik DNA barcoding dapat menyediakan sebuah “barkode biologi” dari urutan pendek DNA yang distandardisasi untuk mengenali suatu spesies (Hajibabaei et al. 2006). Ide penggunaan barcoding ditujukan untuk membedakan spesies dan mengidentifikasi spesimen yang sulit dikenali, seperti fase larva, potongan organ maupun material yang mengalami pemrosesan, dengan menggunakan sekuens gen yang cukup pendek (Hebert et al. 2003). Gen sitokrom oksidase subunit 1 yang dikenal sebagai COI, merupakan salah satu gen dalam genom mitokondria (mtDNA) yang sekuennya biasa digunakan sebagai barcode. Perkembangan literatur tentang barcode DNA menunjukkan bahwa sebuah fragmen pendek COI dapat digunakan sebagai penanda variasi yang secara akurat dapat mengidentifikasi berbagai macam hewan sampai tingkat spesies (Waugh 2007). Tahun 2005, perikanan dipilih sebagai target utama untuk cakupan barcode dunia terkait kepentingan sosial ekonomi, sehingga saat ini lebih dari 5000 spesies telah berhasil diidentifikasi (Wong & Hanner 2008). Hal ini mencakup baik ikan air tawar (Hubert et al. 2008) maupun ikan laut (Rock et al. 2008) sehingga teknik DNA barcoding memainkan peranan penting sebagai alat bantu taksonomi untuk mengungkap secara genetik spesies yang berbeda dan terpisah secara cepat dan akurat. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan memastikan spesies ikan yang berasal dari Danau Laut Tawar dengan mengaplikasikan teknik DNA barcoding. BAHAN DAN METODE Bahan Sampel ikan merupakan koleksi Ibu Ria Ibrahim, M.Si yang diambil dari Danau Laut Tawar, Takengon, Aceh Tengah. Sampel telah dipreservasi dalam etanol 70% dan EDTA 10 mM. Sortir dan Identifikasi Sampel Sampel disortir kemudian diidentifikasi dengan menggunakan kunci identifikasi Kottelat (1993). Ekstraksi dan Isolasi DNA Sampel jaringan yang digunakan sebagai sumber DNA adalah jaringan otot dari bagian tubuh dorsal (epaxial muscle). Proses pencucian alkohol pengawet dilakukan dengan cara merendam sekitar 50 mg potongan otot dalam aquades steril, kemudian dihomogenasi dalam bufer STE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 0.1mM, pH 8). Jaringan otot dihancurkan kemudian dilisis 2 menggunakan proteinase K 0,125 mg/ml dan sodium dodesil sulfat 1%. Pemisahan dan pemurnian DNA dari bahan organik lain selanjutnya mengikuti petunjuk kit ekstraksi Genomic DNA mini kit for animal tissue (Geneaid Biotech Ltd) (Lampiran 2). Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA Amplifikasi ruas gen COI DNA mitokondria dilakukan menggunakan primer universal gen COI pada ikan (http://ibol.org) yaitu primer forward AF282 (5’-TCTACCAA CCACAAAGACATCGG-3’) dan primer reverse AF283 (5’-TACTTCTGGGTGTCCR AAGAATCA-3’). Reaksi PCR dilakukan dalam volume 25 μL yang mengandung Buffer Thermophol, 0.25 mM, deoxynucleotide triphosphate (dNTPs), 2.0 mM MgCl2, 1 µL masing-masing primer, dan 0.5 unit RBC Taq Polimerase Mastermix. Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi predenaturasi pada suhu 94oC selama 5 menit, kemudian dilanjutkan 30 siklus yang terdiri atas denaturasi suhu 94oC selama 1 menit, penempelan primer suhu 55oC selama 1,5 menit, pemanjangan 72oC selama 2 menit dan diakhiri pemanjangan akhir suhu 72oC selama 5 menit. Keberhasilan PCR diamati menggunakan metode polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% yang dijalankan pada tegangan 200 V selama 50 menit yang dilanjutkan dengan pewarnaan sensitif perak (Lampiran 3) (Byun et al. 2009). Perunutan Amplikon dan Analisis DNA Cetakan yang dijadikan PCR for sequencing merupakan amplikon dengan kualitas pita tunggal menggunakan metode big dye terminator dan primer yang sama dengan amplifikasi awal. Hasil perunutan nukleotida diedit secara manual berdasarkan kromatogram kemudian dijadikan input dalam pencarian kesamaan gen menggunakan BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Runutan nukleotida semua sampel dan yang homolog hasil BLAST saling disejajarkan menggunakan Clustal W versi 2.0 yang terdapat dalam program MEGA versi 5.00 (Tamura et al. 2011). Analisis keragam nukleotida dilakukan untuk menentukan spesies menggunakan model Number of differences dan analisis filogenetik menggunakan metode Neighbor Joining berdasarkan model subtitusi Kimura-2parameter. HASIL Sortir dan Identifikasi Sampel Sortir dilakukan pada sekumpulan ikan dengan berbagai fase dan ukuran dari Danau Laut Tawar. Penyortiran kasar dilakukan berdasarkan perbedaan penampakan morfologi luar yang meliputi bentuk tubuh dan ciri-ciri spesifik yang dimiliki spesimen seperti bentuk sirip, garis-garis melintang pada tubuh, serta pola warna sehingga diperoleh 17 variasi morfologi (Lampiran 1). Setiap variasi morfologi diambil dua kali ulangan untuk dilakukan barcode secara molekuler. Sebanyak 20 sampel berhasil diamplifikasi dan menghasilkan pita tunggal saat visualisasi pada gel akrilamid 6%. Namun hanya terdapat tujuh sampel yang ukuran pita DNA nya sesuai target (600-700 pb). Tujuh sampel yang berhasil diamplifikasi dan menghasilkan pita DNA sesuai target (600700 pb) kemudian diidentifikasi lebih lanjut secara morfologi berdasarkan kunci identifikasi Kottelat et al. (1993). Hasil identifikasi morfologi terdiri atas empat famili dan lima spesies (Tabel 1) Tabel 1 Hasil identifikasi morfologi spesimen ikan Sampel 5a 8a 8b 12b 13b 14a 14b Identifikasi morfologi Channa striata Xiphoporus helleri Xiphoporus helleri Poecilia latipinna Oreochromis niloticus Trichopsis vittata Trichopsis vittata Famili Channidae Poeciliidae Poeciliidae Poeciliidae Cichlidae Belontiidae Belontiidae Channa striata memiliki ciri sisi badan mempunyai pita warna berbentuk <; mengarah ke depan; bagian atas umumnya tidak jelas pada spesies dewasa; tidak ada gigi bentuk taring pada vomer dan palatine; 4-5 sisik antara gurat sisi dan pangkal jari-jari sirip punggung bagian depan. Xiphophorus hellerii memiliki garis lateral melintang berwarna cokelat hingga kehitaman, organisme jantan memiliki sirip ekor berujung tajam di sudut agak bawah dengan pola warna bervariasi. Poecilia latipinna memiliki sirip punggung besar; dikenal memiliki beberapa pola pewarnaan. Oreochromis niloticus memiliki garis warna tegak terdapat pada sirip ekor, hampir seluruhnya berwarna hitam; beberapa pita warna pada badan (tidak jelas pada yang dewasa), mulut mengarah ke atas tenggorok, sirip dada, sirip perut, sirip ekor, dan ujung sirip punggung berwarna merah 3 Tabel 2 Hasil identifikasi morfologi dan barcode Sampel Identifikasi morfologi 5a 8a 8b 12b 13b 14a 14b Channa striata Xiphoporus helleri Xiphoporus helleri Poecilia latipinna Oreochromis niloticus Trichopsis vittata Trichopsis vittata Ordo Perciformes Cyprinodontiformes Cyprinodontiformes Cyprinodontiformes Perciformes Perciformes Perciformes ketika musim bekembang biak. Trichopsis vitatta memiliki ciri ujung-ujung sirip ekor, sirip punggung dan sirip dubur meruncing; mempunyai tiga garis warna gelap memanjang (kadang-kadang 2 atau 4) (Kottelat et al. 1993). Setelah dilakukan barcode secara molekuler menggunakan gen COI, maka dapat dipastikan hanya terdapat empat spesies yaitu Channa gachua, Xiphoporus helleri, Oreochromis sp. KM 2006, Trichopsis vittata (Tabel 2). Amplifikasi dan Visualisasi DNA Gen COI target diamplifikasi menggunakan pasangan primer AF282-AF283 berukuran sekitar 700 pb. Suhu optimum penempelan primer pada saat amplifikasi yaitu 55°C. Sebanyak 20 sampel yang pita DNA targetnya terbaca jelas (Gambar 1) dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing. Setelah DNA target dimurnikan dan dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing, maka diperoleh tujuh sampel yang runutan nukleotidanya terbaca dengan jelas pada kromatogram. M 5a 8a 8b 12b 13b 14a 14b 500 pb 600 pb 700 pb Gambar 1 Amplikon gen COI di atas PAGE 6%. Keterangan : M=Marker, 5a-14b=Nomor sampel Analisis DNA dan Filogeni Berdasarkan hasil pensejajaran antar sampel, diperoleh 606 nt (nukleotida) ruas DNA yang saling sejajar. Dari 606 nt, terdapat Famili Channidae Poeciliidae Poeciliidae Poeciliidae Cichlidae Belontiidae Belontiidae Identifikasi Barcode Channa gachua Xiphoporus helleri Xiphoporus helleri Xiphoporus helleri Oreochromis sp. KM 2006 Trichopsis vittata Trichopsis vittata 347 nt yang sama dan 259 nt yang saling berbeda antar sampel. Penentuan kepastian spesies dilakukan dengan cara masing-masing sampel dijadikan input dalam analisis kesamaan BLAST, sehingga diperoleh 103 runutan nukleotida yang homolog. Runutan panjang DNA sampel yang dapat dianalisis selanjutnya sebanyak 605 nt (Lampiran 4). Sampel dengan nilai perbedaan nukleotida paling kecil menunjukkan tingkat kesamaan yang tinggi. Sampel nomor 5a dengan sampel Channa gachua (referensi dari GeneBank), sampel 8a dengan sampel Xipophorus hellerii (referensi dari GeneBank), dan sampel 13b dengan Oreochromis sp. KM 2006 (referensi dari GeneBank) masing-masing mempunyai runutan nukleotida yang identik. Jumlah perbedaan nukleotida terbesar terdapat antara sampel 5a dengan sampel 12b dan sampel 12b dengan sampel Channa gachua (referensi dari GeneBank), yaitu berbeda 195 nukleotida (Tabel 3). Kekerabatan antar spesies dianalisis dengan topologi pohon filogeni menggunakan metode Neighbor Joining dengan bootstrap 1000X (Gambar 2). Hasil rekonstruksi pohon filogeni mengelompokkan sampel menjadi dua klad. Sampel 5a, 13b 14a, dan 14b mengelompok dalam satu klad yang merupakan ordo Perciformes. Sampel 8a, 8b, dan 12b mengelompok dalam satu klad yang merupakan ordo Cyprinodontiformes. Sampel 8a, 8b, dan 12b dipastikan sebagai Xiphophorus hellerii. Sampel 14a dan 14b saling berkerabat dekat dan dipastikan sebagai Trichopsis vittata. Sampel 5a yang sebelumnya diduga Channa striata berkerabat dekat dengan Channa gachua dari GenBank. 4 13b 14a 14b 0.063 0.079 0.015 0.186 0.118 0.124 0.046 0.028 0.043 0.151 0.068 0.052 0.068 0.160 0.049 0.085 0.073 0.087 0.176 0.070 0.035 0.000 0.063 0.079 0.186 0.046 0.068 0.085 0.063 0.000 0.015 0.118 0.028 0.052 0.073 0.063 0.055 0.044 0.060 0.167 0.038 0.012 0.033 0.055 0.044 7 73 117 136 144 147 0 132 117 125 129 76 124 143 150 154 7 139 124 131 136 166 175 183 195 73 178 166 178 177 128 138 133 117 124 0 115 110 Keterangan: 5a-14b: sampel yang berhasil diidentifikasi secara barcode (1 Nomor aksesi GenBank (HM345938) (2 Nomor aksesi GenBank (HM345930) (3 Nomor aksesi GenBank (GQ911985) 19 138 136 6 128 115 109 147 144 17 138 123 117 147 133 133 122 126 132 117 125 129 124 110 103 0.046 0.028 0.043 0.151 0.000 0.049 0.070 0.046 0.028 0.038 0.041 0.046 0.062 0.172 0.036 0.057 0.076 0.041 0.046 0.044 0.036 115 110 C. rostrata 12b M.plagiostomus 147 154 195 133 138 147 0 147 133 133 122 126 8b Oreochromis sp. 5a 8a 8b 12b 13b 14a 14b C. gachua (1 X. helleri (2 T. vittata (3 Oreochromis sp.(4 M.plagiostomus (5 C. rostrata (6 8a T. vittata 5a X. helleri Sampel C. gachua Tabel 3 Jumlah perbedaan nukleotida (diagonal bawah) dan jarak genetik (diagonal atas) antar spesies 0.044 0.038 0.054 0.160 0.028 0.038 0.059 0.044 0.038 0.025 0.028 0.033 115 (4 Nomor aksesi GenBank (AP009126) (Oreochromis sp. KM 2006) (5 Nomor aksesi GenBank (FN813070) (6 Nomor aksesi GenBank (GU225161) 85 100 64 14a 14b Trichopsis vittata Perciformes Canthigaster rostrata 81 Mastacembelus plagiostomus 5a 59 100 Channa gachua 13b 100 Oreochromis sp. KM 2006 12b 100 54 8a Cyprinodontiformes 8b 25 Xiphophorus hellerii 0.02 Gambar 2 Hasil rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan ruas COI mtDNA menggunakan metode NJ dengan bootstrap 1000X. 5 PEMBAHASAN Spesimen-spesimen yang telah diawetkan sangat sulit untuk diidentifikasi secara morfologi, sehingga pola warna pada waktu hidup sangat berguna untuk melakukan identifikasi. Pola warna dipengaruhi oleh keadaan kematangan kelamin, keadaan reproduksi, spesies kelamin, dan beberapa faktor geografi. Spesimen yang lebih tua cenderung berwarna lebih gelap dan pola warna pada badan menjadi tidak jelas sehingga menyulitkan identifikasi (Kottelat et al. 1993). Penggunaan alkohol sebagai pengawet spesimen penelitian dengan waktu penyimpanan yang cukup lama dapat menyebabkan perubahan warna maupun rusaknya beberapa bagian tubuh spesimen yang rapuh, sehingga menyebabkan kesulitan identifikasi morfologi yang berakibat pada kesalahan identifikasi beberapa spesies. Kesalahan identifikasi juga dapat disebabkan oleh kesamaan morfologi maupun kesulitan pengidentifikasian pada spesies dengan berbagai ukuran dalam fase kehidupan yang sulit dibedakan. Pengembangan pustaka barcode dapat dijadikan suatu cara identifikasi sampai tingkat spesies dengan tingkat kebenaran yang tinggi. Ruas basa dari gen COI bermutasi cukup cepat sehingga dapat membedakan spesies yang hampir mirip (Hebert et al. 2003). Teknik barcoding juga dapat membantu pengungkapan spesies yang bersifat cryptic maupun siblings seperti yang terjadi pada fenomena dimorfisme ikan Xiphoporus helleri dalam penelitian ini. Hasil identifikasi morfologi berdasarkan Kottelat et al. (1993) mengelompokkan tujuh sampel menjadi empat famili dan lima spesies. Setelah dilakukan barcode secara molekuler menggunakan gen COI, maka dapat dipastikan hanya terdapat empat spesies yaitu Channa gachua, Xiphoporus helleri, Oreochromis sp. KM 2006, dan Trichopsis vittata. Channa gachua merupakan anggota famili Channidae. Hidup di kawasan tropis Afrika Asia Selatan, Asia Tenggara, dan Asia Timur. Kadang-kadang disebut ikan berkepala ular karena kepalanya lebar dan bersisik besar, mulutnya bersudut tajam, panjang serta tinggi sirip punggung dan dubur hampir sama. Pita warna gelap melintang badan pada Channa gachua terlihat berberbentuk ‘<‘ dan berwarna kurang jelas sehingga terlihat menyerupai Channa striata. Xiphoporus helleri merupakan anggota famili Poecillidae. Hidup di air tawar maupun air payau yang penyebaran alamiahnya terbatas di bagian selatan Amerika Serikat dan Argentina Selatan. Sirip dubur pada jantan mengalami perubahan menjadi gonopodium yang berfungsi untuk mengeluarkan sperma ke dalam tubuh betina. Xiphoporus helleri merupakan ikan dimorfisme yaitu memiliki perbedaan morfologi antara jantan dengan betina. Xiphoporus helleri jantan sering disebut sebagai ikan ekor pedang karena sirip ekor bagian bawah berbentuk panjang meruncing seperti pedang sedangkan morfologi betina lebih mirip Poecilia latipinna. Hal ini menjadi salah satu sebab kekeliruan identifikasi morfologi pada spesies yang diduga Poecilia latipinna selain kedua spesies termasuk dalam famili yang sama. Oreochromis sp. merupakan anggota famili Cichlidae. Hidup air tawar, berasal dari Amerika Tengah dan Selatan, Afrika, Asia Kecil, India, dan Sri Lanka. Dua spesies Oreochromis diintroduksi ke Indonesia melalui budidaya di kolam juga dilepaskan di danau-danau dan sungai-sungai. Famili ini bersifat omnivora dan bisa memakan ikanikan kecil lainnya sehingga banyak ikan spesies asli Indonesia terancam bahkan punah karena dimangsa oleh ikan-ikan anggota famili ini. Trichopsis vittata merupakan anggota famili Belontiidae. Ikan famili ini mempunyai labirin, hidup terbatas di perairan tawar Asia dari India sampai China dan Indonesia Bagian Barat. Hidup di air tenang dan kadang-kadang di perairan dengan konsentrasi oksigen rendah (Kottelat et al. 1993). Jumlah perbedaan runutan nukleotida antar sampel dianalisis menggunakan model Number of differences, sedangkan jarak genetik dilakukan menggunakan model subtitusi Kimura-2-parameter (K2P). Model K2P lebih efektif untuk barcoding, karena opsi tersebut mempertimbangkan tingkat substitusi transisi dan transversi. Sampel 8a dengan 8b dan sampel 14a dengan 14b masing-masing memiliki perbedaan nukleotida sebesar 7 nt dan 19 nt. Sampel 5a, 8a, dan 13b tidak memiliki perbedaan nukleotida dengan spesies pembanding dari GenBank yaitu masing-masing dengan sampel Channa gachua (HM345938), Xiphophorus hellerii (HM345930), dan Oreochromis sp. KM2006 (AP009126). Sampel 14a dan 14b sebagai Trichopsis vittata dipastikan (GQ911985) dengan perbedaan nukleotida masing-masing 6 nt dan 17 nt. Analisis jarak genetik menunjukkan bahwa antara sampel 5a dengan sampel 6 Channa gachua (referensi dari GeneBank), sampel 8a dengan Xipophorus hellerii (referensi dari GeneBank), dan sampel 13b dengan Oreochromis sp. KM 2006 (referensi dari GeneBank) identik. Jarak genetik terbesar ditemukan pada sampel 5a dengan sampel 12b serta sampel 12b dengan sampel Channa gachua (referensi dari GeneBank) yaitu sebesar 0.186 (18.6%). Perbedaan nukleotida dan jarak genetik antar spesies membuktikan bahwa spesies yang semula diidentifikasi berdasarkan morfologi saja masih mungkin terdapat kesalahan. Sampel 12b yang sebelumnya diduga sebagai Poecilia latipinna ternyata memiliki nilai homologi yang tinggi dengan Xiphophorus hellerii dari GenBank dengan jarak genetik yaitu sebesar 0.118 (11.8%) atau memiliki persentase kesamaan sekitar 88.2% setelah dilakukan barcode. Sama halnya dengan sampel 5a yang pada awalnya diduga sebagai Channa striata, memiliki homologi yang tinggi dengan Channa gachua (referensi dari GenBank) yaitu sebesar 100% (Tabel 2). Setelah dilakukan perbandingan dengan data dari GenBank, sampel 5a memang berasal dari Danau Laut Tawar sehingga kemungkinan berasal dari satu indukan yang sama. Sampel 13b menunjukkan kekerabatan yang dekat dengan Oreochromis sp. KM 2006. Dua spesies pembanding dari GenBank yaitu Mastacembelus plagiostomus dan Canthigaster rostrata menunjukkan bahwa dalam penentuan spesies, ketujuh sampel ikan yang diuji bukan termasuk ke dalam dua spesies tersebut. Merujuk letak dan proses pembentukan, Danau Laut Tawar merupakan danau purba yang terisolasi tanpa inlet dan outlet sungai dengan laut sehingga mempengaruhi asal-usul spesies ikan yang saat ini beragam di danau tersebut. Spesies-spesies yang diidentifikasi dalam penelitian ini terdistribusi di seluruh perairan tropis dan diperkirakan masuk ke Indonesia termasuk Danau Laut Tawar melalui introduksi yang dilakukan oleh para pembudidaya. Trichopsis vittata, Channa gachua, dan Oreocrhomis sp. KM 2006 dikelompokkan ke dalam ordo Perciformes sedangkan Xiphophorus hellerii termasuk ordo Cyprinodontiformes. Menurut Muchlisin et al. (2008), Perciformes merupakan ordo terbesar dari ikan-ikan yang hidup di perairan Aceh. Trichopsis vittata, Channa gachua, dan Xiphophorus hellerii dimanfaatkan sebagai ikan hias, sedangkan Oreocrhomis sp. dimanfaatkan sebagai ikan konsumsi (Hadiaty 2005). Menurut Wargasasmita (2002), terdapat dua jenis ikan air tawar endemik Sumatera terancam punah yang berhabitat di Danau Laut Tawar, yaitu Rasbora tawarensis dan Poropontius tawarensis. Sifat universal dari primer yang digunakan dalam penelitian serta keterbatasan data pustaka barcode ikan internasional, dapat menyebabkan sekuen DNA spesies ikan endemik seperti Rasbora tawarensis dan Poropontius tawarensis tidak teridentifikasi secara barcode. Pembuatan primer yang spesifik diharapkan dapat mengungkap sekuen DNA mitokondria spesies-spesies ikan endemik di Indonesia khususnya, sehingga membantu kelengkapan data pustaka barcode ikan dunia untuk keperluan penelitian sejenis. Penentuan spesies dengan mengaplikasikan DNA barcode dalam penelitian ini dapat dijadikan referensi dalam pengembangan akuakultur maupun konservasi ikan air tawar, khususnya di Danau Laut Tawar yang saat ini terjadi ketidakseimbangan antara pemanfaatan dan konservasi danau (Uswa 2008). SIMPULAN Sampel 13b dipastikan sebagai Oreocrhomis sp. KM 2006, 8a dan 8b sebagai Xiphophorus helleri serta 14a dan 14b sebagai Trichopsis vittata. Sampel 5a dan 12b yang masing-masing berdasarkan identifikasi morfologi diduga sebagai Channa striata dan Poecilia latipinna dapat dipastikan sebagai Channa gachua dan Xiphophorus helleri. SARAN Saran bagi penelitian ini adalah diperlukan penelitian lebih lanjut dengan pengembangan desain primer yang lebih spesifik sehingga dapat mengungkap sekuen DNA baik terhadap spesies ikan air tawar non endemik maupun endemik Danau Laut Tawar, seperti Rasbora tawarensis dan Poropuntius tawarensis. 7 DAFTAR PUSTAKA Bickford et al. 2006. Cryptic species as a window on diversity and conservation. Ecology and Evolution 22: 148-155. Budiman A, Arief AJ, Tjakrawidjaya AH. 2002. Peran museum zoologi dalam penelitian dan konservasi keanekaragaman hayati (ikan). Jurnal Iktiologi Indonesia 2: 51-55. Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An effective method for silverstaining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal Biochem 385: 174-175. Hadiaty RK. 2005. Keanekaragaman spesies ikan di Suaq Balimbing dan Ketambe, Taman Nasional Gunung Leuser, Provinsi Nanggroe Aceh Darussalam. J Biol. Indon 9: 379-388. Hajibabaei et al. 2009. DNA barcode distinguish species of tropical Lepidoptera. PNAS 103: 968-971. Hebert PDN, Ratnasingham S, de Waard JR. 2003. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc R Soc 270: 96–99. Hubert et al. 2008. Identifying Canadian freshwater fishes trough DNA barcode. Plos One 6: e2490. Kottelat M, AJ Whitten, S N Kartikasari, S Wirjoatmodjo. 1993. Ikan Air Tawar Indonesia Bagian Barat dan Sulawesi. Jakarta: Periplus edition. Muchlisin ZA, Azizah S, Huat KK, Rudi E. 2008. Keanekaragaman ikan air tawar di Nanggroe Aceh Darussalam (NAD), Indonesia. Jurnal Iktiologi indonesia 3: 1-9. Muchlisin ZA, Musri M, Azizah S. 2010. Spawning season of Rasbora tawarensis (Pisces: Cyprinidae) in Lake Laut Tawar, Aceh Province, Indonesia.Repr Biol and Endocrinology 8:49. Rock et al. 2008. DNA barcodes of fish of the Antarctic Scotia Sea indicate priority groups for taxonomyc and systematics focus. Antarctic Science 20:253-262. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 5.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599. Uswa M. 2008. Kajian penggunaan lahan di pinggir danau sebagai lahan pengembanga kota studi kasus Danau laut Tawar, Kota Takengon, Aceh Tengah [tesis]. Medan: Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara. Wargasasmita S. 2002. The freshwater fishes of endemic of Sumatra that threatened species. Jurnal Iktiologi Indonesia 2:4149 Waugh J. 2007. DNA barcoding in animal species: Progress, potential and pitfalls. BioEssays 29:188-197 Wong EHK & Hanner RH. 2008. DNA Barcoding detect market substitution in North American seafood. Food Research International 41:828-837. 8 LAMPIRAN 9 Lampiran 1 Gambar spesimen ikan yang disortir dan diidentifikasi secara morfologi dan barcode Spesies 1 Spesies 2 Spesies 3 Spesies 4 Spesies 5 Spesies 6 Spesies 7 Spesies 8 Spesies 9 Spesies 10 Spesies 11 Spesies 12 Spesies 13 Spesies 14 Spesies 15 Spesies 16 Spesies 17 10 Lampiran 2 Ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode GeneAid • Sekitar 50 mg jaringan otot dorsal (epaksial muscle) dipotong dan dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml. • Jaringan otot yang telah dipotong kemudian dicuci dengan air destilata sebanyak 2 kali ulangan menggunakan mesin sentrifuse. • Sampel yang telah dicuci kemudian dihomogenasi menggunkana grinder dan ditambahkan 200 µl buffer STE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 0.1mM, pH 8) ke dalam tube. • Sebanyak 50 mg/ml proteinase K 20 µl ditambahkan ke dalam tabung dan vortex selama beberapa detik. • Inkubasi pada suhu 600C selama 30 menit. Setiap 5 menit sekali tabung dibolak-balik secara perlahan. • Sebanyak 200 µl buffer GB ditambahkan ke dalam tabung dan vortex selama 5 detik. • Inkubasi pada suhu 700C selama 20 menit. Setiap 5 menit sekali tabung dibolak-balik secara perlahan. Pada saat yang bersamaan, inkubasi buffer elusi pada suhu yang sama untuk step elusi DNA. • Sebanyak 200 µl etanol ditambahkan ke dalam tabung dan vortex selama 10 detik. • Sampel dipindahkan ke dalam kolom GD pada tube 2 ml. • Sentrifugasi 13.000 rpm selama 2 menit. • Kolom GD dipindahkan ke dalam tabung koleksi yang baru dan supernatan dibuang. • Sebanyak 400 µl buffer W1 ditambahkan ke dalam tabung. • Sentrifugasi 13.000 rpm selama 30 detik. • Supernatan dibuang dan kolom GD diletakkan kembali ke dalam tabung. • Sebanyak 600 µl wash buffer (mengandung etanol) ditambahkan ke dalam kolom GD. • Sentrifugasi 13.000 rpm selama 30 detik. • Supernatan dibuang dan kolom GD diletakkan kembali ke dalam tabung. • Sentrifugasi 13.000 rpm selama 3 menit. • Kolom GD dipindahkan ke dalam tube 1,5 ml yang baru. • Sebanyak 100 µl buffer elusi yang telah diinkubasi ditambahkan ke dalam kolom GD (tepat bagian tengah matriks kolom GD). • Diamkan selama 5 menit. • Sentrifugasi 13.000 rpm selama 30 detik. • Kolom GD dibuang dan didapatkan DNA yang telah berhasil diekstraksi. 11 Lampiran 3 Visualisasi fragmen DNA (penyajian produk PCR) • Gel yang telah dielektroforesis kemudian dikeluarkan dari kaca dan dibilas dengan DW (air destilata) sebanyak 200 ml. • Air destilata dibuang*, gel direndam dalam larutan A. • Gel direndam dalam larutan A selama 8 menit. Pada saat yang bersamaan, larutan B dipanaskan pada suhu 550C. • Kemudian air larutan A dibuang ke dalam botol khusus Ag. • Gel dibilas dengan DW sebanyak 200 ml, kemudian DW dibuang. • Gel direndam dalam larutan B yang telah ditambahkan formaldehid. • Gel direndam hingga muncul pita. • Air larutan B dibuang • Gel direndam dalam larutan C selama 2 menit. Catatan: Larutan A: DW 200 ml AgNO3 0,2 gram NaOH 10N 80 µl (sebaiknya dibuat fresh) amonia 0,8 ml Larutan B: DW 200 ml NaOH 6 gram Formaldehid 100 µl ( ditambahkan sesaat sebelum dituang) Larutan C: DW 100 ml Asetat 100 µl *Setiap larutan dibuang dengan cara dihisap/disedot menggunakan alat vakum penyedot. 12 Lampiran 4 Hasil pensejajaran tujuh DNA sampel dengan referensi GenBank sepanjang 605 nt. 1 5a 2 8a 3 8b 4 12b 5 13b 6 14a 7 14b 8 Channa gachua 9 Xiphophorus hellerii 10 Trichopsis vittata 11 Oreochromis sp.KM 2006 12 Mastacembelus plagiostomus 13 Canthigaster rostrata CTGAGCCTACTTATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCCGGCGCTCTTTTAGGCAACGACCAG[60] TTAAGCCTCTTAATTCGAGCCGAACTAAGTCAACCTGGCACCCTCCTGGGTGACGACCAA[60] TTAAGCCTCTTAATTCGAGCCGAACTAAGTCAACCTGGCACCCTCCTGGGTGACGACCAA[60] TTAAGCCTCTTAATTCGAGCCGAACTAAGTCAACCTGGCACCCTCCTGGGTGACGACCAA[60] CTAAGCCTCCTAATTCGGGCAGAACTAAGCCAGCCCGGCTCTCTTCTCGGAGACGACCAA[60] TTAAGCCTACTAATCCGTGCAGAACTAAGTCAGCCCGGAACTCTTCTTGGAGACGACCAA[60] TTAAGCCTACTAATCCGTGCAGAACTAAGTCAGCCCGGAACTCTTCTTGGAGACGACCAA[60] CTGAGCCTACTTATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCCGGCGCTCTTTTAGGCAACGACCAG[60] TTAAGCCTCTTAATTCGAGCCGAACTAAGTCAACCTGGCACCCTCCTGGGTGACGACCAA[60] TTAAGCCTACTAATCCGTGCAGAACTAAGTCAGCCCGGAGCTCTTCTTGGAGACGACCAA[60] CTAAGCCTCCTAATTCGGGCAGAACTAAGCCAGCCCGGCTCTCTTCTCGGAGACGACCAA[60] CTAAGTCTGCTCATCCGGGCAGAACTAAGTCAACCCGGCGCCCTACTGGGCGATGACCAA[60] TTAAGCCTCCTTATTCGAGCTGAGCTCAGCCAACCCGGCGCACTTTTAGGTGACGACCAA[60] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ATTTATAATGTAATCGTAACAGCCCACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCATAGTCATGCCC[120] ATCTACAATGTGATCGTCACAGCTCATGCCTTTGTAATAATTTTTTTTATAGTCATACCA[120] ATCTACAATGTGATCGTCACAGCTCATGCCTTTGTAATAATTTTTTTTATAGTCATACCA[120] ATCTACAATGTGATCGTCACAGCTCATGCCTTTGTAATAATTTTTTTTATAGTCATACCA[120] ATCTATAATGTAATTGTTACAGCACATGCTTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCA[120] ATTTATAATGTAATCGTAACAGCACATGCTTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCA[120] ATTTATAATGTAATCGTAACAGCACATGCTTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCA[120] ATTTATAATGTAATCGTAACAGCCCACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCATAGTCATGCCC[120] ATCTACAATGTGATCGTCACAGCTCATGCCTTTGTAATAATTTTTTTTATAGTCATACCA[120] ATTTATAATGTAATCGTAACAGCACATGCTTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCA[120] ATCTATAATGTAATTGTTACAGCACATGCTTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCA[120] ATTTATAATGTAATCGTAACAGCACATGCTTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCA[120] ATTTACAATGTAATCGTCACAGCCCATGCATTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCA[120] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ATAATAATTGGAGGATTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGATCGGTGCCCCTGACATA[180] ATCATAATTGGCGGCTTTGGTAACTGATTGATCCCACTAATAATCGGCGCTCCCGACATA[180] ATCATAATTGGCGGCTTTGGTAACTGATTGATCCCACTAATAATCGGCGCTCCCGACATA[180] ATCATAATTGGCGGCTTTGGTAACTGATTGATCCCACTAATAATCGGCGCTCCCGACATA[180] ATTATGATTGGAGGCTTTGGAAACTGACTAGTACCCCTCATGATTGGTGCACCAGACATG[180] GTTATAATTGGAGGTTTTGGAAACTGATTAGTCCCACTTATAATTGGTGCACCAGACATG[180] GTTATAATTGGAGGTTTTGGAAACTGATTAGTCCCACTTATAATTGGGGCACCAGACATG[180] ATAATAATTGGAGGATTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGATCGGTGCCCCTGACATA[180] ATCATAATTGGCGGCTTTGGTAACTGATTGATCCCACTAATAATCGGCGCTCCCGACATA[180] GTTATAATTGGAGGTTTTGGAAACTGATTAGTCCCACTTATAATTGGTGCACCAGACATG[180] ATTATGATTGGAGGCTTTGGAAACTGACTAGTACCCCTCATGATTGGTGCACCAGACATG[180] ATCATAATTGGGGGTTTTGGTAACTGACTTATCCCTTTAATGATCGGAGCACCAGACATA[180] ATCATGATCGGCGGCTTTGGAAACTGGCTAGTACCCCTTATAATCGGAGCACCCGACATG[180] 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 GCCTTTCCTCGCATAAATAACATGAGTTTTTGGCTCCTTCCTCCTTCTTTTCTCCTTCTA[240] GCCTTCCCCCGAATAAATAACATAAGCTTTTGACTCCTTCCCCCCTCATTTCTTCTTCTT[240] GCCTTCCCCCGAATAAATAACATAAGCTTTTGACTCCTTCCCCCCTCATTTCTTCTTCTT[240] GCCTTCCCCCGAATAAATAACATAAGCTTTTGACTCCTTCCCCCCTCATTTCTTCTTCTT[240] GCCTTCCCTCGAATAAATAACATGAGCTTTTGACTTCTCCCCCCCTCATTTCTTCTTCTT[240] GCATTCCCTCGAATAAACAATATAAGTTTTTGACTCCTGCCCCCTTCTTTCCTGCTACTA[240] GCATTCCCTCGAATAAACAATATAAGTTTTTGACTCCTGCCCCCTTCTTTCCTGCTACTA[240] GCCTTTCCTCGCATAAATAACATGAGTTTTTGGCTCCTTCCTCCTTCTTTTCTCCTTCTA[240] GCCTTCCCCCGAATAAATAACATAAGCTTTTGACTCCTTCCCCCCTCATTTCTTCTTCTT[240] GCATTCCCTCGAATAAACAATATAAGTTTTTGACTCCTGCCCCCTTCTTTCCTGCTACTA[240] GCCTTCCCTCGAATAAATAACATGAGCTTTTGACTTCTCCCCCCCTCATTTCTTCTTCTT[240] GCATTCCCCCGAATAAACAACATAAGCTTTTGACTCCTTCCCCCTTCTTTCCTCCTACTC[240] GCATTCCCCCGAATAAATAATATAAGTTTCTGACTACTACCCCCCTCTTTCCTGCTCCTT[240] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 CTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCCGGGGCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTA[300] CTAGCATCCTCCGGGGTTGAAGCAGGAGCTGGAACTGGGTGAACTGTTTATCCCCCTCTT[300] CTAGCATCCTCCGGGGTTGAAGCAGGAGCTGGAACTGGGTGAACTGTTTATCCCCCTCTT[300] CTAGCATCCTCCGGGGTTGAAGCAGGAGCTGGAACTGGGTGAACTGTTTATCCCCCTCTT[300] CTCGCCTCATCTGGAGTCGAAGCAGGTGCCGGCACAGGATGGACTGTTTATCCCCCGCTC[300] CTAGCATCCTCCGGTGTTGAAGCAGGAGCCGGAACAGGTTGAACCGTGTACCCTCCTTTA[300] CGAGCATCCTCCGTCGTTGAAGCAGGAGCCGGAACAGGTTGAGCCGTGTACCCTCCTTTA[300] CTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCCGGGGCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTA[300] CTAGCATCCTCCGGGGTTGAAGCAGGAGCTGGAACTGGGTGAACTGTTTATCCCCCTCTT[300] CTAGCATCCTCCGGTGTTGAAGCAGGAGCCGGAACAGGTTGAACCGTGTACCCTCCTTTA[300] CTCGCCTCATCTGGAGTCGAAGCAGGTGCCGGCACAGGATGGACTGTTTATCCCCCGCTC[300] CTGGCCTCTTCAGCAGTAGAGTCCGGAGCAGGGACAGGATGAACAGTCTACCCTCCCTTA[300] CTAGCATCTTCCGGAGTAGAAGCAGGAGCTGGTACAGGCTGAACAGTCTACCCACCACTA[300] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 GCTAGTAACCTGGCCCACGCAGGAGCATCCGTGGACCTTGCCATCTTCTCTTTACACCTA[360] GCAGGTAATTTGGCACATGCTGGGCCCTCCGTGGACTTGACTATTTTTTCACTCCACTTG[360] GCAGGTAATTTGGCACATGCTGGGCCCTCCGTGGACTTGACTATTTTTTCACTCCACTTG[360] GCAGGTAATTTGGCACATGCTGGGCCCTCCGTGGACTTGACTATTTTTTCACTCCACTTG[360] GCAGGCAATCTTGCCCACGCTGGACCTTCTGTTGACTTAACCATCTTCTCCCTCCACTTG[360] GCCAGCAACCTAGCTCATGCAGGTGCCTCCGTTGATTTAACAATTTTTTCTCTACATCTA[360] GCCAGCAACCTAGCTCATGCAGGTGCCTCCGATGATTTAACAATTTTTTCTCTACATCTA[360] GCTAGTAACCTGGCCCACGCAGGAGCATCCGTGGACCTTGCCATCTTCTCTTTACACCTA[360] GCAGGTAATTTGGCACATGCTGGGCCCTCCGTGGACTTGACTATTTTTTCACTCCACTTG[360] GCCAGCAACCTAGCTCATGCAGGTGCCTCCGTTGATTTAACAATTTTTTCTCTACATCTA[360] GCAGGCAATCTTGCCCACGCTGGACCTTCTGTTGACTTAACCATCTTCTCCCTCCACTTG[360] GCCAGCAACCTAGCCCACGCAGGGGCCTCCGTAGACCTAACGATCTTCTCCCTCCACTTG[360] GCAGGCAACCTAGCCCACGCAGGAGCATCTGTTGACCTCACAATTTTCTCCCTCCACCTG[360] 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 GCAGGTGTCTCCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACAATCATTAATATAAAA[420] GCTGGTATTTCCTCCATTTTAGGGGCAATCAACTTTATCACCACAATAATTAACATAAAA[420] GCTGGTATTTCCTCCATTTTAGGGGCAATCAACTTTATCACCACAATAATTAACATAAAA[420] GCTGGTATTTCCTCCATTTTAGGGGGAATCAACTTTATCACCCCAGTAATTAACATGAAA[420] GCCGGAGTGTCATCTATTTTAGGTGCAATTAATTTTATCACAACCATTATTAACATGAAA[420] GCAGGTGTCTCTTCAATTTTAGGAGCTATCAATTTTATTACCACTATTATTAACATAAAA[420] GCAGGTGTCTCTTCAATTTTAGGAGCTATCAATTTTATTACCACTATTATTAACATAAAA[420] GCAGGTGTCTCCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACAATCATTAATATAAAA[420] GCTGGTATTTCCTCCATTTTAGGGGCAATCAACTTTATCACCACAATAATTAACATAAAA[420] GCAGGTGTCTCTTCAATTTTAGGAGCTATCAATTTTATTACCACTATTATTAACATAAAA[420] GCCGGAGTGTCATCTATTTTAGGTGCAATTAATTTTATCACAACCATTATTAACATGAAA[420] GCAGGTGTCTCATCTATTCTTGGAGCAATTAACTTTATTACAACCATTATTAACATAAAA[420] GCAGGTGTCTCATCAATTCTAGGTGCTATTAATTTTATTACTACAATTATTAACATGAAA[420] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 CCTCCCGCCATCTCCCAATACCAAACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCACTGCC[480] CCCCCCGCAGCATCTCAATACCAGACACCCCTGTTTGTCTGAGCCGTTCTAATTACAGCC[480] CCCCCCGCAGCATCTCAATACCAGACACCCCTGTTTGTCTGAGCCGATCTAATTACAGCC[480] CCCCCGGCAGCATCTCAGTATCGGACACCGCTGTTTGTCTGAGACGTGCTAGTTATAGCC[480] CCCCCTGCCATCTCCCAATATCAAACACCCCTATTTGTGTGATCCGTCCTAATTACCGCA[480] CCCCCTGCCATCTCTCAATATCAGACGCCTCTTTTCGTATGAGCAGTATTAATTACAGCC[480] CCCCCTGCCATCTCTCAAGATCAGACGCCTCTTTTCGTATGAGCAGCATTAATTACACCC[480] CCTCCCGCCATCTCCCAATACCAAACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCACTGCC[480] CCCCCCGCAGCATCTCAATACCAGACACCCCTGTTTGTCTGAGCCGTTCTAATTACAGCC[480] CCCCCTGCCATCTCTCAATATCAGACGCCTCTTTTCGTATGAGCAGTATTAATTACAGCC[480] CCCCCTGCCATCTCCCAATATCAAACACCCCTATTTGTGTGATCCGTCCTAATTACCGCA[480] CCCCCCGCCATCTCACAATATCAAACACCCCTCTTTGTATGGGCCCTGCTAATTACTGCC[480] CCCCCAGCCATTTCTCAATACCAAACCCCCCTTTTCGTATGAGCTGTCCTAATTACTGCT[480] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ATTCTCCTCCTCCTCTCTTTGCCAGTCCTAGCTGCCGGCATCACAATACTACTAACAGAC[540] GTACTCCTACTTCTTTCCCTCCCCGTCCTTGCCGCAGGTATTACCATGCTTCTAACAGAT[540] GAACTCCTACTTCTTTCCCTCGCCGTCCTTGCCGCAGGTATTACCATGCTTCTAACAGAT[540] GACCGCCGACTGGCGTTCATTGATCGTCAGGACGTCCGGGTAGAACCATGCGACGAACAG[540] GTACTACTCCTTCTATCCCTGCCCGTTCTTGCCGCCGGCATCACAATACTTCTAACAGAC[540] GTACTACTTTTATTATCACTTCGAGGATTAGCTGCTGGAATTACAGTAGTGCTAACAGAG[540] GTACTACTTTTATTATCACTTCCAGGATTAGCTGCTGGAGTTACAATACGGCGACCGGAT[540] ATTCTCCTCCTCCTCTCTTTGCCAGTCCTAGCTGCCGGCATCACAATACTACTAACAGAC[540] GTACTCCTACTTCTTTCCCTCCCCGTCCTTGCCGCAGGTATTACCATGCTTCTAACAGAT[540] GTACTACTTTTATTATCACTTCCAGTATTAGCTGCTGGAATTACAATACTGCTAACAGAT[540] GTACTACTCCTTCTATCCCTGCCCGTTCTTGCCGCCGGCATCACAATACTTCTAACAGAC[540] GTCTTACTCCTCCTGTCCCTCCCAGTCCTAGCTGCTGGAATTACAATGCTTCTAACAGAC[540] GTTCTACTATTATTATCACTACCAGTTCTCGCAGCCGGAATTACGATACTTCTCACAGAT[540] 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 CGAAATTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGAGGAGACCCAATTCTTTACCAA[600] CGAAATCTTAACACCACCTTCTTTGACCCCGCAGGTGGGGGAGACCCAATCCTCTACCAA[600] CGAAATCTTAACACCACCTTCTGTGACCCCGCAGGTGGGGGAGACCCAATCCTCTACAAA[600] ATCGGAATAGTAACGCCACCTTTTGACCCCGCAGGGGGGGGAGACCCAATCCTCTACCAA[600] CGAAACCTAAACACAACCTTCTTTGACCCTGCCGGAGGAGGAGACCCCATCCTATACCAA[600] CGCAATCTAAATACCACTTTCTTTGACCCAGCCGGAGGGGGGGATCCAATTTTATATCAA[600] CGGAATCTAAATACCACTTTCTTTGACCCAGCCGGAGGGGGGGATCCAATTTTATATCAA[600] CGAAATTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGAGGAGACCCAATTCTTTACCAA[600] CGAAATCTTAACACCACCTTCTTTGACCCCGCAGGTGGGGGAGACCCAATCCTCTACCAA[600] CGCAATCTAAATACCACTTTCTTTGACCCAGCCGGAGGGGGGGATCCAATTTTATATCAA[600] CGAAACCTAAACACAACCTTCTTTGACCCTGCCGGAGGAGGAGACCCCATCCTATACCAA[600] CGAAACCTTAACACCACATTCTTTGACCCCGCAGGAGGTGGAGACCCAATTCTATATCAA[600] CGAAACCTAAACACCACCTTCTTTGACCCAGCGGGAGGAGGGGAnCCCATTCTTTATCAA[600] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 CACTT[605] CACCT[605] CAGCG[605] CACCT[605] CACTT[605] CACCT[605] CACCT[605] CACTT[605] CACCT[605] CACCT[605] CACTT[605] CATCT[605] CACCT[605]
