Metabolisme prebiotik oleh kandidat probiotik isolat asi
advertisement
METABOLISME PREBIOTIK OLEH KANDIDAT PROBIOTIK ISOLAT ASI SEBAGAI DASAR PENGEMBANGAN PRODUK SINBIOTIK SKRIPSI NUR RITA MARDIANA F24060902 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010 PREBIOTICS METABOLISM BY PROBIOTICS CANDIDATES ISOLATED FROM BREAST MILK AS SINBIOTICS PRODUCT DEVELOPMENT BASE Nur Rita Mardiana, Lilis Nuraida, and Didah Nur Faridah Department of Food Science and Technology, Faculty of Agricultural Technology, Bogor Agricultural University, IPB Dramaga Campus, PO Box 220, Bogor, West Java, Indonesia ABSTRACT Seven Lactobacillus strains isolated from breast milk were evaluated for their ability to metabolite oligosaccharide known as prebiotics, i. e. inulin, FOS, GOS, FOS:GOS (1:9), and inulin:GOS (1:9). The result shows that all Lactobacillus strains were able to grow in medium with prebiotics as carbon sources. The best growth was observed when GOS or FOS were used as carbon source, while inulin was the worst. The best growth in all oligosaccharides was observed in Lactobacillus R23H, followed by R23, B16, and R14. Further study on R23H and R23 shows that there was no difference in metabolizing oligosaccharides between heterofermenter and homofermenter. GOS was the best prebiotic used by the both lactic acid bacteria as shown by rapid decrease of total sugar. The reducing sugar in medium containing GOS was higher than other oligosaccharides. The decrease of total sugar in medium containing inulin was the slowest among the other prebiotics. This indicate that inulin was the most difficult prebiotic to be metabolized by the selected lactic acid bacteria. When inulin mixed with GOS in the ratio 1:9, the rate of decreasing of total sugar in the medium was similar to the medium with GOS as single carbon source, however it cannot be distinguished if the role of inulin took place after GOS disappear. The rate of sugar metabolism was in accordance with the growth of lactic acid bacteria isolates in medium containing prebiotics. Lactobacillus R23 was used in sinbiotic fermented milk product combine with FOS, inulin, and inulin:GOS (1:9). After fermentation, the result show that remaining sugar in skim milk with additional prebiotics was higher than skim milk without additional prebiotics. Remaining sugar on fermented milk product include the amount of prebiotic that will use as carbon source in colon. Combination of potential probiotic Lactobacillus R23 and mixture of inulin:GOS (1:9) could be used to make sinbiotic fermented milk product. Keywords: lactic acid bacteria, inulin, FOS, GOS Nur Rita Mardiana. F24060902. Metabolisme Prebiotik oleh Kandidat Probiotik Isolat ASI sebagai Dasar Pengembangan Produk Sinbiotik. Di bawah bimbingan Lilis Nuraida dan Didah Nur Faridah. 2011 RINGKASAN Salah satu kelompok pangan fungsional yang sedang berkembang beberapa tahun terakhir ini adalah produk pangan dengan penambahan probiotik, prebiotik, dan sinbiotik yang memiliki manfaat bagi kesehatan pencernaan manusia. Probiotik merupakan mikrobiota hidup yang memiliki pengaruh positif terhadap kesehatan saluran cerna inang. Probiotik yang banyak diteliti dan dimanfaatkan umumnya berasal dari kelompok bakteri asam laktat (BAL). Berbagai penelitian mengenai BAL yang berpotensi sebagai probiotik telah banyak dilakukan, salah satunya adalah kandidat probiotik BAL yang diisolasi dari ASI. Penggunaan probiotik dalam produk pangan fungsional seringkali dilakukan dengan penambahan prebiotik sehingga disebut sebagai pangan sinbiotik. Prebiotik merupakan bahan pangan yang tidak dapat dicerna (non digestible) yang menguntungkan bagi inang dengan menstimulasi secara selektif pertumbuhan dan atau aktivitas bakteri tertentu dalam kolon inang. Beberapa jenis prebiotik yang telah popular dan diketahui manfaatnya berasal dari kelompok oligosakarida, seperti inulin, fruktooligosakarida (FOS), dan galaktooligosakarida (GOS). Pemanfaatan prebiotik bersifat spesifik, tidak semua bakteri dapat memetabolisme prebiotik tertentu. Oleh karena itu, perlu dievaluasi kemampuan BAL yang berpotensi sebagai probiotik untuk memetabolisme prebiotik. Tujuan penelitian ini adalah untuk memperoleh BAL kandidat probiotik isolat ASI terbaik yang dapat memanfaatkan prebiotik inulin, FOS, dan GOS sebagai sumber karbon untuk pertumbuhannya. Lebih lanjut, dikaji pula metabolisme prebiotik oleh kandidat probiotik isolat ASI terbaik. Dengan demikian kombinasi dari prebiotik dan kandidat probiotik isolat ASI dapat digunakan dalam pembuatan produk sinbiotik. Penelitian ini terdiri dari tiga tahap, yaitu: (1) seleksi awal BAL isolat ASI yang dapat memanfaatkan prebiotik sebagai sumber karbon untuk pertumbuhannya, (2) mempelajari metabolisme prebiotik oleh BAL isolat ASI terpilih, dan (3) aplikasi kombinasi prebiotik dan BAL isolat ASI terpilih dalam produk susu fermentasi. Pada tahap pertama, isolat BAL A22, A23, B16, R14, R21, R23, dan R23H ditumbuhkan pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon kemudian diinkubasikan pada 37oC selama 24 jam. Jenis prebiotik yang digunakan yaitu inulin, FOS, GOS, FOS:GOS (1:9), dan inulin:GOS (1:9) masing-masing sebanyak 5%. Media berbasis MRSB tanpa penambahan gula digunakan sebagai kontrol. Selanjutnya dilakukan analisis total BAL dengan metode cawan tuang setelah inkubasi 24 jam. Pada tahap ke dua, isolat BAL R23 dan R23H digunakan untuk mengetahui metabolismenya terhadap prebiotik. Jenis prebiotik dan metode yang dilakukan sama seperti tahap sebelumnya tetapi pada tahap ini dilakukan analisis OD, pH, TAT, total gula, dan gula pereduksi setiap 2 jam selama waktu inkubasi 12 jam kemudian dilanjutkan pada jam ke-24. Pada tahap akhir isolat R23 ditumbuhkan pada media susu skim dengan penambahan prebiotik inulin, FOS, dan inulin:GOS (1:9) masing-masing sebesar 5% kemudian diinkubasikan pada 37oC selama 48 jam. Media susu skim tanpa penambahan prebiotik digunakan sebagai pembanding. Selanjutnya dilakukan analisis total BAL, pH, TAT, total gula, dan gula pereduksi pada jam ke-0, 24, dan 48. Hasil penelitian pada tahap pertama menunjukkan bahwa ketujuh kandidat probiotik isolat ASI yaitu Lactobacillus A22, A23, B16, R14, R21, R23, dan R23H dapat memanfaatkan inulin, FOS, dan GOS sebagai sumber karbon untuk pertumbuhannya. Hal ini terbukti dari jumlah BAL yang tumbuh pada seluruh media dengan prebiotik lebih tinggi daripada media kontrol. Dari keseluruhan isolat yang digunakan, Lactobacillus R23H menunjukkan tingkat pertumbuhan tertinggi pada seluruh media yang mengandung prebiotik. GOS merupakan prebiotik yang paling mudah dicerna, sedangkan yang paling sulit dicerna adalah inulin. Pada tahap ke dua dilakukan pengujian metabolisme prebiotik oleh BAL isolat ASI yang diwakili oleh Lactobacillus R23H yang bersifat heterofermentatif dan Lactobacillus R23 yang bersifat homofermentatif sehingga kecenderungan kedua jenis BAL tersebut dalam memetabolisme prebiotik dapat dibandingkan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa GOS adalah sumber prebiotik uji yang paling mudah difermentasi. Secara umum, kecenderungan penggunaan prebiotik pada kedua isolat tidak jauh berbeda. Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H dapat memanfaatkan GOS sebagai sumber karbon. Hal ini terlihat dari kecepatan kedua isolat dalam memetabolisme GOS selama waktu inkubasi. Pada media berbasis MRSB dengan GOS sebagai sumber karbon, kandungan gula di akhir waktu inkubasi paling sedikit jika dibandingkan media yang mengandung prebiotik uji lain. Kedua isolat BAL tersebut paling sulit memanfaatkan inulin sebagai sumber karbon untuk pertumbuhannya. Tetapi pada penambahan kombinasi prebiotik inulin:GOS (1:9), kemampuan kedua isolat dalam memfermentasi prebiotik menjadi lebih baik daripada penggunaan inulin saja sebagai sumber karbon. Hasil pengukuran OD, pH, dan TAT juga mendukung hasil pengukuran total gula. Pada media dengan GOS sebagai sumber karbon, nilai OD menunjukkan angka tertinggi yaitu mencapai 12.32 pada Lactobacillus R23 dan 13.42 pada Lactobacillus R23H. Penurunan pH dan peningkatan TAT terbesar juga terukur pada media dengan GOS sebagai sumber karbon. Inulin sebagai sumber prebiotik tunggal dapat difermentasi dengan lambat oleh Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H. Sementara itu, dengan mengkombinasikan inulin dan GOS (1:9), kemampuan kedua isolat untuk tumbuh dengan memetabolisme prebiotik menjadi lebih baik. GOS memiliki DP < 10, sedangkan inulin memiliki DP berkisar antara 2 – 60. Semakin tinggi DP yang dimiliki oleh prebiotik, kemampuan BAL dalam memfermentasinya semakin berkurang. Hal ini yang menyebabkan GOS lebih mudah dimetabolisme oleh BAL sementara inulin lebih sulit untuk dimetabolisme. Pada aplikasi produk sinbiotik berbasis susu fermentasi, digunakan kandidat probiotik Lactobacillus R23 serta FOS, inulin, dan inulin:GOS (1:9) sebagai prebiotik. Hasil analisis total BAL, pH, dan TAT menunjukkan nilai yang tidak berbeda nyata pada ketiga media skim dengan penambahan prebiotik dengan media skim tanpa penambahan prebiotik (p<0.05). Hasil ini diharapkan terjadi karena mengindikasikan bahwa Lactobacillus R23 hanya memanfaatkan sumber gula dan nutrisi alami yang terdapat pada susu dan tidak memecah prebiotik selama proses fermentasi berlangsung. Hal ini didukung oleh hasil analisis total gula yang menunjukkan sisa gula yang jauh lebih tinggi pada ketiga media dengan prebiotik setelah proses fermentasi berlangsung. Sisa gula pada susu fermentasi ini mencangkup prebiotik yang akan dimanfaatkan sebagai sumber karbon bagi probiotik pada kolon setelah produk dikonsumsi. Perpaduan jenis prebiotik berantai panjang seperti inulin dan prebiotik berantai pendek seperti GOS serta Lactobacillus R23 yang merupakan BAL kandidat probiotik dapat digunakan pada produk susu fermentasi sinbiotik. Dengan memanfaatkan kombinasi tersebut, sumber prebiotik tidak terlalu cepat dicerna sehingga tidak akan habis dipecah oleh BAL selama di dalam produk. Setelah produk dikonsumsi, prebiotik akan dimetabolisme oleh probiotik di kolon. GOS yang memiliki struktur lebih sederhana akan dimetabolisme terlebih dahulu di bagian awal kolon, sedangkan inulin yang memilki rantai lebih panjang dan lebih sulit dipecah akan bermanfaat sebagai sumber karbon pada bagian akhir dari saluran kolon. METABOLISME PREBIOTIK OLEH KANDIDAT PROBIOTIK ISOLAT ASI SEBAGAI DASAR PENGEMBANGAN PRODUK SINBIOTIK SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor Oleh : NUR RITA MARDIANA F24060902 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010 Judul Skripsi Nama NIM : Metabolisme Prebiotik oleh Kandidat Probiotik Isolat ASI sebagai Dasar Pengembangan Produk Sinbiotik : Nur Rita Mardiana : F24060902 Menyetujui, Pembimbing I, Pembimbing II, (Dr. Ir. Lilis Nuraida, M.Sc) NIP 19621009.198703.2.002 (Ir. Didah Nur Faridah, M.Si) NIP 19711117.199802.2.001 Mengetahui: Ketua Departemen, (Dr.Ir. Dahrul Syah) NIP 19650814.199002.1.001 Tanggal Ujian Sarjana : 31 Desember 2010 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul Metabolisme Prebiotik oleh Kandidat Probiotik Isolat ASI sebagai Dasar Pengembangan Produk Sinbiotik adalah hasil karya saya sendiri dengan arahan Dosen Pembimbing Akademik, dan belum diajukan dalam bentuk apapun pada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Bogor, 31 Desember 2010 Yang membuat pernyataan Nur Rita Mardiana F24060902 BIODATA PENULIS Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal 17 Maret 1988 sebagai anak kedua dari dua bersaudara, pasangan Tasibun dan Ramini. Penulis menyelesaikan jenjang pendidikan di SD Negeri Dadali II Bandung, SLTP Negeri 1 Majenang, dan SMA Negeri 1 Majenang. Penulis kemudian diterima menjadi mahasiswa Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI pada tahun 2006. Selama menjadi mahasiswa IPB, penulis pernah tergabung dalam organisasi dan kegiatan kemahasiswaan, diantaranya adalah menjadi staf konsumsi dalam kegiatan Seminar dan Pelatihan PLASMA (Pelatihan Sistem Manajemen Halal), koordinator kesekretariatan dalam kegiatan Seminar dan Pelatihan HACCP (Hazard Analitical Critical Control Point), dan staf kesekretariatan HIMITEPA. Penulis juga pernah mengikuti acara-acara seminar atau pelatihan, diantaranya Seminar Indonesian Food Expo 2008, Workshop IRN (Indofood Riset Nugraha), serta Seminar dan Pelatihan PLASMA yang diselenggarakan oleh HIMITEPA IPB. Selain itu, penulis juga pernah menjadi asisten Praktikum Biokimia Pangan dan Analisis Pangan, aktif mengikuti PKM (Program Kreativitas Mahasiswa) dan mendapatkan dana penelitian dari DIKTI. Bidang PKM yang didanai adalah PKMP (Program Kreativitas Mahasiswa Penelitian) dan PKMK (Program Kreativitas Mahasiswa Kewirausahaan). Sebagai syarat untuk memperoleh gelar sarjana Teknologi Pertanian, penulis menyelesaikan skripsi dengan judul ”Metabolisme Prebiotik oleh Kandidat Probiotik Isolat ASI sebagai Dasar Pengembangan Produk Sinbiotik”, di bawah bimbingan Dr. Ir. Lilis Nuraida, M.Sc dan Ir. Didah Nur Faridah, M.Si. KATA PENGANTAR Segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, salawat serta salam semoga selalu tercurah kepada Nabi Besar Muhammad SAW. Atas kehendak dan karunia-Nya, penelitian yang berjudul “Metabolisme Prebiotik oleh Kandidat Probiotik Isolat ASI sebagai Dasar Pengembangan Produk Sinbiotik” dapat diselesaikan. Penelitian ini dilakukan sebagai bagian dari tugas akhir untuk memperoleh gelar sarjana pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dapat diselesaikan atas sumbangan pemikiran dan masukan dari pembimbing serta bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada : 1. Keluarga tercinta, Mama, Bapak, Aa, Mbak, dan si kecil Fafa. Terima kasih banyak atas doa, dukungan, semangat, kasih sayang, dan pengorbanan yang telah diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. 2. Dr. Ir. Lilis Nuraida, M.Sc. selaku dosen pembimbing akademik dan pembimbing skripsi yang telah memberikan bimbingan, saran, bantuan dan nasihat yang sangat berharga bagi penulis. Mohon maaf atas segala kesalahan dan kekurangan penulis, semoga Allah membalas kebaikan Ibu dengan sebaik-baik balasan. 3. Ir. Didah Nur Faridah, M.Si. selaku dosen pembimbing skripsi dan dosen penguji yang telah memberikan bimbingan dan saran bagi kelengkapan skripsi penulis sehingga skripsi yang dihasilkan menjadi lebih teratur dan terstruktur penyusunan bagian isinya. 4. Dr. Feri Kusnandar yang telah bersedia menjadi dosen penguji dan memberikan saran bagi kelengkapan skripsi penulis. 5. SEAFAST CENTER yang telah mendanai dan memfasilitasi jalannya penelitian ini. 6. Dosen-dosen ITP dan TPB serta guru-guru SD, SMP, SMA atas segala ilmu dan pelajaran hidup. 7. Teman berbagi laboratorium: Wina, Ipit, Vany, Jupe, Iphan, Septi, Widi, Yogi, Victor, dan Abdi atas segala canda, kerjasama, dan kebahagiaan sehingga penulis dapat merasakan suasana penelitian yang menyenangkan. 8. Sahabat terbaik: Ifat, Nadia, Wina, Arin, Saida, Ovi, Lingga, Mer, Khusnur, Wiwit, Wikeu, dan Tikah atas kebersamaan dan semangatnya. 9. Teman-teman ITP angkatan 43, 44, dan 42 atas persahabatan dan kebersamaan dalam mencari ilmu. 10. Mbak Hana, mbak Sofah, mbak April, mas Yeris, mbak Denok, dan mbak Ari atas bantuan, pelajaran, dan masukan yang diberikan kepada penulis. 11. Teknisi dan Laboran ITP: Pak Wahid, Pak Sidik, Pak Yahya, Pak Rojak, Pak Gatot, dan Bu Rub terimakasih atas segala bantuan yang diberikan kepada penulis selama melaksanakan penelitian. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, yang telah berkontribusi secara langsung maupun tidak langsung dalam penyelesaian tugas akhir ini. Semoga Allah SWT menerima dan membalas seluruh kebaikan yang telah dilakukan. Bogor, 31 Desember 2010 Nur Rita Mardiana DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR ................................................................................................................. iii DAFTAR ISI ............................................................................................................................... iv DAFTAR TABEL ....................................................................................................................... vi DAFTAR GAMBAR .................................................................................................................. vii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................................... x I. PENDAHULUAN ................................................................................................................... A. LATAR BELAKANG .................................................................................................. B. TUJUAN ....................................................................................................................... C. MANFAAT ................................................................................................................... 1 1 2 2 II. TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................................... 3 A. BAKTERI ASAM LAKTAT ........................................................................................ 3 B. BAKTERI ASAM LAKTAT SEBAGAI PROBIOTIK................................................ 6 C. BAKTERI ASAM LAKTAT ISOLAT ASI ................................................................. 7 D. PREBIOTIK .................................................................................................................. 9 1. Inulin ...................................................................................................................... 10 2. Fruktooligosakarida ............................................................................................... 12 3. Galaktooligosakarida ............................................................................................. 13 E. SUSU FERMENTASI .................................................................................................. 14 III. METODOLOGI PENELITIAN ............................................................................................ A. BAHAN DAN ALAT ................................................................................................... B. METODE PENELITIAN .............................................................................................. 1. Seleksi BAL Isolat ASI yang Dapat Memanfaatkan Prebiotik sebagai Sumber Karbon ...................................................................................................... a. Penyegaran dan Pengawetan Kultur ............................................................... b. Persiapan Media Fermentasi ........................................................................... c. Uji Pertumbuhan BAL pada Media Berbasis MRSB dengan Prebiotik sebagai Sumber karbon ....................................................... 2. Uji Metabolisme Prebiotik oleh BAL .................................................................... 3. Aplikasi Pemanfaatan Prebiotik dan BAL isolat ASI pada Susu Fermentasi ........ C. METODE ANALISIS ................................................................................................... 1. Analisis Pertumbuhan BAL dengan Metode Hitungan Cawan .............................. 2. Analisis Pertumbuhan BAL dengan Metode Spektrofotometri.............................. 3. Analisis Total Gula Metode Fenol-Sulfat .............................................................. 4. Analisis Total Gula Pereduksi metode Park-Johnson ............................................ 5. Analisis Persen Asam Laktat ................................................................................. 6. Analisis pH ............................................................................................................ 7. Analisis Statistik .................................................................................................... 15 15 15 17 17 17 18 18 18 19 19 19 20 20 20 21 21 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................................. 22 A. SELEKSI BAL ISOLAT ASI YANG DAPAT MEMANFAATKAN PREBIOTIK SEBAGAI SUMBER KARBON ............................................................ 22 B. METABOLISME PREBIOTIK OLEH Lactobacillus R23 DAN Lactobacillus R23H ...................................................................................................... 27 1. Pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H pada Media Berbasis MRSB dengan Prebiotik sebagai Sumber Karbon ............................... 27 2. Perubahan Nilai pH dan TAT selama Pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H pada Media Berbasis MRSB dengan Prebiotik sebagai Sumber Karbon ......................................................................................... 31 3. Perubahan Karbohidrat selama Pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H ............................................................................................... 36 C. APLIKASI PEMANFAATAN PREBIOTIK DAN Lactobacillus R23 PADA PRODUK SUSU FERMENTASI ..................................................................... 47 1. Pertumbuhan Lactobacillus R23 ............................................................................ 48 2. Perubahan Nilai pH dan TAT ................................................................................ 49 3. Perubahan Total Gula dan Gula Pereduksi ............................................................ 51 V. SIMPULAN DAN SARAN.................................................................................................... 55 A. SIMPULAN ........................................................................................................................ 55 B. SARAN ............................................................................................................................... 55 DAFTAR PUSTAKA.................................................................................................................. 57 LAMPIRAN ................................................................................................................................ 62 v DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Kelompok dan spesies BAL yang diisolasi dari ASI................................................... 8 Tabel 2. Jumlah BAL pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon .. 23 Tabel 3. Jumlah Lactobacillus R23 pada media susu skim dengan penambahan prebiotik ...... 48 vi DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Jalur fermentasi BAL homofermentatif ............................................................ 4 Gambar 2. Jalur fermentasi BAL heterofermentatif ........................................................... 5 Gambar 3. Struktur inulin ................................................................................................... 11 Gambar 4. Struktur FOS ..................................................................................................... 12 Gambar 5. Struktur GOS ................................................................................................... 13 Gambar 6. Bagan alir penelitian ......................................................................................... 16 Gambar 7. Perbedaan nilai log BAL pada media fermentasi berbasis MRSB dengan inulin sebagai sumber karbon dibandingkan dengan kontrol (tanpa gula)........ 23 Perbedaan nilai log BAL pada media fermentasi berbasis MRSB dengan FOS sebagai sumber karbon dibandingkan dengan kontrol (tanpa gula).......... 24 Perbedaan nilai log BAL pada media fermentasi berbasis MRSB dengan GOS sebagai sumber karbon dibandingkan dengan kontrol (tanpa gula) ......... 24 Perbedaan nilai log BAL pada media fermentasi berbasis MRSB dengan FOS:GOS (1:9) sebagai sumber karbon dibandingkan dengan kontrol ............ 25 Perbedaan nilai log BAL pada media fermentasi berbasis MRSB dengan Inulin:GOS (1:9) sebagai sumber karbon dibandingkan dengan kontrol .......... 26 Grafik pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon ...................................................................... 28 Grafik pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon.......................................................... 28 Selisih OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan prebiotik terhadap kontrol (tanpa gula) .................................... 31 Selisih OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik terhadap kontrol (tanpa gula) .................................... 31 Grafik perubahan pH selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon................................ 32 Grafik perubahan pH selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon................................ 32 Selisish nilai pH selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan prebiotik terhadap kontrol (tanpa gula) ...................... 33 Selisish nilai pH selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik terhadap kontrol (tanpa gula) ...................... 34 Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Grafik perubahan TAT selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media vii Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon................................ 35 Grafik perubahan TAT selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon ............ 35 Selisih nilai TAT selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan prebiotik terhadap kontrol (tanpa gula) ...................... 36 Selisih nilai TAT selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik terhadap kontrol (tanpa gula) ...................... 36 Grafik perubahan total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon ............ 37 Grafik perubahan total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon ..................... 37 Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan inulin sebagai sumber karbon .................................................................................................. 38 Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan inulin sebagai sumber karbon .................................................................................................. 39 Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan FOS sebagai sumber karbon .................................................................................................. 40 Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan FOS sebagai sumber karbon .................................................................................................. 40 Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan GOS sebagai sumber karbon .................................................................................................. 41 Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan GOS sebagai sumber karbon ................................................................................................. 42 Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan FOS:GOS (1:9) sebagai sumber karbon ..................................................................................... 43 Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan FOS:GOS (1:9) sebagai sumber karbon ..................................................................................... 44 Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan inulin:GOS (1:9) sebagai sumber karbon ..................................................................................... 44 Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan inulin:GOS (1:9) sebagai sumber karbon ..................................................................................... 44 Grafik perubahan gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 viii Gambar Gambar Gambar 37. 38. 39. pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon ............ 45 Grafik perubahan gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon ............ 46 Jumlah total Lactobacillus R23 pada media susu skim dengan penambahan prebiotik....................................................................................... 48 Grafik perubahan nilai pH selama proses fermentasi susu skim dengan penambahan prebiotik....................................................................................... 50 Gambar 40. Selisih nilai pH susu fermentasi dengan penambahan prebiotik setelah 24 dan 48 jam dibandingkan dengan 0 jam .................................................................. 50 Gambar 41. Grafik perubahan TAT selama proses fermentasi susu skim dengan penambahan prebiotik....................................................................................... 51 Selisih nilai TAT susu fermentasi dengan penambahan prebiotik setelah 24 dan 48 jam dibandingkan dengan 0 jam ........................................................... 51 Grafik perubahan total gula selama proses fermentasi susu skim dengan penambahan prebiotik....................................................................................... 52 Selisih total gula susu fermentasi dengan penambahan prebiotik setelah 24 dan 48 jam dibandingkan dengan 0 jam ........................................................... 53 Grafik perubahan gula pereduksi selama proses fermentasi susu skim dengan penambahan prebiotik .......................................................................... 53 Selisih gula pereduksi susu fermentasi dengan penambahan prebiotik dibandingkan dengan susu fermentasi tanpa penambahan prebiotik ................ 54 Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar 42. 43. 44. 45. 46. ix DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Hasil Pewarnaan Gram BAL isolat ASI ........................................................... 62 Lampiran 2. Bahan-bahan dan prosedur pembuatan media berbasis MRSB ........................ 63 Lampiran 3. Pembuatan larutan untuk analisis gula pereduksi ............................................. 64 Lampiran 4. Prosedur standardisasi NaOH ........................................................................... 64 Lampiran 5. Data hasil hitungan cawan pertumbuhan BAL isolat ASI pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik ............................................. 65 Hasil analisis statistik pertumbuhan BAL isolat ASI pada media MRS basic dengan penamabahan prebiotik ...................................................... 67 Nilai OD Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik....................................................................................... 69 Nilai OD Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik....................................................................................... 71 Nilai pH Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik ...................................................................................... 73 10. Nilai pH Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik....................................................................................... 73 11. Nilai TAT (% asam laktat) Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik ....................................................... 74 12. Nilai TAT (% asam laktat) Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik ....................................................... 74 Lampiran 13. Kurva standar glukosa ...................................................................................... 75 Lampiran 14. Data total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik ............................................. 76 15. Data total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik ............................................. 78 16. Data gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik ............................................. 80 17. Data gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik .................................... 82 18. Data hitungan cawan pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan berbagai prebiotik .................................. 84 19. Nilai pH dan TAT (% asam laktat) Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik ................................................. 86 Lampiran Lampiran Lampiran Lampiran Lampiran Lampiran Lampiran Lampiran Lampiran Lampiran Lampiran Lampiran 6. 7. 8. 9. x Lampiran Lampiran Lampiran Lampiran 20. Data total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik ...................................... 87 21. Data gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik .............................. 88 22. Hasil analisis statistik nilai OD Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik ............................................. 89 23. Hasil analisis statistik nilai OD Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik ............................................. 91 Lampiran 24. Hasil analisis statistik nilai total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik .................................... 93 Lampiran 25. Hasil analisis statistik nilai total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik .................................... 95 Lampiran 26. Hasil analisis statistik nilai gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik ....... 97 27. Hasil analisis statistik nilai gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik ... 99 Lampiran Lampiran 28. Hasil analisis statistik nilai Log Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik ................................................. 101 Lampiran 28. Hasil analisis statistik nilai pH Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik ................................................. 103 Lampiran 29. Hasil analisis statistik nilai TAT Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik ................................................. 105 Lampiran 30. Hasil analisis statistik nilai total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik .............................. 107 Lampiran 31. Hasil analisis statistik nilai gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik 109 Lampiran 32. Hasil analisis korelasi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H .......................................................................................... 111 xi I. PENDAHULUAN A. LATAR BELAKANG Saat ini kesadaran masyarakat akan gaya hidup sehat terus meningkat sehingga masyarakat semakin memusatkan perhatiannya pada makanan yang bermanfaat bagi kesehatan, yang dikenal dengan istilah pangan fungsional. Beberapa produk pangan fungsional yang telah berkembang adalah makanan yang mengandung probiotik, prebiotik, dan sinbiotik. Menurut Holzapfel (2005) produk probiotik telah menguasai pasar pangan fungsional sekitar 60-70%. Perkembangan produk probiotik, prebiotik, dan sinbiotik dilatarbelakangi oleh beberapa hal antara lain dengan berkembangnya ilmu pengetahuan mengenai sistem pencernaan, adanya gejala penyakit yang timbul akibat mikroba di saluran pencernaan, serta keinginan untuk memperoleh nutrisi yang baik (Shin et al. 1992). Selain itu, beredar pula beberapa isu kesehatan yang berkaitan dengan manfaat produk-produk tersebut seperti peningkatan toleransi laktosa (bagi penderita intoleransi laktosa), perlindungan terhadap gastroentritis, sintesis vitamin-vitamin tertentu, peningkatan fungsi saluran pencernaan, metabolisme kolesterol dalam usus, dan respon alergi terhadap makanan (Gibson dan Angus 2000). Salminen et al. (2004) mendefinisikan probiotik sebagai sediaan sel mikroba hidup yang memiliki pengaruh positif terhadap kesehatan inangnya. Probiotik dapat berupa bakteri Gram positif, Gram negatif, khamir atau fungi (Rolfe 2000). Namun, jenis mikroba yang umum digunakan dalam pembuatan produk-produk probiotik yang sudah beredar terutama berasal dari kelompok bakteri asam laktat (BAL). Ducluzeau et al. (1991) menyatakan beberapa probiotik yang umum dan aman digunakan antara lain adalah Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Sterptococcus lactis, Enterococcus faecium, Bifidobacterium adolescentis, dan Bifidobacterium coagulans. Nuraida et al. (2007) mengisolasi BAL dari ASI yang berpotensi sebagai probiotik antara lain Lactobacillus rhamnosus A23, B16, R14, R21, R23, dan R23H serta Lactobacillus acidophillus A22. Berdasarkan penelitian Hartanti (2007) dan Nuraida et al. (2007), beberapa BAL isolat ASI tersebut setelah diuji secara in vitro menunjukkan ketahanan hidup yang baik pada kondisi pH asam (pH 2 selama 5 jam) dan konsentrasi garam empedu sebesar 0.5% dengan penurunan log kurang dari 1 unit. Selain itu, Nuraida et al. (2009) telah menguji kemampuan penghambatan BAL isolat ASI terhadap Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC). Hasilnya menyatakan bahwa beberapa BAL isolat ASI yang telah disebutkan sebelumnya memiliki daya hambat yang besar terhadap EPEC yaitu di atas 1 log. Dari hasil studi tersebut terlihat bahwa BAL isolat ASI memiliki potensi untuk dijadikan sumber probiotik. Penggunaan probiotik pada produk pangan fungsional seringkali disertai dengan penambahan prebiotik. Hal ini dilakukan untuk mendukung pertumbuhan dari bakteri probiotik yang digunakan dan sekaligus memperoleh manfaat dari prebiotik yang ditambahkan. Kombinasi probiotik dan prebiotik dalam suatu produk pangan dikenal dengan istilah sinbiotik (Gibson dan Robertfroid 1995). Konsep prebiotik sendiri didefinisikan sebagai bahan pangan yang tidak dapat dicerna dan memiliki manfaat yang menguntungkan dengan menstimulasi pertumbuhan dan aktivitas dari beberapa bakteri yang terdapat pada usus sehingga dapat meningkatkan kesehatan inang (Gibson dan Robertfroid 1995). Fruktooligosakarida (FOS), galaktooligosakarida (GOS), dan inulin adalah beberapa jenis prebiotik yang banyak digunakan (Bouhnik et al. 1999). Produk pangan yang umumnya ditambahkan prebiotik adalah es krim, makanan bayi, susu, susu fermentasi, cookies, sereal, dan produk lainnya. Tujuan penambahannya selain sebagai sumber prebiotik biasanya untuk meningkatkan kandungan serat. Meskipun perkembangan produk sinbiotik sudah semakin pesat, tetapi kejelasan hubungan antara probiotik dan prebiotik masih perlu dikaji lebih dalam. Beberapa penelitian membahas dan mengkaji kecocokan kombinasi antara jenis probiotik dengan beberapa sumber prebiotik yang telah banyak dikenal. Shin et al. (2000) meneliti pertumbuhan Bifidobacterium spp pada susu skim dengan penambahan prebiotik berupa inulin, FOS, dan GOS pada berbagai dosis. Chen et al. (2006) juga melakukan penelitian yang serupa dengan menggunakan teknik pemograman kuadratik sekuensial untuk memperoleh kombinasi yang cocok antara jenis prebiotik dan probiotiknya pada produk susu fermentasi. Pemanfaatan berbagai jenis prebiotik oleh probiotik bersifat spesifik, jenis prebiotik yang dapat dimanfaatkan oleh satu jenis probiotik belum tentu dapat digunakan pula oleh jenis probiotik lainnya (Salminen et al. 2004). Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian pemanfaatan prebiotik oleh jenis probiotik lain seperti kandidat probiotik yang berasal dari ASI. Produk pangan yang banyak memanfaatkan konsep sinbiotik diantaranya adalah produk susu fermentasi. Produk tersebut akan berguna bagi tubuh setelah prebiotik dan probiotik yang terkandung di dalamnya sampai pada saluran pencernaan. Oleh karena itu, untuk memperoleh manfaat dari prebiotik dan probiotik secara optimal, maka harus dapat dipastikan bahwa prebiotik yang ditambahkan tidak habis digunakan oleh probiotik selama di dalam produk. Dengan demikian, selain kemampuan probiotik dalam memanfaatkan prebiotik, kejelasan proses dan waktu metabolisme dari prebiotik yang digunakan menjadi penting untuk diketahui. Jika prebiotik yang ditambahkan telah habis digunakan oleh probiotik dalam produk, tentu manfaat keduanya menjadi kurang optimal. Jadi jelas bahwa probiotik dan prebiotik yang terdapat dalam produk harus sampai pada kolon sehingga dapat meningkatkan kesehatan saluran pencernaan inang. Pada penelitian ini akan diseleksi kandidat probiotik isolat ASI terbaik yang mampu memanfaatkan prebiotik komersial berupa inulin, FOS, dan GOS sebagai sumber karbon. Selanjutnya akan dipelajari metabolisme berbagai prebiotik komersial oleh kandidat probiotik tersebut. Dengan demikian, dapat diketahui dengan jelas laju metabolisme dari prebiotik yang ditambahkan. Selanjutnya, kombinasi probiotik dan prebiotik terbaik diaplikasikan pada produk susu fermentasi sehingga hasil penelitian dapat dijadikan sebagai acuan dalam pengembangan produk sinbiotik khususnya produk yang berbasis susu fermentasi. B. TUJUAN 1. 2. Memilih BAL kandidat probiotik isolat ASI terbaik yang dapat memetabolisme prebiotik inulin, FOS, dan GOS untuk pertumbuhannya. Mengevaluasi metabolisme prebiotik oleh BAL kandidat probiotik isolat ASI. C. MANFAAT Melalui penelitian diperoleh informasi mengenai metabolisme prebiotik komersial oleh kandidat probiotik isolat ASI terbaik sehingga dapat dijadikan acuan dalam pemilihan jenis prebiotik dan probiotik yang tepat untuk pengembangan produk sinbiotik khususnya produk yang berbasis susu fermentasi. 2 II.TINJAUAN PUSTAKA A. BAKTERI ASAM LAKTAT Bakteri Asam Laktat (BAL) termasuk kelompok bakteri baik bagi manusia dan umumnya memenuhi status GRASS (Generally Recognize As Safe), yaitu aman bagi manusia. Kelompok bakteri ini tidak membusukkan protein dan dapat memetabolisme berbagai jenis karbohidrat secara fermentatif menjadi asam laktat sehingga disebut bakteri asam laktat. Istilah BAL juga dihubungkan dengan bakteri yang berperan dalam fermentasi makanan dan pakan, serta bakteri yang berhubungan dengan kesehatan permukaan mukosa hewan dan manusia (Axselsson 2004). BAL bersifat Gram positif, tidak membentuk spora, dapat berbentuk koki, kokibasili atau batang, dan mempunyai komposisi basa DNA kurang dari 50% mol G + C. BAL pada umumnya tidak bersifat katalase dan membutuhkan karbohidrat yang difermentasi untuk pertumbuhannya (De Vuyst dan Vandamme 1994). Klasifikasi bakteri asam laktat menjadi beberapa genus didasarkan pada perbedaan morfologi, jenis fermentasi glukosa, perbedaan suhu pertumbuhan, produksi asam laktat, kemampuan untuk tumbuh pada konsentrasi garam tinggi, dan toleransi terhadap asam, alkali, serta garam yang berbeda-beda. Pada pengklasifikasian beberapa genus baru, penambahan karakteristik seperti komposisi asam lemak dan sifat motil juga digunakan sebagai dasar. Klasifikasi terbaru menggolongkan BAL ke dalam 20 genus, namun dari sudut pandang teknologi pangan hanya terdapat 12 genus BAL yang utama, yaitu : Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Oenococcus, Weisella dan Vagococcus (Axelsson 2004). Ditinjau dari hasil metabolisme glukosa, BAL terbagi menjadi dua golongan, yaitu homofermentatif dan heterofermentatif (Surono 2004). Menurut Axelsson (2004), BAL yang hanya memproduksi asam laktat melalui jalur glikolisis disebut homofermentatif, sedangkan yang memproduksi zat-zat lain disamping asam laktat (asam laktat terbanyak) melalui fosfoketolase disebut heterofermentatif. Leuconostoc, Oenococci, Weissela dan beberapa Lactobacilli termasuk kelompok bakteri heterofermentatif dan selainnya adalah bakteri homofermentatif (Axelsson 2004). Jalur fermentasi BAL homofermentatif dan heterofermentatif dapat dilihat pada Gambar 1 dan Gambar 2. BAL homofermentatif melibatkan jalur Embden Meyerhof, yaitu glikolisis, menghasilkan asam laktat, 2 mol ATP dari 1 molekul heksosa dalam kondisi normal, dan tidak menghasilkan CO2. Secara umum BAL homofermentatif digunakan dalam fermentasi susu menjadi yogurt. Selain itu, dapat juga dimanfaatkan untuk menghasilkan asam laktat sebagai asidulan dalam industri makanan dan industri polilaktat suatu industri polimer atau plastik ramah lingkungan (Surono 2004). Jalur 6-fosfoglukonat/fosfoketolase digunakan oleh BAL heterofermentatif dalam memetabolisme gula. Selain menghasilkan asam laktat, BAL heterofermentatif juga menghasilkan etanol, CO2, asam asetat, dan manitol serta 1 mol ATP dari heksosa dan tidak mempunyai enzim aldolase. BAL jenis ini banyak dimanfaatkan dalam industri susu untuk menghasilkan keju, senyawa citarasa, dan pengental yaitu eksopoliskarida (Surono 2004). BAL memerlukan nutrisi yang sangat kompleks dalam pertumbuhannya. Oleh karena itu, umumnya habitat BAL kaya akan nutrisi seperti berbagai jenis makanan yaitu susu, daging, dan sayuran. Selain pada makanan, beberapa jenis BAL juga merupakan bakteri mulut, saluran usus, dan vagina dari mamalia (Axelsson 2004). Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan dan kelangsungan hidup BAL sangat beragam, namun komposisi kimia dan kandungan nutrisi pada habitatnya adalah yang paling berpengaruh (Surono 2004). Gambar 1. Jalur fermentasi BAL homofermentatif (Todar 2009) 4 Gambar 2. Jalur fermentasi BAL heterofermentatif (Todar 2009) 5 Air Susu Ibu (ASI) juga merupakan salah satu sumber BAL. Menurut Salminen et al. (2004), ditemukan strain Bifidobacterium bifidum (yang kemudian dikenal Lactobacillus bifidus) di dalam ASI. Hal ini berkaitan dengan keberadaan N-acetylglucosamine sebagai faktor bifidus di dalam ASI, yaitu sejenis karbohidrat yang mengandung nitrogen dan dapat menunjang pertumbuhan bakteri Lactobacillus bifidus (Surono 2004). Nuraida et al. (2007) telah melakukan penelitian terhadap isolat klinis bakteri asam laktat yang diisolasi dari ASI. Isolat yang teridentifikasi diantaranya adalah Streptococcus homofermentatif, Lactobacillus heterofermentatif, dan Lactobacillus homofermentatif. BAL dapat memproduksi senyawa antimikroba berupa produk asam organik (asam laktat, asam format, dan asam asetat), diasetil, hidrogen peroksida, karbondioksida, dan bakteriosin (De Vuyst and Vandamme 1994). Menurut Salminen et al. (2004), asam organik (asam laktat dan asam asetat) menyebabkan penurunan pH sitoplasma yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba patogen. Hal ini disebabkan akumulasi anion yang terbentuk menyebabkan penurunan laju sintesis makromolekul dan mempengaruhi perpindahan senyawa melalui membran sel. B. BAKTERI ASAM LAKTAT SEBAGAI PROBIOTIK Menurut Fuller (1989) yang dikutip oleh Agrawal (2005) probiotik adalah mikroba hidup yang sangat menguntungkan bagi manusia dan hewan karena dapat meningkatkan keseimbangan mikroflora usus. Seleksi mikroba khususnya bakteri asam laktat (BAL) sangat diperlukan untuk mendapatkan strain-strain probiotik yang unggul. Hal tersebut dikarenakan tidak semua BAL berpotensi sebagai probiotik. Definisi lain probiotik menurut Winarno (1997) adalah suatu preparat yang terdiri dari mikroba hidup yang dimasukkan ke dalam tubuh manusia atau ternak secara oral. Probiotik diharapkan mampu memberikan pengaruh positif terhadap kesehatan manusia atau ternak, dengan cara memperbaiki sifat-sifat yang dimiliki oleh mikroba alami yang tinggal di dalam saluran pencernaan makhluk hidup yang dimaksud. Untuk dapat memberikan manfaat sepenuhnya, galur probiotik harus dapat mengkoloni usus minimal untuk sementara atau dalam jangka waktu pendek (Jenie 2003). Salminen et al. (2004) menyatakan bahwa terdapat beberapa kriteria yang harus dipenuhi oleh suatu probiotik, diantaranya adalah: (1) bersifat nonpatogenik dan mewakili mikrobiota normal pada usus inangnya, serta masih aktif pada kondisi asam lambung dan konsentrasi garam empedu yang tinggi dalam usus halus, (2) dapat tumbuh dan bermetabolisme dengan cepat serta terdapat dalam jumlah yang tinggi dalam usus halus, (3) mampu mengkolonisasi beberapa bagian dari saluran usus inangnya, (4) dapat memproduksi asam-asam organik secara efisien dan memiliki sifat antimikroba terhadap bakteri patogen, (5) mudah diproduksi, mampu tumbuh dalam sistem produksi skala besar, dan hidup selama kondisi penyimpanan. Makanan, minuman atau suplemen probiotik biasanya mengacu pada bakteri hidup. Produk probiotik dapat berupa bakteri kering beku, dalam bentuk tablet, kapsul, produk fermentasi susu seperti yoghurt, dan susu manis acidophillus (Salminen et al. 2004) yang dikonsumsi manusia dan hewan yang memberikan efek menguntungkan dengan memperbaiki sifat dari mikroflora indogenus. Produk yang mengandung probiotik dikategorikan sebagai pangan fungsional (Kneifel et al. 1999; Hoover 2000) dan di Indonesia hal ini telah resmi 6 dinyatakan dalam Peraturan Pangan Fungsional dari BPOM tahun 2005, namun belum secara spesifik dinyatakan regulasi dan jumlah minimal kandungannya. Nousiainen et al. (2004) merekomendasikan dosis probiotik dalam diet berkisar antara 6 7 10 -10 CFU/g untuk dapat memberikan efek yang diinginkan. International Diary Federation (IDF) memberikan standar jumlah minimum probiotik hidup sebagai acuan adalah 106 CFU/ml pada produk akhir (Indratingsih, 2004). Namun demikian, jumlah ini bukanlah nilai mutlak karena dosis efektif dari probiotik bersifat spesifik tergantung pada kemampuan probiotik untuk bertahan dan berpenetrasi pada saluran pencernaan inang (Nousiainen et al. 2004 di dalam Salminen et al. 2004). Terdapat beberapa efek kesehatan yang menguntungkan dari probiotik yaitu membantu mengurangi beberapa jenis penyakit dan masalah kesehatan. Beberapa penyakit yang dapat dikurangi diantaranya adalah infeksi enterik, diare, diare akibat obat antibiotik, konstipasi, dan kanker usus (Salminen et al. 2004). Probiotik juga dapat menghambat bakteri patogen dan melakukan metabolisme terhadap laktosa sehingga bermanfaat bagi penderita intoleransi laktosa (Rusilianti 2006). BAL yang dapat mencapai saluran pencernaan manusia dalam keadaan hidup adalah Bifidobacteria (B. bifidum, B. infantis, B. breve, B. adolescentis, dan B. longum), beberapa spesies Lactobacillus (L. acidophilus, L. salivarus, L. fermentum, L. casei, L. plantarum, L. brevis, dan L. buchneri), dan beberapa Enterococci (Yuguchi et al. 1992). Keberadaan bakteribakteri tersebut dalam saluran pencernaan penting untuk menjaga keseimbangan ekosistem mikroflora dalam usus. Bakteri-bakteri tersebut menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap bakteri patogen Listeria monocytogenes, Escherichia coli, dan Salmonella sp. (Jenie 2003). Penelitian tentang BAL sebagai probiotik telah banyak dilakukan. Erkkilä dan Petäjä (2000) telah mengisolasi strain Lactobacillus sake dan Pediococcus acidilactici dari daging yang berpotensi sebagai probiotik karena kemampuannya untuk bertahan dalam suasana asam dan konsentrasi garam empedu yang tinggi. Moyano et al. (2008) mengisolasi BAL yang berpotensi sebagai probiotik dari feses manusia. Berdasarkan hasil pengujian tersebut diperoleh tujuh isolat BAL yang berpotensi sebagai probiotik, enam isolat teridentifikasi sebagai Lactobacillus casei dan satu isolat lainnya adalah Lactobacillus fermentum. C. BAKTERI ASAM LAKTAT ISOLAT ASI Air Susu Ibu (ASI) merupakan salah satu habitat BAL. ASI adalah cairan putih segar yang keluar dari kelenjar mamae seorang ibu sesaat setelah melahirkan bayi. ASI merupakan suatu emulsi lemak dalam larutan protein, laktosa, dan garam-garam anorganik yang disekresikan oleh kelenjar mamae ibu dan berguna sebagai makanan bagi bayinya (Siregar 2004). ASI pertama yang keluar berupa cairan berwarna kuning kental disebut kolostrom atau jolong. Kolostrom bertanggungjawab terhadap populasi mikroflora dalam usus bayi (Surono 2004). Kolostrom mengandung banyak sekali zat gizi yang sangat diperlukan bayi, salah satunya adalah faktor bifidus, yaitu sejenis karbohidrat yang mengandung nitrogen dan dapat menunjang pertumbuhan bakteri Lactobacillus bifidus (Worthington dan Roberts 1993). Pada tahun 1889, Tissier, peneliti Prancis di laboratorium Prof. Pasteur, menemukan bahwa bakteri yang mendominasi saluran usus bayi yang meminum ASI adalah Bifidobacterium. Semula bakteri ini diberi nama Bacillus bifidus, bentuknya seperti huruf Y, dalam bahasa Latin disebut bifurcated, sehingga selanjutnya disebut Bifidobacterium (Surono 2004). 7 Berbagai penelitian mengenai BAL yang diisolasi dari ASI telah banyak dilakukan. Pada Tabel 1. disajikan beberapa strain BAL yang telah berhasil diisolasi dari ASI. Tabel 1. Kelompok dan spesies BAL yang diisolasi dari ASI Kelompok Bakteri Lactobacillus sp. Spesies L. gasseri L. rhamnosus L. acidophilus L. plantarum L. fermentum Enterococcus sp. E. faecium E. faecalis Sumber: Martin et al. (2004), berdasarkan hasil penelitian Gavin dan Ostovar (1977), West et al. (1979), Eidelman dan Szilagyi (1979), El-Mohandes et al. (1993), Wright dan Fenny (1998), Marta´ n et al. (2002), Heikkila dan Saris (2003), dan Xaus et al. (2003) Selain hasil penelitian di atas, Nuraida et al. (2007) juga telah melakukan penelitian terhadap isolat klinis BAL yang diisolasi dari ASI. Isolat-isolat BAL yang diperoleh dari ASI tersebut diamati ciri fisiologis dan sifat biokimianya. Isolat-isolat BAL tersebut teridentifikasi sebagai Streptococcus heterofermentatif, Lactobacillus heterofermentatif, dan Lactobacillus homofermentatif. Hartanti (2007) dan Nuraida et al. (2007) lebih lanjut mengidentifikasi beberapa BAL yang telah diisolasi dari ASI, diantaranya adalah Lactobacillus A22, A23, B16, R14, R21, R23, dan R23H. Hasil pengamatan ciri fisiologis dan sifat biokimia menunjukkan kultur Lactobacillus rhamnosus A23, B16, R14, R21, R23, dan R23H serta Lactobacillus acidophillus A22 tergolong bakteri Gram positif, berbentuk batang, katalase negatif, mampu tumbuh pada suhu 10, 15, dan optimal tumbuh pada suhu 45oC, tidak menghasilkan CO2 dari fermentasi glukosa sehingga tergolong sebagai bakteri asam laktat homofermentatif kecuali Lactobacillus R23H, serta tidak menghasilkan dekstran dari fermentasi sukrosa. Bakteri-bakteri L. rhamnosus dan L. acidophillus isolat ASI ini dapat bertahan pada kondisi penambahan NaCl sampai konsentrasi 6.5% Beberapa BAL isolat ASI kemudian diikutsertakan dalam uji sifat probiotik. Berdasarkan hasil penelitian Hartanti (2007) dan Nuraida et al. (2007) isolat A22, A23, B16, R14, R21, dan R23 yang diuji secara in vitro menunjukkan ketahanan hidup yang baik pada kondisi pH asam (pH 2 selama 5 jam) dan konsentrasi garam empedu sebesar 0.5%, serta memiliki daya hambat terhadap Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, dan Staphylococcus aureus. Penelitian lebih lanjut yang dilakukan oleh Nuraida et al. (2009) menunjukkan bahwa isolat-isolat tersebut memiliki daya penghambatan terhadap Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) di atas 1 log dengan jumlah EPEC 105 CFU/ml dan jumlah isolat BAL 106 CFU/ml. Berdasarkan hasil uji tersebut, terlihat bahwa isolat A22, A23, B16, R14, R21, R23, dan R23H memiliki sifat-sifat bakteri probiotik. Uji gula-gula yang dilakukan terhadap beberapa strain BAL isolat ASI menunjukkan bahwa isolat tersebut dapat memfermentasi glukosa, rafinosa, dan sedikit memfermentasi inulin dan oligofruktosa (Hartanti 2007). Nuraida et al. (2009) meneliti pertumbuhan Lactobacillus acidophillus A22 serta Lactobacillus rhamnosus B16 dan R21 pada media berbasis MRSB dengan penambahan 5% FOS dan 5% inulin. Hasilnya menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut 8 dapat tumbuh dengan cukup baik pada media yang mengandung 5% FOS dan sedikit lebih rendah pada media yang mengandung 5% inulin. D. PREBIOTIK Untuk meningkatkan jumlah bakteri menguntungkan yang terdapat dalam kolon dibutuhkan sumber karbohidrat yang tidak dapat dicerna sehingga dapat dijadikan substrat untuk pertumbuhan bakteri. Terdapat beberapa jenis oligosakarida yang tidak dapat dicerna, diantaranya adalah fruktooligosakarida (FOS), galaktosilaktosa, isomaltooligosakarida, atau transgalaktooligosaksrida (TOS) yang memiliki efek meningkatkan jumlah bifidobacteria indigenous dan beberapa bakteri asam laktat (Salminen et al. 2004). Berdasarkan hal tersebut, lahirlah konsep prebiotik. Gibson dan Roberfroid (1995) yang diacu dalam Salminen et al. (1998) mendefinisikan prebiotik sebagai bahan pangan yang tidak dapat dicerna (non digestible) yang menguntungkan bagi inang dengan menstimulasi secara selektif pertumbuhan dan atau aktivitas bakteri tertentu dalam kolon inang. Salminen et al. (2004) menyebutkan bahwa suatu ingredien pangan dapat diklasifikasikan sebagai prebiotik jika memenuhi persyaratan berikut: (1) tidak terhidrolisis atau terserap pada saluran pencernaan bagian atas, (2) secara selektif dapat menstimulir pertumbuhan bakteri yang menguntungkan pada kolon, (3) dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen, sehingga secara sistematik dapat meningkatkan kesehatan. Prebiotik pada umumnya merupakan karbohidrat dengan bobot molekul rendah yang tidak dapat diserap dan dicerna serta umumnya berbentuk oligosakarida dan serat pangan (Silalahi dan Hutagalung 2002). Salminen et al. (2004) menyebutkan bahwa beberapa jenis prebiotik seperti inulin dan oligosakarida kedelai berasal dari sumber alami. Saat ini industriindustri pun telah banyak memproduksi prebiotik komersial seperti fruktooligosakarida (FOS), galaktooligosaksrida (GOS), dan xylooligosakarida. Konsumsi prebiotik merupakan salah satu strategi untuk meningkatkan kandungan mikrobiota pada saluran pencernaan. Selain sebagai suplemen bagi bakteri eksogenous, prebiotik juga merupakan bahan pangan yang tidak dapat dicerna yang secara selektif mampu menstimulasi proliferasi dan aktivitas populasi bakteri baik pada saluran pencernaan inang. Sebagian besar prebiotik teridentifikasi sebagai karbohidrat yang tidak dapat dicerna oleh manusia tetapi dapat difermentasi oleh bakteri. Proliferasi populasi mikrobiota saluran pencernaan seperti Lactobacilli dan Bifidobacteria dapat meningkat melalui konsumsi prebiotik. Peningkatan jumlah mikrobiota berkisar antara 10-100 kali di dalam feses (Crettenden 1999 di dalam Salminen 2009). Selain mendukung pertumbuhan probiotik, prebiotik juga memiliki banyak manfaat lain bagi tubuh. Prebiotik mempunyai efek yang menyerupai serat pangan sehingga dapat mencegah terjadinya konstipasi. Dengan menstimulasi pertumbuhan bakteri baik, prebiotik juga turut berperan dalam mencegah diare (Musatto 2007). Prebiotik akan dimetabolisme oleh probiotik di dalam kolon dan menghasilkan Short Chain Fatty Acid (SCFA) yang akan menyebabkan pH kolon menurun. Penurunan pH kolon mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen serta mempercepat penyerapan mineral. Bakteri yang berperan dalam pembentukan SCFA di dalam kolon umumnya berasal dari golongan Lactobacillus dan Bifidobacteria. SCFA yang dihasilkan diantaranya adalah asetat, propionat, dan butirat (Musatto 2007). 9 Fermentasi prebiotik yang menghasilkan SCFA berlangsung pada kondisi anaerob. Prebiotik akan dihidrolisis menjadi monomer unit glukosa, galaktosa, xylosa, atau arabinosa, yang kemudian akan difermentasi melalui glikolisis menjadi asam piruvat. Setelah dalam bentuk piruvat, akhirnya diubah menjadi SCFA dan sebagian gas. Hasil samping selain SCFA akibat fermentasi bakteri diantaranya adalah metana (CH4), hidrogen (H2), dan karbon dioksida (CO2). SCFA hasil fermentasi akan diserap pada lokasi usus besar dan diangkut ke hati melalui sirkulasi enterohepatic (Cummings 1997). Persamaan fermentasi heksosa menjadi SCFA dalam kolon adalah sebagai berikut: 59 C6H12O6 + 38 H2O → 60 CH3COOH + 22 CH3CH2COOH + 18 CH3CH2CH2COOH + 96 CO2 + 268 H+ + panas Efek prebiotik bersifat spesifik terhadap jenis probiotik tertentu. Ukuran molekul, komposisi gula penyusun, dan struktur ikatan prebiotik akan menentukan jenis probiotik yang dapat memetabolismenya terkait dengan enzim yang disekresikan oleh probiotik tersebut. Berbagai penelitian mengenai pengaruh prebiotik terhadap probiotik telah banyak dilakukan. Bouhnik et al. (1996) meneliti pengaruh pemberian susu fermentasi yang mengandung probiotik Bifidobacterium sp. dan prebiotik FOS terhadap manusia. Hasilnya menunjukkan bahwa terdapat peningkatan jumlah Bifidobacteria pada feses manusia yang mengkonsumsi susu fermentasi dibandingkan dengan yang tidak mengkonsusmsi susu fermentasi. Shin et al. (2000) meneliti pengaruh beberapa jenis prebiotik komersial yaitu inulin, FOS, dan GOS terhadap probiotik Bifidobacterium spp. Dengan penambahan prebiotik pada media, proliferasi sel Bifidobacterium spp. menjadi lebih cepat. Beberapa faktor yang mempengaruhi efektifitas prebiotik antara lain jenis prebiotik, dosis, dan komposisi mikroorganisme. Reid et al. (2001) yang diacu di dalam Surono (2004) menyarankan dosis prebiotik yang efektif adalah 1 – 3 g/hari untuk anak-anak dan 5 – 15 g/hari untuk orang dewasa. Konsumsi prebiotik yang berlebih (lebih dari 20 g/hari) dikhawatirkan dapat memberi efek laksatif yaitu mempercepat pengeluaran pada sistem saluran pencernaan atau melunakkan sisa pencernaan (Bouhnik et al. 1999). Jenis prebiotik yang umum digunakan dan sudah banyak diteliti diantaranya adalah inulin, FOS, dan GOS (Bouhnik et al. 1999). Jenis prebiotik tersebut dapat digunakan sebagai sumber prebiotik tunggal atau dikombinasikan antara satu jenis prebiotik dengan prebiotik lainnya. Produk pangan komersial yang telah memanfaatkan prebiotik sebagai salah satu ingredientnya diantaranya adalah produk olahan susu. Terdapat lebih dari 10 merk susu formula dan makanan pendamping ASI yang dipasarkan di Indonesia mengandung prebiotik inulin, FOS, dan GOS di dalam produknya. European Commission (EC) bahkan telah merekomendasikan kombinasi prebiotik FOS:GOS (1:9) sebanyak 0.8 g/ 100 ml untuk produk susu formula (SCF 2001a; SCF 2001b). Kombinasi oligofruktosa berantai panjang dan GOS berantai pendek dengan perbandingan 1:9 telah digunakan pada produk susu formula di Eropa selama lebih dari lima tahun (Veereman 2007). 1. Inulin Inulin merupakan polimer fruktan yang diisolasi pertama kali dari tanaman Inula helenium. Inulin juga ditemukan pada chicory, dandelion, dan artichoke (Roberfroid 2000). Inulin dan hidrosilatnya ditemukan secara alami pada beberapa tanaman seperti bawang 10 putih, asparagus, bawang daun, pisang, gandum, dan jerussalem artichoke (Salminen et al. 1998). Inulin umumnya dimanfaatkan sebagai bahan pengganti lemak (Gorski 1995). Sama halnya dengan prebiotik lain, inulin tidak dapat dihidrolisis atau diserap di dalam usus halus. Inulin juga telah menunjukkan efek meningkatkan jumlah bakteri baik pada kolon sehingga dapat dikatakan sebagai prebiotik (Roberfroid et al. 1998). Inulin adalah fruktan dengan ikatan β(1-2) antar monomer pada poli atau oligomernya. Terdapat unit glukosa pada ujungnya yang memiliki ikatan β(2-1) dengan monomer fruktosa (Niness 1999). Roberfroid (1999) menyatakan hal yang sama bahwa fruktan tipe inulin memiliki komposisi β-D-fruktofuranosa yang saling terhubung dengan ikatan β(1-2), dengan monomer pertama dari rantainya adalah residu β-D-glukopiranosil atau β-D-fruktopiranosil. Struktur inulin dapat dilihat pada Gambar 3. Gambar 3. Struktur inulin (Roberfroid 2008) Inulin memiliki derajat polimerisasi (DP) yang cukup tinggi dibandingkan dengan prebiotik lainnya yaitu berkisar antara 2 – 60 dengan rata-rata DP sebesar 10 (Roberfroid 1993 di dalam Salminen et al. 1998). Hasil ini berdampak pada karakteristiknya yang larut sempurna di air panas, namun sedikit larut dalam air dingin maupun alkohol (Bergner 1997). Oleh karena itu, pemanfaatan inulin secara lebih luas perlu diperhatikan. Selain sebagai pengganti lemak, inulin juga telah dimanfaatkan sebagai bahan pengental dan pemanis buatan. Beberapa produk yang memanfaatkan inulin sebagai ingrediennya antara lain selai, roti, sereal, susu, bahkan tablet suplemen (Franck dan Leener 2005). Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui pengaruh inulin terhadap pertumbuhan berbagai probiotik. Rowland et al. 1998 meneliti pangaruh pemberian prebiotik inulin dan probiotik Bifidobacerium longum terhadap saluran cerna tikus yang menderita kanker. Hasilnya menunjukkan terdapat efek yang sinergis antara prebiotik dan probiotik yang diberikan. Penelitian lain menunjukkan bahwa Lactobacillus plantarum IS-10506 dapat memfermentasi inulin saat ditumbuhkan pada media berbasis MRSB dengan inulin sebagai sumber karbon (Artanti 2009). Hasil ini berbeda dengan hasil penelitian Huebner et al. (2007) yang menunjukkan bahwa pemberian inulin tidak mendukung pertumbuhan Lactobacillus plantarum 4008. Hal ini mengindikasikan bahwa efek inulin sebagai prebiotik bersifat spesifik terhadap strain tertentu. 11 2. Fruktooligosakarida Fruktooligosakarida (FOS) merupakan jenis oligosakarida yang tidak dapat dicerna yang tersusun atas glukosil-(fruktosil)n-1-fruktosa (GFn) dan (fruktosil)m-1-fruktosa (Fm). Huruf n dan m merepresentasikan derajat polimerisasi (DP) yang menunjukkan banyaknya unit fruktosa dalam oligomer FOS (Salminen et al. 2004). FOS banyak terdapat dalam berbagai jenis tanaman secara alami. FOS dapat ditemukan pada bawang, asparagus, bawang daun, pisang, dan gandum serta terdapat dalam akar chicory sebagai sediaan energi utamanya (Salminen et al. 1998). FOS umumnya digunakan sebagai pemanis pengganti sukrosa karena memiliki nilai kalori yang rendah yaitu sekitar 1.5 kkal/g (Roberfroid et al. 1993). Produk pangan yang memanfaatkan FOS sebagai pemanis diantaranya adalah kue, roti, permen, produk susu, dan beberapa minuman (Trenev 2000). FOS selama ini diperoleh dengan dua cara berbeda, yaitu melalui hidrolisis parsial inulin yang berasal dari chicory dan melalui sintesis dari sukrosa menggunakan fruktosil transferase (Franck 2000). FOS difermentasi secara selektif oleh sebagian besar BAL galur bifidobacteria. Konsumsi FOS 4-20 g/hari secara selektif mampu menstimulasi pertumbuhan bifidobakteri pada manusia (Salminen et al. 2004). R = CH2OH n = 2-9 Gambar 4. Struktur FOS (Roberfroid 2008) FOS dalam sistem pencernaan manusia tidak mengalami perubahan signifikan karena struktur spesifik (ikatan β(2-1)) yang dimilikinya tidak dapat dihidrolisis oleh enzim pencernaan manusia. Senyawa ini akan sampai ke dalam usus besar dan difermentasi oleh mikroba (Franck 2000). Sama halnya dengan inulin, FOS sebagai hidrosilat inulin menunjukkan efek peningkatan proliferasi bifidobakteri pada kolon yang diikuti dengan penurunan jumlah bakteroid dan klostridia pada feses (Hidaka et al. 1990; Gibson et al. 1995 di dalam Salminen et al. 1998). Penelitian yang dilakukan Gmeiner et al. (2000) menunjukkan bahwa penambahan prebiotik FOS dapat meningkatkan proliferasi sel Lactobacillus acidophilus secara in vitro. Penelitian lain yang dilakukan oleh Pennachia et al. (2006) menyimpulkan bahwa Lactobacillus plantarum DL6 dapat tumbuh pada media berbasis MRSB yang mengandung 2% FOS sebagai sumber karbon, namun tidak demikian dengan Lactobacillus plantarum 12 WCFSI. Perbedaan respon tiap strain ini dikarenakan perbedaan pengkodean gen dalam sistem metabolik yang berpengaruh terhadap skor aktivitas prebiotik (Huebner et al. 2007). Umumnya dosis FOS dalam asupan terhadap percobaan klinis yang pernah dilakukan berkisar antara 3 – 20 g/hari untuk orang dewasa serta 0.4 – 3 g/hari untuk balita. Dosis ini merupakan dosis aman karena mewakili rata-rata kandungan FOS yang terdapat secara alami pada bahan pangan, khususnya sayuran (Roberfroid et al. 1998). 3. Galaktooligosakarida Galaktooligosakarida (GOS) merupakan salah satu oligosakarida yang mampu menstimulasi proliferasi bifidobakteri. GOS banyak ditemukan pada ASI, susu sapi, dan produk yoghurt komersial. Struktur kimianya terdiri dari beberapa molekul galaktosa yang berikatan dengan gugus glukosa dibagian ujungnya. GOS disintesis dari laktosa melalui transfer glikosil dari satu atau lebih unit D-galaktosil menjadi unit D-galaktosa dengan memanfaatkan enzim β-D-galaktosidase sebagai katalis (Mahoney 1998 di dalam Villaluenga et al. 2008). n Gambar 5. Struktur GOS (Roberfroid 2008) Molekul GOS (sebagai contoh, Gal (β 1-4) Gal (β1-4) Glc) merupakan hasil sintesis yang memanfaatkan aktivitas enzim β-galaktosidase dari laktosa yang dikenal dengan istilah reaksi transgalaktosilasi. β–galaktosidase adalah kelompok enzim hidrolitik dan telah banyak digunakan oleh industri produk olahan susu untuk menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Reaksi hidrolisis ini dapat meningkatkan tingkat kemanisan pada produk olahan susu dan juga menurunkan kadar laktosa sehingga bermanfaat bagi penderita intoleransi laktosa (Lomer et al. 2008 di dalam Gosling et al. 2010). Reaksi transgalaktosilasi dan pembentukan GOS dari laktosa pertama kali diteliti pada tahun 1950 (Wallenfels 1951 di dalam Gosling et al. 2010). Sejak saat itu, GOS telah menjadi produk komersial yang banyak beredar di Eropa dan Asia ( Crittenden dan Playne 1996 di dalam Golsing et al. 2010). Sebanyak 6000 ton GOS telah diproduksi di Jepang pada tahun 2005 (Taniguchi 2005 di dalam Golsing et al. 2010). Sintesis GOS dari laktosa dengan memanfaatkan hidrolisis enzimatik oleh β-Dgalaktosidase yang berasal dari Aspergillus oryzae dan Streptococcus thermophilus telah berhasil dilakukan (Ito et al. 1990 di dalam Salminen et al. 1998). Beberapa penelitian lain yang telah dilakukan menunjukkan bahwa terdapat korelasi yang positif antara pemberian GOS pada diet dengan peningkatan jumlah bifidobakteri dan laktobasili pada feses sukarelawan. Dosis yang dibutuhkan agar dapat memberikan efek yang signifikan adalah 10 g/hari (Ito et al. 1990 di dalam Salminen et al. 1998). 13 E. SUSU FERMENTASI Salah satu minuman hasil fermentasi asam laktat yang telah dikenal luas adalah susu fermentasi. Produk susu fermentasi telah dikenal dan dikonsumsi manusia jauh sebelum penemuan mikroba itu sendiri. Baru pada awal abad ke-20, Metchnikoff (1845-1916) menemukan bahwa komponen asam laktat dan produk-produk lain yang terdapat di dalam susu fermentasi dihasilkan oleh bakteri asam laktat (Oberman dan Libudzisz 1985 diacu dalam Wood 1998). Susu fermentasi adalah hasil fermentasi susu segar, susu skim atau susu konsentrat yang telah dipasteurisasi atau disterilisasi oleh mikroba tertentu (Oberman dan Libudzisz 1985 diacu dalam Wood 1998). Tujuan awal dari fermentasi susu adalah untuk memperpanjang umur simpan susu sehingga dapat tahan lebih lama. Kosikowski (1977) mengklasifikasikan susu fermentasi menjadi 4 tipe, yaitu: (1) berasam rendah, contohnya susu krim dan susu mentega; (2) berasam sedang, contohnya susu acidophilus dan yoghurt; (3) berasam tinggi, contohnya susu bulgaricus; (4) mengandung asam dan alkohol, contohnya kefir dan koumiss. Jenis susu fermentasi yang sudah dikenal luas antara lain yoghurt, susu acidophilus, susu bulgaricus, kefir, koumiss, yakult, pilima, skyr, taette, lassi, leben, dahi, vilia, dan masih banyak lagi (Vedamuthu 1982 diacu dalam Rose 1982). Secara tradisional susu yang digunakan dalam pembuatan susu fermentasi dapat berasal dari jenis binatang mamalia yang banyak ditemukan di daerah masing-masing, seperti susu unta, susu kambing, susu kuda, susu kerbau dan yang paling umum adalah susu sapi. Keistimewaan susu fermentasi terletak pada umur simpan yang lebih panjang dibanding susu segar. Hal ini karena susu fermentasi memiliki tingkat keasaman yang tinggi (pH < 4,5) sehingga tidak disukai oleh mikroba-mikroba kontaminan. Keistimewaan lain yang membuat susu fermentasi digemari adalah kandungan metabolit-metabolit hasil fermentasi mikroba yang baik bagi kesehatan tubuh terutama saluran pencernaan. Beberapa manfaat dari susu fermentasi menurut Yuguchi et al. yang diacu dalam Nakazawa dan Hosono (1992), antara lain: (1) nilai pH yang rendah di dalam usus akibat aktivitas BAL membantu absorpsi mineral terutama kalsium, (2) menghambat pertumbuhan bakteri patogen dalam usus, (3) membantu penderita intoleransi laktosa karena BAL memfermentasi laktosa yang ada di dalam susu dan dapat meningkatkan sekresi enzim laktase di dalam saluran pencernaan. Rieska (2009) telah melakukan penelitian pembuatan produk susu fermentasi berupa yoghurt dengan memanfaatkan BAL isolat ASI sebagai starter. BAL isolat ASI yang digunakan antara lain adalah Lactobacillus pentosus A7, Pediococcus pentosaceus A16, Lactobacillus fermentum A17f, dan Lactobacillus rhamnosus B16. Hasilnya menunjukkan bahwa BAL isolat ASI tersebut dapat digunakan sebagi starter dalam pembuatan yoghurt. Berdasarkan hasil pengamatan terhadap nilai pH, TAT (% asam laktat), tekstur crud, dan total BAL pada yoghurt, diperoleh suhu dan waktu inkubasi terbaik yang dapat digunakan yaitu pada suhu 37oC dan 42oC selama 48 jam. Kombinasi kultur BAL isolat ASI dengan Streptococcus thermophilus (perbandingan 1:1) menghasilkan mutu sensori yoghurt yang baik dan mendekati mutu sensori yoghurt konvensional (Rieska 2009). 14 III. BAHAN DAN METODE A. BAHAN DAN ALAT 1. Bahan Bahan utama yang dibutuhkan dalam penelitian terdiri dari prebiotik berupa fruktooligosakarida (QHTFOS-G50LTM), galaktooligisakarida (QHTGOS-50LTM), dan inulin (Frutafit IQTM). Bakteri Asam Laktat (BAL) yang digunakan dalam penelitian ini adalah BAL yang berasal dari isolat ASI. Isolat tersebut antara lain: Lactobacillus rhamnosus A23, B16, R14, R21, R23 dan R23H serta Lactobacillus acidophillus A22. Isolat kultur BAL tersebut diperoleh dari SEAFAST CENTER IPB. Bahan yang digunakan untuk media pertumbuhan diantaranya adalah media MRS (deMan, Rogosa and Sharpe) broth, MRS agar, yeast extract (OxoidTM), susu skim (SunlacTM), protease peptone (DifcoTM), Tween 80, K2HPO4.3H2O, MgSO4.7H2O, MnSO4.4H2O (MerckTM), dan sodium asetat (CicaTM). Bahan-bahan untuk analisis oligosakarida meliputi larutan fenol 5%, H2SO4 pekat, Na2CO3, NaHCO3, KCN, FeNH4(SO4)2 (MerckTM), dan potassium ferric cyanide (CicaTM). Bahan yang digunakan untuk analisis persen asam laktat adalah NaOH 0.1 N (CicaTM), KHP, indikator penolfthalein (MerckTM), dan air destilata. 2. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian terdiri dari peralatan analisis mikrobiologi dan analisis kimia untuk oligosakarida dan persen asam laktat. Alat-alat untuk analisis mikrobiologi meliputi mikropipet 100-1000 µl, mikropipet 10-100 µl, membran filter steril 0.2 µl, autoklaf, oven, hot plate magnetic stirrer, pH meter, tabung reaksi, dan cawan petri. Alat-alat untuk analisis oligosakarida dan persen asam laktat meliputi sentrifus, spektrofotometer, buret, tabung reaksi, dan alat gelas lainnya. B. METODE PENELITIAN Pelaksanaan penelitian ini terdiri dari tiga tahap. Tahap pertama adalah seleksi BAL isolat ASI yang dapat mempergunakan prebiotik sebagai sumber karbon untuk pertumbuhannya. Pada tahap ke dua, isolat terpilih ditumbuhkan kembali pada media dengan berbagai prebiotik sebagai sumber gula untuk dilihat metabolismenya dengan menganalisis kandungan gula dan asam laktat pada media. Selanjutnya pada tahap ke tiga, isolat terpilih ditumbuhkan pada media susu skim dengan penambahan kombinasi prebiotik untuk kembali diamati metabolismenya. Dengan demikian, hasil yang diperoleh dapat dijadikan acuan dalam pengembangan produk sinbiotik berbasis susu fermentasi. Tahapan penelitian secara keseluruhan dapat dilihat pada Gambar 6. Seleksi BAL yang dapat memetabolisme prebiotik, BAL ditumbuhkan pada media berbasis MRSB dengan kombinasi prebiotik (A, B, C, D, E, dan F)*, inkubasi BAL pada 37oC selama 24 jam Analisis total BAL Kultur BAL terpilih Uji metabolisme prebiotik oleh BAL, BAL ditumbuhkan pada media berbasis MRSB dengan kombinasi prebiotik (A, B, C, D, E, dan F)*dan diinkubasi pada 37oC selama 24 jam Analisis OD, pH, % asam laktat, total gula, dan gula pereduksi Kombinasi BAL dan prebiotik terpilih Aplikasi pemanfaatan BAL isolat ASI dan prebiotik dalam produk susu fermentasi, BAL ditumbuhkan pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik terpilih, inkubasi pada 37oC selama 24 jam Analisis total BAL, pH, % asam laktat, total gula, dan gula pereduksi, Kombinasi BAL dan prebiotik terpilih pada pembuatan susu fermentasi Gambar 6. Bagan Alir Penelitian * Keterangan: A B C D E F : : : : : : media berbasis MRSB tanpa gula (kontrol) media berbasis MRSB dengan 5% FOS media berbasis MRSB dengan 5% GOS media berbasis MRSB dengan 5% inulin media berbasis MRSB dengan 5% FOS:GOS (1:9) media berbasis MRSB dengan 5% inulin:GOS (1:9) 16 1. Seleksi BAL Isolat ASI yang Dapat Memanfaatkan Prebiotik sebagai Sumber Karbon a. Penyegaran dan Pengawetan Kultur (Hariyadi et al. 2003) Manik-manik yang mengandung mikroba yang digunakan (sebanyak ± 3 biji) ditempatkan pada tabung reaksi yang berisi MRSB steril. Kemudian masing-masing tabung diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam. Selanjutnya dari tabung reaksi berisi kultur tersebut diambil sebanyak 0.1 ml dan dimasukan ke dalam tabung reaksi lain yang berisi 10 ml MRSB untuk diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam. Kultur yang telah diinkubasi siap untuk digunakan. Pengawetan kultur sangat penting untuk dilakukan agar kultur bakteri dapat terus digunakan. Pengawetan dilakukan dengan cara menambahkan gliserol steril ke dalam kultur BAL yang telah diinokulasikan dalam MRSB steril dengan perbandingan 1:4 kemudian dikocok rata. Suspensi bakteri yang telah berisi gliserol dimasukkan ke dalam vial yang berisi manik-manik steril sampai manik-manik tersebut terendam. Campuran kemudian dikocok dan sisa cairan dipipet dan dibuang. Kultur yang telah termobilisasi disimpan pada suhu -20oC. b. Persiapan Media Fermentasi Media fermentasi yang digunakan adalah media berbasis MRSB tetapi glukosa pada media diganti dengan beberapa jenis prebiotik yang digunakan. Pembuatan media berbasis MRSB ini mengacu pada pembuatan media yang dilakukan oleh Khrisnayudha (2007). Media berbasis MRSB dibuat dengan mencampurkan protease pepton, yeast extract, Tween 80, dipotassium hidrogen fosfat, sodium asetat, MgSO4.7H2O dan MnSO4.4H2O. Jumlah bahan dan prosedur pembuatan media berbasis MRSB dapat dilihat pada Lampiran 2. Sterilisasi medium dilakukan dalam autoklaf pada 121oC selama 15 menit. Konsentrasi prebiotik FOS, GOS, dan inulin yang ditambahkan pada media berbasis MRSB adalah sebesar 5%. Terlebih dahulu dibuat larutan stok prebiotik dengan konsentrasi 10 kali konsentrasi awal media, kecuali untuk inulin dibuat larutan stok dengan konsentrasi 2 kali konsentrasi semula. Penambahan prebiotik dilakukan secara terpisah setelah didapatkan medium dan larutan prebiotik steril. Sterilisasi prebiotik dilakukan dengan menggunakan filter steril 0.2 µm. Sesaat sebelum digunakan, media berbasis MRSB yang telah disiapkan ditambah dengan prebiotik steril. Terdapat enam jenis media dengan kombinasi prebiotik yang berbeda yaitu FOS, GOS, inulin, FOS:GOS (1:9), inulin:GOS (1:9), dan kontrol tanpa penambahan prebiotik. Media berbasis MRSB yang telah dicampur dengan prebiotik sebagai sumber gula siap untuk digunakan sebagai media pertumbuhan BAL. 17 c. Uji Pertumbuhan BAL pada Media Berbasis MRSB dengan Prebiotik sebagai Sumber Karbon Pada tahap penyeleksian ini, pengaruh penambahan prebiotik berupa FOS, GOS, dan inulin diujikan terhadap tujuh kultur BAL isolat ASI yang telah disebutkan sebelumnya. Kultur dari masing-masing BAL sebanyak 0.1 ml ditambahkan pada tabung reaksi berisi media yang telah dipersiapkan sebelumnya untuk selanjutnya dilakukan inkubasi di dalam inkubator 37oC selama 24 jam. Prosedur yang sama juga dilakukan terhadap kontrol yang berupa media tanpa penambahan gula. Dengan demikian, secara keseluruhan terdapat enam perlakuan untuk masing-masing kultur dengan perbedaan pada penambahan jenis prebiotik yaitu 5% FOS, 5% GOS, 5% inulin, 5% FOS:GOS (1:9), 5% inulin:GOS (1:9), dan kontrol. Analisis total BAL secara kuantitatif dilakukan setelah inkubasi selama 24 jam. Analisis dilakukan dengan menghitung secara langsung jumlah BAL yang tumbuh pada MRSA setelah dilakukan pencawanan dengan metode cawan tuang. Prosedur selengkapnya dapat dilihat pada metode analisis pertumbuhan BAL. 2. Uji Metabolisme Prebiotik oleh BAL Metabolisme prebiotik oleh BAL dapat diamati dengan menganalisis kandungan gula dan asam pada media pertumbuhan yang digunakan. Kultur BAL yang terpilih berdasarkan seleksi pada tahap 1 (Lactobacillus R23 dan R23H), ditumbuhkan kembali pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon. Media berbasis MRSB dan kombinasi prebiotik yang digunakan sama dengan pengujian pada tahap sebelumnya. Hanya saja pada tahap ini proses sterilisasi prebiotik dengan membran filter diganti dengan proses pasteurisasi pada suhu 85oC selama 30 menit. Hal ini dilakukan untuk menyesuaikan dengan kondisi proses pembuatan susu fermentasi pada umumnya. Masing-masing kultur BAL yang ditumbuhkan diamati dan dianalisis setiap dua jam mulai jam ke-0 sampai jam ke-12 dan selanjutnya diamati kembali pada jam ke-24. Beberapa analisis yang dilakukan adalah pertumbuhan sel dengan metode spektrofotometri, analisis total gula, gula pereduksi, persen asam laktat, dan pH. Prosedur analisis selengkapnya dapat dilihat pada bagian metode analisis. 3. Aplikasi pemanfaatan Prebiotik dan BAL Isolat ASI pada Susu Fermentasi Berbeda dengan kedua tahap sebelumnya, untuk tahap ke tiga, media yang digunakan adalah susu skim. Pembuatan media susu skim dilakukan dengan melarutkan susu skim sebanyak 12% (b/v) ke dalam akuades kemudian dipasteurisasi dengan autoklaf pada suhu 100oC selama 30 menit. Media susu skim digunakan agar dapat dilihat metabolisme prebiotik dengan keberadaan sumber gula lain yaitu laktosa. Dengan demikian, hasil dari penelitian ini dapat dijadikan acuan dalam pengembangan produk sinbiotik berbasis susu fermentasi. Sebelum dilakukan pengujian, disiapkan terlebih dahulu starter kultur seperti halnya dalam pembuatan produk susu fermentasi. Kultur BAL terpilih (Lactobacillus R23) sebanyak 2% ditumbuhkan pada media susu skim 10% yang telah dipasteurisasi pada suhu 100oC 18 selama 30 menit. Media susu skim yang telah diinokulasi dengan BAL kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Starter yang telah diinkubasi siap untuk digunakan. Kombinasi prebiotik yang digunakan adalah FOS, Inulin, dan Inulin:GOS (1:9). Prebiotik yang telah dipasteurisasi pada 85oC selama 30 menit ditambahkan ke dalam media susu skim sebanyak 5% sesaat sebelum media digunakan. Selain media susu skim dengan penambahan prebiotik, digunakan pula media susu skim tanpa penambahan prebiotik sebagai media pembanding. Selanjutnya, 1% starter kultur yang telah siap digunakan diinokulasikan ke dalam media susu skim dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Analisis yang dilakukan meliputi analisis total BAL dengan menggunakan metode hitungan cawan, analisis total gula, gula pereduksi, pH, dan TAT (% asam laktat). Analisis dilakukan pada jam ke-0, jam ke-24, dan jam ke-48. Prosedur analisis selengkapnya dapat dilihat pada bagian metode analisis. C. METODE ANALISIS 1. Analisis Pertumbuhan BAL dengan Metode Hitungan Cawan (BAM 2001) Sebanyak 1 ml kultur dipipet secara aseptis ke dalam pengenceran berseri hingga diperoleh tiga pengenceran terbesar yang akan dicawankan secara duplo. Metode pencawanan yang digunakan adalah metode agar tuang (pour plate) dengan MRSA sebanyak 12-15 ml. MRSA dituang ke dalam cawan petri yang berisi kultur dan diratakan dengan cara memutar cawan lalu dibiarkan membeku. Setelah membeku, cawan diinkubasikan dengan posisi terbalik pada suhu 37oC selama 48 jam. Koloni yang dihitung berada dalam kisaran 25 – 250 koloni. Jumlah koloni dicatat dan dihitung dengan rumusan sebagai berikut: N = Σ C / [ ( 1 x n1) + ( 0.1 x n2) ] x d Keterangan: N : Jumlah koloni (CFU) per ml atau gram produk ΣC : Total seluruh koloni pada cawan yang dapat dihitung : Jumlah cawan dari pengenceran pertama yang dihitung n1 : Jumlah cawan dari pengenceran kedua yang dihitung n2 d : Nilai pengenceran dari penghitungan pertama yang digunakan 2. Analisis Pertumbuhan BAL dengan Metode Spektrofotometri (Widdel 2007) Analisis kuantitatif pertumbuhan BAL dengan metode spektrofotometri dilakukan dengan mengukur nilai optical density (OD) media kultur pada λ 600 nm. Pengukuran ini dilakukan setiap 2 jam selama waktu inkubasi berlangsung yaitu dari jam ke-0 sampai jam ke-12 dan dilanjutkan pada jam ke-24. Pengukuran OD ini dimaksudkan untuk menduga pola pertumbuhan bakteri. Pada awal waktu inkubasi, pengukuran dilakukan langsung terhadap 5 ml media kultur. Tetapi untuk waktu inkubasi selanjutnya (disesuaikan dengan tingkat kekeruhan media) dilakukan pengenceran terlebih dahulu agar nilai OD tetap terbaca pada alat. Sebanyak 0.5 ml media kultur diencerkan dengan 4.5 ml media yang sama tetapi tidak mengandung kultur sehingga diperoleh faktor pengenceran 10. Blanko yang digunakan 19 adalah media tanpa kultur yang sama dengan media yang digunakan untuk pengencer. OD sampel diukur dengan menggunakan rumus sebagai berikut: ODterhitung = Odterukur x FP Keterangan: OD : optical density FP : faktor pengenceran 3. Analisis Total Gula Metode Fenol-Sulfat (Dubois et al. 1956) Total gula diukur setiap 2 jam selama waktu inkubasi yaitu dari jam ke-0 sampai jam ke-12 dan dilanjutkan pada jam ke-24. Persiapan sampel dilakukan dengan cara memisahkan gula dari BAL yang ditumbuhkan dan komponen lain yang terdapat dalam media. Hal ini dilakukan dengan cara mensentrifus media berisi BAL selama 10 menit pada kecepatan 4000 rpm. Selanjutnya sebanyak 1 ml supernatan dipipet dan ditambahkan NaOH 1 N sampai pH netral (2 tetes). Sebelum dianalisis, sampel diencerkan terlebih dahulu dengan akuades hingga mencapai konsentrasi pada kisaran konsentrasi kurva standar. Kemudian sampel sebanyak 0.5 ml dipipet untuk dianalisis total gulanya. Sampel tersebut dicampurkan dengan 0.5 ml larutan fenol 5% kemudian divorteks. Setelah itu, campuran tersebut ditambah dengan 2.5 ml H2SO4 pekat lalu divorteks kembali dan disimpan selama 20 menit pada suhu ruang. Sampel kemudian diukur absorbansinya pada λ 490 nm. Hal yang sama dilakukan terhadap larutan glukosa standar dengan konsentrasi 20, 40, 60, 80, dan 100 µg/ml untuk pembuatan kurva standar. 4. Analisis Total Gula Pereduksi metode Park-Johnson (Takeda 2003) Penetapkan total gula pereduksi dilakukan setiap 2 jam selama waktu inkubasi berlangsung yaitu dari jam ke-0 sampai jam ke-12 dan dilanjutkan pada jam ke-24. Persiapan sampel yang dilakukan sama dengan persiapan sampel untuk analisis total gula. Sebelumnya disiapkan pula beberapa larutan yang dibutuhkan dalam analisis ini yaitu larutan buffer sodium karbonat-sodium hidrogen karbonat (larutan A), larutan potassium fericianida 0.1% (larutan B), dan larutan feric ammonium sulfat (larutan C). Pembuatan ketiga jenis larutan tersebut dapat dilihat pada Lampiran 3. Selanjutnya sebanyak 1 ml sampel dicampurkan dengan 0.5 ml larutan A dan 0.5 ml larutan B. Campuran tersebut dipanaskan selama 15 menit dalam air mendidih kemudian didinginkan dengan air yang mengalir selama 10 menit. Setelah cukup dingin, ke dalam campuran ditambahkan 2.5 ml larutan C lalu divorteks dan dibiarkan bereaksi selama 20 menit di suhu ruang. Sampel diukur absorbansinya pada λ 715 nm. Hal yang sama juga dilakukan terhadap larutan glukosa standar dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, dan 10 µg/ml untuk pembuatan kurva standar. 5. Analisis Persen Asam Laktat (AOAC 942.05, 1998) Penentuan jumlah persen asam laktat selama inkubasi dilakukan melalui pengukuran total asam tertitrasi (TAT) setiap 2 jam dari jam ke-0 sampai jam ke-12 dan 20 dilanjutkan pada jam ke-24. Pengukuran TAT dilakukan dengan mentitrasi kandungan asam pada sampel oleh basa standar yaitu NaOH 0.1 N. NaOH yang digunakan sebelumnya harus distandardisasi terlebih dahulu dengan menggunakan asam potassium phthalate (KHP). Prosedur standardisasi selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 4. Sebanyak 1 ml sampel dilarutkan dengan air destilata menjadi 25 ml di dalam labu takar. Kemudian sampel ditambahkan 2-3 tetes indikator phenolftalein lalu dititrasi dengan NaOH 0.1 N. Titik akhir titrasi tercapai saat muncul warna pink yang pertama. Perhitungan jumlah persen asam laktat dilakukan dengan menggunakan rumus berikut: Asam laktat (%) = V1 x N x BE x FP x 100% Keterangan: V2 x 1000 V1 N BE FP V2 : Volume NaOH 0.1 N yang telah distandardisasi : Normalitas NaOH hasil standardisasi : Bobot ekuivalen asam laktat (90.08 g/ekuivalen) : Faktor Pengenceran : Jumlah sampel yang dititrasi (ml) 6. Analisis pH (AOAC 973.41, 1998) Penentuan pH sampel dilakukan setiap 2 jam selama waktu inkubasi berlangsung yaitu pada jam ke-0 sampai jam ke-12 dan dilanjutkan pada jam ke-24. Sebelumnya pH meter dikalibrasi terlebih dahulu dengan buffer pH 7.00 dan kemudian dilanjutkan dengan buffer pH 4.00. Elektroda pH meter dibilas dahulu, dikeringkan dengan tisu, dicelup ke dalam buffer pH, dan ditunggu sampai layar menunjukkan nilai pH sesuai dengan buffer yang digunakan. Selanjutnya sebanyak 5 ml sampel diletakkan dalam gelas piala kemudian diukur pH-nya secara duplo. 7. Analisis Statistik Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan ANOVA (Analysis of Variance) dengan analisis lanjutan menggunakan uji Duncan pada taraf signifikansi 5%. Analisis statistik ini dilakukan terhadap data hasil hitungan cawan, nilai OD, gula pereduksi, total gula, pH, dan TAT (% asam laktat) dengan bantuan program SPSS 16 for Windows. 21 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. SELEKSI BAL ISOLAT ASI YANG DAPAT MEMANFAATKAN PREBIOTIK SEBAGAI SUMBER KARBON Salah satu manfaat prebiotik adalah mempengaruhi fisiologi dan modulasi mikrobiota pada bagian tertentu, seperti saluran pencernaan (Marlis 2008). Pengujian langsung terhadap probiotik, yang merupakan mikrobiota penghuni saluran cerna, menjadi penting untuk melihat efek prebiotik terhadap pertumbuhan probiotik secara spesifik. Kandidat probiotik isolat ASI merupakan target yang cukup baik untuk diteliti pertumbuhannya dengan adanya prebiotik sebagai sumber karbon. Prebiotik yang diujikan adalah inulin, FOS, dan GOS. Pemilihan penggunaan prebiotik tersebut dilakukan karena ketiga jenis prebiotik telah banyak dimanfaatkan dalam produk pangan dan banyak diteliti manfaatnya bagi kesehatan saluran cerna (Bouhnik et al. 1999). Kombinasi prebiotik FOS:GOS (1:9) dan inulin:GOS (1:9) juga digunakan berdasarkan penelitian-penelitian terdahulu yang menunjukkan bahwa kombinasi tersebut adalah kombinasi prebiotik terbaik yang menyerupai komposisi oligosakarida ASI yang dapat menstimulir pertumbuhan bakteri baik di kolon ketika sumber nutrisi lain tidak ada (Boehm et al. 2002; Moro et al. 2002; Schmelzle et al. 2003). Beberapa produk susu bubuk komersial di Indonesia juga telah memanfaatkan kombinasi FOS:GOS (1:9) di dalam produknya dengan konsentrasi berkisar antara 1.2 – 5.3 g/100 g. Jumlah prebiotik yang ditambahkan ke dalam media sebesar 5% agar dapat terlihat dengan signifikan kemampuan BAL dalam memfermentasi prebiotik. Komposisi prebiotik FOS dan inulin sebesar 5% sebelumnya telah diujikan terhadap beberapa strain BAL isolat ASI lainnya. Hasilnya menunjukkan bahwa beberapa isolat yaitu Lactobacillus A17, R21, dan B16 mampu tumbuh dengan baik pada kedua media yang mengandung prebiotik dengan perbedaan jumlah log yang signifikan terhadap kontrol (tanpa gula) (Nuraida et al. 2009). Jumlah koloni yang tumbuh pada masing-masing media dapat dilihat pada Tabel 2, sedangkan hasil perhitungan nilai log BAL pada media yang mengandung prebiotik dibandingkan dengan kontrol disajikan pada Gambar 7 sampai dengan Gambar 11. Secara keseluruhan, pertumbuhan BAL isolat ASI pada media tanpa penambahan sumber karbohidrat tergolong rendah. Salminen et al. (2004) menyatakan bahwa BAL membutuhkan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk pertumbuhannya. Pada media kontrol, pertumbuhan BAL berlangsung pada kondisi dengan nutrisi minimal tanpa sumber karbohidrat. BAL hanya memperoleh nutrisi yang berasal dari protease peptone dan yeast extract, serta sumber mineral berupa K2HPO4.3H2O, MgSO4.7H2O, dan MnSO4.4H2O. Oleh karena itu, jumlah koloni yang tumbuh pada media kontrol menunjukkan nilai yang paling rendah dibandingkan dengan media lain yang menggunakan berbagai jenis prebiotik sebagai sumber karbon. Hasil perhitungan total BAL menunjukkan bahwa ketujuh isolat yang digunakan mampu tumbuh lebih baik pada media dengan prebiotik sebagai sumber karbon dibandingkan pada media kontrol. Hal ini terlihat dari jumlah koloni yang tumbuh pada media dengan prebiotik lebih banyak daripada media kontrol (Tabel 2). Prebiotik yang digunakan yaitu inulin, FOS, dan GOS merupakan jenis oligosakarida yang sudah banyak diteliti dan terbukti memiliki kemampuan menstimulir pertumbuhan bakteri baik pada kolon dimana ketersediaan nutrisi sangat kurang (Crittenden dan Playne 1996 di dalam Shin et al. 2000). Prebiotik tidak dapat dicerna di saluran pencernaan bagian atas, sehingga dapat dimanfaatkan sebagai sumber karbon oleh probiotik di dalam kolon. Tabel 2. Jumlah BAL pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon Kode Isolat A22 A23 B16 R14 R21 R23 R23H Jumlah BAL (Log CFU/ml) Kontrol (tanpa gula) 8.47 9.19 8.42 8.59 8.55 8.83 8.19 Inulin FOS GOS 8.35 9.45 9.12 9.01 9.00 9.54 9.54 9.26 9.64 9.72 9.89 9.56 9.84 10.02 8.72 9.40 9.69 9.85 8.83 9.93 10.72 FOS:GOS (1:9) 9.08 9.35 9.86 9.66 9.17 10.00 10.04 Inulin:GOS (1:9) 8.81 9.28 9.94 9.51 9.53 9.89 9.94 Perbedaan Jumlah BAL (log CFU/ml) Pada media dengan inulin sebagai sumber karbon, secara umum pertumbuhan seluruh isolat terlihat lebih rendah dibandingkan dengan media yang mengandung jenis prebiotik lain (Tabel 2). Inulin merupakan oligosakarida berantai panjang yang memiliki nilai derajat polimerisasi (DP) 2 – 60 dengan rata-rata DP sebesar 10 (Roberfroid, 1993 di dalam Salminen et al. 1998). Menurut penelitian yang dilakukan Shin et al. (2000), inulin dinilai paling tidak efektif dalam menstimulir pertumbuhan Bifidobacterium Bf-1 dan Bf-6 pada media susu skim dibandingkan dengan sumber prebiotik uji lainnya yaitu FOS dan GOS yang memiliki nilai DP < 10. Hal ini disebabkan kemampuan BAL dalam memfermentasi oligosakarida dengan DP > 10 hanya setengah dari kecepatan fermentasi oligosakarida dengan DP < 10. Namun demikian, Franz et al. (1998) menyatakan bahwa inulin dan oligofruktosa dapat menstimulir pertumbuhan bakteri tertentu pada saluran pencernaan manusia terutama bakteri baik dari golongan Bifidobacteria dan Lactobacillus serta menghambat pertumbuhan bakteri patogen seperti Clostridia. 2,0 1.4a 1,5 1,0 0.7b 0.7b 0.5bc 0,5 0.3bc 0.4bc 0.0c 0,0 A22 A23 B16 R14 R21 R23 R23H Kode Isolat Gambar 7. Perbedaan nilai log BAL pada media fermentasi berbasis MRSB dengan inulin sebagai sumber karbon dibandingkan dengan kontrol (tanpa gula) FOS merupakan salah satu jenis prebiotik yang cukup popular dan banyak digunakan pada berbagai produk pangan. Pemanfaatannya dapat sebagai sumber prebiotik tunggal atau dikombinasikan dengan prebiotik lain. Berbagai produk olahan susu seperti susu bubuk, susu 23 Perbedaan Jumlah BAL (log CFU/ml) UHT, dan susu fermentasi merupakan contoh produk yang sering memanfaatkan FOS sebagai sumber prebiotik. 2,0 1.8a 1,5 1.3bc 1.4ab 1.0bc 1.0bc 1,0 0.8cd 0.4d 0,5 0,0 A22 A23 B16 R14 R21 R23 R23H Kode Isolat Gambar 8. Perbedaan nilai log BAL pada media fermentasi berbasis MRSB dengan FOS sebagai sumber karbon dibandingkan dengan kontrol (tanpa gula) Perbedaan Jumlah BAL (log CFU/ml) Hasil pengujian pertumbuhan kandidat probiotik isolat ASI pada media dengan FOS sebagai sumber karbon menunjukkan hasil yang cukup baik terhadap keseluruhan isolat yang digunakan. Pada Gambar 8 terlihat bahwa Lactobacillus R23H menunjukkan jumlah pertumbuhan tertinggi pada media dengan FOS sebagai sumber karbon diikuti oleh Lactobacillus R14, B16, R23, R21, A22, dan A23. Seperti yang telah diungkapkan sebelumnya bahwa BAL membutuhkan sumber karbohidrat yang dapat dicerna untuk pertumbuhannya, dalam hal ini FOS telah dimanfaatkan sebagai sumber karbohidrat oleh BAL. FOS memiliki nilai DP 2-7 (Gibson 2000). FOS juga dapat dihasilkan melalui hidrolisis inulin. Oleh karena itu, FOS lebih mudah difermentasi dibandingkan dengan inulin. 2,0 1.8a 1.4a 1,5 1.2a 1.1a 1,0 0,5 0.3b 0.3b 0.2b 0,0 A22 A23 B16 R14 R21 R23 R23H Kode Isolat Gambar 9. Perbedaan nilai log BAL pada media fermentasi berbasis MRSB dengan GOS sebagai sumber karbon dibandingkan dengan kontrol (tanpa gula) Pertumbuhan kandidat probiotik isolat ASI pada media dengan GOS sebagai sumber karbon menunjukkan hasil yang berbeda untuk setiap isolat. Beberapa isolat yaitu Lactobacillus R14, R23, dan R23H menunjukkan tingkat pertumbuhan yang cukup tinggi dan hampir sama dengan pertumbuhan pada media dengan FOS sebagai sumber karbon. Tetapi keempat isolat uji lainnya menunjukkan pertumbuhan yang lebih rendah jika dibandingkan pertumbuhan pada 24 Perbedaan Jumlah BAL (log CFU/ml) media FOS. Pada Gambar 9 terlihat jelas pertumbuhan Lactobacillus A22, A23, dan R21 jauh lebih rendah pada media yang mengandung GOS dibandingkan dengan pertumbuhan pada media yang mengandung FOS. Hal ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Shin et al. (2000) yang menguji pertumbuhan Bifidobacterium spp pada susu skim yang mengandung FOS, GOS, dan inulin. Hasilnya menunjukkan bahwa pada dosis yang sama, GOS mampu menstimulir pertumbuhan Bifidobacterium spp lebih baik daripada inulin tetapi tidak seefektif FOS. Perbedaan kecenderungan tingkat pertumbuhan BAL dengan keberadaan prebiotik yang sama sebagai sumber karbon menunjukkan bahwa efek prebiotik bersifat spesifik. Hal ini terkait dengan kemampuan setiap strain BAL dalam memproduksi enzim yang dapat memetabolisme prebiotik. GOS banyak ditemukan pada ASI, susu sapi, dan produk yoghurt komersial. Struktur kimianya terdiri dari molekul glukosa dan galaktosa yang saling berikatan satu sama lain. GOS disintesis dari laktosa melalui transfer glikosil dari satu atau lebih unit D-galaktosil menjadi unit D-galaktosa dengan memanfaatkan enzim β-D-galaktosidase sebagai katalis (Mahoney 1998 di dalam Villaluenga et al. 2008). Sama halnya dengan FOS, GOS juga memiliki DP berkisar antara 2-7 sehingga masih cukup mudah untuk difermentasi oleh BAL (Gibson 2000). Penggunaan kombinasi prebiotik FOS:GOS (1:9) dan inulin:GOS (1:9) mampu dimanfaatkan dengan baik oleh sebagian besar isolat BAL yang diujikan. Hasilnya dapat dilihat pada Gambar 10 dan Gambar 11 yang menunjukkan bahwa kombinasi prebiotik yang ditambahkan mampu meningkatkan pertumbuhan BAL dengan cukup baik terutama pada isolat Lactobacillus R23H, R23, B16, R14, dan R21. Beberapa penelitian yang telah dilakukan membuktikan bahwa penambahan GOS atau FOS pada susu formula menghasilkan efek bifidogenik yaitu menstimulir pertumbuhan Bifidobacteria dan Lactobacillus pada saluran pencernaan bayi. Penelitian yang dilakukan Moro et al. (2002) menunjukkan bahwa pemberian susu formula yang difortifikasi dengan campuran FOS dan GOS dengan konsentrasi 0.4 g/100ml atau 0.8 g/100 ml selama 28 hari menunjukkan peningkatan Bifidobacteria dan Lactobacillus dalam feses. Penambahan campuran prebiotik tersebut menghasilkan formulasi yang lebih mendekati komposisi ASI dibandingkan dengan penambahan satu jenis prebiotik saja. Campuran inulin berantai panjang (2-60 monomer) dan GOS (2-7 monomer) dengan rasio 10-90% juga telah ditambahkan ke dalam produk susu bayi di Eropa selama lebih dari 5 tahun (Veereman 2007). 2,0 1.8a 1,5 1.3ab 1.2abc 1.0bc 1,0 0.7cde 0,5 0.6de 0.2e 0,0 A22 A23 B16 R14 R21 R23 R23H Kode Isolat Gambar 10. Perbedaan nilai log BAL pada media fermentasi berbasis MRSB dengan FOS:GOS (1:9) sebagai sumber karbon dibandingkan dengan kontrol (tanpa gula) 25 Perbedaan Jumlah BAL (log CFU/ml) 2,0 1.8a 1.5a 1,5 0.9b 1,0 0,5 1.0b 1.1b 0.4c 0.1c 0,0 A22 A23 B16 R14 R21 R23 R23H Kode Isolat Gambar 11. Perbedaan nilai log BAL pada media fermentasi berbasis MRSB dengan inulin:GOS (1:9) sebagai sumber karbon dibandingkan dengan kontrol (tanpa gula) Berdasarkan hasil pengujian pada tahap seleksi ini, terlihat bahwa Lactobacillus R23H memiliki tingkat pertumbuhan yang paling tinggi (p < 0.05) pada seluruh media uji yang mengandung prebiotik sebagai sumber karbon (Tabel 2). Peningkatan jumlah Lactobacillus R23H yang ditumbuhkan pada media dengan prebiotik sebagai sumber karbon berkisar antara 1.4–1.8 log CFU/ml. Tingginya pertumbuhan Lactobacillus R23H pada seluruh media menunjukkan bahwa isolat tersebut mampu memproduksi enzim yang dapat memecah prebiotik yang diujikan. Isolat lain yang memiliki tingkat pertumbuhan cukup tinggi adalah Lactobacillus B16, R14 dan R23 dengan peningkatan nilai log masing-masing berkisar antara 0.7-1.5 log CFU/ml, 0.5-1.4 log CFU/ml, dan 0.7-1.2 log CFU/ml. Ketiga isolat tersebut menunjukkan tingkat pertumbuhan yang cukup tinggi pada media dengan penambahan prebiotik yang diujikan kecuali inulin. Tingkat pertumbuhan pada ketiga isolat tersebut tidak berbeda nyata satu sama lain (p < 0.05) (Lampiran 6). Sedangkan pada ketiga isolat uji lainnya yaitu Lactobacillus A22, A23, dan R21 terlihat tingkat pertumbuhan yang masih rendah dengan peningkatan nilai log berada pada kisaran 0.0-1.0 log CFU/ml. Perbedaan kecenderungan pemanfaatan jenis prebiotik oleh BAL menunjukkan bahwa efek dari prebiotik bersifat spesifik. Namun demikian, mekanisme pemanfaatan prebiotik dalam fermentasi oleh BAL masih belum dikemukakan secara jelas. Berbagai penelitian mengungkapkan bahwa enzim yang dihasilkan bakteri, misalnya β-fruktosidase dan βgalaktosidase, dapat menghidrolisis prebiotik. Penelitian Barrangou et al. (2003) yang diacu di dalam Saulnier et al. (2007) menunjukkan adanya peran dari fruktosidase dalam hidrolisis FOS oleh L. acidophillus. Yoon (2008) meneliti peran enzim galaktosidase yang dihasilkan beberapa strain L. curvatus dan L. mesenteriodes dalam memetabolisme oligosakarida kedelai. Hasilnya menunjukkan bahwa terdapat perbedaan aktivitas enzim galaktosidase dari masing-masing strain yang diuji. L. curvatus R08 dan L. mesenteriodes JK55 menunjukkan aktivitas tertinggi sehingga mampu memecah oligosakarida kedelai lebih baik dibandingkan strain uji lainnya. Hal ini menunjukkan adanya perbedaan kemampuan setiap isolat dalam memproduksi enzim yang dapat menghidrolisis prebiotik dan ini merupakan faktor yang sangat berpengaruh terhadap efektivitas dari prebiotik yang digunakan. Pada tahap selanjutnya, diteliti lebih lanjut metabolisme prebiotik oleh BAL isolat ASI. Lactobacillus R23H dan Lactobacillus R23 terpilih untuk digunakan pada tahap penelitian tersebut. Hal ini karena kedua isolat tersebut memiliki kemampuan yang cukup baik dalam memanfaatkan prebiotik FOS, GOS, dan inulin sebagai sumber karbon. Perbedaan kedua isolat 26 tersebut terletak pada aktivitas metabolismenya. Lactobacillus R23H bersifat heterofermentatif, sedangkan Lactobacillus R23 bersifat homofermentatif. Dengan menggunakan kedua isolat tersebut, dapat dibandingkan kecenderungannya dalam memetabolisme prebiotik sebagai sumber karbon. Selain itu, penelitian yang dilakukan oleh Hartanti (2009) menunjukkan bahwa Lactobacillus R23 memiliki kemampuan yang baik dalam menghambat pertumbuhan Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) sehingga berperan dalam pencegahan diare. Hal ini dapat menjadi nilai tambah dalam pemanfaatan Lactobacillus R23 pada produk sinbiotik. B. METABOLISME PREBIOTIK OLEH Lactobacillus R23 DAN Lactobacillus R23H 1. Pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H pada Media Berbasis MRSB dengan Prebiotik sebagai Sumber Karbon Pengujian pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H dilakukan dengan metode spektrofotometri. Menurut Harrigan (2000), semakin tinggi kandungan organisme dalam larutan akan menyebabkan semakin sedikit cahaya yang dapat diteruskan, sehingga cahaya yang diserap oleh larutan tersebut semakin banyak. Pada metode spektrofotometri, cahaya yang terserap oleh larutan akan terukur menghasilkan nilai tertentu yang disebut dengan optical density (OD). Nilai OD dari media kultur sesungguhnya tidak dapat diartikan sebagai absorbansi seperti pada pengukuran larutan berwarna. Hal ini karena pada umumnya pertumbuhan sel bakteri tidak menghasilkan warna sehingga lebih tepat dikatakan sebagai turbidity atau kekeruhan (Widdel 2007). Gambar 12 dan Gambar 13 menyajikan hasil pengukuran OD dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. Pada kedua isolat yang diujikan, nilai OD pada media kontrol mengindikasikan tingkat pertumbuhan yang rendah selama waktu inkubasi 24 jam. Surono (2004) menyatakan bahwa BAL membutuhkan nutrisi kompleks untuk pertumbuhannya, yaitu sumber karbon, asam amino, dan vitamin. Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H yang tergolong sebagai BAL dapat tumbuh mengandalkan asam amino sebagai sumber energi dalam kondisi lingkungan yang kritis sumber karbon seperti pada media kontrol. Sumber energi diperoleh melalui kandungan yeast extract, protease pepton, dan beberapa sumber mineral yang ditambahkan pada media. Terbatasnya sumber energi pada media kontrol menyebabkan tingkat pertumbuhan yang rendah. Pada media kontrol, fase log pada pertumbuhan kedua isolat sangat singkat dan selanjutnya menunjukkan tingkat pertumbuhan yang statis. Fardiaz (1989) menyatakan bahwa pada fase log pertambahan jumlah sel sensitif terhadap kondisi lingkungan dan dapat diperlambat oleh kurangnya zat nutrisi pada media hingga sel akan memasuki fase stasioner. Pengukuran nilai OD Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H pada media dengan penambahan prebiotik menunjukkan hasil yang lebih tinggi dibandingkan kontrol (Gambar 12-13). Mandelstam dan McQuillen (1989) menyatakan bahwa nutrisi penting untuk membentuk energi dan menyusun komponen sel. Penambahan nutrisi dapat meningkatkan jumlah sel yang ada karena terjadi sintesis RNA, DNA, dan protein baru secara cepat sehingga dapat meningkatkan kecepatan pembelahan sel. Oleh karena itu, dengan penambahan prebiotik sebagai sumber karbon, pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H dapat dipercepat. 27 Log OD Terhitung kontrol 10,00 FOS Inulin 1,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 GOS FOS:GOS 0,10 Inulin:GOS 0,01 Waktu (jam) Log OD Terhitung Gambar 12. Grafik pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon kontrol 10,00 FOS Inulin 1,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 GOS FOS:GOS 0,10 Inulin:GOS 0,01 Waktu (jam) Gambar 13. Grafik pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon Nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media dengan inulin sebagai sumber karbon menunjukkan terjadinya peningkatan yang lambat yaitu sebesar 0.13 pada jam ke-0 dan meningkat menjadi 1.35 pada jam ke-12. Kemudian nilai OD meningkat secara signifikan hingga mencapai nilai tertinggi pada jam ke-24 yaitu sebesar 7.53 (Gambar 12). Pertumbuhan berlangsung lambat di masa awal inkubasi karena inulin sebagai sumber karbon memiliki rantai yang panjang dengan DP cukup tinggi yaitu berkisar antara 2-60 sehingga BAL sulit untuk memetabolismenya (Gibson 2000). Setelah melewati waktu inkubasi pada jam ke-12, nilai OD meningkat pesat karena semakin lama semakin banyak struktur inulin yang telah dipecah oleh Lactobacillus R23, sehingga kemampuannya dalam memetabolisme inulin menjadi lebih baik. Akibatnya, pada akhir waktu inkubasi tingkat pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media inulin cukup tinggi. Pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media dengan inulin sebagai sumber karbon menunjukkan pola yang serupa dengan pertumbuhan Lactobacillus R23. Nilai OD pada jam ke-0 sebesar 0.06 dan mengalami peningkatan mencapai 2.09 pada jam ke-12. Tingkat pertumbuhan tertinggi teramati pada jam ke-24 yaitu mencapai 7.55 (Gambar 13). Nilai ini 28 cukup tinggi jika dibandingkan tingkat pertumbuhan pada media kontrol. Hasil ini menunjukkan bahwa Lactobacillus R23H dapat memetabolisme inulin selama pertumbuhannya meskipun dengan waktu yang lambat. Inulin umumnya dapat dipecah oleh enzim inulinase yang terdapat pada beberapa tanaman dan mikroorganisme (kapang, khamir, dan bakteri). Inulinase memotong unit fruktosa dari ujung yang tidak tereduksi atau dari fruktosa tertentu (Molina et al. 2005). Enzim ini merupakan enzim ekstraseluler yang bersifat induktif, yaitu hanya akan diproduksi bila terdapat substrat yang sesuai (Anonim 2010). Pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H pada media dengan FOS sebagai sumber karbon menunjukkan nilai yang cukup tinggi, bahkan lebih tinggi daripada media yang mengandung inulin. Hal ini ditunjukkan dengan nilai OD yang tinggi pada setiap waktu pengamatan. Nilai OD tertinggi teramati pada akhir waktu inkubasi yaitu masingmasing mencapai 9.09 untuk Lactobacillus R23 dan 11.89 untuk Lactobacillus R23H. Pada Gambar 12 dan Gambar 13 terlihat grafik pertumbuhan kedua isolat pada media FOS mengalami peningkatan yang cukup signifikan. Tingkat pertumbuhan yang lebih tinggi teramati pada pertumbuhan Lactobacillus R23H. Sejak awal waktu inkubasi nilai OD Lactobacillus R23H pada media FOS lebih tinggi dari media lainnya, walaupun di akhir inkubasi nilainya sedikit lebih rendah dibandingkan media yang mengandung GOS (Gambar 13). Lactobacillus R23 juga menunjukkan tingkat pertumbuhan yang cukup tinggi sejak awal inkubasi tetapi tidak setinggi Lactobacillus R23H. Pertumbuhan kedua isolat yang berlangsung cepat sejak awal waktu inkubasi menunjukkan kemampuan kedua isolat yang cukup baik dalam memetabolisme FOS. Hal ini berkaitan dengan struktur FOS yang lebih sederhana daripada inulin dengan DP yang cukup rendah yaitu berkisar antara 2-7 (Gibson 2000). Semakin rendah DP yang dimiliki oleh prebiotik, maka kemampuan BAL untuk memfermentasinya akan semakin baik (Roberfroid 1998). Kemampuan kedua isolat dalam memetabolisme FOS juga mengindikasikan bahwa kedua isolat dapat memproduksi enzim β-fruktosidase yang berperan dalam pemecahan ikatan glikosidik pada FOS. Pengukuran OD pada media dengan GOS sebagai sumber karbon menunjukkan tingkat pertumbuhan yang tinggi baik pada Lactobacillus R23 maupun Lactobacillus R23H. Tingkat pertumbuhan tertinggi kedua isolat teramati pada jam ke-24. Lactobacillus R23 menunjukkan nilai OD yang tinggi sejak awal sampai akhir inkubasi yaitu mencapai 12.32 (Gambar 12). Sedangkan Lactobacillus R23H menunjukkan kecenderungan yang sedikit berbeda dengan nilai OD yang tidak terlalu tinggi pada masa awal inkubasi dan mengalami peningkatan pada akhir waktu inkubasi yaitu mencapai 13.42 (Gambar 13). Kemampuan kedua isolat dalam memetabolisme GOS secara umum terlihat cukup baik. Walaupun pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media ini sedikit lebih rendah di masa awal inkubasi, tetapi nilainya masih lebih tinggi daripada pertumbuhannya pada media inulin. Sama halnya dengan FOS, GOS juga memiliki nilai DP yang tidak terlalu tinggi yaitu berkisar antara 2-7 (Gibson 2000). Dengan demikian, kedua isolat dapat lebih mudah memanfaatkan GOS sebagai sumber karbon dalam pertumbuhannya. Kemampuan kedua isolat dalam memetabolisme GOS terkait pula dengan kemampuannya dalam memproduksi enzim β-galaktosidase yang berperan dalam pemecahan GOS. Dengan melihat tingginya tingkat pertumbuhan kedua isolat pada media GOS, menunjukkan kemungkinan bahwa kedua isolat mampu memproduksi enzim tersebut. GOS merupakan salah satu jenis prebiotik yang cukup popular karena merupakan komponen oligosakarida yang terkandung dalam ASI (Newburg dan Neubauer 1995). 29 Dengan keberadaannya di dalam ASI, maka GOS dipercaya memiliki kemampuan untuk mempengaruhi perkembangan mikroflora baik pada saluran pencernaan bayi (Gopal et al. 2001). Grogy (1973) yang diacu di dalam Gopal et al. 2001 menyatakan bahwa fraksi GOS yang berasal dari ASI merupakan bagian dari faktor bifidus. Fraksi ini mampu menstimulir pertumbuhan bifidobakteria pada saluran pencernaan bayi yang diberi ASI ataupun susu sapi yang telah disuplemetasi oleh GOS. Kombinasi dua jenis prebiotik yang digunakan yaitu FOS:GOS (1:9) dan inulin:GOS (1:9) dapat dimanfaatkan dengan baik oleh Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H. Hal ini terlihat dari tingginya tingkat pertumbuhan yang ditunjukkan dengan nilai OD yang tinggi pada setiap waktu pengamatan. Kedua media yang mengandung campuran prebiotik, bersama dengan media yang mengandung GOS menunjukkan nilai tertinggi pada pengukuran nilai OD di akhir waktu inkubasi. Pada Gambar 12 dan Gambar 13 terlihat grafik pertumbuhan pada media yang mengandung GOS berhimpit dengan grafik pertumbuhan pada media yang mengandung campuran FOS:GOS (1:9) dan inulin:GOS (1:9). Hal ini menunjukkan bahwa kemungkinan pada masa awal pertumbuhan, kedua isolat memetabolisme GOS terlebih dahulu sebelum sumber karbon lainnya. Pada media dengan FOS:GOS (1:9) sebagai sumber karbon, nilai OD Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H masing-masing mencapai 12.14 dan 11.58 pada jam ke-24. Pada media yang mengandung inulin:GOS (1:9) pengukuran OD menunjukkan nilai yang tidak jauh berbeda yaitu sebesar 11.28 untuk Lactobacillus R23 dan 12.00 untuk Lactobacillus R23H (Gambar 12-13). Jika dibandingkan dengan hasil pengukuran nilai OD pada media yang hanya memanfaatkan inulin sebagai sumber karbon, pada media dengan campuran dua jenis prebiotik menunjukkan tingkat pertumbuhan yang jauh lebih baik. Hal ini menunjukkan penambahan GOS pada media ini sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan kedua isolat. GOS memiliki struktur yang lebih sederhana dengan DP < 10 sehingga kemampuan isolat dalam memetabolismenya sudah terlihat sejak awal inkubasi. Kombinasi dari campuran prebiotik dinilai lebih berpotensi dalam meningkatkan pertumbuhan BAL dibandingkan komposisi tunggalnya. Campuran oligofruktosa berantai panjang dan GOS dengan perbandingan 1:9 dapat menghasilkan komposisi prebiotik yang menunjukkan efek bifidogenik menyerupai prebiotik pada ASI (Moro et al. 2002; Schmelzle et al. 2003). Boehm et al. (2002) juga meneliti pengaruh kombinasi FOS dan GOS (1:9) yang disuplementasikan ke dalam susu formula, hasilnya terjadi peningkatan jumlah bifidobakteria pada feses bayi yang diberi perlakuan. Kombinasi FOS dan GOS 1:9 sebanyak 0.8 g/100 ml juga telah ditetapkan oleh European Commission (EC) sebagai kombinasi prebiotik yang diperbolehkan untuk produk susu formula (SCF 2001a; SCF 2001b). Pada Gambar 14 dan Gambar 15, disajikan diagram yang menunjukkan selisih nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H pada media prebiotik terhadap media kontrol. Melalui diagram tersebut, dapat dilihat dengan jelas peningkatan nilai OD pada kedua isolat saat ditumbuhkan pada media dengan prebiotik sebagai sumber karbon. Secara keseluruhan, hasil penelitian menunjukkan bahwa kedua isolat mampu menggunakan seluruh prebiotik yang diujikan sebagai sumber karbon untuk pertumbuhannya. Perbedaan kecenderungan pemanfaatan prebiotik oleh kedua isolat terutama terlihat pada media dengan FOS dan GOS sebagai sumber karbon. Lactobacillus R23H yang bersifat heterofermentatif, terlihat lebih mudah tumbuh pada media FOS sejak awal masa pertumbuhan tetapi sedikit lebih lambat pada media yang mengandung GOS. Sedangkan Lactobacillus R23 yang bersifat homofermentatif, mengalami tingkat 30 pertumbuhan yang lebih rendah pada media FOS tetapi cukup tinggi pada media yang mengandung GOS. Namun demikian, pada diagram terlihat bahwa kedua isolat sama-sama menunjukkan tingkat pertumbuhan tertinggi pada media dengan GOS sebagai sumber karbon di akhir waktu inkubasi. ∆ OD Terhitung 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 24 Waktu (jam) FOS Inulin GOS FOS:GOS Inulin:GOS Gambar 14. Selisih OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan prebiotik terhadap kontrol (tanpa gula) ∆ OD Terhitung 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 24 Waktu (jam) FOS Inulin GOS FOS:GOS Inulin:GOS Gambar 15. Selisih OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik terhadap kontrol (tapa gula) 2. Perubahan nilai pH dan TAT selama Pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H pada Media Berbasis MRSB dengan Prebiotik sebagai Sumber Karbon Asam laktat adalah hasil metabolisme utama dari BAL. Asam laktat merupakan asam yang mudah terdisosiasi membentuk ion H+ dan ion CH3CHOHCOO-. Semakin tinggi konsentrasi asam laktat akan menghasilkan konsentrai ion H+ yang semakin tinggi pula sehingga pH menjadi semakin asam (Helferich dan Westhoff 1980). Nilai pH yang semakin menurun mengindikasikan bahwa BAL dapat memetabolisme sumber nutrisi yang tersedia dan menghasilkan asam laktat. 31 Nilai pH Pengukuran pH yang dilakukan selama pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H pada media kontrol menunjukkan perubahan yang tidak signifikan selama waktu inkubasi (p < 0.05) (Gambar 16-17). Pada awal waktu inkubasi, pH media pertumbuhan Lactobacillus R23 menunjukkan nilai 7.33 dan turun perlahan hingga mencapai nilai 6.82 pada akhir waktu inkubasi. Pengukuran pH pada media pertumbuhan Lactobacillus R23H menunjukkan hasil yang tidak berbeda jauh yaitu sebesar 7.26 pada awal inkubasi dan menurun hingga 7.04 pada akhir waktu inkubasi. Hasil ini mendukung hasil pengukuran nilai OD yang menunjukkan tingkat pertumbuhan yang rendah pada media kontrol. Keterbatasan sumber nutrisi pada media ini yang menyebabkan tingkat pertumbuhan sel sangat rendah sehingga hanya dihasilkan sedikit asam laktat dari proses metabolisme. Dengan demikian, hanya terjadi sedikit penurunan nilai pH media. 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Kontrol FOS Inulin GOS FOS:GOS 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Inulin:GOS Waktu (jam) Nilai pH Gambar 16. Grafik perubahan pH selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Kontrol FOS Inulin GOS FOS:GOS 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Inulin:GOS Waktu (jam) Gambar 17. Grafik perubahan pH selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon Berbeda dengan pengukuran pH pada media kontrol, pada media dengan inulin sebagai sumber karbon menunjukkan penurunan pH yang signifikan selama waktu inkubasi (p<0.05) (Gambar 16-17). Pada media pertumbuhan Lactobacillus R23 nilai pH media sebesar 7.30 pada jam ke-0 dan berangsur turun mencapai nilai 5.41 pada jam ke-24. Hal 32 ∆ pH serupa juga terjadi pada media pertumbuhan Lactobacillus R23H yang menunjukkan nilai pH media sebesar 7.20 pada jam ke-0 dan menurun hingga 5.10 pada jam ke-24. Penurunan pH terjadi karena produksi asam laktat sebagai hasil fermentasi dari BAL. Gambar 16 dan Gambar 17 memperlihatkan grafik penurunan pH pada media inulin lebih lambat daripada media yang mengandung prebiotik uji lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan kedua isolat dalam memfermentasi inulin tidak sebaik sumber prebiotik uji lainnya. Hasil pengukuran OD yang menunjukkan peningkatan yang lambat selama pertumbuhan kedua isolat pada media inulin membuktikan bahwa kedua isolat lebih sulit menggunakan inulin sebagai sumber karbon untuk pertumbuhannya. Pada media dengan FOS sebagai sumber karbon penurunan pH selama pertumbuhan kedua isolat terjadi lebih cepat daripada media inulin (Gambar 16-17). Selama terjadi peningkatan pertumbuhan sel, produksi asam laktat semakin tinggi sehingga media menjadi semakin asam dengan nilai pH yang terus menurun. Di akhir waktu inkubasi nilai pH turun sampai dengan 3.88 untuk Lactobacillus R23 dan 4.17 untuk Lactobacillus R23H. Penurunan pH pada media ini teramati cukup cepat sejak awal inkubasi. Hal ini sesuai dengan hasil pengukuran OD yang menunjukkan bahwa kedua isolat mampu tumbuh dengan baik pada media FOS sejak awal inkubasi. Penurunan pH yang cukup besar juga terjadi pada media yang memanfaatkan GOS, FOS:GOS (1:9), dan inulin:GOS (1:9) sebagai sumber karbon. Pada media yang mengandung GOS, nilai pH akhir media terukur sebesar 3.84 untuk Lactobacillus R23 dan sebesar 4.44 untuk Lactobacillus R23H. Penurunan pH pada kedua media lain yang mengandung campuran prebiotik tidak berbeda nyata dengan penurunan pH pada media GOS (p < 0.05). Tampak bahwa ketiga media yaitu media yang berisi GOS, FOS:GOS (1:9), dan inulin:GOS (1:9) menunjukkan grafik yang hampir berhimpit satu sama lain (Gambar 16-17). Hal ini sesuai dengan hasil pengukuran OD yang juga menunjukkan grafik yang hampir berhimpit pada ketiga media tersebut (Gambar 12-13). Nilai pH dan OD pertumbuhan secara umum berkorelasi negatif (p < 0.05) (Lampiran 33). 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 2 4 6 8 10 12 24 Waktu (jam) FOS Inulin GOS FOS:GOS Inulin:GOS Gambar 18. Selisish nilai pH selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan prebiotik terhadap kontrol (tanpa gula) 33 ∆ pH 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 2 4 6 8 10 12 24 Waktu (jam) FOS Inulin GOS FOS:GOS Inulin:GOS Gambar 19. Selisish nilai pH selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik terhadap kontrol (tanpa gula) Pada Gambar 18 dan Gambar 19, disajikan diagram yang menunjukkan selisih nilai pH pada media dengan prebiotik sebagai sumber karbon terhadap media kontrol. Melalui kedua gambar tersebut terlihat bahwa penurunan pH yang terjadi selama pertumbuhan Lactobacillus R23H secara umum lebih kecil jika dibandingkan penurunan pH selama pertumbuhan Lactobacillus R23. Hal ini karena Lactobacillus R23 termasuk ke dalam kelompok BAL homofermentatif yang menghasilkan 2 molekul asam laktat, sedangkan Lactobacillus R23H termasuk ke dalam kelompok BAL heterofermentatif yang menghasilkan 1 molekul asam laktat (Surono 2004). Semakin banyak asam laktat yang dihasilkan, maka pH media akan semakin menurun. Hasil pengukuran menunjukkan pada akhir waktu inkubasi, media pertumbuhan Lactobacillus R23 memiliki pH yang lebih rendah daripada media pertumbuhan Lactobacillus R23H. Hasil pengukuran pH selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 9 dan Lampiran 10. Hasil pengukuran TAT (% asam laktat) sebanding dengan hasil pengukuran pH. Nilai TAT yang semakin tinggi menyebabkan pH media yang semakin menurun, nilai pH dan TAT berkorelasi negatif (p < 0.05) (Lampiran 33). Pengukuran TAT mengindikasikan banyaknya asam laktat yang terbentuk. Semakin tinggi total asam yang terbentuk pada media menandakan semakin banyaknya asam laktat yang dihasilkan oleh Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H melalui proses metabolisme. Pada media kontrol yang memiliki tingkat pertumbuhan BAL yang rendah, jumlah asam laktat selama waktu inkubasi cenderung konstan (Gambar 20-21). Pada Gambar 20 dan Gambar 21 terlihat peningkatan nilai TAT pada media dengan inulin sebagai sumber karbon lebih tinggi daripada kontrol tetapi masih lebih rendah jika dibandingkan dengan keempat media uji lainnya. Berdasarkan hasil pengukuran OD diketahui bahwa pertumbuhan kedua isolat pada media dengan inulin sebagai sumber karbon tidak setinggi pertumbuhan pada media dengan prebiotik uji lainnya. Dengan demikian, asam laktat yang dihasilkan melalui proses metabolisme juga menunjukkan nilai yang lebih rendah. 34 2,50 2,00 kontrol % Asam Laktat 1,50 FOS 1,00 Inulin 0,50 GOS FOS:GOS 0,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Inulin:GOS Waktu (jam) Gambar 20. Grafik perubahan TAT selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon 2,50 2,00 % Asam Laktat Kontrol 1,50 FOS 1,00 Inulin 0,50 GOS FOS:GOS 0,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Inulin:GOS Waktu (jam) Gambar 21. Grafik perubahan TAT selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon Pada media yang memanfaatkan FOS sebagai sumber karbon, peningkatan nilai TAT selama pertumbuhan cukup tinggi yaitu mencapai 1.76 untuk Lactobacillus R23 dan 1.44 untuk Lactobacillus R23H. Pada ketiga media uji yang mengandung GOS, peningkatan nilai TAT tidak terlalu berbeda satu sama lain. Hal ini terlihat dari grafik peningkatan nilai TAT yang hampir berhimpit satu sama lain (Gambar 20-21). Semakin tinggi nilai TAT dapat mengindikasikan tingkat pertumbuhan yang tinggi pula. Nilai TAT dan OD berkorelasi positif (p < 0.05) (Lampiran 33). Hasil pengukuran nilai TAT secara keseluruhan dapat dilihat pada Lampiran 9 dan Lampiran 10. Pada Gambar 22 dan Gambar 23 disajikan diagram yang menunjukkan selisih nilai TAT pada media dengan prebiotik terhadap kontrol. Melalui diagram tersebut dapat terlihat bahwa secara umum peningkatan TAT selama pertumbuhan Lactobacillus R23 lebih tinggi daripada Lactobacillus R23H. Lactobacillus R23 merupakan kandidat probiotik yang tergolong dalam BAL homofermentatif, sedangkan Lactobacillus R23H adalah BAL heterofermentatif. BAL homofermentatif melakukan fermentasi asam laktat dengan mengubah karbohidrat hampir seluruhnya menjadi produk tunggal yaitu asam laktat (Axselsson 2004 di dalam Salminen et al. 2004). BAL homofermentatif dapat mengubah 35 95% glukosa atau heksosa lainnya menjadi asam laktat dan sejumlah kecil CO2 (Surono 2004). Axselsson (2004) di dalam Salminen et al. (2004) menyatakan bahwa BAL homofermentatif menghasilkan 2 molekul asam laktat dari heksosa apapun yang dapat difermentasi, sedangkan BAL heterofermentatif hanya menghasilkan 1 molekul asam laktat. Hal ini yang menyebabkan peningkatan TAT selama pertumbuhan Lactobacillus R23 lebih tinggi daripada Lactobacillus R23H. ∆ % Asam Laktat 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 2 4 6 8 10 12 24 Waktu (jam) FOS Inulin GOS FOS:GOS Inulin:GOS Gambar 22. Selisih nilai TAT selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media MRSB dengan prebiotik terhadap kontrol (tanpa gula) ∆ % Asam Laktat 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 2 4 6 8 10 12 24 Waktu (jam) FOS Inulin GOS FOS:GOS Inulin:GOS Gambar 23. Selisih nilai TAT selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media MRSB dengan prebiotik terhadap kontrol (tanpa gula) 3. Perubahan Karbohidrat (Total Gula dan Gula Pereduksi) selama Pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H Karbohidrat adalah kelompok senyawa kimia yang cukup besar mencakup monosakarida (tetrosa, pentosa, dan heksosa), disakarida, oligosakarida, dan polisakarida (Ray 1996). Meskipun karbohidrat adalah sumber karbon yang paling disukai, mikrorganisme mempunyai perbedaan yang cukup besar dalam kemampuannya untuk memecah karbohidrat tertentu. Karbohidrat dimetabolisme di tingkat sel sebagai 36 Konsentrasi Total Gula (%) monosakarida, sedangkan disakarida dan trisakarida akan ditransportasikan ke dalam sel dan dihidrolisis menjadi unit monosakarida sebelum dimetabolisme lebih lanjut (Ray 2006). Prebiotik merupakan jenis karbohidrat yang tidak dapat dicerna, tetapi mempunyai pengaruh baik terhadap ekosistem mikroflora probiotik dalam kolon sehingga dapat memberikan efek kesehatan pada inang. Prebiotik pada umumnya termasuk dalam kelompok oligosakarida dan polisakarida. Oligosakarida dan polisakarida dipecah menjadi mono- dan disakarida menggunakan enzim mikrobial ekstraseluler yang disekresikan sebelum proses transportasi dan metabolisme (Ray 2006). Berbagai monosakarida selanjutnya dimetabolisme oleh mikrorganisme menjadi glukosa-6-fosfat atau fruktosa-6-fosfat dalam tahapan glikolisis atau jalur Embden Meyerhoff Parnas (EMP) (Surono 2004). Metabolisme prebiotik oleh BAL isolat ASI diamati dengan menghitung perubahan total gula dan gula pereduksi selama pertumbuhan. Total gula yang semakin menurun mengindikasikan bahwa prebiotik sebagai sumber gula tunggal yang terdapat dalam media dapat dimanfaatkan oleh bakteri untuk pertumbuhannya. Perubahan total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H secara keseluruhan dapat dilihat pada Gambar 24 dan Gambar 25. 6,00 5,00 4,00 FOS 3,00 Inulin 2,00 GOS 1,00 FOS:GOS 0,00 Inulin:GOS 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) Konsentrasi Total Gula (%) Gambar 24. Grafik perubahan total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon 6,00 5,00 4,00 FOS 3,00 Inulin 2,00 GOS 1,00 FOS:GOS 0,00 Inulin:GOS 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) Gambar 25. Grafik perubahan total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon 37 Pada media pertumbuhan Lactobacillus R23 dengan inulin sebagai sumber karbon, total gula pada awal waktu inkubasi terukur sebesar 4.47% dan berangsur turun hingga mencapai 3.23% pada akhir waktu inkubasi. Pada Gambar 24 terlihat bahwa grafik penurunan total gula pada media ini paling landai jika dibandingkan keempat media uji lainnya, yaitu dengan nilai kemiringan 1.786 (dihitung dari jam ke-0 sampai jam ke-12). Nilai ini lebih kecil dibandingkan dengan media yang mengandung prebiotik uji lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa Lactobacillus R23 memetabolisme inulin lebih lambat dibandingkan prebiotik uji lainnya. Hasil pengukuran ini sesuai dengan hasil pengukuran OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media inulin yang menunjukkan bahwa isolat tumbuh dengan lambat dibandingkan pada media lain yang juga mengandung prebiotik. Pertumbuhan yang lambat terjadi karena isolat sulit memfermentasi inulin, terutama di masa awal inkubasi ketika rantai inulin masih panjang. Penurunan total gula pada media mengindikasikan isolat mampu memecah inulin. Pengukuran total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media dengan inulin sebagai sumber karbon menunjukkan hasil yang serupa dengan Lactobacillus R23 (Gambar 25). Penurunan total gula berlangsung lambat dibandingkan media dengan prebiotik lainnya. Pada awal waktu inkubasi total gula yang terukur adalah sebesar 5.41% dan tersisa sebesar 3.63% di akhir waktu inkubasi. Inulin yang memiliki rantai lebih panjang dibandingkan FOS dan GOS, menjadikannya lebih sulit untuk dimetabolisme oleh BAL. Hal ini didukung oleh hasil penelitian yang dilakukan oleh Gopal et al. (2001) yang menunjukkan bahwa Lactobacillus rhamnosus DR20 lebih mudah memanfaatkan sumber karbon yang berantai pendek seperti mono- dan disakarida daripada sumber karbon lain yang memiliki rantai lebih panjang. Hasil pengukuran OD pada media inulin yang menunjukkan peningkatan yang lambat merupakan bukti bahwa isolat lebih sulit memecah inulin terutama di masa awal inkubasi. Hubungan antara penurunan total gula dan gula pereduksi serta peningkatan OD dapat dilihat pada Gambar 26 dan Gambar 27. 5,0 10,00 4,0 3,0 1,00 2,0 0,10 1,0 0,0 Log OD Terhitung Total Gula dan Gula Pereduksi (%) 6,0 Total Gula Gula Pereduksi Log OD 0,01 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) Gambar 26. Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan inulin sebagai sumber karbon 38 10,00 5,0 4,0 1,00 3,0 2,0 0,10 Log OD Terhitung Total Gula dan Gula Pereduksi (%) 6,0 Total Gula Gula Pereduksi Log OD 1,0 0,0 0,01 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) Gambar 27. Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan inulin sebagai sumber karbon Kemampuan BAL dalam memetabolisme inulin terkait dengan keberadaan enzim inulinase yaitu enzim yang dapat menghidrolisis inulin. Inulinase adalah β-fruktosidase yang dapat menghidrolisis molekul inulin. Ekso inulinase (β-D-fruktanfruktohidrolase, EC 3.2.1.80) memecah unit fruktosa terminal dari ujung yang tidak mereduksi, enzim ini juga dapat menghidrolisis molekul sukrosa dan rafinosa. Di samping itu, endo inulinase (2,1- β-Dfruktan fruktanohidrolase, EC 3.2.1.7) menghidrolisis ikatan inulin dari bagian dalam untuk menghasilkan fruktooligosakarida seperti inulotriosa, tetraosa, dan pentaosa sebagai produk utamanya (Nakamura et al. 1995 di dalam Saryono et al. 1999). Enzim inulinase merupakan enzim yang bersifat induktif yaitu enzim yang pembentukannya dirangsang oleh adanya substrat. Enzim ini akan diproduksi ketika BAL tumbuh pada media atau lingkungan yang mengandung inulin. Mula-mula Lactobacillus R23 dan R23H tidak mampu menggunakan inulin sehingga pertumbuhan di masa awal inkubasi cenderung lambat. Setelah beberapa waktu pertumbuhan mulai meningkat pesat yang dibuktikan dengan tingginya nilai OD yang terukur. Enzim diproduksi selama masa awal inkubasi (fase adaptasi), selanjutnya enzim dapat digunakan untuk memecah inulin selama pertumbuhan kedua isolat. Pengukuran total gula pada media dengan FOS sebagai sumber karbon menunjukkan jumlah penurunan yang lebih besar dan cepat selama pertumbuhan Lactobacillus R23. Pada Gambar 24 terlihat grafik penurunan total gula pada media yang mengandung FOS lebih curam jika dibandingkan dengan media yang mengandung inulin. Total gula pada awal waktu inkubasi terukur sebesar 4.50% kemudian berangsur turun hingga tersisa sebesar 2.39% pada akhir waktu inkubasi. Hal ini menunjukkan bahwa FOS sebagai sumber gula tunggal pada media mampu dimanfaatkan dengan baik oleh Lactobacillus R23 untuk pertumbuhannya yang dibuktikan dengan hasil pengukuran nilai OD yang cukup tinggi. Pada media pertumbuhan Lactobacillus R23H yang mengandung FOS sebagai sumber karbon menunjukkan pula terjadinya penurunan total gula yang signifikan selama waktu inkubasi (p < 0.05) (Gambar 25). Total gula menurun dari 4.55% menjadi 1.20% selama 24 jam waktu inkubasi. Grafik yang lebih curam menunjukkan bahwa penurunan total gula pada media FOS berlangsung lebih cepat daripada media inulin. Pada pengukuran nilai OD yang telah dibahas sebelumnya, terlihat pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media FOS lebih tinggi daripada inulin sejak awal inkubasi. Hal ini membuktikan bahwa isolat 39 6,0 5,0 10,00 4,0 3,0 1,00 2,0 0,10 Log OD Terhitung Total Gula dan Gula Pereduksi (%) dapat lebih mudah memecah FOS sejak masa awal pertumbuhan. Hasil pengukuran OD juga menunjukkan tingkat pertumbuhan Lactobacillus R23H lebih tinggi daripada Lactobacillus R23 pada media dengan FOS sebagai sumber karbon. Berdasarkan hasil pengukuran total gula, dapat diketahui bahwa Lactobacillus R23H memetabolisme FOS lebih banyak sehingga FOS yang tersisa pada akhir waktu inkubasi lebih sedikit. Hasil ini menunjukkan kemampuan Lactobacillus R23H dalam memfermentasi FOS lebih baik daripada Lactobacillus R23. Hubungan antara penurunan total gula dan gula pereduksi serta peningkatan nilai OD selama pertumbuhan kedua isolat pada media FOS disajikan pada Gambar 28 dan Gambar 29. Total Gula Gula Pereduksi Log OD 1,0 0,0 0,01 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) 6,0 5,0 10,00 4,0 3,0 1,00 2,0 0,10 Log OD Terhitung Total Gula dan Gula Pereduksi (%) Gambar 28. Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan FOS sebagai sumber karbon Total Gula Gula Pereduksi Log OD 1,0 0,0 0,01 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) Gambar 29. Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan FOS sebagai sumber karbon Fermentasi asam laktat dengan memanfaatkan FOS akan menghasilkan ATP. Peran ATP sangat penting dalam proses pertumbuhan karena merupakan sumber energi dalam aktivitas sel. FOS dapat dipecah oleh enzim β-fruktosidase menghasilkan molekul glukosa dan fruktosa. Enzim ini merupakan enzim ekstraseluler yang bersifat induktif. Jadi enzim hanya akan diproduksi ketika substrat yang sesuai yaitu FOS ada di lingkungan pertumbuhan BAL. Selanjutnya molekul monosakarida yang dihasilkan dari hidrolisis FOS akan masuk ke 40 6,0 5,0 10,00 4,0 3,0 1,00 2,0 0,10 1,0 0,0 Log OD Terhitung Total Gula dan Gula Pereduksi (%) tahap glikolisis menghasilkan asam piruvat, 2 molekul adenosine triphosphate (ATP), dan 2 molekul NADH. Asam piruvat diubah oleh enzim laktat dehidrogenase menjadi asam laktat dengan mengubah 2 molekul NADH menjadi 2 molekul NAD+. Prinsip fermentasi asam laktat adalah transfer H+ dari NADH kepada gugus karbonil dari piruvat sehingga piruvat tereduksi menjadi laktat (Bertolani 2007). Pengukuran total gula pada media dengan GOS sebagai sumber karbon menunjukkan tingkat penurunan yang paling cepat selama pertumbuhan Lactobacillus R23. Pada awal waktu inkubasi jumlah total gula terukur sebesar 4.73% dan terus menurun selama waktu pertumbuhan hingga tersisa sebesar 1.72% pada jam ke-24. Pada Gambar 24 terlihat grafik penurunan total gula pada media ini tampak paling curam dengan nilai kemiringan grafik sebesar 3.74 (dihitung dari jam ke-0 sampai jam ke-12). Hal ini mengindikasikan bahwa Lactobacillus R23 dapat memanfaatkan GOS lebih mudah dibandingkan dengan sumber prebiotik uji lainnya. Hasil pengukuran ini didukung oleh hasil pengukuran OD Lactobacillus R23 pada media GOS yang menunjukkan tingkat pertumbuhan tertinggi sejak awal hingga akhir inkubasi. Isolat dapat tumbuh dengan cepat karena sumber karbon yang dibutuhkan dalam pertumbuhan dapat diperoleh dengan keberadaan GOS pada media. Hal yang serupa terjadi pada pengukuran total gula media pertumbuhan Lactobacillus R23H yang memanfaatkan GOS sebagai sumber karbon. Pada media ini, sisa gula di akhir waktu inkubasi menunjukkan nilai yang paling rendah yaitu 0.99%. Penurunan total gula pada media ini berlangsung sedikit lambat di awal waktu inkubasi, tetapi kemudian menurun dengan cepat sampai akhir inkubasi (Gambar 25). Nilai DP GOS yang tidak terlalu tinggi menyebabkan GOS lebih mudah untuk difermentasi. Hal ini terbukti dengan tingginya nilai OD yang terukur selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media GOS. Pola peningkatan nilai OD juga sesuai dengan hasil pengukuran total gula yaitu sedikit lebih lambat di awal tetapi kemudian meningkat dengan cepat sampai akhir waktu inkubasi. Kecenderungan pertumbuhan Lactobacillus R23H memang sedikit berbeda dengan Lactobacillus R23 yang menunjukkan tingginya tingkat pertumbuhan sejak masa awal inkubasi. Tetapi secara umum, keduanya mampu memecah GOS lebih banyak dibanding prebiotik uji lainnya selama waktu inkubasi. Hubungan antara penurunan total gula dan gula pereduksi serta peningkatan nilai OD selama pertumbuhan kedua isolat pada media GOS disajikan pada Gambar 30 dan Gambar 31. Total Gula Gula Pereduksi Log OD 0,01 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Waktu (jam) 18 20 22 24 Gambar 30. Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan GOS sebagai sumber karbon 41 5,0 10,00 4,0 3,0 1,00 2,0 0,10 1,0 0,0 Log OD Terhitung Total Gula dan Gula Pereduksi (%) 6,0 Total Gula Gula Pereduksi Log OD 0,01 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) Gambar 31. Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan GOS sebagai sumber karbon GOS merupakan oligosakarida dengan struktur kimia yang terdiri dari beberapa molekul galaktosa yang berikatan dengan gugus glukosa dibagian ujungnya. Telah banyak hasil penelitian in vitro yang menyatakan bahwa GOS mampu meningkatkan proliferasi sel Bifidobacteria dan Lactobacilli (Tanaka et al. 1983; Smart et al. 1993; Ishikawa et al. 1995; Yanahira et al. 1995). Selain itu, hasil penelitian lain juga menyebutkan bahwa GOS dapat dimetabolisme dengan lebih mudah oleh Bifidobacteria secara in vitro dibandingkan dengan sumber prebiotik lain seperti laktulosa dan rafinosa (Tanaka dan Matsumoto 1998 di dalam Gopal et al. 2001). GOS terdapat secara alami di dalam ASI dan merupakan faktor bifidus yang dapat mendukung pertumbuhan bakteri baik pada saluran cerna (Gopal et al. 2001). Lactobacillus R23 merupakan kelompok Lactobacillus rhamosus yang diisolasi dari ASI, sehingga sangat dimungkinkan bahwa GOS dapat mendukung pertumbuhan Lactobacillus R23. Hal ini didukung oleh hasil penelitian Gopal et al. (2001) yang menyatakan bahwa strain Lactobacillus rhamosus DR20 dapat memanfaatkan GOS selama pertumbuhannya pada media yang mengandung GOS. Kemampuan BAL dalam memetabolisme GOS terkait dengan keberadaan enzim β-galaktosidase yang dihasilkan oleh BAL tersebut. Enzim βgalaktosidase dapat memecah ikatan glikosidik pada GOS sehingga BAL dapat memetabolismenya. Selain itu, GOS juga memiliki DP yang tidak terlalu tinggi yaitu berkisar antara 2-7 sehingga BAL masih cukup mudah untuk memecahnya. Pengukuran total gula juga dilakukan pada media dengan kombinasi prebitoik FOS:GOS (1:9) dan inulin:GOS (1:9). Pada kedua kombinasi prebiotik tersebut, profil penurunan total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H berbeda dengan profil penurunan total gula pada media yang memanfaatkan satu jenis prebiotik sebagai sumber karbon (Gambar 24-25). Pada media dengan kombinasi inulin:GOS (1:9), menunjukkan penurunan total gula yang lebih besar jika dibandingkan dengan media yang memanfaatkan inulin secara tunggal. Hal ini menunjukkan kemungkinan kedua isolat memecah GOS lebih banyak daripada inulin karena struktur GOS yang lebih sederhana dengan DP < 10. Berbeda dengan media yang berisi kombinasi FOS:GOS (1:9), penurunan total gula selama pertumbuhan menjadi sedikit lebih lambat dibandingkan dengan media yang hanya menggunakan FOS secara tunggal. 42 6,0 5,0 10,00 4,0 3,0 1,00 2,0 0,10 Log OD Terhitung Total Gula dan Gula Pereduksi (%) Selama pertumbuhan Lactobacillus R23, kecepatan penurunan total gula pada kedua media dengan kombinasi dua jenis prebiotik tidak terlalu berbeda satu sama lain (Gambar 24). Hal ini terlihat dari nilai kemiringan grafik yang tidak berbeda jauh yaitu 2.126 untuk FOS:GOS (1:9) dan -2.857 untuk inulin:GOS (1:9). Hasil pengukuran nilai OD juga menunjukkan pertumbuhan Lactobacillus R23 pada kedua media ini tidak berbeda nyata (p < 0.05). Hal yang serupa juga teramati pada Lactobacillus R23H yang menunjukkan laju penurunan total gula yang hampir sama pada kedua kombinasi prebiotik. Nilai kemiringan grafik terukur sebesar -4.158 untuk FOS:GOS (1:9) dan -3.125 untuk inulin:GOS (1:9). Pengukuran total gula pada media dengan kombinasi prebiotik menunjukkan laju penurunan yang medium baik pada Lactobacillus R23 maupun Lactobacillus R23H. Pada Gambar 24 dan Gambar 25 terlihat grafik penurunan total gula pada kedua media ini berakhir di area tengah yang berarti bahwa lebih cepat dari inulin tetapi lebih lambat daripada FOS dan GOS. Namun demikian, hasil pengukuran OD menunjukkan bahwa kedua isolat mampu tumbuh dengan baik pada media dengan kombinasi prebiotik tersebut sama halnya dengan pertumbuhan pada media yang hanya memanfaatkan GOS sebagai sumber gula. Kondisi tersebut diharapkan pada aplikasi produk sinbiotik, sehingga selama proses fermentasi berlangsung prebiotik tidak akan habis dipecah oleh BAL. Dengan demikian, prebiotik yang terkandung dalam produk akan dimanfaatkan sebagai sumber karbon oleh probiotik di dalam kolon setelah produk dikonsumsi. Hubungan antara penurunan total gula dan gula pereduksi serta peningkatan nilai OD selama pertumbuhan kedua isolat pada media dengan kombinasi prebiotik disajikan pada Gambar 32 sampai dengan Gambar 35. Total Gula Gula Pereduksi Log OD 1,0 0,0 0,01 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) Gambar 32. Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan FOS:GOS (1:9) sebagai sumber karbon 43 5,0 10,00 4,0 3,0 1,00 2,0 0,10 1,0 0,0 Log OD Terhitung Total Gula dan Gula Pereduksi (%) 6,0 Total Gula Gula Pereduksi Log OD 0,01 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) 6,0 5,0 10,00 4,0 3,0 1,00 2,0 0,10 1,0 0,0 Log OD Terhitung Total Gula dan Gula Pereduksi (%) Gambar 33. Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan FOS:GOS (1:9) sebagai sumber karbon Total Gula Gula Pereduksi Log OD 0,01 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) 6,00 5,00 10,00 4,00 3,00 1,00 2,00 0,10 1,00 0,00 Log OD Terhitung Total Gula dan Gula Pereduksi (%) Gambar 34. Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan inulin:GOS (1:9) sebagai sumber karbon Total Gula Gula Pereduksi Log OD 0,01 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) Gambar 35. Hubungan total gula, gula pereduksi, dan nilai OD selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan inulin:GOS (1:9) sebagai sumber karbon 44 Konsentrasi Gula Pereduksi (%) Selain perubahan total gula selama pertumbuhan BAL, perubahan konsentrasi gula pereduksi juga diukur dan dibandingkan antar media perlakuan. Pengukuran perubahan nilai gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media dengan inulin sebagai sumber karbon menunjukkan terjadinya penurunan yang lambat (Gambar 36). Pada awal waktu inkubasi, nilai gula pereduksi pada media dengan inulin adalah sebesar 0.56% dan perlahan turun hingga mencapai 0.39% pada akhir waktu inkubasi. Pada media pertumbuhan Lactobacillus R23H, hasil pengukuran menunjukkan kecenderungan yang sama. Jumlah awal gula pereduksi terukur sebesar 0.72% dan menurun sampai 0.38% pada akhir inkubasi. Jumlah gula pereduksi awal pada media inulin paling sedikit jika dibandingkan dengan media yang mengandung prebiotik uji lainnya. Jumlah gula pereduksi awal terukur lebih rendah dibandingkan prebiotik uji lainnya karena inulin memiliki rantai yang panjang dengan DP yang paling tinggi yaitu berkisar antara 2 – 60 dengan rata-rata DP sebesar 10, sedangkan FOS dan GOS hanya memiliki DP berkisar antara 2 - 7. Hal ini menyebabkan pada satuan berat yang sama, jumlah molekul inulin lebih sedikit daripada FOS dan GOS sehingga gugus gula pereduksi yang terkandung di dalamnya pun lebih sedikit. Dengan demikian, pada media yang mengandung 5% inulin menunjukkan nilai gula pereduksi yang lebih rendah daripada media yang mengandung 5% FOS ataupun 5% GOS. Pada Gambar 36 dan Gambar 37 dapat dilihat grafik penurunan gula pereduksi yang paling landai pada media dengan inulin sebagai sumber karbon dengan nilai kemiringan grafik sebesar -0.045 untuk Lactobacillus R23 dan -0.058 untuk Lactobacillus R23H. Hasil pengukuran OD yang telah dibahas sebelumnya memperlihatkan bahwa pertumbuhan kedua isolat pada media inulin berlangsung lambat. Hal ini berhubungan dengan struktur inulin yang lebih panjang dengan DP yang cukup besar sehingga isolat sulit untuk memecah inulin. Semakin tinggi nilai DP akan menurunkan kemampuan BAL dalam memecah prebiotik tersebut (Roberfroid 1998). Tetapi seiring dengan bertambahnya waktu inkubasi, isolat berhasil memproduksi enzim inulinase yang dapat memecah inulin sehingga pertumbuhan meningkat yang ditunjukkan dengan nilai OD yang tinggi di akhir waktu inkubasi. 3,50 3,00 2,50 FOS 2,00 Inulin 1,50 1,00 GOS 0,50 FOS:GOS 0,00 Inulin:GOS 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) Gambar 36. Grafik perubahan gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon 45 Konsentrasi Gula Pereduksi (%) 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 FOS Inulin GOS FOS:GOS Inulin:GOS 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) Gambar 37. Grafik perubahan gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon Selama pertumbuhan kedua isolat pada media inulin, nilai gula pereduksi yang terukur pada media cenderung rendah dan konstan (Gambar 36-37). Hal ini berkaitan dengan monosakarida utama penyusun inulin yaitu fruktosa yang bukan merupakan gula pereduksi. Sehingga walaupun enzim inulinase telah memecah ikatan glikosidik pada inulin, kandungan gula pereduksi tidak bertambah karena ujung gugus fruktosa tidak terukur sebagai gula pereduksi. Sedangkan nilai gula pereduksi yang terukur selama pertumbuhan berasal dari gugus glukosa yang terdapat pada setiap ujung struktur inulin. Pada media dengan FOS sebagai sumber karbon, hasil pengukuran gula pereduksi selama pertumbuhan kedua isolat menujukkan terjadinya penurunan yang lebih besar dibandingkan inulin (Gambar 36-37) . Pengukuran pada media pertumbuhan Lactobacillus R23 menunjukkan jumlah awal gula pereduksi sebesar 1.30% kemudian menurun hingga 0.29% pada jam ke-24. Kandungan gula pereduksi awal pada media FOS lebih besar daripada inulin karena FOS memiliki rantai yang lebih pendek sehingga pada konsentrasi yang sama gugus gula pereduksi pada FOS lebih banyak daripada inulin. Selama pertumbuhan Lactobacillus R23H, kandungan gula pereduksi pada media ini menurun dari 1.88% menjadi 0.21%. Nilai gula pereduksi berasal dari ujung rantai glukosa yang memiliki gugus -OH bebas pada struktur FOS yang telah dipecah oleh bakteri. Gugus gula ini kemudian dimanfaatkan oleh BAL sebagai sumber karbon sehingga jumlahnya terus menurun seiring dengan lamanya waktu pertumbuhan dan jumlah isolat yang terus meningkat. FOS memiliki DP < 10 sehingga Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H masih cukup mudah dalam memecahnya. Hal ini terbukti dengan tingginya tingkat pertumbuhan kedua isolat pada media dengan FOS sebagai sumber karbon dibandingkan dengan pertumbuhan pada media inulin. Nilai OD yang terukur selama pertumbuhan kedua isolat pada media ini menunjukkan peningkatan yang cukup tinggi sejak awal inkubasi. Struktur FOS yang lebih sederhana daripada inulin menyebabkan isolat dapat memecah FOS dengan lebih mudah sejak awal waktu inkubasi. Hal ini juga didukung dengan penurunan total gula yang lebih cepat selama pertumbuhan kedua isolat. Hasil pengukuran gula pereduksi pada media dengan GOS sebagai sumber karbon menunjukkan bahwa GOS memiliki kandungan gula pereduksi yang paling banyak dibandingkan sumber prebiotik uji lainnya. Hal ini dapat dilihat dari tingginya kadar gula 46 pereduksi dalam media yang mengandung GOS (Gambar 36-37). Pada awal waktu inkubasi nilai gula pereduksi yang terukur pada media pertumbuhan Lactobacillus R23 adalah sebesar 2.93%. Jumlah gula pereduksi mengalami perubahan yang fluktuatif tetapi cederung menurun dengan jumlah gula pereduksi sebesar 0.77% pada akhir waktu inkubasi. Pengukuran selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media GOS juga menunjukkan hasil yang serupa. Kandungan awal gula pereduksi sebesar 3.04% dan sempat mengalami peningkatan mencapai 3.47% pada jam ke-4. Selanjutnya kandungan gula pereduksi terus menurun hingga mencapai 0.94% pada akhir inkubasi. Hasil pengukuran yang fluktuatif ini menunjukkan pada masa-masa awal inkubasi, GOS terus dipecah oleh isolat sehingga jumlah gula pereduksi sempat meningkat. Namun kemudian, gula pereduksi ini juga dimetabolisme sehingga jumlahnya semakin menurun selama waktu pertumbuhan. Hasil pengukuran gula pereduksi yang tinggi pada media GOS dapat menunjukkan bahwa GOS memiliki nilai DP yang cukup rendah. Hal ini karena monosakarida penyususn GOS yaitu galaktosa dan glukosa merupakan gula pereduksi, sehingga perbandingan total gula dengan gula pereduksi pada media dapat mengindikasikan besarnya DP. Dengan kandungan gula pereduksi yang semakin tinggi, maka DP yang dimiliki menjadi semakin rendah. Prebiotik dengan DP yang rendah dapat dengan mudah difermentasi oleh BAL. Hal ini dibuktikan dengan tingginya nilai OD yang terukur selama pertumbuhan kedua isolat pada media GOS. Peningkatan nilai OD berlangsung cepat, demikian halnya dengan penurunan gula pereduksi yang juga menunjukkan kecenderungan penurunan yang cepat. Hasil pengukuran total gula pada media GOS juga menunjukkan laju penurunan yang cepat dengan sedikitnya kandungan GOS yang tersisa pada akhir waktu inkubasi. Kandungan gula pereduksi awal pada media yang mengandung FOS:GOS (1:9) dan inulin:GOS (1:9) menunjukkan jumlah yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan media yang menggunakan FOS dan inulin sebagai sumber gula tunggal. Meningkatnya kadar gula pereduksi ini karena sumber gula yang digunakan lebih dari satu, sehingga gugus gula pereduksi yang terdapat dalam media menjadi lebih banyak. Pada Gambar 36 dan Gambar 37 terlihat grafik perubahan kadar gula pereduksi pada kedua media yang cukup fluktuatif tetapi cenderung menurun. Kombinasi antara inulin yang memiliki DP tinggi dengan GOS yang memiliki kandungan gula pereduksi tinggi dan DP rendah ternyata dapat dimanfaatkan dengan baik oleh kedua isolat sebagai sumber karbon dalam pertumbuhannya. Melalui hasil pengukuran OD, juga terlihat bahwa kedua isolat dapat tumbuh dengan baik pada media dengan kombinasi prebiotik tersebut. C. APLIKASI PEMANFAATAN PREBIOTIK DAN Lactobacillus R23 PADA PRODUK SUSU FERMENTASI Produk susu fermentasi telah banyak dikenal dan digemari oleh masyarakat. Produk ini merupakan salah satu jenis produk yang tepat untuk dijadikan target dalam mengaplikasikan konsep sinbiotik. Hal ini didukung pula oleh animo masyarakat yang semakin tinggi terhadap produk pangan yang memilki efek meningkatkan kesehatan. Dengan penambahan probiotik dan prebiotik yang sesuai ke dalam produk susu fermentasi, akan meningkatkan nilai tambah produk ini dari segi kesehatan. 47 1. Pertumbuhan Lactobacillus R23 Produk susu fermentasi menunjukkan manfaat yang diinginkan untuk kesehatan jika jumlah bakteri probiotik yang hidup didalamnya cukup tinggi. Kurmann dan Rasic (1991) menganjurkan dosis minimum jumlah probiotik adalah 108-109 CFU/ml, sehingga ketika melewati saluran pencernaan masih cukup banyak probiotik hidup yang sampai ke usus dan dapat memberikan manfaat bagi kesehatan. Hasil analisis total BAL selama proses fermentasi susu disajikan pada Tabel 3, sedangkan diagram yang membandingkan jumlah total BAL pada seluruh media susu skim dapat dilihat pada Gambar 38. Tabel 3. Jumlah Lactobacillus R23 pada media susu skim dengan penambahan prebiotik Waktu Jumlah BAL (Log CFU/ml) inkubasi Skim Skim+FOS Skim+Inulin (jam) Skim+Inulin: GOS (1:9) 8.35 8.29 8.35 8.42 24 9.92 10.15 10.05 10.11 48 9.60 9.49 9.79 9.92 Total BAL (Log CFU/ml) 0 12,00 10,00 ab a c c c a a c b b ab ab 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0 24 48 Waktu (jam) Skim Skim+FOS Skim+Inulin Skim+Inulin:GOS Gambar 38. Jumlah total Lactobacillus R23 pada media susu skim dengan penambahan prebiotik Pertumbuhan Lactobacillus R23 pada seluruh media susu skim menunjukkan pola yang serupa (Gambar 38). Total BAL meningkat hingga hari pertama inkubasi, kemudian jumlahnya sedikit menurun pada hari kedua inkubasi. Penurunan jumlah BAL pada hari kedua inkubasi dikarenakan pH susu fermentasi telah mencapai nilai yang sangat rendah. Kashket (1987) dikutip oleh Ostlie et al. (2005) menyatakan bahwa pertumbuhan Lactobacillus meningkat hingga pH sitoplasma mencapai 4.4 (pH eksternal 3.5), namun ketika pH sitoplasma mencapai pH yang lebih rendah dari batas yang dapat diterima, sel akan mati. Hasil pengukuran total BAL dengan menggunakan metode cawan tuang menunjukkan bahwa jumlah awal Lactobacillus R23 pada keempat media susu skim tidak berbeda nyata (p < 0.05). Pengamatan pada jam ke-24 menunjukkan terjadi peningkatan jumlah BAL pada keempat media. Jumlah peningkatan tertinggi adalah pada media susu 48 skim dengan penambahan FOS diikuti oleh media susu skim dengan inulin:GOS (1:9), inulin, dan skim tanpa prebiotik. Namun, peningkatan jumlah BAL pada keempat media tersebut tidak berbeda nyata satu sama lain (p < 0.05). Hal ini dikarenakan media susu skim memiliki kandungan nutrisi yang cukup bagi pertumbuhan BAL, sehingga Lactobacillus R23 mampu tumbuh dengan baik pada keseluruhan media uji. Pengukuran total BAL yang dilakukan pada jam ke-48 atau akhir dari waktu fermentasi menunjukkan terjadinya penurunan (Gambar 38). Hasil analisis menyatakan bahwa jumlah akhir Lactobacillus R23 pada keempat media tidak berbeda nyata secara signifikan (p < 0.05). Hal ini mengindikasikan bahwa selama proses fermentasi berlangsung, prebiotik yang ditambahkan ke dalam susu tidak difermentasi oleh Lactobacillus R23. Lactobacillus R23 memanfaatkan secara optimal sumber nutrisi yang ada di dalam susu termasuk laktosa yang merupakan sumber gula alami pada susu sehingga prebiotik yang ditambahkan masih tetap tersedia sampai proses fermentasi selesai. Prebiotik yang tersedia pada produk susu fermentasi tersebut merupakan sumber karbon yang akan digunakan di dalam kolon setelah produk dikonsumsi. Berdasarkan hasil pengukuran yang disajikan pada Tabel 3 dapat disimpulkan bahwa jumlah akhir Lactobacillus R23 telah memenuhi syarat jumlah minimal BAL pada produk susu fermentasi yaitu berkisar antara 108-109 CFU/ml (Kurmann dan Rasic 1991). Hasil pengukuran total BAL pada keempat media susu skim secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 18. 2. Perubahan Nilai pH dan TAT Hasil pengamatan nilai pH susu fermentasi pada masing-masing perlakuan menunjukkan semakin lama inkubasi dilakukan maka nilai pH semakin menurun (Gambar 39). Penurunan nilai pH ini dikarenakan semakin banyaknya jumlah asam laktat yang terbentuk akibat pemecahan gula oleh BAL. Nilai pH awal pada keempat media susu skim berkisar antara 6.16 - 6.26. Pada jam ke-24, nilai pH di seluruh media mengalami penurunan. Pada media skim tanpa penambahan prebiotik nilai pH turun menjadi 4.85, sedangkan pada ketiga media lainnya yaitu media dengan FOS, inulin, dan inulin:GOS (1:9) nilai pH turun menjadi 4.58, 4.72, dan 4.64. Penurunan pH pada ketiga media yang mengandung prebiotik sedikit lebih besar daripada penurunan pH pada media kontrol. Hal ini sesuai dengan hasil pengukuran total BAL yang menunjukkan bahwa pada jam ke-24 jumlah Lactobacillus R23 pada ketiga media skim dengan prebiotik sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan media skim tanpa prebiotik, tetapi tidak berbeda nyata satu sama lain (p < 0.05). Semakin tinggi jumlah total BAL, maka jumlah asam laktat yang dihasilkan menjadi semakin tinggi pula sehingga dapat menurunkan nilai pH. Jumlah total BAL dan nilai pH berkorelasi negatif (p < 0.05) (Lampiran 33). Pengukuran nilai pH pada jam ke-48 menunjukkan adanya sedikit penurunan pada keseluruhan media jika dibandingkan dengan nilai pH pada jam ke-24 (Gambar 39). Pada media dengan FOS, inulin, inulin:GOS (1:9), dan media tanpa prebiotik nilai pH akhir berturut-turut adalah 4.09, 4.06, 4.10, dan 4.15. Nilai pH pada produk susu fermentasi yang direkomendasikan adalah 3.65 - 4.40 (Jay 2005). Menurut ICMSF (1996) dikutip oleh Paswey (2002), pada nilai pH di atas 4 beberapa galur patogen dari E. coli, Salmonella, dan Clostridium masih dapat hidup. Dengan demikian seluruh media susu fermentasi yang diujikan telah memenuhi syarat nilai pH pada produk susu fermentasi. 49 6,50 6,00 Nilai pH 5,50 5,00 Skim 4,50 Skim+FOS 4,00 Skim+Inulin 3,50 Skim+Inulin:GOS 3,00 0 24 48 Waktu (jam) Gambar 39. Grafik perubahan nilai pH selama proses fermentasi susu skim dengan penambahan prebiotik Pada Gambar 40 disajikan diagram yang menunjukkan selisih nilai pH awal media skim dengan nilai pH pada setiap waktu pengamatan. Berdasarkan diagram tersebut, terlihat jelas bahwa nilai pH selama proses fermentasi terus mengalami penurunan. Penurunan pH yang terjadi tidak berbeda jauh pada keempat media susu skim. Hal ini diharapkan terjadi karena mengindikasikan bahwa pertumbuhan isolat pada keseluruhan media tidak berbeda nyata yang berarti bahwa isolat hanya memanfaatkan sumber nutrisi alami pada susu tanpa memetabolisme prebiotik selama proses fermentasi berlangsung. 2,50 2,11 2,11 2,10 2,12 Delta pH 2,00 1,41 1,50 1,62 1,44 1,58 1,00 0,50 0,00 24 48 Waktu (jam) Skim Skim+FOS Skim+Inulin Skim+Inulin:GOS Gambar 40. Selisih nilai pH susu fermentasi dengan penambahan prebiotik setelah 24 dan 48 jam dibandingkan dengan 0 jam Hasil pengukuran TAT (% asam laktat) mendukung hasil pengukuran pH. Nilai TAT terus meningkat selama asam laktat diproduksi oleh BAL sehingga pH media terus menurun. Nilai pH dan TAT berkorelasi negatif (p < 0.05) (Lampiran 33). Selama waktu inkubasi 48 jam terjadi peningkatan nilai TAT seiring dengan penurunan nilai pH (Gambar 41). Pada awal waktu inkubasi, nilai TAT pada keempat media berkisar antara 0.40% 0.55%. Setelah inkubasi selama 24 jam, nilai TAT pada keempat media mengalami peningkatan mencapai 1.05% - 1.30%. Pada jam ke-48 nilai TAT pada media dengan FOS, 50 inulin, inulin:GOS (1:9), dan media tanpa prebiotik berturut-turut adalah 2.00%, 1.93%, 2.00%, dan 1.68%. Laju pembentukan asam laktat tidak sepenuhnya dipengaruhi oleh pertumbuhan. Asam laktat terus diproduksi dengan kecepatan rendah selama sumber karbon masih tersedia, meskipun pertumbuhan sel menurun (Lee dan Wong 1998). Oleh karena itu, nilai TAT media terus meningkat sampai akhir waktu inkubasi meskipun jumlah total BAL mengalami penurunan pada jam ke-48. Gambar 42 menyajikan diagram yang menunjukkan selisih nilai TAT awal dengan nilai TAT pada setiap waktu pengamatan. Melalui gambar tersebut dapat dilihat seberapa besar peningkatan TAT yang terjadi selama proses fermentasi. % Asam Laktat 2,50 2,00 1,50 Skim 1,00 Skim+FOS 0,50 Skim+Inulin Skim+Inulin:GOS 0,00 0 24 48 Waktu (jam) Gambar 41. Grafik perubahan TAT selama proses fermentasi susu skim dengan penambahan prebiotik ∆ % Asam Laktat 2,00 1,52 1,52 1,52 1,50 1,15 0,75 0,78 0,83 1,00 0,53 0,50 0,00 24 48 Waktu (jam) Skim Skim+FOS Skim+Inulin Skim+Inulin:GOS Gambar 42. Selisih nilai TAT susu fermentasi dengan penambahan prebiotik setelah 24 dan 48 jam dibandingkan dengan 0 jam 3. Perubahan Total Gula dan Gula Pereduksi Total gula dan gula pereduksi selama waktu fermentasi diukur untuk mengetahui perubahan yang terjadi. Secara umum jumlah total gula pada keempat media susu skim mengalami penurunan selama proses fermentasi. Hal ini menunjukkan Lactobacillus R23 51 Konsentrasi Total Gula (%) telah memetabolisme gula yang terdapat pada media menjadi asam laktat. Hasil analisis total gula dan gula pereduksi secara lengkap disajikan pada Lampiran 20 dan Lampiran 21. Pada Gambar 43 disajikan grafik penurunan total gula pada masing-masing media skim selama proses fermentasi. Melalui grafik dapat dilihat bahwa kandungan gula awal pada ketiga media skim yang ditambah dengan prebiotik dua kali lebih tinggi dibanding skim tanpa prebiotik. Pada media skim tanpa prebiotik, total gula awal terukur sebesar 5.14%, sedangkan pada ketiga media skim yang mengandung prebiotik total gula berkisar antara 10.12% - 10.65%. Total gula yang terukur pada media skim tanpa prebiotik merupakan laktosa yang terkandung dalam susu, sedangkan pada ketiga media lainnya total gula menunjukkan kandungan laktosa dan prebiotik yang ditambahkan. 12,00 10,00 8,00 Skim 6,00 Skim+FOS 4,00 Skim+Inulin 2,00 Skim+Inulin:GOS 0,00 0 24 48 Waktu (jam) Gambar 43. Grafik perubahan total gula selama proses fermentasi susu skim dengan penambahan prebiotik Hasil pengukuran total gula pada jam ke-24 menunjukkan pada media skim tanpa prebiotik jumlah gula tersisa sebesar 3.65%, sedangkan pada media skim yang mengandung FOS, inulin, dan inulin:GOS (1:9), jumlah gula yang tersisa masing-masing sebesar 8.84%, 8.41%, dan 6.67%. Karena metode pengukuran total gula yang dilakukan tidak bersifat spesifik, sehingga tidak dapat diketahui secara pasti berapa bagian laktosa, FOS, inulin, dan GOS yang terukur. Namun demikian, diduga laktosa merupakan gula yang difermentasi terlebih dahulu oleh Lactobacillus R23 karena merupakan disakarida dengan struktur yang sederhana dan mudah untuk dimetabolisme oleh BAL. Hasil pengukuran total gula pada jam ke-48 menunjukkan jumlah yang semakin menurun pada keseluruhan media uji. Melalui Gambar 43 dapat dilihat bahwa total gula yang tersisa pada media kontrol paling sedikit dibanding ketiga media lainnya yaitu sebesar 3.35%. Media yang mengandung inulin memiliki sisa gula terbanyak yaitu 8.03% yang berarti hanya turun sebesar 22.45% dari total gula awal. Pada media dengan FOS penurunan total gula secara keseluruhan adalah 41.67%, sedangkan pada media yang mengandung inulin:GOS (1:9) mengalami penurunan sebesar 34.07%. Pada Gambar 44 disajikan diagram yang menunjukkan selisih total gula awal dengan total gula pada setiap waktu pengamatan. Melalui gambar, dapat dilihat perbedaan kandungan gula yang tersisa pada masing-masing media selama proses fermentasi berlangsung. Sisa gula yang terdapat dalam susu fermentasi mencangkup jumlah prebiotik yang akan berguna pada kolon setelah dikonsumsi. Prebiotik tersebut tidak dapat 52 dimetabolisme di bagian atas saluran pencernaan sehingga dapat digunakan sebagai sumber karbon oleh probiotik pada kolon. ∆ Total Gula (%) 5,00 4,44 4,00 3,45 3,13 3,00 1,48 2,00 2,33 1,81 1,95 1,79 1,00 0,00 24 48 Waktu (jam) Skim Skim+FOS Skim+Inulin Skim+Inulin:GOS Gambar 44. Selisih total gula susu fermentasi dengan penambahan prebiotik setelah 24 dan 48 jam dibandingkan dengan 0 jam Konsentrasi Gula Pereduksi (%) Pengukuran gula pereduksi juga dilakukan untuk mengetahui perubahan jumlah gula pereduksi selama proses fermentasi berlangsung. Pada Gambar 45 dapat dilihat perubahan gula pereduksi pada keseluruhan media uji. Nilai gula pereduksi yang terukur pada media berasal dari kandungan laktosa pada susu dan gugus gula pereduksi pada masingmasing prebiotik yang ditambahkan. 7,00 6,00 5,00 4,00 Skim 3,00 Skim+FOS 2,00 Skim+Inulin 1,00 Skim+Inulin:GOS 0,00 0 24 48 Waktu (jam) Gambar 45. Grafik perubahan gula pereduksi selama proses fermentasi susu skim dengan penambahan prebiotik Jumlah awal gula pereduksi pada media dengan penambahan FOS dan inulin:GOS (1:9) lebih tinggi dibanding media uji lainnya. Pada media dengan FOS jumlah gula pereduksi awal sebesar 6.57% dan pada media dengan inulin:GOS (1:9) sebesar 6.62%. Tingginya jumlah gula pereduksi ini karena FOS dan GOS yang ditambahkan pada masingmasing media memiliki kandungan gula pereduksi yang tinggi. Hal ini sesuai dengan hasil analisis total gula pereduksi pada pengujian sebelumnya yang menyatakan bahwa kandungan gula pereduksi pada FOS dan GOS cukup tinggi. Pada jam ke-24 jumlah gula pereduksi pada 53 ∆ Gula Pereduksi (%) kedua media menurun dan terus mengalami penurunan hingga tersisa sebesar 3.63% pada media FOS dan 4.15% pada media inulin:GOS di akhir waktu inkubasi. Inulin yang memiliki kandungan gula pereduksi lebih rendah hanya meningkatkan kandungan gula pereduksi awal sedikit lebih tinggi daripada media skim tanpa prebiotik. Jumlah awal gula pereduksi pada media ini adalah sebesar 4.12%, sedangkan pada media skim tanpa prebiotik sebesar 3.77%. Sama halnya dengan kedua media uji lainnya, kedua media ini juga mengalami penurunan jumlah gula pereduksi selama proses fermentasi berlangsung. Selisih nilai gula pereduksi pada media susu fermentasi yang mengandung prebiotik terhadap media tanpa prebiotik dapat dilihat pada Gambar 46. Melalui gambar tersebut dapat dilihat dengan jelas selisih kandungan gula pereduksi pada masing-masing media selama proses fermentasi berlangsung. 3,0 2,80 2,86 2,5 2,0 1,54 1,41 1,25 1,5 1,02 1,0 0,5 0,35 0,37 0,06 0,0 0 24 48 Waktu (jam) Skim+FOS Skim+Inulin Skim+Inulin:GOS Gambar 46. Selisih gula pereduksi susu fermentasi dengan penambahan prebiotik dibandingkan dengan susu fermentasi tanpa penambahan prebiotik Keberadaan inulin sebagai sumber prebiotik tunggal dapat difermentasi dengan lambat oleh Lactobacillus R23. Sementara itu, dengan mengkombinasikan inulin dan GOS (1:9), kemampuan Lactobacillus R23 untuk tumbuh dengan memetabolisme prebiotik menjadi lebih baik. Perpaduan jenis prebiotik berantai panjang seperti inulin dan prebiotik berantai pendek seperti GOS serta Lactobacillus R23 yang merupakan BAL kandidat probiotik dapat digunakan pada produk susu fermentasi sinbiotik. Dengan memanfaatkan kombinasi tersebut, sumber prebiotik tidak terlalu cepat dicerna sehingga tidak akan habis dipecah oleh BAL selama di dalam produk. Dengan demikian, prebiotik dapat digunakan sebagai sumber karbon oleh probiotik di kolon setelah produk dikonsumsi. 54 V. SIMPULAN DAN SARAN A. SIMPULAN Hasil penelitian menunjukkan bahwa ketujuh kandidat probiotik isolat ASI yaitu Lactobacillus A22, A23, B16, R14, R21, R23, dan R23H dapat memanfaatkan inulin, FOS, dan GOS sebagai sumber karbon untuk pertumbuhannya. Lactobacillus R23H menunjukkan tingkat pertumbuhan tertinggi pada seluruh media yang mengandung prebiotik. Pengujian metabolisme prebiotik oleh BAL isolat ASI yang diwakili oleh Lactobacillus R23H dan Lactobacillus R23 menunjukkan bahwa GOS adalah sumber prebiotik uji yang paling mudah difermentasi. Secara umum, kecenderungan penggunaan prebiotik pada kedua isolat tidak jauh berbeda. Lactobacillus R23 yang bersifat homofermentatif dan Lactobacillus R23H yang bersifat heterofermentatif sama-sama dapat memanfaatkan GOS sebagai sumber karbon. Hal ini terlihat dari kecepatan kedua isolat dalam memetabolisme GOS selama waktu inkubasi. Pada media berbasis MRSB dengan GOS sebagai sumber karbon, kandungan gula di akhir waktu inkubasi paling sedikit jika dibandingkan media yang diberi prebiotik lain. Kedua isolat BAL tersebut paling sulit memanfaatkan inulin sebagai sumber karbon untuk pertumbuhannya. Tetapi pada penambahan kombinasi prebiotik inulin:GOS (1:9), kemampuan kedua isolat dalam memfermentasi prebiotik menjadi lebih baik daripada penggunaan inulin saja sebagai sumber karbon. Inulin sebagai sumber prebiotik tunggal dapat difermentasi dengan lambat oleh Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H. Sementara itu, dengan mengkombinasikan inulin dan GOS (1:9), kemampuan kedua isolat untuk tumbuh dengan memetabolisme prebiotik menjadi lebih baik. GOS memiliki DP < 10, sedangkan inulin memiliki DP berkisar antara 2 – 60. Semakin tinggi DP yang dimiliki oleh prebiotik, kemampuan BAL dalam memfermentasinya semakin berkurang. Hal ini yang menyebabkan GOS lebih mudah dimetabolisme oleh BAL sementara inulin lebih sulit untuk dimetabolisme. Pada aplikasi produk sinbiotik berbasis susu fermentasi, digunakan kandidat probiotik Lactobacillus R23 serta FOS, inulin, dan inulin:GOS (1:9) sebagai prebiotik. Hasil analisis total gula menunjukkan sisa gula yang jauh lebih tinggi pada ketiga media susu skim dengan penambahan prebiotik setelah proses fermentasi berlangsung dibandingkan dengan media susu skim tanpa prebiotik. Sisa gula yang lebih tinggi menunjukkan kemungkinan prebiotik di dalam produk belum dimetabolisme oleh BAL sehingga ketika dikonsumsi diharapkan dimetabolisme di kolon. Perpaduan jenis prebiotik berantai panjang seperti inulin dan prebiotik berantai pendek seperti GOS serta Lactobacillus R23 yang merupakan BAL kandidat probiotik dapat digunakan pada produk susu fermentasi sinbiotik. Dengan memanfaatkan kombinasi tersebut, sumber prebiotik tidak terlalu cepat dicerna sehingga tidak akan habis dipecah oleh BAL selama di dalam produk. Setelah produk dikonsumsi, prebiotik akan dimetabolisme oleh probiotik di kolon. GOS yang memiliki struktur lebih sederhana akan dimetabolisme terlebih dahulu di bagian awal kolon, sedangkan inulin yang memilki rantai lebih panjang dan lebih sulit dipecah akan bermanfaat sebagai sumber karbon pada bagian akhir dari saluran kolon. B. SARAN Perlu dilakukan pengujian yang lebih spesifik yang dapat menunjukkan berapa bagian prebiotik yang dipecah dan yang tersisa setelah proses fermentasi. Selain itu, perlu diuji pula kemampuan isolat BAL dalam menghasilkan enzim yang dibutuhkan untuk memecah prebiotik. 56 DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2000. Probiotik. http://www.asiamaya.com/nutrients/probiotik.htm. [21 September 2010] Agrawal R. 2005. Probiotics: An emerging food supplement with health benefits. Food Biotechnology 19: 227-246. AOAC. 1998. Official Methods of Analysis of AOAC International. AOAC International Virginia, USA. Axelsson LT. 2004. Lactic Acid Bacteria Classification and Physiology. Di dalam: Salminen S, Wright AV, dan Ouwehand A (eds.). 2004. Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspect. Marcell Dekker Inc., New York, Basel. BAM . 2001. Bacteriological Analytical Manual Chapter 3: Aerobic Plate Count. U.S. Food and Drug Administration. www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/ BacteroilogycalAnalyticalManualBAM/ucm063346.htm [15 Juni 2010] Bergner P. 1997. Inulin in Medical Herbalism: A Journal for the Herbal Practicioner. http://medherb.com [4 Juni 2010]. Bertolani GP. 2007. Chemotrophic Energy Metabolism: Glycolysis and Fermentation. Di dalam: Becker WM, Kleinsmith LJ, dan Hardin J (eds.). The World of The Cell 6th Edition. Pearson Benjamin Cummings, San Francisco. Boehm G. 2002. Supplementations of bovine milk formula with an oligosaccharide mixture increases counts of fecal bifidobacteria in preterm infants. Archives of Disease in child, Fetal Neonatal Edition. 86, F178. Bouhnik Y, Kvahedi, Achou L, Attar A, Salfat J, Pochart P, Marteau P, dan Flourie B. 1999. Short chain fructooligosaccharide administration dose dependently increases faecal bifidobacteria in healthy humans. J. Nutr. 129: 113-116. Chen MJ, Chen KN, dan Lin CW. 2006. Development and verification of an optimum composition Model for a synbiotic fermented milk using sesuential quadratic programming techniques. J. Anim. Sci. 10: 1490-1495. Crittenden RG dan Playne MJ. 1996. Production, properties and applications of food-grade oligosaccharides. Trends in Food Science and Technology, 7(11): 353–361. ----------. 2009. Prebiotics. Di dalam: Salminen S. dan Yuan Kun Lee (eds.). Handbook of Probiotics and Prebiotics. John Wiley and Sons, Inc., New Jersey. Cummings JH. 1997. The Large Intestine in Nutrition and Disease. Institute Danone, Brussels. De Vuyst L. dan Vandamme EJ. 1994. Antimicrobial potention of lactic acid bacteria. Di dalam: De Vuyst L. dan Vandamme EJ (eds.). Bacteriocin of lactic acid bacteria microbiology, genetic, and application. Blackie Academic and Professional, London. pp: 91-129. Dubois M, Gilles K, Hamilton J, Roberts P, dan Smith F. 1956. Colorimeteric method for determining sugars and related substances. Analytical Chemistry, 28:350-354. Ducluzeau RP, Gouet P, dan Williams PEV. 1991. Probiotics in Ruminants. Di dalam: Jouany JP (ed.). Rumen Microbial Metabolism and Ruminant Digestion. INRA, Paris. Erkkilä S dan Petäjä E. 2000. Screening of commercial meat starter cultures at low pH and in the presence of bile salts for potential probiotic use. J. Meat Sci. 55:297-300. Fanworth ER. 2001. Probiotics and prebiotics. Di dalam: Wildman, REC (ed.). Nutraceutical and Functional Foods. CRC Press, New York. Fardiaz S. 1983. Keamanan Pangan Jilid 1. Jurusan Ilmu dan Teknologi Pangan. Fateta-IPB, Bogor. ----------. 1989. Mikrobiologi Pangan. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Depdikbud, PAU-IPB, Bogor. Forestier C, Champs CD, Vatoux C, and Joly B. 2001. Probiotic acticities of Lactobacillus casei rhamnosus : in vitro adherence to intestinal cells and antimicrobial properties. J. Res. Microbial 152:167-173. Franck dan Anne ME. 2000. Inulin dan Oligofruktosa. Di dalam: Glen Gibson dan Fiona Angus (eds.). Prebiotics and Probiotics. LRFA Limited, United Kingdom. -------- dan Leenher LD. 2005. Inulin. Di dalam: Steinbuchel A dan Rhee SK (eds.). Polysaccharides and Polyamides in the Food Industry Volume 1. Wiley VCH, Weinheim. Franz Z, Jane AW, dan Hanz K. 1998. Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Marcel Dekker, Inc. New York. Fuller R. 1989. Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacterial. 66: 365-378. Di dalam: Agrawal, R. 2005. Probiotics: An Emerging Food Supplement With Health Benefits. Food Biotechnology 19:227-246. Gibson GR dan Roberfroid M. 1995. Dietary modulation of human colonic microbiota – introducingthe concept of prebiotics. J. Nutr 125: 1401-1412. ---------, dan Angus F. 2000. LFRA Ingredients Handbook of Prebiotics and Probiotics. Leatherhead Food RA Publishing Limited. Gilliland SE. 1986. Role of starter culture bacteria in food preservation. Di dalam: Gilliland SE (ed.). Bacterial Starter Cultures for Food. CRC Press, Inc., Florida. Gmeiner M. 2000. Influence of symbiotic mixture consisting of Lactobacillus acidophilus 74-2 and FOS preparation on the microbial ecology sustained in asimulation of the human intestinal microbiologycal system (SHIME). J. Microbiology Biotechnology, 53:219. Gopal PK, Sullivan PA, dan Smart JB. 2001. Utilisation of galacto-oligosaccharides as selective substrates for growth by lactic acid bacteria including Bixdobacterium lactis DR10 and Lactobacillus rhamnosus DR20. J. International Diary. 11: 19-25 Golsing A, Stevens GW, Barber AR, Kenitsh SE, dan Gras SL. 2010. Recent advances refining galactooligosaccharide production from lactose. J. Food chemistry 121: 307-318. Gorski D. 1995. Fat replacement technology. J. Diary food 1: 38-39. Gyorgy P. 1973. Effect of carbohydrates on intestinal flora. Di dalam: Sipple HL dan McNutt KW (eds.). Sugars in Nutrition (pp. 101-154). Academic Press, New York. Hariyadi RD, Anjaya N, Suliantari, Nuraida L, dan Satiawihardja B. 2003. Penuntun Praktikum Teknologi Fermentasi. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi Fakultas Teknologi Pertanian IPB, Bogor. Harrigan WF. 2000. Laboratory Methods in Food Microbiology. Academic Press Publishing, Sandiego. Hartanti AW. 2007. Seleksi bakteri asam laktat yang berpotensi sebagai probiotik dari isolat air susu ibu [skripsi]. Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Hayakawa K. 1992. Classification and action of food microorganism. Di dalam: Nakazawa H dan Hosono A (eds.). Functions of Fermented Milks: Challenge for The Health Science. Elsevier Applied Science, London. New York. Helferich W. dan Westhoff DC. 1980. All About Yoghurt. Prentice Hall. Inc., New York. Hidaka H, Hirayama M, Tokunaga T, dan Eida T. 1990. The effect of undigestible fructooligosaccharides on intestinal microflora and various physicological functions on human health. Di dalam: Furda I, dan Brine CJ. (eds.). New Development in Dietary Fiber (pp. 105-117). Plenum Press, New York. Holzapfel WH. 2005. Introducing to Prebiotics and Probiotics. Di dalam: Goktepe I, Juneja VK, Ahmedna M (eds.). Probiotics in Food Safety and Human Health. Aspen Publisher, Marylen. 58 Hoover DG. 2000. Microorganism and their products in the preservation of foods. Di dalam: Lund BM, Baird-Parker TC, dan Gould GW (eds.). The Microbiologycal Safety and Quality of Food. Aspen Publisher, Marylen. Huebner J, Wehling RL, dan Hutkins RW. 2007. Functional activity of commercial prebiotics. Int. Diary Journal 17:770-775. ICMSF. 1996. Micro-organisms in Foods vol. 5. Characteristics of Microbiology. Academic Press, London. Indratingsih WS, Salasia S, dan Wahyuni E. 2004. Produksi yoghurt shiitake (Yohsitake) sebagai pangan kesehatan berbasis susu. J. Teknol. Dan Ind. Pangan Vol. XV (1): 54-60. Ito M, Deguchi Y, Miyamori A, Matsumoto K, Kikuchi H, Kobayashi Y, Yajima T, dan Kan T. 1990. Effects of administration of galactooligosaccharide on the human faecal microflora, stool weight and abdominal sensation. Microbial. Ecol. Health Dis. 3:285-292. Jay MJ. 1978. Modern Food Microbiology 2nd Edition. Van Nostrand Reinhold Company, New York. Jenie BSL. 2003. Pangan fungsional penyusun flora usus yang menguntungkan. Makalah pada Seminar Sehari Keseimbangan Flora Usus bagi Kesehatan dan Kebugaran, Bogor. Kneifel W, Sandholm TM, dan Wright AV. 1999. Probiotic Bacteria. Di dalam: Robinson RK, Batt CA, dan Patel PD (eds.). Encyclopedia of Food Microbiology III. Academic Press, London. Kosikowski F. 1982. Cheese and Fermanted Milk Foods, 3rd. Kosikowski dan Associates, New York. Krisnayudha K. 2007. Mempelajari Potensi Garut (Maranta arundiacea L.) dan Ganyong (Canna edulis, Kerr) untuk Mendukung Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat [skripsi]. Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Kurmann JA. dan Rasic JL. 1991. The health potential of products containing bifidobacteria. Di dalam: Robinson RK (ed). Therapeutic Properties of Fermented Milks. Elsevier Applied Science. Lee Y dan Wong SF. 1998. Stability of Lactic Acid Bacteria in Fermented Milk. Di dalam: Salminen S, Wright AV, dan Ouwehand A (eds.). Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspect. Marcell Dekker Inc., New York, Basel. Mahoney RR. 1998. Galactocyl-oligosaccharide formation during lactose hydrolysis: a review. J. Food Chem. 63: 147-154 Mandelstam J dan McQuillen K. 1989. Biochemistry of Bacterial Growth. Blackwell Publishing, UK. Marlis A. 2008. Isolasi Oligosakarida Ubi Jalar (Ipomoea batatas L.) dan Pengaruh Pengolahan terhadap Potensi Prebiotiknya [tesis]. Sekolah Pascasarjana. Insitut Pertanian Bogor, Bogor. Martin R, Langa S, Reviriego C, Jimenes E, Marin ML, Olivares M, Boza J, Jimenez J, Fernandez L, Xaus J, danRodriguez M. 2004. The commensal microflora of human milk: new perspective for food bacterioteraphy and probiotics. J. Trends in Food Sci. and Tech. 15:121-127. Matsumoto K, Kobayashi Y, Ueyama S, Wantabe T, Tanaka R, Kan T, Kuroda A, dan Sumihara Y. 1993. Galacto-oligosaccharides. Di dalam: Nakakuki T (ed.) Oligosaccharides Production, Properties and Application (pp. 90-106). Gordon and Breach, Jepang. Mitsuoka T, Hidaka H, dan Eida T. 1987. Effect of fructooligosaccharides on intestinal microflora. Die Nahrung 31: 427. Molina DL, Navarro-Martinez MD, Melgarejo FR, Hiner ANP, Chazarra S, dan Rodriguez-Lopez JN. 2005. Molecular properties and prebiotic effect of inulin obtained from arthicoke (Cynara scolymus L.). Phytocemistry 66: 1476-1484. Moro G, Minoli I, Mosca M, Fanaro S, Jelinek J, Stahl B and Boehm G. 2002. Dosage –related bifidogenic effects of galacto and fructo-oligosaccharides in formula-fed term infants, J. Pediatric Gastroenterol Nutr. 34:291-295. 59 Moyano SR, Martin A, Benito MJ, Nevado FP, dan Cordoba MDG. 2008. Screening of lactic acid bacteria and bifidobacteriafor potencial probiotic use in lberian dry fermented sausage. J. Meat Sci. 80:715-721. Musatto SI dan Mancilha IM. 2007. Non-digestible oligosaccharide: A review. J. Carbohydrate Polymer 68: 587-597. Nakamura T, Ogata Y, Shitasa A, Nakamura A and Ohta K. 1995. Continuous production of fructose syrups from inulin by immobilized inulinase from Aspergillus niger Mutan 817. J. of Fermentation and Bioeng. 80(2): 164-169. Newburg DS dan Neubauer SH. 1995. Carbohydrate in milk: Analysis, quantities and significance. Di dalam: RG. Jensen (ed.). Handbook of Milk Composition (pp. 273-338). Academic Press, New York. Niness KR. Inulin and oligofructose: What are they?. J. Nutrition 129: 1402-1406. Nousiainen J, Javanainen P, dan Setala J. 2004. Lactic acid bacteria as animal probiotics. Di dalam: Salminen S, Wright AV, dan Ouwehand A (eds.). Lactic Acid Bacteria Microbiological and Functional Aspects 3rd Edition. Marcel Dekker, Inc., New York. Nuraida L, Susanti, dan Hartanti AW. 2007. Lactic acid bacteria and Bifidobacteria profile of breast milk and their potency as probiotics. 10th ASEAN Food Conference. Food for MankindContribution of Science and Technology. 21-23 August. Kuala Lumpur, Malaysia. ----------, dan Hartanti AW. 2009. Petency to metabolise prebiotics by lactic acid bacteria of breast milk. 11th ASEAN Food Conference. Food for Mankind-Contribution of Science and Technology. 21-23 October. Bandar Seri Begawan, Brunei Darussalam. Oberman H. dan Libudzisz Z. 1985. Fermented Milk. Di dalam: Wood BJB (ed.). 1988. Microbiology of Fermented Foods Volume I. Blackie Academic Elsevier Sci. Publ. Ltd., London and Professional, London. Pennachia C, Vaughan EE, dan Villani F. 2006. Potencial probiotic Lactobacillus strains from fermented sausage: further investigations on their probiotic properties. J. Meat Sci. 73: 90101. Ray B. 2001. Fundamental Food Microbiology 2nd edition. CRC Press, New York. Roberfroid MB, Van Loo JAE, dan Gibson GR. 1998. The bifidogenic nature of chicory inulin and its hydrolysis product. J. Nutr. 128: 11-19. ----------. 1999. Concepts in functional foods: the case of inulin and oligofructose. J. Nutr. 129: 13981401. ----------. 2000. Prebiotics and probiotics: are they functional foods?. Am. J. Clin Nutr. 71: 1682-1687. ----------. 2008. Handbook of Prebiotics. CRC Press, Boca Raton, London, New York. Rolfe RD. 2000. The role of probiotic culture in the control of gastrointestinal health. In symposium: Probiotic Bacteria: Implication for Human Health. American Society for Nutritional Science. Rouzaud GCM. 2007. Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics: Functional Ingredients for Microbial Management Strategies. Di dalam: Biliadries CG dan Izydorczyk MS (eds.). Functional Food Carbohydrates. CRC Press, Boca Raton. Salminen S. dan Wright AV. 1998. Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects 2nd Edition, Revised and Expanded. Marcel Dekker, Inc., New York. ----------, Wright AV, dan Ouwehand A. 2004. Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects 3th Edition, Revised and Expanded. Marcel Dekker, Inc., New York. ---------- dan Yuan Kun Lee. 2009. Handbook of Probiotics and Prebiotics 2nd Edition. John Wiley and Sons, Inc., Hoboken, New Jersey. Saryono, Is Sulistiyati P, Zul D, dan Martina A. 1999. Identifikasi jamur pendegradasi inulin pada rizosfir umbi dahlia (Dahlia variabilis). J. Natur Indonesia. 11: 22-27. 60 SCF (Scientific Committee on Food). 2001a. Statement on the use of resistant short chain carbohydrates (oligofructose and oligogalactose) in infant formulae and in follow-on formulae. Opinion expressed on 26 September 2001. SCF (Scientific Committee on Food). 2001b. Additional statement on the use of resistant short chain carbohydrates (oligofructosyl-saccharose and oligogalactosyl-lactose) in infant formulae and in follow-on formulae. Opinion expressed on 13 December 2001. Shin HS, Lee JH, Pestka JJ, dan Ustunol Z. 2000. Growth and viability of commercial Bifidobacterium spp in skim milk containing oligosaccharides and inulin. J. Food sci. 5: 884887. Shin SY, Klienbenstein J, Hayes DJ, dan Shorgen JP. 1992. Consumer willingnes to pay safer products. J. Food Safety 13 (1). Shortt C, Shaw D, dan Mazza G. 2004. Overview of opportunities for healthenhancing functional dairy products. Di dalam: Shortt C dan O'Brien J (eds.). Handbook of functional dairy products (pp. 1−12). CRC Press, Boca Raton. Siregar. 2004. Air susu ibu. http://www.foodsci.uoguelph.ca/asi.php. [21 September 2010]. Suhardjo. 1992. Pemberian Makanan Pada Bayi dan Anak. Kanisius, Yogyakarta. Surono IS. 2004. Probiotik Susu Fermentasi dan Kesehatan. YAPMMI, Jakarta. Takeda Y, Hanashiro M. 2003. Examination of the structure of amylase and amylo-pectin by fluorescent labeling terminal. J. Applied Glyco-science. 48: 123-130. Taniguchi H. 2005. Carbohydrate active enzymes for the production of oligosaccharides. Di dalam: Hou CT (ed.). Handbook of industrial biocatalysis (pp. 20-1–20-23). CRC Press, Boca Raton. Todar K. 2009. Lactic Acid Bacteria. http://textbookofbacteriology.net/lactics_2.html [25 Oktober 2010]. Trenev N. 2000. Probiotics: Natural Internal Healers. www.scdiet.org [22 Mei 2010] Van den Broek LAM. dan Alpohn GJV. 2008. Bifidobacterium glycoside hydrolases and (potentian) prebiotics. J. Innovative Food Science and Emerging Technologies 9:401-407. Veereman G. 2007. Pediatric Applications of inulin and oligofructose. J. Nutr. 137:2585S-2589S. Villaluenga CM, Cobas AC, Corzo N, dan Olano A. 2008. Study of galactooligisaccharide composition in commercial fermented milks. J. Food Composition and Analysis 21: 540-544. Wallenfels K. 1951. Enzymatische synthese Naturwissenschaften. 38(13): 306. von oligosacchariden aus disacchariden. Widdel F. 2007. Theory and measurement of bacterial growth. Di dalam: Grundpraktikum Mikrobiologie, 4. Sem. (B. Sc) Universitat Bremen. Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. WHO/FAO (2001). Health and Nutritional Properties of Probiotic in Food Including Powder Milk with Lactic Acid Bacteria. Report of a joint FAO/WHO expert consultation. Geneva : World Health Worthington dan Roberts. 1993. Immunology. Pergamon Press, New York. Yoon MY dan Hwang HJ. 2008. Reduction of soybean oligosaccharides and properties of α-Dgalactosidase from L. curvatus R08 and L. mesenteriodes JK55. J. Food Microbiology, 25:815-823. Yuguchi H, Goto T, dan Okonogi S. 1992. Fermented Milks, Lactid Drinks, and Intestinal Microflora. Di dalam: Nakazawa Y dan Hosono A (eds.). Functions of Fermented Milks: Challenge for The Health Science. Elsevier Applied Science, London, New York. 61 LAMPIRAN Lampiran 1. Hasil Pewarnaan Gram BAL isolat ASI LactobacillusA22 Lactobacillus A23 Lactobacillus B16 Lactobacillus R14 Lactobacillus R21 Lactobacillus R23 Lactobacillus R23H Lampiran 2. Bahan-bahan dan prosedur pembuatan media berbasis MRSB Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam pembuatan media berbasis MRSB (sebanyak 1 liter), adalah: Na-asetat 5 gram 2 gram K2HPO4.3H2O 0.2 gram MgSO4.7H2O MnSO4.4H2O 0.05 gram Tween 80 1 gram Protease peptone 10 gram Yeast ekstrak 5 gram Akuades 1 liter Bahan-bahan tersebut dicampur dalam erlenmeyer 1 L (kecuali mineral yaitu K2HPO4.3H2O, MgSO4.7H2O, dan MnSO4.4H2O) dan diaduk menggunakan magnetic stirrer selama 1 jam hingga larut. Selanjutnya pH media diatur dengan menggunakan HCl dan NaOH hingga mencapai 6.4-6.6 dan disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Mineral dibuat terpisah dengan membuat larutan stok yang memiliki konsentrasi 100 x konsentrasi awal media. Selanjutnya mineral disterilkan terpisah. Penambahan mineral dilakukan pada saat uji pertumbuhan media berbasis MRSB akan dimulai. Mineral yang ditambahkan sebanyak 0.01 ml ke dalam tabung berisi 9 ml media. 63 Lampiran 3. Pembuatan larutan untuk analisis gula pereduksi A. Pembuatan larutan buffer sodium karbonat-sodium hidrogen karbonat (Larutan A) Bahan-bahan yang diperlukan dalam membuat larutan ini adalah: 4.8 g Na2CO3 NaHCO3 9.2 g 0.65 g KCN Akuades 1L Bahan-bahan tersebut dicampur kemudian dilarutkan dalam 1 L akuades dan diaduk dengan menggunakan magnetik stirrer sampai larut. Larutan sebanyak 0.5 ml ditambahkan pada sampel saat proses analisis gula pereduksi dimulai. B. Pembuatan larutan potassium fericianida 0.1% (Larutan B) Bahan-bahan yang diperlukan dalam membuat larutan ini adalah: Potassium fericianida 1g Akuades 1L Dibuat larutan potassium fericianida 0.1% dengan cara melarutkan 1 g potassium fericianida ke dalam 1 L akuades. C. Pembuatan larutan feric ammonium sulfat (Larutan C) Bahan-bahan yang diperlukan dalam membuat larutan ini adalah: 3g NH4Fe(SO3)4.2H2O 2.84 ml H2SO4 pekat Akuades 1L Dibuat larutan H2SO4 50mM dengan cara mengencerkannya dengan akuades sebanyak 1 L. Selanjutnya 1 L larutan 50 mM H2SO4 tersebut dicampurkan dengan 3 g NH4Fe(SO3)4.2H2O. Sebanyak 2.5 ml larutan ini ditambahkan ke dalam sampel pada tahap analisis gula pereduksi. Lampiran 4. Prosedur standardisasi NaOH Standardisasi NaOH dilakukan dengan menggunakan larutan asam potasium phtalate (KHP). Sebelumnya 0.8 g KHP dilarutkan dengan 50 ml akuades di dalam erlenmeyer. Selanjutnya dilakukan titrasi dengan terlebih dahulu menambahkan 3 tetes indikator PP. Volume NaOH yang dibutuhkan untuk titrasi dimasukkan ke dalam rumus sehingga normalitas NaOH yang sebenarnya dapat diketahui. N NaOH = Keterangan: N NaOH W KHP BM KHP V NaOH : W KHP BM KHP x V NaOH : Normalitas NaOH (N) : Bobot KHP (204.228 g/mol) : Bobot Molekul KHP (g) Volume NaOH sebagai titran (ml) 64 Lampiran 5. Data hasil hitungan cawan pertumbuhan BAL isolat ASI pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik No Isolat B16 R23H R14 A23 Jenis gula Kontrol FOS GOS Inulin FOS:GOS (1:9) Inulin:GOS (1:9) Kontrol FOS GOS Inulin FOS:GOS (1:9) Inulin:GOS (1:9) Kontrol FOS GOS Inulin FOS:GOS (1:9) Inulin:GOS (1:9) Kontrol FOS GOS Inulin FOS:GOS (1:9) Inulin:GOS (1:9) Duplo 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 Ulangan 1 Hitungan cawan (24 jam) Jumlah BAL 10-6 10-7 10-8 cfu/ml 273/280 TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB 20/142 TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB 40/32 TB/TB TB/TB 113/210 TB/TB TB/TB 10/16 TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB 70/59 TB/TB TB/TB 125/169 TB/TB TB/TB 161/119 TB/TB 249/TB TB/TB TB/204 197/198 4/1 38/132 93/73 31/31 98/143 150/131 1/1 110/125 80/74 35/24 171/139 92/86 7/8 106/109 66/76 21/19 91/74 55/1 11/12 68/53 44/40 67/27 29/0 18/13 3.6 x 108 8.5 x 109 8.3 x 109 1.8 x 109 1.2 x 1010 1.4 x 1010 1.4 x 108 1.2 x 1010 7.7 x 109 3.5 x 109 1.6 x 1010 8.9 x 109 6.4 x 108 1.1 x 1010 7.1 x 109 1.5 x 109 8.2 x 109 5.5 x 109 1.4 x 109 6.1 x 109 2.8 x 109 4.7 x 109 2.1 x 109 2.0 x 109 log cfu/ml 1.4 1.4 0.7 1.5 1.6 1.9 1.7 1.4 2.0 1.8 1.2 1.0 0.4 1.1 0.9 0.6 0.3 0.5 0.2 0.2 Ulangan 2 Hitungan cawan (24 jam) Jumlah BAL 10-6 10-7 10-8 cfu/ml 161/163 TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB 179/158 TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB 6/144 TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB 26/29 210/219 142/174 89/83 249/221 TB/TB 15/25 TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB 14/11 TB/TB TB/TB 67/40 111/94 105/101 182/150 TB/230 TB/211 106/79 231/TB 195/144 1/2 14/5 20/15 10/0 23/14 31/1 6/2 78/99 88/108 34/22 46/69 89/81 1/1 47/42 74/67 9/2 9/7 11/9 16/13 16/52 20/32 11/29 17/36 30/34 1.7 x 108 2.1 x 109 1.6 x 109 8.6 x 108 2.4 x 109 3.4 x 109 1.7 x 108 8.8 x 109 9.8 x 109 3.4 x 109 5.8 x 109 8.5 x 109 1.4 x 108 4.4 x 109 7.0 x 109 5.4 x 108 1.0 x 109 1.0 x 109 1.7 x 109 2.7 x 109 2.2 x 109 1.0 x 109 2.4 x 109 1.8 x 109 log cfu/ml 1.1 1.0 0.7 1.1 1.3 1.7 1.8 1.3 1.5 1.7 1.5 1.7 0.6 0.8 0.8 0.2 0.1 -0.2 0.2 0 Rerata log cfu/ml 1.3 1.2 0.7 1.3 1.5 1.8 1.8 1.4 1.8 1.8 1.4 1.4 0.5 1.0 0.9 0.4 0.2 0.3 0.2 0.1 65 Lanjutan Lampiran 5. Data hasil hitungan cawan pertumbuhan BAL isolat ASI pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik No Isolat R21 A22 R23 Jenis gula Kontrol FOS GOS Inulin FOS:GOS (1:9) Inulin:GOS (1:9) Kontrol FOS GOS Inulin FOS:GOS (1:9) Inulin:GOS (1:9) Kontrol FOS GOS Inulin FOS:GOS (1:9) Inulin:GOS (1:9) Duplo 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 Ulangan 1 Hitungan cawan (24 jam) Jumlah BAL 10-6 10-7 10-8 cfu/ml 247/228 TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB 244/243 TB/TB TB/TB TB/235 TB/213 TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB 37/31 TB/203 62/81 30/34 56/TB TB/TB 26/0 161/129 80/76 17/22 99/76 57/64 54/45 TB/TB TB/TB 196/209 TB/TB TB/TB 3/5 39/52 13/14 2/3 7/10 29/44 4/0 33/42 11/11 1/2 13/63 8/8 4/5 78/16 85/85 34/27 119/117 75/58 2.5 x 108 2.4 x 109 7.2 x 108 3.2 x 108 5.6 x 108 3.6 x 109 2.4 x 108 1.6 x 109 7.8 x 108 2.3 x 108 1.1 x 109 6.0 x 108 5.0 x 108 7.8 x 109 8.5 x 109 2.1 x 109 1.2 x 1010 6.7 x 109 log cfu/ml 1.0 0.4 0.1 0.4 1.2 0.8 0.5 0 0.7 0.4 1.2 1.2 0.6 1.4 1.1 Ulangan 2 Hitungan cawan (24 jam) Jumlah BAL 10-6 10-7 10-8 cfu/ml TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/248 TB/TB 235/245 209/230 TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB 55/38 TB/TB 14/62 147/187 239/247 TB/TB 94/77 194/185 46/37 26/22 97/141 80/59 70/99 TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB TB/TB 5/9 36/62 3/9 0/14 0/26 36/29 3/5 32/28 7/3 7/5 7/38 10/5 10/6 68/49 85/85 47/48 77/81 78/102 4.6 x 108 4.9 x 109 6.2 x 108 1.7 x 109 2.4 x 109 3.2 x 109 3.5 x 108 2.0 x 109 2.6 x 108 2.2 x 108 1.3 x 109 7 x 108 8.5 x 108 5.9 x 109 8.5 x 109 4.8 x 109 7.9 x 109 9 x 109 log cfu/ml 1.0 0.1 0.6 0.7 0.8 0.8 -0.1 -0.2 0.6 0.3 0.8 1.0 0.7 1.0 1.0 Rerata log cfu/ml 1.0 0.3 0.4 0.6 1.0 0.8 0.3 0 0.7 0.4 1.0 1.1 0.7 1.2 1.1 66 Lampiran 6. Hasil analisis statistik pertumbuhan BAL isolat ASI pada media MRS basic dengan penamabahan prebiotik Between-Subjects Factors BAL JENIS_GU 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 Value Label B16 R23 R14 A23 R21 A22 R23.1 Fos gos inulin fos+gos inulin+gos N 10 10 10 10 10 10 10 14 14 14 14 14 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: LOG_TERH Source Corrected Model Intercept BAL JENIS_GU Error Total Corrected Total Type III Sum of Squares 16.928a 53.681 14.646 2.282 3.581 74.190 20.509 df 10 1 6 4 59 70 69 Mean Square 1.693 53.681 2.441 .571 .061 F 27.893 884.515 40.220 9.401 Sig. .000 .000 .000 .000 a. R Squared = .825 (Adjusted R Squared = .796) 67 Lanjutan Lampiran 6. Hasil analisis statistik pertumbuhan BAL isolat ASI pada media MRS basic dengan penamabahan prebiotik Post Hoc Tests BAL Homogeneous Subsets LOG_TERH Duncan a,b Subset BAL A23 A22 R21 R23.1 R14 B16 R23 Sig. N 1 .2300 .4100 10 10 10 10 10 10 10 2 3 4 .4100 .6300 1.0000 1.0000 1.1800 .108 .050 .128 1.6800 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = .061. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 10.000. b. Alpha = .05. JENIS_GULA Homogeneous Subsets LOG_TERH Duncan a,b JENIS_GU inulin gos inulin+gos fos+gos Fos Sig. N 14 14 14 14 14 1 .5429 Subset 2 .8714 .9357 .9429 1.000 .475 3 .9357 .9429 1.0857 .133 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = .061. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 14.000. b. Alpha = .05. 68 Lampiran 7. Nilai OD Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Perlakuan Kontrol FOS GOS Waktu Duplo 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 Ulangan 1 OD terukur 0.060/0.058 0.076/0.075 0.240/0.225 0.347/0.350 0.394/0.396 0.408/0.408 0.414/0.420 0.730/0.720 0.120/0.120 0.158/0.159 0.253/0.256 0.319/0.318 0.466/0.468 0.466/0.466 0.626/0.624 0.650/0.652 0.081/0.083 0.155/0.155 0.267/0.270 0.258/0.257 0.825/0.825 0.708/0.704 1.085/1.090 0.265/0.264 FP 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2.5 5 10 10 14 1 1 1 5 5 10 10 45.5 Ulangan 2 OD terhitung 0.059 0.076 0.232 0.348 0.395 0.408 0.417 0.725 0.120 0.158 0.254 0.796 2.335 4.660 6.250 9.114 0.082 0.155 0.268 1.288 4.125 7.060 10.875 12.035 OD terukur 0.059/0.058 0.070/0.074 0.244/0.239 0.365/0.390 0.390/0.386 0.408/0.404 0.410/0.416 0.730/0.720 0.116/0.116 0.159/0.158 0.370/0.365 0.337/0.331 0.514/0.524 0.464/0.456 0.612/0.608 0.648/0.646 0.107/0.107 0.195/0.196 0.338/0.335 0.295/0.298 0.855/0.845 0.730/0.730 1.120/1.110 0.277/0.277 FP 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2.5 5 10 10 14 1 1 1 5 5 10 10 45.5 OD terhitung 0.058 0.072 0.242 0.366 0.388 0.406 0.413 0.725 0.116 0.158 0.368 0.835 2.595 4.600 6.100 9.058 0.107 0.196 0.336 1.482 4.250 7.300 11.150 12.604 OD rata-rata 0.058 0.074 0.237 0.357 0.392 0.407 0.415 0.725 0.118 0.158 0.311 0.816 2.465 4.630 6.175 9.086 0.094 0.176 0.302 1.385 4.188 7.180 11.012 12.320 69 Lanjutan Lampiran 7. Nilai OD Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Perlakuan Inulin FOS: GOS (1:9) Inulin: GOS (1:9) Waktu Duplo 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 Ulangan 1 OD terukur 0.130/0.136 0.194/0.197 0.332/0.330 0.293/0.294 0.219/0.222 0.114/0.102 0.130/0.132 0.756/0.750 0.088/0.086 0.163/0.160 0.308/0.314 0.316/0.323 0.860/0.865 0.748/0.738 1.105/1.105 0.266/0.268 0.082/0.084 0.145/0.145 0.208/0.208 0.356/0.358 0.900/0.900 0.742/0.752 0.977/0.975 0.272/0.272 FP 1 1 1 2.5 5 10 10 10 1 1 1 5 5 10 10 45.5 1 1 1 5 5 10 10 45.5 Ulangan 2 OD tehitung 0.133 0.196 0.331 0.734 1.102 1.080 1.310 7.530 0.087 0.162 0.311 1.598 4.312 7.430 11.050 12.148 0.083 0.145 0.208 1.785 4.500 7.470 9.760 12.376 OD terukur 0.131/0.132 0.173/0.162 0.307/0.293 0.269/0.257 0.198/0.193 0.107/0.114 0.133/0.144 0.750/0.756 0.088/0.093 0.160/0.158 0.321/0.320 0.315/0.311 0.900/0.900 0.775/0.765 1.100/1.100 0.265/0.268 0.084/0.082 0.132/0.132 0.204/0.204 0.268/0.268 0.804/0.804 0.780/0.780 0.980/0.985 0.225/0.223 FP 1 1 1 2.5 5 10 10 10 1 1 1 5 5 10 10 45.5 1 1 1 5 5 10 10 45.5 OD terhitung 0.132 0.168 0.300 0.658 0.978 1.105 1.385 7.530 0.090 0.159 0.320 1.565 4.500 7.700 11.000 12.126 0.083 0.132 0.204 1.340 4.020 7.800 9.825 10.192 OD rata-rata 0.132 0.182 0.316 0.696 1.040 1.092 1.348 7.530 0.088 0.160 0.316 1.582 4.406 7.565 11.025 12.137 0.083 0.138 0.206 1.562 4.260 7.635 9.792 11.284 70 Lampiran 8. Nilai OD Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Perlakuan Kontrol FOS GOS Waktu Duplo 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 Ulangan 1 Ulangan 2 OD terukur FP OD terhitung OD terukur FP OD terhitung OD rata-rata 0.084/0.082 0.183/0.182 0.209/0.213 0.284/0.287 0.363/0.365 0.357/0.357 0.345/0.345 0.357/0.357 0.061/0.065 0.142/0.146 0.408/0.416 0.576/0.580 0.620/0.614 0.935/0.930 0.915/0.915 0.240/0.227 0.079/0.079 0.120/0.120 0.187/0.183 0.126/0.133 0.182/0.180 0.332/0.327 0.364/0.359 1.340/1.310 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5 10 10 10 50 1 1 1 1.67 5 10 10 10 0.083 0.182 0.211 0.286 0.364 0.357 0.345 0.357 0.063 0.144 0.412 2.890 6.170 9.325 9.150 11.675 0.079 0.120 0.185 0.217 0.905 3.295 3.615 13.250 0.081/0.075 0.117/0.115 0.428/0.418 0.536/0.540 0.518/0.518 0.845/0.835 0.900/0.895 0.243/0.241 0.086/0.089 0.133/0.139 0.225/0.220 0.182/0.181 0.270/0.266 0.342/0.343 0.365/0.364 1.380/1.340 1 1 1 5 10 10 10 50 1 1 1 1.67 5 10 10 10 0.078 0.116 0.423 2.690 5.180 8.385 8.975 12.100 0.088 0.136 0.222 0.303 1.340 3.425 3.645 13.600 0.083 0.182 0.211 0.286 0.364 0.357 0.345 0.357 0.070 0.130 0.418 2.790 5.675 8.855 9.062 11.888 0.084 0.128 0.204 0.260 1.122 3.360 3.630 13.425 71 Lanjutan Lampiran 8. Nilai OD Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Perlakuan Inulin FOS: GOS (1:9) Inulin: GOS (1:9) Waktu Duplo 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 Ulangan 1 OD terukur 0.052/0.056 0.123/0.124 0.269/0.274 0.348/0.347 0.152/0.151 0.126/0.129 0.194/0.196 0.149/0.152 0.084/0.088 0.141/0.137 0.240/0.247 0.278/0.277 0.640/0.636 0.392/0.392 0.552/0.546 1.240/1.240 0.093/0.091 0.137/0.136 0.245/0.243 0.255/0.254 0.532/0.540 0.333/0.328 0.430/0.422 1.230/1.230 FP 1 1 1 5 10 10 10 50 1 1 1 1.67 5 10 10 10 1 1 1 1.67 5 10 10 10 Ulangan 2 OD terhitung 0.054 0.124 0.272 1.738 1.515 1.275 1.950 7.525 0.086 0.139 0.244 0.463 3.190 3.920 5.490 12.400 0.092 0.136 0.244 0.425 2.680 3.305 4.260 12.300 OD terukur 0.064/0.060 0.084/0.087 0.315/0.314 0.346/0.346 0.146/0.152 0.126/0.129 0.446/0.446 0.149/0.154 0.084/0.083 0.107/0.107 0.224/0.214 0.227/0.222 0.534/0.530 0.366/0.366 0.454/0.450 1.080/1.070 0.049 0.064 0.155 0.228 0.526 0.335 0.432 1.175 FP 1 1 1 5 10 10 5 50 1 1 1 1.67 5 10 10 10 1 1 1 1.67 5 10 10 10 OD terhitung 0.062 0.086 0.314 1.730 1.490 1.275 2.230 7.575 0.084 0.107 0.219 0.375 2.660 3.660 4.520 10.750 0.050 0.068 0.155 0.374 2.625 3.335 4.300 11.700 OD rata-rata 0.058 0.105 0.293 1.734 1.502 1.275 2.090 7.550 0.085 0.123 0.232 0.419 2.925 3.790 5.005 11.575 0.071 0.102 0.200 0.400 2.652 3.320 4.280 12.000 72 Lampiran 9. Nilai pH Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik No. Jenis Gula 1. Kontrol 2. FOS 3. GOS 4. Inulin 5. FOS:GOS (1:9) 6. Inulin:GOS (1:9) Ulangan 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 0 7.31 7.35 7.18 7.26 7.05 6.91 7.34 7.27 7.10 7.11 7.03 7.08 2 7.00 7.00 6.92 7.00 6.85 6.76 6.98 7.06 6.87 6.89 6.81 6.87 4 6.97 6.94 6.77 6.85 6.49 6.47 6.78 6.87 6.54 6.55 6.44 6.52 Nilai pH Jam ke6 8 6.85 6.78 6.83 6.78 6.02 4.87 6.16 4.95 5.98 4.96 5.82 4.92 6.01 5.46 6.20 5.50 5.78 4.91 5.81 4.95 5.76 4.90 5.85 4.98 10 6.83 6.83 4.51 4.55 4.40 4.40 5.47 5.52 4.40 4.41 4.40 4.44 12 6.72 6.72 4.24 4.28 4.28 4.21 5.43 5.48 4.16 4.20 4.19 4.19 24 6.81 6.82 3.88 3.89 3.85 3.83 5.39 5.43 3.83 3.88 3.83 3.81 Lampiran 10. Nilai pH Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik No. Jenis Gula 1. Kontrol 2. FOS 3. GOS 4. Inulin 5. FOS:GOS (1:9) 6. Inulin:GOS (1:9) Ulangan 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 0 7.26 7.26 7.19 7.20 7.15 7.11 7.20 7.20 7.08 7.16 7.09 7.03 2 6.91 6.91 6.84 6.88 7.07 7.04 6.88 6.93 6.99 7.05 6.98 6.86 4 6.92 6.92 6.39 6.43 6.97 7.00 6.63 6.63 6.89 6.99 6.81 6.78 Nilai pH Jam ke6 8 7.04 7.02 7.04 7.02 5.25 4.67 5.28 4.72 6.70 6.25 6.58 5.94 5.79 5.57 5.74 5.63 6.17 5.22 6.43 5.41 6.31 5.39 6.21 5.33 10 6.98 6.98 4.29 4.31 4.97 4.88 5.47 5.54 4.56 4.65 4.69 4.76 12 7.01 7.01 4.28 4.27 4.53 4.59 5.47 5.53 4.44 4.50 4.60 4.58 24 7.04 7.04 4.20 4.13 4.44 4.43 5.07 5.13 4.17 4.20 4.18 4.25 73 Lampiran 11. Nilai TAT (% asam laktat) Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik No. Jenis Gula 1. Kontrol 2. FOS 3. GOS 4. Inulin 5. FOS:GOS (1:9) 6. Inulin:GOS (1:9) Ulangan 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 0 0.21 0.21 0.21 0.17 0.25 0.25 0.21 0.21 0.21 0.21 0.23 0.23 2 0.25 0.25 0.25 0.21 0.25 0.25 0.25 0.25 0.23 0.25 0.25 0.25 Nilai % Asam Laktat Jam ke4 6 8 10 0.25 0.30 0.25 0.30 0.25 0.30 0.25 0.30 0.30 0.38 0.68 0.89 0.30 0.38 0.68 0.85 0.30 0.38 0.51 0.76 0.30 0.38 0.51 0.76 0.25 0.38 0.42 0.44 0.25 0.38 0.42 0.44 0.28 0.44 0.57 0.85 0.30 0.42 0.59 0.85 0.30 0.42 0.57 0.85 0.28 0.42 0.55 0.78 12 0.25 0.25 1.02 1.06 0.93 0.93 0.47 0.47 0.93 1.10 1.02 1.02 24 0.25 0.25 1.78 1.74 1.95 1.95 0.51 0.51 1.95 1.78 2.03 1.95 Lampiran 12. Nilai TAT (% asam laktat) Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik No. Jenis Gula 1. Kontrol 2. FOS 3. GOS 4. Inulin 5. FOS:GOS (1:9) 6. Inulin:GOS (1:9) Ulangan 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 0 0.25 0.25 0.25 0.25 0.17 0.17 0.25 0.25 0.17 0.17 0.17 0.17 2 0.17 0.17 0.25 0.25 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 Nilai % Asam Laktat Jam ke4 6 8 10 0.25 0.21 0.21 0.21 0.25 0.21 0.21 0.21 0.30 0.51 0.93 1.06 0.30 0.51 0.93 1.06 0.21 0.25 0.38 0.64 0.21 0.25 0.38 0.68 0.25 0.34 0.42 0.42 0.25 0.38 0.42 0.42 0.25 0.30 0.59 0.89 0.21 0.30 0.59 0.89 0.21 0.30 0.59 0.68 0.21 0.30 0.59 0.68 12 0.21 0.21 0.97 0.97 0.85 0.85 0.38 0.38 0.89 0.89 0.76 0.76 24 0.21 0.21 1.44 1.44 1.52 1.52 0.59 0.55 1.48 1.48 1.44 1.44 74 Lampiran 13. Kurva standar glukosa A. Kurva standar glukosa untuk total gula 1,2 y = 0,021x - 0,018 R² = 0,992 1,0 Absorbansi 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 0 10 20 30 40 50 60 Konsentrasi (ppm) B. Kurva standar glukosa untuk gula pereduksi 1,2 y = 0,280x - 0,026 R² = 0,996 Absorbansi 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 Konsentrasi (ppm) 75 Lampiran 14. Data total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Jenis Gula Waktu (jam) FOS 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 GOS Inulin Ulangan 1 A1 A2 0.845 0.774 0.738 0.700 0.670 0.594 0.578 0.490 0.855 0.750 0.708 0.692 0.558 0.470 0.408 0.336 0.835 0.784 0.662 0.646 0.638 0.614 0.606 0.598 0.845 0.782 0.730 0.702 0.672 0.596 0.576 0.498 0.850 0.752 0.708 0.686 0.550 0.464 0.410 0.337 0.835 0.784 0.662 0.646 0.638 0.614 0.606 0.598 A Rerata 0.845 0.778 0.734 0.701 0.671 0.595 0.577 0.494 0.853 0.751 0.708 0.689 0.554 0.467 0.409 0.337 0.835 0.784 0.662 0.646 0.638 0.614 0.606 0.598 Ulangan 2 Total Gula (%) 4.52 4.17 3.94 3.77 3.61 3.21 3.12 2.69 4.56 4.03 3.81 3.71 3.00 2.54 2.24 1.86 4.47 4.20 3.57 3.48 3.44 3.31 3.27 3.23 A1 A2 0.835 0.624 0.532 0.478 0.466 0.458 0.404 0.382 0.918 0.815 0.792 0.691 0.527 0.505 0.431 0.282 0.835 0.786 0.660 0.648 0.639 0.615 0.606 0.596 0.840 0.622 0.534 0.478 0.460 0.458 0.408 0.384 0.918 0.815 0.792 0.691 0.527 0.505 0.431 0.282 0.835 0.786 0.660 0.648 0.639 0.615 0.606 0.596 A Rerata 0.838 0.623 0.533 0.478 0.463 0.458 0.406 0.383 0.918 0.815 0.792 0.691 0.527 0.505 0.431 0.282 0.835 0.786 0.660 0.648 0.639 0.615 0.606 0.596 Total Gula (%) 4.48 3.36 2.89 2.60 2.52 2.50 2.22 2.10 4.91 4.37 4.25 3.72 2.86 2.74 2.35 1.57 4.47 4.22 3.56 3.49 3.45 3.32 3.27 3.22 Rerata Total Gula (%) 4.50 3.77 3.42 3.19 3.07 2.86 2.67 2.39 4.73 4.20 4.03 3.71 2.93 2.64 2.30 1.72 4.47 4.21 3.56 3.49 3.44 3.32 3.27 3.23 76 Lanjutan Lampiran 14. Data total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Jenis gula Waktu (jam) FOS: GOS (1:9) 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 Inulin: GOS (1:9) Ulangan 1 A1 A2 0.808 0.734 0.724 0.656 0.588 0.574 0.535 0.526 0.905 0.903 0.836 0.813 0.749 0.630 0.576 0.532 0.808 0.734 0.724 0.656 0.588 0.574 0.535 0.526 0.905 0.903 0.836 0.813 0.749 0.630 0.576 0.532 A Rerata 0.808 0.734 0.724 0.656 0.588 0.574 0.535 0.526 0.905 0.903 0.836 0.813 0.749 0.630 0.576 0.532 Ulangan 2 Total Gula (%) 4.33 3.94 3.89 3.53 3.18 3.10 2.90 2.85 4.84 4.83 4.48 4.36 4.02 3.40 3.12 2.88 A1 A2 0.792 0.734 0.722 0.654 0.588 0.578 0.532 0.523 0.934 0.926 0.813 0.794 0.744 0.628 0.576 0.555 0.792 0.734 0.722 0.654 0.588 0.578 0.532 0.523 0.934 0.926 0.813 0.794 0.744 0.628 0.576 0.555 A Rerata 0.792 0.734 0.722 0.654 0.588 0.578 0.532 0.523 0.934 0.926 0.813 0.794 0.744 0.628 0.576 0.555 Total Gula (%) 4.25 3.94 3.88 3.52 3.18 3.13 2.88 2.84 4.99 4.95 4.36 4.26 3.99 3.39 3.11 3.00 Rerata Total Gula (%) 4.29 3.94 3.89 3.53 3.18 3.12 2.89 2.85 4.91 4.89 4.42 4.31 4.01 3.39 3.11 2.94 Total gula (%) = [(hasil perhitungan dengan persamaan reaksi) x FP] 104 FP = 1.1 x 103 77 Lampiran 15. Data total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Jenis Gula Waktu (jam) FOS 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 GOS Inulin Ulangan 1 A1 A2 0.885 0.855 0.805 0.792 0.596 0.572 0.454 0.204 0.875 0.830 0.750 0.722 0.572 0.374 0.356 0.132 1.020 0.910 0.775 0.755 0.725 0.700 0.680 0.675 0.890 0.845 0.802 0.788 0.588 0.574 0.452 0.205 0.865 0.840 0.750 0.724 0.572 0.374 0.349 0.132 1.010 0.910 0.775 0.755 0.725 0.700 0.680 0.675 A Rerata 0.888 0.850 0.804 0.790 0.592 0.573 0.453 0.205 0.870 0.835 0.750 0.723 0.572 0.374 0.353 0.132 1.015 0.910 0.775 0.755 0.725 0.700 0.680 0.675 Ulangan 2 Total Gula (%) 4.75 4.55 4.31 4.24 3.20 3.10 2.47 1.17 4.66 4.47 4.03 3.89 3.09 2.06 1.94 0.78 5.41 4.86 4.16 4.05 3.90 3.76 3.66 3.63 A1 A2 0.815 0.770 0.789 0.792 0.596 0.572 0.396 0.217 0.875 0.830 0.750 0.722 0.576 0.373 0.356 0.129 1.020 0.910 0.780 0.750 0.720 0.695 0.690 0.675 0.810 0.760 0.787 0.788 0.588 0.574 0.398 0.217 0.865 0.840 0.750 0.724 0.576 0.373 0.349 0.129 1.010 0.910 0.780 0.750 0.720 0.695 0.690 0.675 A Rerata 0.813 0.765 0.788 0.790 0.592 0.573 0.397 0.217 0.870 0.835 0.750 0.723 0.576 0.373 0.353 0.129 1.015 0.910 0.780 0.750 0.720 0.695 0.690 0.675 Total Gula (%) 4.35 4.11 4.23 4.24 3.20 3.10 2.18 1.23 4.66 4.47 4.03 3.89 3.12 2.05 1.94 1.20 5.41 4.86 4.18 4.03 3.87 3.74 3.71 3.63 Rerata Total Gula (%) 4.55 4.33 4.27 4.24 3.20 3.10 2.32 1.20 4.66 4.47 4.03 3.89 3.10 2.05 1.94 0.99 5.41 4.86 4.17 4.04 3.88 3.75 3.69 3.63 78 Lanjutan Lampiran 15. Data total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Jenis Gula Waktu (jam) FOS: GOS (1:9) 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 Inulin: GOS (1:9) Ulangan 1 A1 A2 1.000 0.935 0.890 0.820 0.748 0.550 0.492 0.324 1.070 0.895 0.870 0.850 0.820 0.658 0.630 0.404 0.990 0.945 0.900 0.825 0.748 0.550 0.490 0.314 1.070 0.885 0.875 0.850 0.815 0.660 0.632 0.404 A Rerata 0.995 0.940 0.895 0.823 0.748 0.550 0.491 0.319 1.070 0.890 0.873 0.850 0.818 0.659 0.631 0.404 Ulangan 2 Total Gula (%) 5.31 5.02 4.79 4.41 4.02 2.98 2.67 1.77 5.70 4.76 4.67 4.55 4.38 3.55 3.40 2.21 A1 A2 1.000 0.935 0.895 0.820 0.748 0.544 0.492 0.430 1.070 0.895 0.870 0.850 0.808 0.658 0.630 0.404 0.990 0.945 0.900 0.825 0.748 0.546 0.490 0.428 1.070 0.885 0.875 0.850 0.812 0.660 0.632 0.404 A Rerata 0.995 0.940 0.898 0.823 0.748 0.545 0.491 0.429 1.070 0.890 0.873 0.850 0.810 0.659 0.631 0.404 Total Gula (%) 5.31 5.02 4.80 4.41 4.02 2.95 2.67 2.35 5.70 4.76 4.67 4.55 4.34 3.55 3.40 2.21 Rerata Total Gula (%) 5.31 5.02 4.79 4.41 4.02 2.97 2.67 2.06 5.70 4.76 4.67 4.55 4.36 3.55 3.40 2.21 Total gula (%) = [(hasil perhitungan dengan persamaan reaksi) x FP] 104 FP = 1.1 x 103 79 Lampiran 16. Data gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Jenis Gula FOS GOS Inulin Waktu (jam) 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 Ulangan 1 A1 A2 A Rerata 0.296 0.202 0.202 0.200 0.219 0.233 0.167 0.055 0.696 0.543 0.409 0.397 0.136 0.274 0.270 0.175 0.117 0.110 0.065 0.061 0.080 0.039 0.033 0.065 0.276 0.202 0.202 0.186 0.219 0.137 0.176 0.055 0.692 0.535 0.407 0.395 0.150 0.272 0.270 0.170 0.117 0.110 0.065 0.061 0.080 0.039 0.033 0.065 0.286 0.202 0.202 0.193 0.219 0.185 0.172 0.055 0.694 0.539 0.408 0.396 0.143 0.273 0.270 0.173 0.117 0.110 0.065 0.061 0.080 0.039 0.033 0.065 Ulangan 2 Gula Pereduksi (%) 1.23 0.90 0.90 0.86 0.96 0.83 0.78 0.32 2.83 2.22 1.71 1.66 0.66 1.18 1.16 0.78 0.56 0.54 0.36 0.34 0.42 0.25 0.23 0.36 A1 A2 A Rerata 0.333 0.276 0.254 0.179 0.216 0.180 0.166 0.038 0.740 0.348 0.328 0.280 0.162 0.279 0.215 0.170 0.120 0.104 0.069 0.050 0.092 0.044 0.039 0.074 0.310 0.276 0.254 0.179 0.216 0.180 0.166 0.038 0.755 0.346 0.330 0.284 0.162 0.279 0.211 0.169 0.116 0.094 0.069 0.050 0.069 0.043 0.040 0.084 0.322 0.276 0.254 0.179 0.216 0.180 0.166 0.038 0.748 0.347 0.329 0.282 0.162 0.279 0.213 0.170 0.118 0.099 0.069 0.050 0.081 0.044 0.040 0.079 Gula Pereduksi (%) 1.37 1.19 1.10 0.81 0.95 0.81 0.76 0.25 3.04 1.47 1.40 1.21 0.74 1.20 0.94 0.77 0.57 0.49 0.37 0.30 0.42 0.27 0.26 0.41 Rerata Gula Pereduksi (%) 1.30 1.04 1.00 0.83 0.96 0.82 0.77 0.29 2.93 1.84 1.55 1.43 0.70 1.19 1.05 0.77 0.56 0.51 0.37 0.32 0.42 0.26 0.24 0.39 80 Lanjutan Lampiran 16. Data gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Jenis gula FOS: GOS (1:9) Inulin: GOS (1:9) Waktu (jam) 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 Ulangan 1 A1 A2 A Rerata 0.698 0.685 0.543 0.413 0.316 0.244 0.185 0.228 0.538 0.426 0.461 0.374 0.352 0.231 0.208 0.151 0.698 0.685 0.543 0.413 0.316 0.244 0.185 0.228 0.538 0.426 0.461 0.374 0.352 0.231 0.208 0.151 0.698 0.685 0.543 0.413 0.316 0.244 0.185 0.228 0.538 0.426 0.461 0.374 0.352 0.231 0.208 0.151 Ulangan 2 Gula pereduksi (%) 2.85 2.79 2.24 1.72 1.34 1.06 0.83 1.00 2.22 1.78 1.91 1.57 1.49 1.01 0.92 0.70 A1 A2 A Rerata 0.716 0.634 0.674 0.448 0.289 0.213 0.274 0.289 0.589 0.448 0.465 0.376 0.344 0.247 0.240 0.160 0.716 0.634 0.674 0.448 0.289 0.213 0.274 0.289 0.589 0.448 0.465 0.376 0.344 0.247 0.240 0.160 0.716 0.634 0.674 0.448 0.289 0.213 0.274 0.289 0.589 0.448 0.465 0.376 0.344 0.247 0.240 0.160 Gula pereduksi (%) 2.91 2.59 2.75 1.86 1.24 0.94 1.18 1.24 2.42 1.86 1.93 1.58 1.45 1.07 1.05 0.73 Rerata Gula Pereduksi (%) 2.88 2.69 2.49 1.79 1.29 1.00 1.00 1.12 2.32 1.82 1.92 1.58 1.47 1.04 0.98 0.71 Gula pereduksi (%) = [(hasil perhitungan dengan persamaan reaksi) x FP] 104 FP = 1.1 x 104 81 Lampiran 17. Data gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Jenis Gula FOS GOS Inulin Waktu (jam) 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 Ulangan 1 A1 A2 A Rerata 0.414 0.398 0.359 0.290 0.265 0.196 0.170 0.018 0.765 0.690 0.875 0.676 0.679 0.549 0.415 0.247 0.177 0.143 0.117 0.033 0.063 0.058 0.070 0.066 0.433 0.419 0.334 0.288 0.250 0.184 0.147 0.027 0.723 0.691 0.875 0.676 0.679 0.521 0.412 0.248 0.177 0.143 0.084 0.033 0.068 0.057 0.070 0.069 0.424 0.409 0.347 0.289 0.258 0.190 0.158 0.022 0.744 0.691 0.875 0.676 0.679 0.535 0.414 0.248 0.177 0.143 0.100 0.033 0.065 0.058 0.070 0.067 Ulangan 2 Gula Pereduksi (%) 1.77 1.71 1.46 1.24 1.11 0.85 0.72 0.19 3.02 2.81 3.54 2.76 2.77 2.20 1.73 1.08 0.80 0.67 0.50 0.23 0.36 0.33 0.38 0.37 A1 A2 A Rerata 0.445 0.434 0.377 0.166 0.108 0.002 0.020 0.020 0.762 0.717 0.789 0.626 0.487 0.390 0.322 0.178 0.140 0.131 0.109 0.050 0.077 0.052 0.070 0.073 0.522 0.438 0.307 0.143 0.155 0.070 0.027 0.041 0.739 0.682 0.889 0.540 0.506 0.390 0.337 0.182 0.140 0.125 0.109 0.050 0.077 0.057 0.071 0.073 0.484 0.436 0.342 0.155 0.131 0.036 0.024 0.030 0.750 0.699 0.839 0.583 0.497 0.390 0.330 0.180 0.140 0.128 0.109 0.050 0.077 0.054 0.070 0.073 Gula Pereduksi (%) 2.00 1.82 1.45 0.71 0.62 0.24 0.20 0.22 3.05 2.85 3.40 2.39 2.05 1.63 1.40 0.81 0.65 0.61 0.53 0.30 0.41 0.32 0.38 0.39 Rerata Gula Pereduksi (%) 1.88 1.76 1.46 0.97 0.87 0.55 0.46 0.21 3.04 2.83 3.47 2.57 2.41 1.92 1.56 0.94 0.72 0.64 0.51 0.26 0.38 0.32 0.38 0.38 82 Lanjutan Lampiran 17. Data gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Jenis gula FOS: GOS (1:9) Inulin: GOS (1:9) Waktu (jam) 0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24 Ulangan 1 A1 A2 A Rerata 0.763 0.539 0.588 0.543 0.437 0.288 0.246 0.165 0.682 0.565 0.611 0.591 0.400 0.347 0.301 0.250 0.763 0.539 0.588 0.543 0.441 0.289 0.251 0.165 0.682 0.565 0.611 0.591 0.400 0.348 0.301 0.250 0.763 0.539 0.588 0.543 0.439 0.289 0.249 0.165 0.682 0.565 0.611 0.591 0.400 0.348 0.301 0.250 Ulangan 2 Gula pereduksi (%) 3.10 2.22 2.41 2.23 1.83 1.24 1.08 0.75 2.78 2.32 2.50 2.42 1.67 1.47 1.29 1.09 A1 A2 A Rerata 0.626 0.539 0.618 0.569 0.407 0.293 0.257 0.188 0.718 0.675 0.748 0.467 0.388 0.357 0.347 0.329 0.626 0.544 0.618 0.564 0.407 0.293 0.257 0.184 0.718 0.675 0.748 0.467 0.388 0.352 0.347 0.329 0.626 0.542 0.618 0.567 0.407 0.293 0.257 0.186 0.718 0.675 0.748 0.467 0.388 0.354 0.347 0.329 Gula pereduksi (%) 2.56 2.23 2.53 2.33 1.70 1.25 1.11 0.83 2.92 2.75 3.04 1.94 1.62 1.49 1.46 1.40 Rerata Gula Pereduksi (%) 2.83 2.22 2.47 2.28 1.76 1.25 1.10 0.79 2.85 2.54 2.77 2.18 1.65 1.48 1.37 1.24 Gula pereduksi (%) = [(hasil perhitungan dengan persamaan reaksi) x FP] 104 FP = 1.1 x 104 83 Lampiran 18. Data hitungan cawan pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan berbagai prebiotik Waktu Inkubasi (Jam) Kontrol (Skim) 0 24 48 Skim + Inulin 0 24 48 Duplo Ulangan 1 Pengenceran 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Ulangan 2 Jumlah BAL Log CFU/ml CFU/ml 10-5 10-6 10-7 TBUD TBUD 10-6 TBUD TBUD TBUD TBUD 216 216 10-7 TBUD TBUD 146 144 0 30 10-8 50 44 25 10 2.2 x 108 8.34 4.7 x 109 9.76 1.5 x 109 9.18 TBUD TBUD 10-6 TBUD TBUD TBUD TBUD 206 205 10-7 TBUD TBUD 171 226 34 18 10-8 97 76 18 61 2.1 x 108 8.32 8.6 x 109 9.93 2.2 x 109 9.34 Pengenceran 10-5 10-6 10-7 TBUD TBUD 10-6 TBUD TBUD TBUD TBUD 224 224 10-7 TBUD TBUD TBUD TBUD 30 0 10-8 127 106 55 75 TBUD TBUD 10-6 TBUD TBUD TBUD TBUD 236 218 10-7 TBUD TBUD TBUD TBUD 38 25 10-8 148 141 98 103 Jumlah BAL Log CFU/ml CFU/ml Rerata Log CFU/ml 2.3 x 108 8.36 8.35 1.2 x 1010 10.08 9.92 6.5 x 109 9.81 9.60 2.4 x 108 8.38 8.35 1.4 x 1010 10.15 10.05 1.0 x 1010 10.00 9.79 84 Lanjutan Lampiran 18. Data hitungan cawan pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan berbagai prebiotik Waktu Inkubasi (Jam) Ulangan 1 Pengenceran Duplo 10-5 10-6 10-7 TBUD TBUD 10-6 TBUD TBUD TBUD TBUD 247 TBUD 10-7 TBUD TBUD TBUD TBUD 20 17 10-8 147 173 40 37 TBUD TBUD 10-6 TBUD TBUD TBUD TBUD TBUD 234 10-7 TBUD TBUD TBUD TBUD 44 40 10-8 144 117 63 48 Ulangan 2 Jumlah BAL Log CFU/ml CFU/ml Pengenceran 10-5 10-6 10-7 TBUD TBUD 10-6 TBUD TBUD TBUD TBUD 171 112 10-7 TBUD TBUD 237 TBUD 21 14 10-8 106 131 23 2 TBUD TBUD 10-6 TBUD TBUD TBUD TBUD TBUD TBUD 10-7 TBUD TBUD TBUD TBUD 27 26 10-8 132 133 106 109 Jumlah BAL Log CFU/ml CFU/ml Rerata Log CFU/ml FOS 0 1 2 24 1 2 1 2 48 Inulin:GOS (1:9) 0 1 2 24 48 1 2 1 2 2.5 x 108 8.40 1.6 x 1010 10.20 3.8 x 109 9.58 2.7 x 108 8.43 1.3 x 1010 10.11 5.6 x 109 9.75 1.4 x 108 8.15 8.29 1.2 x 1010 10.08 10.15 2.4 x 109 9.38 9.49 2.6 x 108 8.41 8.42 1.3 x 1010 10.11 10.11 1.1 x 1010 10.04 9.92 85 Lampiran 19. Nilai pH dan TAT (% asam laktat) Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik A. Nilai pH No. Jenis Gula 1. Kontrol 2. FOS 3. Inulin 4. Inulin:GOS (1:9) Ulangan 1 2 1 2 1 2 1 2 0 6.25 6.26 6.19 6.20 6.17 6.15 6.21 6.22 Nilai pH Jam ke24 4.82 4.87 4.61 4.55 4.72 4.72 4.60 4.67 48 4.14 4.15 4.09 4.08 4.06 4.06 4.09 4.10 0 0.50 0.55 0.45 0.50 0.40 0.40 0.50 0.45 Nilai TAT Jam ke24 1.10 1.00 1.20 1.25 1.20 1.15 1.30 1.30 48 1.60 1.75 2.00 2.00 1.90 1.95 2.00 2.00 B. Nilai TAT (% asam laktat) No. Jenis Gula 1. Kontrol 2. FOS 3. Inulin 4. Inulin:GOS (1:9) Ulangan 1 2 1 2 1 2 1 2 86 Lampiran 20. Data total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik Jenis Gula Waktu (jam) Skim 0 24 48 0 24 48 0 24 48 0 24 48 Skim + FOS Skim + Inulin Skim + Inulin:G OS Ulangan 1 A1 A2 0.995 0.682 0.620 1.000 0.830 0.604 0.974 0.784 0.782 0.946 0.647 0.617 0.995 0.682 0.620 1.000 0.840 0.602 0.974 0.784 0.782 0.946 0.647 0.617 A Rerata 0.995 0.682 0.620 1.000 0.835 0.603 0.974 0.784 0.782 0.946 0.647 0.617 Ulangan 2 Total Gula (%) 5.31 3.67 3.35 1.67 8.94 6.51 10.40 8.41 8.39 10.11 6.97 6.66 A1 A2 0.930 0.676 0.620 0.995 0.815 0.546 0.966 0.784 0.714 0.948 0.649 0.619 0.930 0.676 0.620 0.995 0.815 0.544 0.966 0.784 0.714 0.948 0.649 0.619 A Rerata 0.930 0.676 0.620 0.995 0.815 0.545 0.966 0.784 0.714 0.948 0.649 0.619 Total Gula (%) 4.97 3.64 3.35 1.62 8.73 5.91 10.32 8.41 7.68 10.13 6.99 6.68 Rerata Total Gula (%) 5.14 3.65 3.35 10.65 8.84 6.21 10.36 8.41 8.03 10.12 6.98 6.67 Total gula (%) = [(hasil perhitungan dengan persamaan reaksi) x FP] 104 3 FP skim = 1.1 x 10 FP skim+prebiotik = 2.2 x 103 87 Lampiran 21. Data gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik Jenis Gula Waktu (jam) Skim 0 24 48 0 24 48 0 24 48 0 24 48 Skim + FOS Skim + Inulin Skim + Inulin:G OS Ulangan 1 A1 A2 0.505 0.328 0.306 0.787 0.484 0.354 0.491 0.383 0.309 0.852 0.587 0.537 0.507 0.322 0.306 0.787 0.486 0.356 0.491 0.385 0.309 0.852 0.585 0.537 A Rerata 0.506 0.325 0.306 0.787 0.485 0.355 0.491 0.384 0.309 0.852 0.586 0.537 Ulangan 2 Total Gula (%) 4.18 2.76 2.61 6.39 4.02 2.99 4.06 3.22 2.63 6.90 4.81 4.42 A1 A2 0.399 0.376 0.306 0.833 0.534 0.516 0.505 0.411 0.319 0.782 0.473 0.467 0.403 0.376 0.306 0.833 0.534 0.518 0.505 0.411 0.319 0.782 0.473 0.469 A Rerata 0.401 0.376 0.306 0.833 0.534 0.517 0.505 0.411 0.319 0.782 0.473 0.468 Total Gula (%) 3.36 3.16 2.61 6.75 4.40 4.27 4.17 3.43 2.71 6.35 3.92 3.88 Rerata Total Gula (%) 3.77 2.96 2.61 6.57 4.21 3.63 4.12 3.33 2.67 6.62 4.36 4.15 Gula pereduksi (%) = [(hasil perhitungan dengan persamaan reaksi) x FP] 104 4 FP = 2.2 x 10 88 Lampiran 22. Hasil analisis statistik nilai OD Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors Value Label media waktu N 1 kontrol 16 2 FOS 16 3 GOS 16 4 inulin 16 5 FOS:GOS 16 6 1 inulin:GOS 0 jam 16 12 2 2 jam 12 3 4 jam 12 4 6 jam 12 5 8 jam 12 6 10 jam 12 7 12 jam 12 8 24 jam 12 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:OD Source Corrected Model Intercept Media Waktu Error Total Corrected Total Type III Sum of Squares Df a 1198.675 908.515 261.401 937.274 308.106 2415.296 1506.781 Mean Square 12 1 5 7 83 96 95 99.890 908.515 52.280 133.896 3.712 F 26.909 244.743 14.084 36.070 Sig. .000 .000 .000 .000 a. R Squared = .796 (Adjusted R Squared = .766) 89 Lanjutan Lampiran 22. Hasil analisis statistik nilai OD Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Post Hoc Tests waktu Homogeneous Subsets OD Duncan Subset waktu 0 jam 2 jam 4 jam 6 jam 8 jam 10 jam 12 jam 24 jam Sig. N 1 12 12 12 12 12 12 12 12 2 3 4 5 .09583 .14825 .28208 1.06625 2.79167 4.75158 6.62792 .268 1.000 1.000 1.000 8.84692 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = 3.712. media Homogeneous Subsets OD Duncan Subset media kontrol inulin FOS inulin:GOS GOS FOS:GOS Sig. N 1 16 16 16 16 16 16 2 3 .33294 1.54300 2.96981 .079 1.000 4.37019 4.58206 4.65987 .692 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = 3.712. 90 Lampiran 23. Hasil analisis statistik nilai OD Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors Value Label Media Waktu N 1 Kontrol 16 2 FOS 16 3 GOS 16 4 inulin 16 5 FOS:GOS 16 6 1 inulin:GOS 0 jam 16 12 2 2 jam 12 3 4 jam 12 4 6 jam 12 5 8 jam 12 6 10 jam 12 7 12 jam 12 8 24 jam 12 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:OD Source Corrected Model Intercept Media Waktu Error Total Corrected Total Type III Sum of Squares df a 1030.898 650.323 182.995 847.903 280.990 1962.211 1311.888 Mean Square 12 1 5 7 83 96 95 85.908 650.323 36.599 121.129 3.385 F 25.376 192.095 10.811 35.780 Sig. .000 .000 .000 .000 a. R Squared = .786 (Adjusted R Squared = .755) 91 Lanjutan Lampiran 23. Hasil analisis statistik nilai OD Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Post Hoc Tests waktu Homogeneous Subsets OD Duncan Subset waktu 0 jam 2 jam 4 jam 6 jam 8 jam 10 jam 12 jam 24 jam Sig. N 1 12 12 12 12 12 12 12 12 2 .07517 .12833 .25933 .98142 .279 3 .98142 2.37358 .067 4 2.37358 3.49283 .140 5 3.49283 4.04542 .464 9.46575 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = 3.385. media Homogeneous Subsets OD Duncan Subset media kontrol inulin GOS inulin:GOS FOS:GOS FOS Sig. N 1 16 16 16 16 16 16 2 3 .27312 1.80844 2.77656 2.87806 3.01919 1.000 .093 4.86100 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = 3.385. 92 Lampiran 24. Hasil analisis statistik nilai total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors Value Label media waktu N 1 FOS 16 2 GOS 16 3 Inulin 16 4 FOS:GOS 16 5 1 inulin:GOS 0 jam 16 10 2 2 jam 10 3 4 jam 10 4 6 jam 10 5 8 jam 10 6 10 jam 10 7 12 jam 10 8 24 jam 10 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:total_gula Source Corrected Model Intercept Media Waktu Error Total Corrected Total Type III Sum of Squares df a 31.714 818.880 5.049 26.665 6.572 857.166 38.286 Mean Square 11 1 4 7 68 80 79 2.883 818.880 1.262 3.809 .097 F 29.829 8.472E3 13.060 39.411 Sig. .000 .000 .000 .000 a. R Squared = .828 (Adjusted R Squared = .801) 93 Lanjutan Lampiran 24. Hasil analisis statistik nilai total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Post Hoc Tests waktu Homogeneous Subsets total_gula Duncan Subset waktu 24 jam 12 jam 10 jam 8 jam 6 jam 4 jam 2 jam 0 jam Sig. N 1 10 10 10 10 10 10 10 10 2 2.3860 2.5900 3 2.5900 2.7860 4 5 6 2.7860 3.0230 3.3130 3.5100 3.8190 .147 .163 .093 .161 1.000 4.1680 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .097. media Homogeneous Subsets total_gula Duncan Subset Media FOS GOS FOS:GOS Inulin inulin:GOS Sig. N 1 16 16 16 16 16 2 2.9388 2.9850 3.1444 .081 3 3.1444 3.2937 .179 3.6350 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .097. 94 Lampiran 25. Hasil analisis statistik nilai total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors Value Label media waktu N 1 FOS 16 2 GOS 16 3 inulin 16 4 FOS:GOS 16 5 1 inulin:GOS 0 jam 16 10 2 2 jam 10 3 4 jam 10 4 6 jam 10 5 8 jam 10 6 10 jam 10 7 12 jam 10 8 24 jam 10 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:total_gula Source Corrected Model Intercept Media Waktu Error Total Corrected Total Type III Sum of Squares df a 75.343 932.637 11.365 63.978 7.930 1015.909 83.273 Mean Square 11 1 4 7 68 80 79 6.849 932.637 2.841 9.140 .117 F 58.732 7.997E3 24.363 78.372 Sig. .000 .000 .000 .000 a. R Squared = .905 (Adjusted R Squared = .889) 95 Lampiran 25. Hasil analisis statistik nilai total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Post Hoc Tests waktu Homogeneous Subsets total_gula Duncan Subset waktu 24 jam 12 jam 10 jam 8 jam 6 jam 4 jam 2 jam 0 jam Sig. N 1 10 10 10 10 10 10 10 10 2 3 4 5 6 1.8340 2.5510 2.8050 3.3750 3.8400 3.9850 1.000 .101 1.000 .346 3.9850 4.2650 .071 4.6600 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .117. media Homogeneous Subsets total_gula Duncan Subset Media GOS FOS FOS:GOS inulin:GOS Inulin Sig. N 1 16 16 16 16 16 2 2.8563 3.0925 .054 3.5513 3.7731 3.7988 .056 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .117. 96 Lampiran 26. Hasil analisis statistik nilai gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors Value Label media waktu N 1 FOS 16 2 GOS 16 3 Inulin 16 4 FOS:GOS 16 5 1 inulin;GOS 0 jam 16 10 2 2 jam 10 3 4 jam 10 4 6 jam 10 5 8 jam 10 6 10 jam 10 7 12 jam 10 8 24 jam 10 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:gula_pereduksi Source Corrected Model Intercept Media Waktu Error Total Corrected Total Type III Sum of Squares df a 28.591 93.913 16.455 12.135 6.367 128.871 34.958 Mean Square 11 1 4 7 68 80 79 2.599 93.913 4.114 1.734 .094 F 27.760 1.003E3 43.937 18.515 Sig. .000 .000 .000 .000 a. R Squared = .818 (Adjusted R Squared = .788) 97 Lanjutan Lampiran 26. Hasil analisis statistik nilai gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Post Hoc Tests waktu Homogeneous Subsets gula_pereduksi Duncan Subset waktu 24 jam 12 jam 10 jam 8 jam 6 jam 4 jam 2 jam 0 jam Sig. N 1 10 10 10 10 10 10 10 10 2 .5964 .7366 .7845 .8798 .061 3 .8798 1.0832 4 1.0832 1.3329 .142 5 1.3329 1.4380 .072 .445 3 4 1.8164 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .094. media Homogeneous Subsets gula_pereduksi Duncan Subset Media Inulin FOS GOS inulin;GOS FOS:GOS Sig. N 1 16 16 16 16 16 2 .3500 .7954 1.3041 1.3458 1.000 1.000 .701 1.6220 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .094. 98 Lampiran 27. Hasil analisis statistik nilai gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors Value Label media waktu N 1 FOS 16 2 GOS 16 3 inulin 16 4 FOS:GOS 16 5 1 inulin:GOS 0 jam 16 10 2 2 jam 10 3 4 jam 10 4 6 jam 10 5 8 jam 10 6 10 jam 10 7 12 jam 10 8 24 jam 10 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:gula_pereduksi Source Corrected Model Intercept Media Waktu Error Total Corrected Total Type III Sum of Squares df a 51.081 155.161 31.945 19.136 6.179 212.421 57.261 Mean Square 11 1 4 7 68 80 79 4.644 155.161 7.986 2.734 .091 F 51.102 1.707E3 87.885 30.083 Sig. .000 .000 .000 .000 a. R Squared = .892 (Adjusted R Squared = .875) 99 Lanjutan Lampiran 27. Hasil analisis statistik nilai gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media MRS basic dengan penambahan prebiotik Post Hoc Tests waktu Homogeneous Subsets gula_pereduksi Duncan Subset waktu 24 jam 12 jam 10 jam 8 jam 6 jam 2 jam 4 jam 0 jam Sig. N 1 10 10 10 10 10 10 10 10 2 .6473 .8855 3 4 .8855 1.0021 1.2859 1.5039 .082 .390 .110 1.8163 1.9412 2.0591 .093 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .091. media Homogeneous Subsets gula_pereduksi Duncan Subset Media Inulin FOS FOS:GOS inulin:GOS GOS Sig. N 1 16 16 16 16 16 2 3 4 .4088 .9259 1.6706 1.8274 1.000 1.000 .146 2.1306 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .091. 100 Lampiran 28. Hasil analisis statistik nilai Log Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik Between-Subjects Factors Value Label media waktu N 1 Skim 6 2 skim+FOS 6 3 skim+inulin 6 4 1 skim+inulin:GO S 0 jam 2 24 jam 8 3 48 jam 8 6 8 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:log_BAL Source Type III Sum of Squares Df a Model media waktu Error Total 2107.073 .181 12.491 .777 2107.850 Mean Square 6 3 2 18 24 351.179 .060 6.245 .043 F Sig. 8.140E3 1.397 144.754 .000 .276 .000 a. R Squared = 1.000 (Adjusted R Squared = 1.000) Between-Subjects Factors N media_waktu 1_1 2 1_2 2 1_3 2 2_1 2 2_2 2 2_3 2 3_1 2 3_2 2 3_3 2 4_1 2 4_2 2 4_3 2 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:log_BAL Source Corrected Model Intercept media_waktu Error Total Corrected Total Type III Sum of Squares Df 12.821a 2094.402 12.821 .627 2107.850 13.448 Mean Square 11 1 11 12 24 23 1.166 2094.402 1.166 .052 F 22.300 4.007E4 22.300 Sig. .000 .000 .000 a. R Squared = .953 (Adjusted R Squared = .911) 101 Lanjutan Lampiran 28. Hasil analisis statistik nilai Log Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik Post Hoc Tests media_waktu Homogeneous Subsets log_BAL Duncan Subset media_w aktu N 1 2 3 2_1 2 8.2750 1_1 2 8.3500 3_1 2 8.3500 4_1 2 8.4200 2_3 2 9.4800 1_3 2 9.4950 3_3 2 9.6700 9.6700 1_2 2 9.8750 9.8750 4_3 2 9.8950 9.8950 3_2 2 10.0400 4_2 2 10.1100 2_2 2 10.1400 Sig. .567 .123 .088 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .052. 102 Lampiran 29. Hasil analisis statistik nilai pH Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik Between-Subjects Factors Value Label media waktu N 1 Skim 6 2 skim+FOS 6 3 skim+inulin 6 4 1 skim+inulin:GO S 0 jam 2 24 jam 8 3 48 jam 8 6 8 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:pH Source Type III Sum of Squares df 618.776a .057 18.919 .045 618.822 Model media waktu Error Total Mean Square 6 3 2 18 24 103.129 .019 9.459 .003 F Sig. 4.081E4 7.582 3.743E3 .000 .002 .000 a. R Squared = 1.000 (Adjusted R Squared = 1.000) Between-Subjects Factors N media_waktu 1_1 2 1_2 2 1_3 2 2_1 2 2_2 2 2_3 2 3_1 2 3_2 2 3_3 2 4_1 2 4_2 2 4_3 2 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:pH Source Corrected Model Intercept media_waktu Error Total Corrected Total Type III Sum of Squares df a 19.016 599.800 19.016 .006 618.822 19.022 Mean Square 11 1 11 12 24 23 1.729 599.800 1.729 .001 F 3.457E3 1.200E6 3.457E3 Sig. .000 .000 .000 a. R Squared = 1.000 (Adjusted R Squared = .999) 103 Lanjutan Lampiran 29. Hasil analisis statistik nilai pH Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik Post Hoc Tests media_waktu Homogeneous Subsets pH Duncan Subset media_w aktu N 1 2 3 4 5 6 7 8 3_3 2 4.0600 2_3 2 4.0850 4_3 2 4.0950 1_3 2 2_2 2 4_2 2 3_2 2 1_2 2 3_1 2 6.1600 2_1 2 6.1950 4_1 2 1_1 2 Sig. 9 4.1450 4.5800 4.6350 4.7200 4.8450 6.1950 6.2150 6.2150 6.2550 .162 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 .144 .389 .099 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .001. 104 Lampiran 30. Hasil analisis statistik nilai TAT Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik Between-Subjects Factors Value Label media waktu N 1 Skim 6 2 skim+FOS 6 3 skim+inulin 6 4 1 skim+inulin:GO S 0 jam 2 24 jam 8 3 48 jam 8 6 8 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:TAT Source Type III Sum of Squares df a Model media waktu Error Total 42.029 .110 8.194 .138 42.168 Mean Square 6 3 2 18 24 F 7.005 .037 4.097 .008 Sig. 912.855 4.792 533.905 .000 .013 .000 a. R Squared = .997 (Adjusted R Squared = .996) Between-Subjects Factors N media_waktu 1_1 2 1_2 2 1_3 2 2_1 2 2_2 2 2_3 2 3_1 2 3_2 2 3_3 2 4_1 2 4_2 2 4_3 2 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:TAT Source Corrected Model Intercept media_waktu Error Total Corrected Total Type III Sum of Squares df 8.419a 33.725 8.419 .024 42.168 8.442 Mean Square 11 1 11 12 24 23 .765 33.725 .765 .002 F 386.694 1.704E4 386.694 Sig. .000 .000 .000 a. R Squared = .997 (Adjusted R Squared = .995) 105 Lanjutan Lampiran 30. Hasil analisis statistik nilai TAT (% asam laktat) Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik Post Hoc Tests media_waktu Homogeneous Subsets TAT Duncan Subset media_w aktu N 1 2 3 4 5 6 7 3_1 2 .4000 2_1 2 .4750 .4750 4_1 2 .4750 .4750 1_1 2 1_2 2 3_2 2 1.1750 2_2 2 1.2250 4_2 2 1_3 2 3_3 2 1.9250 2_3 2 2.0000 4_3 2 2.0000 Sig. .5250 1.0500 1.2250 1.3000 1.6750 .134 .306 1.000 .283 .118 1.000 .134 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .002. 106 Lampiran 31. Hasil analisis statistik nilai total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik Between-Subjects Factors Value Label media waktu N 1 Skim 6 2 skim+FOS 6 3 skim+inulin 6 4 1 skim+inulin:GO S 0 jam 2 24 jam 8 3 48 jam 8 6 8 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:total_gula Source Type III Sum of Squares df a Model media waktu Error Total 1183.162 75.404 31.336 5.765 1188.927 Mean Square 6 3 2 18 24 F 197.194 25.135 15.668 .320 Sig. 615.741 78.484 48.923 .000 .000 .000 a. R Squared = .995 (Adjusted R Squared = .994) Between-Subjects Factors N media_waktu 1_1 2 1_2 2 1_3 2 2_1 2 2_2 2 2_3 2 3_1 2 3_2 2 3_3 2 4_1 2 4_2 2 4_3 2 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:total_gula Source Corrected Model Intercept media_waktu Error Total Corrected Total Type III Sum of Squares Df 112.071a 1076.422 112.071 .433 1188.927 112.504 Mean Square 11 1 11 12 24 23 10.188 1076.422 10.188 .036 F 282.126 2.981E4 282.126 Sig. .000 .000 .000 a. R Squared = .996 (Adjusted R Squared = .993) 107 Lanjutan Lampiran 31. Hasil analisis statistik nilai total gula selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik Post Hoc Tests media_waktu Homogeneous Subsets total_gula Duncan Subset media_w aktu N 1 2 3 4 5 6 7 8 1_3 2 3.0400 1_2 2 3.3250 1_1 2 2_3 2 4_3 2 6.0600 4_2 2 6.3500 3_3 2 7.3050 3_2 2 7.6400 2_2 2 4_1 2 9.2000 3_1 2 9.4150 2_1 2 Sig. 4.6750 5.6450 7.6400 8.0350 9.4150 9.6750 .160 1.000 1.000 .153 .103 .060 .280 .196 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .036. 108 Lampiran 32. Hasil analisis statistik nilai gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik Between-Subjects Factors Value Label media waktu N 1 Skim 6 2 skim+FOS 6 3 skim+inulin 6 4 1 skim+inulin:GO S 0 jam 2 24 jam 8 3 48 jam 8 6 8 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:gula_pereduksi Source Type III Sum of Squares Df a Model media waktu Error Total 359.565 14.372 14.633 4.240 363.805 Mean Square 6 3 2 18 24 F 59.928 4.791 7.316 .236 Sig. 254.424 20.338 31.062 .000 .000 .000 a. R Squared = .988 (Adjusted R Squared = .984) Between-Subjects Factors N media_waktu 1_1 2 1_2 2 1_3 2 2_1 2 2_2 2 2_3 2 3_1 2 3_2 2 3_3 2 4_1 2 4_2 2 4_3 2 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:gula_pereduksi Source Corrected Model Intercept media_waktu Error Total Corrected Total Type III Sum of Squares df 31.511a 330.561 31.511 1.733 363.805 33.244 Mean Square 11 1 11 12 24 23 2.865 330.561 2.865 .144 F 19.834 2.289E3 19.834 Sig. .000 .000 .000 a. R Squared = .948 (Adjusted R Squared = .900) 109 Lanjutan Lampiran 32. Hasil analisis statistik nilai gula pereduksi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 pada media susu skim 12% dengan penambahan prebiotik Post Hoc Tests media_waktu Homogeneous Subsets gula_pereduksi Duncan Subset media_w aktu N 1 2 3 4 5 6 1_3 2 2.3700 3_3 2 2.4250 2.4250 1_2 2 2.6900 2.6900 2.6900 3_2 2 3.0250 3.0250 3.0250 3.0250 2_3 2 3.3000 3.3000 3.3000 3.3000 1_1 2 3.4250 3.4250 3.4250 3_1 2 3.7400 3.7400 4_3 2 3.7750 3.7750 2_2 2 3.8250 3.8250 4_2 2 2_1 2 5.9750 4_1 2 6.0200 Sig. 3.9650 .136 .053 .098 .081 .139 .908 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = .144. 110 Lampiran 33. Hasil analisis korelasi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H A. Lactobacillus R23 pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon Correlations Inulin:GOS Log_BAL Log_BAL Pearson Correlation pH 1 pH 8 Pearson Correlation ** Sig. (2-tailed) -.962 Pearson Correlation Sig. (2-tailed) -.977** -.946** .000 .002 .000 .000 Sig. (2-tailed) 8 8 8 1 ** ** ** -.846 .008 .979 .000 .965 .000 8 8 8 8 8 -.846** 1 -.875** -.868** .002 .008 .004 .005 8 8 8 ** ** ** -.977 .979 -.875 8 8 1 ** .956 .000 .000 .004 8 8 8 8 8 ** ** ** ** 1 N Gula_pered Pearson Correlation uksi Sig. (2-tailed) 8 .910** N Total_gula Pearson Correlation Gula_peredu ksi .910** .000 N TAT Total_gula -.962** Sig. (2-tailed) N TAT -.946 .965 -.868 .000 .956 .000 .000 .005 .000 8 8 8 8 N 8 **. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed). B. Lactobacillus R23H pada media berbasis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon Correlations FOS Log_BAL Log_BAL Pearson Correlation pH 1 Sig. (2-tailed) N pH Pearson Correlation Sig. (2-tailed) TAT TAT .984** -.953** -.961** .001 .000 .000 .000 8 8 8 8 8 -.933** 1 -.926** .832* .983** .001 .010 .000 8 8 8 1 ** ** .001 8 8 Pearson Correlation ** ** .984 Sig. (2-tailed) .001 8 8 8 ** * ** -.953 .000 N Gula_pered Pearson Correlation uksi Sig. (2-tailed) N -.926 .000 N Total_gula Pearson Correlation Gula_peredu ksi -.933** N Sig. (2-tailed) Total_gula -.961 .832 .010 -.949 .000 -.949 -.947 .000 8 8 1 ** .000 .892 .003 8 8 8 8 8 ** ** ** ** 1 .983 -.947 .892 .000 .000 .000 .003 8 8 8 8 8 **. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed). *. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed). 111 Lanjutan Lampiran 33. Hasil analisis korelasi selama pertumbuhan Lactobacillus R23 dan Lactobacillus R23H C. Lactobacillus R23 pada media susu skim dengan penambahan prebiotik Correlations Skim+Inulin:GOS Log BAL Log BAL Pearson Correlation pH 1 pH Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N TAT .836 -.983 -.984 .223 .370 .119 .114 3 3 3 3 3 -.939 1 -.974 .987 .985 .147 .104 .109 .223 3 3 3 3 3 Pearson Correlation .836 -.974 1 -.923 -.920 Sig. (2-tailed) .370 .147 .251 .256 N Total gula Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N Gula pereduksi Gula pereduksi Total gula -.939 Sig. (2-tailed) N TAT Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N 3 3 3 3 3 -.983 .987 -.923 1 1.000** .119 .104 .251 3 3 3 3 3 ** 1 .005 -.984 .985 -.920 1.000 .114 .109 .256 .005 3 3 3 3 3 **. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed). 112
