bio.unsoed.ac.id - Fakultas Biologi

III. METODE PENELITIAN
A. Materi
1. Materi Penelitian
Materi penelitian berupa benih ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V.)
berumur 1, 2, 3, dan 4 bulan hasil kejut panas pada menit ke 25, 27 atau 29 setelah
pencampuran milt dan oosit. Pakan Ikan berupa pelet komersial (dengan kandungan
nutrisi Protein 41% dan Lemak 6%). Bahan yang akan digunakan meliputi GnRH
analog + domperidon, parafin dengan titik leleh 56-58 oC, larutan bouin, balok es,
pewarna Carrazi’s Haematoxylin, eosin, gelatin 1%, xylol, alkohol 70%, alkohol
80%, alkohol 90%, alkohol 100%, giemza, metanol, dan akuades.
Alat yang digunakan pada penelitian ini yaitu water bath, saringan, spuit 1
ml, kertas tissue, pipet tetes, gelas ukur 100 ml, sendok plastik, botol fiksatif,
cetakan parafin terbuat dari kertas karton, steples, specimen holder, mikrotom putar
beserta asesorinya, lampu spiritus, kertas label, pinset, skapel, object glass, cover
glass, milimeter block, hot plate, eye piece graticle, cawan petri, oven inkubator,
mikroskop binokuler, camera digital, gunting bedah, aerator, countainer/wadah
pemeliharaan, dan wadah plastik.
B. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Struktur Perkembangan Hewan
Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. Penelitian dilaksanakan selama 9
bulan dimulai dari Mei 2014 – Februari 2015.
C. Metode Penelitian
1. Rancangan Percobaan
Penelitian dilakukan secara eksperimental menggunakan rancangan dasar
bio.unsoed.ac.id
berupa Rancangan Acak Lengkap (RAL) atau Completely randomized design
dengan 4 (empat) perlakuan dan 6 (enam) ulangan. Perlakuan yang dicobakan
meliputi:
1) Kejut panas 40oC selama 90 detik pada menit ke 25.
2) Kejut panas 40oC selama 90 detik pada menit ke 27.
3) Kejut panas 40oC selama 90 detik pada menit ke 29.
4) Kontrol (tanpa pemberian kejut panas).
9
2. Variabel yang diamati
Variabel bebas yang diamati yaitu waktu pemberian kejut panas,
sedangkan variabel tergantung adalah diferensiasi gonad. Parameter utama yang
diamati berupa struktur gonad, jumlah dan ukuran sel germinalis primordia, dan
volume gonad. Parameter pendukung meliputi panjang dan berat ikan,
pengukuran eritrosit, dan jumlah larva hidup pada akhir penelitian.
3. Bagan Alir
bio.unsoed.ac.id
Gambar 3.1. Bagan Alir Penelitian
10
4. Cara Kerja
4.1. Pemijahan dan Stripping Induk Ikan Nilem
Induk ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V.) jantan dan betina matang
gonad disiapkan, ovaprim disuntikkan kepada masing-masing induk ikan
nilem (Osteochilus hasselti C.V.) jantan dan betina, dengan dosis 0,5ml/kg
BB. Selanjutnya ditempatkan dalam satu akuarium dan ditunggu selama 8 10 jam. Pada saat induk telah menunjukkan tanda-tanda akan memijah,
masing-masing induk ikan jantan dan betina distripping untuk mendapatkan
milt dan oosit.
4.2. Perlakuan Poliploidisasi
Empat wadah plastik disiapkan sebagai kontrol, perlakuan 25 menit,
27 menit, dan 29 menit, milt dan oosit disatukan dibeberapa wadah plastik,
ditambahkan akuadest atau air untuk mengaktivasi sperma, kemudian wadah
plastik diagitasi secara perlahan, setelah itu sel telur disaring untuk
menghilangkan milt dan dimasukkan ke dalam wadah pertama sebagai
kontrol. Sel telur lainnya dimasukan ke kontainer yang telah diberi aerasi,
untuk selanjutnya akan diberi kejut panas pada menit ke 25, 27, dan 29 menit
setelah pencampuran milt dan oosit. Pada waktu yang telah ditentukan, sel
telur ditelakkan ke dalam saringan dan diberi kejut panas dengan
mencelupkan sel telur tersebut ke dalam water bath yang telah disiapkan pada
suhu 40oC. Pemberian kejut panas dilakukan selama 90 detik. Sel telur yang
telah diberi kejut panas dimasukkan ke dalam wadah penetasan yang telah
dipersiapkan agar embrio berkembang dan menetas
4.3. Pemeliharaan Benih Hasil Poliploidisasi
Larva hasil penetasan dari masing-masing perlakuan kejut panas
bio.unsoed.ac.id
dipelihara selama 4 bulan dalam kontainer bervolume 25 l yang masingmasing berisi 25 ekor. Pemberian pakan ikan dilakukan 2 kali sehari pada
pagi dan sore hari.
4.4. Pengukuran Panjang dan Berat Ikan
Pada hari ke 30, 60, 90, dan 120 setelah penetasan, secara acak diambil
6 ekor sampel, diamati morfologinya kemudian diukur panjang dan berat
11
masing-masing. Pengukuran panjang total ikan dilakukan menggunakan
kertas milimeter block dengan ketelitian 1mm. Pengukuran berat ikan
dilakukan menggunakan timbangan digital dengan ketelitian 0,01 mg,
kemudian hasil yang didapatkan dicatat, selanjutnya ikan difoto.
4.5. Pembuatan Sediaan Histologi
1) Ikan yang telah diukur panjang dan beratnya dimatikan.
2) Proses embedding menggunakan metode paraffin.
3) Setelah paraffin membeku direkatkan pada holder dari kayu dan diberi
kode nomor spesimen.
4) Pengirisan blok
paraffin dilakukan dengan
menggunakan
rotary
microtome dengan ketebalan 5 µm.
5) Pita yang didapatkan dari hasil pemotongan dicelupkan kedalam air hangat
dan kemudian dilekatkan ke objek glas yang telah dilapisi gelatin 1 %.
6) Proses Pewarnaan jaringan menggunakan Carrazi’s Haematoxylin dan
eosin (Prosedur lengkap pembuatan sediaan histologi gonad ikan nilem
disajikan pada Lampiran. 3).
4.6. Evaluasi Sediaan Histologi
Gonad diidentifikasi sebagai struktur berpasangan terletak di sebelah
ventral gelembung renang. Di dalam gonad terdapat primordial germ cell
berbentuk bulat dengan rasio inti terhadap sel relatif besar dengan inti
bersifat metakromatik dan jaringan somatis. Gonad dibungkus oleh lapisan
tunica dan dihubungkan dengan dinding dorsal tubuh melalui mesenterium
dorsal (Nakamura, 2013).
Seluruh irisan pada masing-masing sampel dievaluasi di mikroskop,
jumlah irisan yang memperlihatkan keberadaan gonad dihitung (I) . Jumlah
bio.unsoed.ac.id
irisan yang memiliki gonad dibagi sepuluh, hasil bagi tersebut (x) digunakan
sebagai interval dalam evaluasi struktur gonad. Pada setiap sampel
dievaluasi 10 irisan dengan jarak (x). Pada setiap irisan yang diamati diukur
luasnya (A) menggunakan eye piece graticle yang telah dikalibrasi
Volume gonad dihitung menggunakan Cavaliery principles dengan
rumus sebagai berikut:
V= A. x. 10. t
Keterangan t = ketebalan irisan gonad yaitu 5µ
12
Gambar 3.2. Skema Pengukuran Volume Gonad menggunakan eye piece graticle
Jumlah seluruh PGC pada setiap irisan yang digunakan untuk
pengukuran volume gonad dihitung dan dicatat. Diameter PGC diperoleh
dengan mengukur 10 sel pada setiap irisan yang digunakan untuk
pengukuran volume gonad.
4.7. Pengukuran Eritrosit
Sebagai data pendukung pada penelitian ini dilakukan pengukuran
dimensi eritrosit dan inti eritrosit serta dihitung volume eritrosit dan inti
eritrosit, luas eritrosit, rasio diameter panjang dan lebar inti dan eritrosit serta
rasio inti dan eritrosit. Sediaan eritrosit disiapkan dengan membuat preparat
apus darah yang diperoleh dari vena caudal masing-masing sampel (Prosedur
pembuatan sediaan apus darah disajikan pada Lampiran 2). Sebanyak 100 sel
dari masing-masing sampel digunakan untuk evaluasi ukuran eritrosit.
Pengukuran dilakukan menggunakan eye piece micrometer yang telah
dikalibrasi (Felip, 2009).
bio.unsoed.ac.id
Gambar 3.3. Skema Pengukuran Diameter Eritrosit
Luas Eritrosit dan luas inti eritrosit dihitung dengan menggunakan
rumus sebagai berikut :
S =  (a/2) x (b/2)
Keterangan :
a = diameter panjang
b = diameter lebar
13
Volume eritrosit dan volume inti eritrosit dihitung dengan
menggunakan rumus sebagai berikut :
Veritrosit
Vinti eritrosit
= 4/3 x  x (A/2) x (B/2)2
= 4/3 x  x (a/2) x (b/2)2
Keterangan :
A = Panjang eritrosit
B = Lebar eritrosit
a = Panjang inti eritrosit
b = Lebar inti eritrosit
D. Metode Analisis
Data hasil pengukuran volume gonad, jumlah dan ukuran PGC selanjutnya
dianalisis menggunakan ANOVA satu arah. Apabila nilai p<0,05 maka analisis
dilanjutkan dengan BNT. Struktur gonad dianalisis secara deskriptif. Keterkaitan
antara ukuran eritrosit (  panjang dan volume inti eritrosit) dan panjang tubuh
serta jumlah PGC dan volume gonad dianalisis menggunakan uji korelasi.
bio.unsoed.ac.id
14