PERKEMBANGAN DAN PENGGUNAAN HEWAN TRANSGENIK

PERKEMBANGAN DAN PENGGUNAAN HEWAN
TRANSGENIK
Perbaikan genetik ternak dan hewan domestik Æ perkawinan
+ seleksi Æ waktu lama & mahal
Perkembangan perbaikan genetik dengan transgenesis Æ
lambat
Strategi introduksi gen ke kromosom hewan tk tinggi:
-Gen diinjeksikan ke inti sel telur yang telah dibuahi
-Telur diletakkan di dalam betina reseptif
-Beberapa keturunan membawa gen sasaran
-Hewan yang membawa gen sasaran di dalam sel nutfah
disilangkan untuk mendapat galur baru
Transgenesis pada hewan Æ alat:
-mempelajari ekspresi gen dan perkembangan
-hewan model untuk penyakit manusia
-protein farmasetik bagi manusia (susu dari kelenjar susu)
Produksi protein melalui kelenjar susu:
Æ Melalui air susu, karena:
1. dapat diperbaharui
2. dapat diambil terus tanpa
membahayakan hewannya
Protein farmasetik yang dihasilkan dalam air
susu harus:
1. tidak mempunyai efek sampingan thd proses
fisiologi dari hewan transgenik
2. melalui proses pascatranslasi Æ mirip
protein manusia
3. mudah melakukan purifikasi
Tikus Transgenik
-awal perkembangan transgenesis pada hewan
-sejak 1980an: 100an gen Æ galur baru
Kontribusi:
-mengetahui regulasi ekspresi gen, perkembangan sel
-mengetahui perkembangan tumor, spesifisitas imunologi
-mengetahui proses biologi fundamental
-pengujian kelayakan produksi obat terapetik manusia
-model penyakit manusia
Introduksi DNA sasaran ke dalam sel inang
melalui:
1. Vektor retrovirus Æ sel embrio tahap
awal Æ betina reseptif
2. Mikroinjeksi ke inti sel sperma yang
membesar (pronukleus jantan) dari sel
telur yang telah dibuahi
3. Sel batang embrionik Æ embrio stadia
awal Æ betina reseptif
Metode vektor retrovirus
-keuntungan: integrasi transgen ke dalam
genom efektif
-kerugian:
-transgen ukuran kecil (< 8 kb) shg
transgen kekurangan regulator ekspresi
gen
-genom retrovirus dapat melakukan
replikasi walaupun menggunakan
vektor defektif replikasi
Æ secara komersial jarang (tidak)
digunakan
Metode mikroinjeksi DNA
Tahapan:
1. Meningkatkan jumlah telur terbuahi Æ
stimulasi superovulasi pada betina
donor
Cara: serum kuda hamil Æ injeksi Æ
48 jam: chorionic gonad-otropin
manusia Æ 35 sel telur (normal: 5-10
sel)
2. Betina tsb x jantan Æ telur diambil
dari oviduct
3. Telur diinjeksi (segera)
Transgen Æ linier (bebas DNA
prokaryot)
4. Telur ditanam di induk betina angkat
5. Identifikasi tikus transgenik
Tikus transgenik x WT Æ integrasi
transgen?
Tikus transgenik (lanjutan)
Injeksi sel telur
Mamalia:
Sperma masuk ke sel telur Æ inti sel sperma (pronukleus jantan)
terpisah dari inti sel telur. Setelah inti sel telur selesai meiosis Æ
pronukleus betina Æ fusi dengan pronukleus jantan (karyogami).
Pronukleus jantan > pronukleus betina Æ injeksi dilakukan pada
pronukleus jantan (sel telur dapat difiksasi dan diorientasikan)
Penanaman sel telur ke induk betina palsu
25-40 sel telur ditanam di betina angkat (bedah mikro) yang telah
dibuat hamil palsu. Hamil palsu: perkawinan dengan jantan mandul
(vasektomi) Æ persiapan uterus untuk implantasi
3 minggu Æ lahir anak tikus
Identifikasi tikus transgenik
DNA (ekor/darah) Æ hibridisasi southern atau PCR
Tikus transgenik x WT Æ integrasi transgen?
Keturunan x sesamanya Æ homozigot transgenik
Efisiensi
66% telur hidup setelah diinjeksi
25% telur yang ditanam berkembang menjadi anak
25% anak yang lahir adalah transgenik
Î 1000 telur diinjeksi Æ 30-50 anak transgenik
Metode sel batang embrionik yang telah direkayasa
Sel dari embrio stadia blastosis Æ proliferasi Æ
sel batang embrionik (ESC)
ES Æ pluripotent Æ direkayasa tetap pluripotent
Transgen diintegrasikan ke genom ES Æ blastosis
Æ ditanam Æ transgenik
Transfeksi ESC dengan transgen:
-sel dengan integrasi transgen pada situs bukan sasaran
-sel dengan integrasi transgen pada situs sasaran
-sel tidak mengandung transgen
Peningkatan jumlah sel dengan situs sesuai sasaran:
seleksi positif – negatif
Seleksi positif: memilih sel dengan integrasi di
sembarang situs
Seleksi negatif: membuang sel yang mengandung
transgen terintegrasi di sembarang situs
Situs sasaran: di daerah yang bukan penyandi
(tidak penting) sehingga perkembangan dan
fungsi sel tidak terganggu
Vektor untuk seleksi positif-negatif
1. 2 blok sekuen DNA (HB1 dan HB2)
yang homolog dengan situs sasaran
2. Transgen (TG) Æ fungsi baru untuk
resipien
3. Sekuen DNA penyandi resistensi
terhadap G418 (NeoR)
4. 2 gen berbeda untuk thymidine kinase
(tk1 dan tk2) dari virus simplex herpes
tipe I dan II (HSV-tk1 dan HSV-tk2)
Di antara HB: transgen dan gen neoR
Di luar HB: gen HSV-tk1 dan HSV-tk2
Jika integrasi terjadi pada situs bukan sasaran Æ salah satu atau kedua
HSV-tk terintegrasi kedalam genom sel resipien
Jika integrasi terjadi pada situs sasaran Æ HSV-tk tidak terintegrasi
Sel + G418 Æ sel tanpa neoR Æ mati (sel hidup punya neoR). +
gancyclovir Æ sel yang mengekspresikan tk Æ mati (gancyclovir diubah
oleh tk menjadi toxinÆ sel mati)
Sel + G418 + gancyclovir Æ sel yang mengandung transgen yang
terintegrasi pada situs sasaran
Seleksi dengan PCR
Uji ESC yang mengandung transgen pada situs sasaran Æ PCR
ESC transgenik Æ kultur Æ disisipkan kedalam embrio stadia blastosis Æ
ditanam pada betina pembawa (hamil palsu) Æ galur transgenik.
Homozigot: kawin sesama transgenik
Fungsi gen di suatu organisme dapat diganggu melalui penyisipan
potongan DNA (biasanya penanda seleksi) ke dalam gen tsb Æ untuk:
•mengetahui pengaruh suatu gen terhadap fisiologi dan pertumbuhan
organisme ybs
•sistem model untuk mempelajari penyakit manusia secara molekuler
Inaktivasi gen = gene disruption = gene knockout
Inaktivasi fungsi gen
Contoh pemanfaatan gene disruption:
Gangguan terhadap gen rhodopsin mencit Æ kerusakan rod cells dari
retina ~ retinitis pigmentosa pada manusia Æ digunakan mengetahui
degenerasi retina & pengaruh agen terapetik
250 mencit yang mengalami gene knockout Æ model untuk kajian
berbagai kelainan pada manusia
Modifikasi genetik dengan sistem rekombinasi Cre-loxP
Sistem rekombinasi cre-loxP Æ gene knockout
Cre-loxP dari fage P1 (100 kb) Æ linier-sirkuler genom
P1: genom sirkuler Æ replikasi genom viral (siklus lisis), linier
(terintegrasi) Æ jarang
Rekombinase Cre (circularization
recombination): memotong &
merekombinasi DNA dari situs loxP
(locus of crossing over in P1)
Situs loxP: 2 DNA berulang 13 bp yang
dipisahkan oleh 8 bp
Hasil rekombinasi tergantung orientasi loxP:
-berbeda arah: daerah pemisah mengalami inversi
-searah: daerah pemisah kedua loxP Æ eksisi (hilang)
Cre-loxP Æ berfungsi bila kedua situs loxP berjauhan
contoh: mencit yang mempunyai gen yang termodifikasi secara spesifik
1. Tikus transgenik Cre: promoter spesifik sel + gen cre Æ MT1
2. Klon DNA (termasuk smg) (floxed) diapit 2 loxP searah Æ MT2
3. MT1 x MT2 Æ MT3: rekombinasi antara 2 loxP karena ada
rekombinase Cre
Rekombinasi Cre-loxP
Ekson2 diapit loxP searah Æ hilang Æ gen tidak berfungsi
Aktivasi gen dengan rekombinasi Cre-loxP
Konstruksi floxed mengandung DNA yang mencegah transkripsi
Floxed ditempatkan di antara promoter dan gen penyandi
Cre Æ rekombinasi di loxP Æ DNA yang mencegah transkripsi Æ eksisi
(hilang) Æ gen diekspresikan
Transgenesis dengan vektor berkapasitas besar
Gen utuh, multigen Æ vektor kapasitas besar
Kelompok gen b-globin= 250 kb
Antibodi:
tetramer: rantai berat (H) dan ringan (L)
H: variable (VH), diversity (DH), joining (JH), constant (CH) di sel B
L: tipe λ dan κ Æ Vλ & Vκ, Jλ & Jκ, Cλ & Cκ
Antibodi H manusia: 95 VH, 30 DH, 6 JH dan 5 C (Cα, Cγ, Cδ, Cε, Cμ)
Lokus k: 76 Vκ, 5 Jκ, 1 Cκ
H & κ @ 1-1.5 Mb
Aplikasi tikus transgenik
-model penyakit manusia Æ uji senyawa terapetik
misal: Alzheimer, muscular dysthrophy, tumorigenesis, hypertension,
neurodegenerative disorder, endocrinological dysfunction,
-Uji produksi
1. Model penyakit Alzheimer
Penyakit alzheimer: kelainan otak, kehilangan ingatan
secara progresif, gangguan bicara, lamban
Di dalam neocortex dan hippocampus dari otak pasien
alzheimer, serabut neofibril mengakumulasikan di
dalam badan neuron senile plaque yang mengandung
badan amyloid dan sel-sel otak (neuron) hilang.
Protein utama badan amyloid Alzheimer: prot 4 kDa Æ
Aβ (β-amyloid, protein β, β−amyloid protein atau β/A4):
39-42 aa (terbanyak: Aβ40 & Aβ42) hasil pemotongan
proteolitik β-amyloid precursor protein (APP) Æ
disebabkan oleh mutasi pada gen APP (beberapa famili)
Model penyakit Alzheimer
Promoter dari virus spesifik otak + gen APP penyandi 100 aa terakhir dari
ujung C yang mengandung βA4 Æ histokimia: Alzheimer
Konstruksi model penyakit Alzheimer di tikus transgenik
Alzheimer: APP-177: ValÆPhe; APP-670/671: Lys+Met ÆAsn+Leu
promoter platelet-derived growth factor β + APP-cDNA intron Æ tikus
mengandung plaque amyloid, kematian sel neuron, kehilangan ingatan
APP-670/671 Æ tikus dg penampakan Alzheimer (kelebihan Aβ42)
APP-177
Val
GUU
GUC
Phe
UUU
UUC
GUA
GUG
CUU
CUC
APP-670/671
Lys
AAA
AAG
Asn
AAU
AAC
Met
Leu
AUG
UUA
UUG
CUA
CUG
2. Model sistem ekspresi/produksi
Produksi susu yang mengandung protein dari transgen
Studi fungsi CFTR (Cystic Fibrosis Trans-membrane
Regulator) dan potensi terapi untuk CF (Cystic Fibrosis):
CFTR perlu jumlah banyak
CF rusak Æ fungsi CFTR rusak (sebagai kanal klorida) Æ
aliran Cl rusak Æ akumulasi lendir di pankreas & paru
Lendir: situs infeksi bakteri Æ sulit dikendalikan dengan
antibiotik
Bakteri mati Æ lendir tebal Æ fungsi organ terganggu:
menyumbat saluran Æ memperburuk efek CF
(harapan hidup penderita CF: 25 th)
Produksi CFTR
In vitro, produksi CFTR rendah (akumulasi di membran).
Penanggulangan: membran diambil (produksi tinggi, purifikasi mudah)
Sel kelenjar susu Æ sekresi lemak yang dibungkus oleh membran
plasma (globule dalam susu)
cDNA CFTR Æ di tengah gen β-casein yang tidak lengkap dari kambing
(delesi dari E2 akhir s/d E7 awal) di bawah kontrol promoter dan
terminator β-casein. β-casein diekspresikan di kelenjar susu selama laktasi
dan dalam jumlah yang tinggi
Tikus transgenik: susu mengandung protein CFTR yang terikat di
membran dari globule lemak (tidak ada efek negarif bagi induk & anak).
CFTR mengalami glikosilasi dan mudah diekstraksi dari fraksi kaya lemak
dari susu.
Peningkatan produksi CFTR Æ mamalia besar (sapi, kambing, domba)
Pengklonan ternak melalui transfer inti
Domba Dolly: inti dari sel mammary
Sapi Transgenik
Kelenjar susu: bioreaktor Æ sapi sangat berpotensi
(10.000 l/th, dengan 35 g protein/l susu)
Modifikasi mikroinjeksi pada tikus
Penggunaan prosedur tanpa pembedahan dalam implantasi
embrio: 2 sapi transgenik dari 2470 oocyte Æ tidak efisien
Perbaikan: uji sel embrio Æ embrio transgenik Æ implantasi
Salah satu tujuan: mengubah kandungan susu
Keju Æ κ-casein Æ over ekpresi transgen κ-casein
Ekspresi lactase di kelenjar susu Æ susu bebas laktosa
Transgenesis pada sapi Æ lambat (2 th dari telur terbuahi
s/d anak sapi)
Untuk ternak Æ resistensi terhadap bakteri, virus, parasit
Imunisasi in vivo: introduksi transgen penyandi antibodi
untuk antigen spesifik
Kambing, Domba, dan Babi Transgenik
-penekanan pada kelenjar susu
sebagai bioreaktor Æ protein
farmasetik
-metode: seperti tikus dengan
promoter spesifik kelenjar susu
-kambing, domba Æ protein
(manusia) yang disekresikan ke
dalam susu mengalami glikosilasi,
dan punya aktivitas
-Ekspresi GH dengan promoter
metallothionein di babi Æ besar,
tapi timbul penyakit bernanah di
saluran pencernaan, terganggunya
fungsi ginjal, hati.
-potensi: produksi hemoglobin
(darah) manusia dari babi?
Daerah regulator β-globin manusia
+ 2 gen α1-globin manusia + 1
gen βA-globin manusia Æ
hemoglobin man
Unggas Transgenik
Mikroinjeksi ke telur yang sudah terbuahi sulit:
-Fertilisasi: beberapa sperma masuk ke dalam sel telur Æ sulit
mengidentifikasi pronukleus jantan yang akan berfusi dengan
pronukleus betina
-Injeksi DNA ke sitoplasma Æ DNA tidak terintegrasi ke genom sel telur
-Setelah fertilisasi Æ telur cepat berkembang, diselimuti membran yang
kuat, diliputi oleh albumin yang tebal, dan dilapisi membran cangkang
dalam dan luar
Inokulasi embrio pada stadia blastoderma dengan vektor retrovirus
yang defektif replikasi dan gen penanda Æ ayam, puyuh transgenik
Æ retrovirus?
Cara lain: rekayasa sel
ESC unggas Æ belum diidentifikasi?
Sel blastoderma Æ liposom (lipid
kation) + transgen Æ introduksi ke
subgerminal embrio dari telur
Keturunan: campuran sel (donor+resipien)
Æ kimera
Seleksi kimera Æ sel nutfah transgenik Æ
persilangan
Radiasi (540-660 rad) terhadap embrio
resipien Æ meningkatkan rasio donor
Ayam transgenik:
-resistensi penyakit
-efisiensi pakan
-penurunan kadar lemak dan
kolesterol dalam telur
-kualitas daging
Ikan Transgenik
Mikroinjeksi DNA kedalam sel telur terbuahi: salem
Pronukleur tidak terlihat dengan mikroskop Æ DNA linier diinjeksikan
kedalam sitoplasma sel telur yang sudah dibuahi atau ke embrio
stadia awal (4 sel). Telur ikan berkembang di luar induk Æ suhu
lingkungan diatur
Setelah injeksi, 35-80% embrio hidup Æ transgenik 10-70%
Identifikasi transgen Æ PCR dengan cetakan DNA dari sel darah
merah
Transgenesis : GH
Promoter gen penyandi protein antibeku dari ocean pout + cDNA GH
salem + terminator gen antibeku dari ocean pout Æ salem atlantik
Salem transgenik: tumbuh cepat dan lebih besar (pada kondisi air
dingin Æ ekspresi GH sangat tinggi)