1. PENGERTIAN DNA 1.1. STRUKTUR DAN
advertisement
1. PENGERTIAN DNA 1.1. STRUKTUR DAN KARAKTERISTIK DNA DNA (deoxyribo nucleic acid) adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik yang berguna perkembangan dan fungsi biologis seluruh organisme hidup. Fungsi utama dari molekul DNA adalah sebagai tempat penyimpanan informasi jangka panjang. DNA seringkali dianalogkan dengan blue print, karena DNA mengandung instruksi yang diperlukan dalam pembentukan komponen sel seperti protein dan molekul RNA. Segmen DNA yang membawa informasi genetik disebut gen. DNA berwujud dua rantai polimer panjang (double helix) yang terdiri dari komponen gula pentosa (deoksiribosa) dan gugus fosfat yang distabilisasi oleh ikatan hidrogen antar molekul basa yang terdapat pada kedua untai. Keempat basa DNA adalah Adenin (A), sitosin (C), guanin (G), dan timin (T), yang kemudian diklasifikasikan menjadi dua tipe, yaitu Purin (pasangan adenin dan guanin yang memiliki struktur cincin ganda) dan Pirimidin (pasangan sitosin dan timin yang mempunyai struktur cincin tungal). (1) Selain itu, DNA mempunyai unit esensial berupa kodon, yang merupakan triplet urutan basa dan masing-masing triplet mengkodekan sebuah asam amino tertentu. Kode genetik hanya menentukan struktur protein primer. Protein ini dapat merupakan komponen struktural makromolekul atau enzim yang mengendalikan sintesis non protein. (1) Pada organisme eukariotik, sebagian besar DNA berada pada inti sel (kromosom), yaitu yang disebut core DNA (c-DNA); dan sebagian kecil DNA berada dalam mitokondria (organel mitokondria), yaitu yang disebut mitokondria DNA (mt-DNA). c-DNA merupakan materi genetik yang membawa sifat individu dan diturunkan dari ayah dan ibu menurut hukum Mendel. Berdasarkan pola pewarisan ini, maka pemeriksaan c-DNA dapat digunakan untuk mencari hubungan anak-ibu maupun anak-bapak. (1) Gambar 1. Struktur Kimia DNA URL: http://schools-wikipedia.org/wp/g/Genetics.ht m Sedangkan mt-DNA merupakan materi genetik yang membawa kode genetik dari berbagai enzim dan protein yang berkaitan dengan proses pembentukan dan penuaan. Berbeda dengan c-DNA, mt-DNA berbentuk lingkaran ganda yang hanya diturunkan dari ibu kepada anak, sehingga pemeriksaan mt-DNA hanya dapat digunakan untuk mencari hubungan anak-ibu. Dalam forensik yang dimaksud dengan pemeriksaan DNA umumnya merujuk pada pemeriksaan c-DNA yang penggunannya lebih luas. (1) 1.2. KROMOSOM Setiap sel dalam tubuh seseorang memiliki rangkaian DNA identik. Rangkaian DNA setiap sel disebut kromosom. Setiap kromosom dibagi menjadi lokus-lokus yang menandai posisi gen dalam kromosom. Setiap sel dalam tubuh manusia memiliki 23 pasang kromosom yang terdiri atas 22 pasang kromosom autosomal dan satu pasang kromosom seks (XX pada wanita, dan XY pada laki-laki). Rangkaian DNA pada setiap orang didapatkan dari kontribusi sel ovum ibunya dan sel sperma ayahnya. Kromosom Y menempati posisi yang unik dalam hal kriminologi dan genealogi. Kromosom Y merupakan salah satu kromosom terkecil dari 23 pasang kromosom manusia, namun memiliki sejumlah gen aktif dan memiliki nilai penting dalam DNAtyping. (2) Kromosom Y mengandung SRY (Sex Determining Region Y) yang berperan menentukan kelelakian seseorang dengan peranannya mengatur terbentuknya hormon testosterone. Kromosom Y bersifat unik karena setiap kromosom Y pada seorang pria akan diturunkannya secara langsung hanya kepada anak laki-lakinya dan kemudian diteruskan oleh anak laki-lakinya kepada cucunya hingga keturunan laki-laki selanjutnya. Peran penting kromosom Y dalam DNA typing antara lain untuk kriminologi dan analisis forensik, analisis orang hilang, kasus warisan yang melibatkan keterkaitan genetik antara anggota keluarga laki-laki, kasus imigrasi untuk menentukan kekerabatan genetik, dan kepentingan antropologi. 2. (2) TES DNA 2.1. PENGERTIAN TES DNA Tes DNA adalah salah satu teknik biologi molekuler penanda genetik yang dipakai untuk pengujian terhadap materi profil DNA, yaitu sehimpunan data yang menggambarkan susunan DNA yang dianggap khas untuk individu yang menjadi sampelnya. Hanya sebagian kecil berkas DNA yang dipakai untuk pengujian, seperti bagian DNA yang berisi pengulangan urutan basa (variable number tandam repeats / VNRT). Tes DNA ini sangat dipercaya dan sudah diakui keabsahannya dapat mengidentifikasi seseorang dengan keakuratan mencapai 100 %, sehingga banyak dimanfaatkan dalam analisis, pihak kepolisian maupun pengadilan khusunya untuk membantu mengungkap suatu perkara. Adanya kesalahan bahwa kemiripan pola DNA bisa terjadi secara random (kebetulan) sangat kecil kemungkinannya, yaitu dengan peluang satu diantara satu juta. Jikapun terdapat kesalahan itu disebabkan oleh faktor human error terutama pada kesalahan interpretasi fragmen-fragmen DNA oleh operator (manusia). (1) DNA yang biasa digunakan dalam tes adalah c-DNA dan mt-DNA. Sampel DNA yang paling akurat digunakan dalam tes adalah c-DNA, karena inti sel tidak bisa berubah. Sementara mt-DNA dapat berubah karena berasal dari garis keturunan ibu yang dapat berubah seiring dengan perkawinan keturunannya. Namun, keunikan dari pola pewarisan mt-DNA tersebut sekaligus menjadi kelebihannya, sehingga mt-DNA dapat dijadikan sebagai marker (penanda) untuk tes DNA dalam upaya mengidentifikasi hubungan kekerabatan secara maternal. (3) 2.2. TUJUAN TES DNA Tes DNA pada umumnya digunakan untuk 2 tujuan yaitu (1) tujuan pribadi seperti penentuan perwalian anak atau penentuan orang tua dari anak (Tes Paternitas); dan (2) tujuan hukum, yang meliputi masalah forensik, seperti identifikasi korban yang telah hancur maupun untuk pembuktian kasus kejahatan semisal kasus pemerkosaan atau pembunuhan. (3) Tes paternitas adalah pemeriksaan yang dilakukan untuk mengetahui apakah seorang pria adalah ayah biologis dari seorang anak. Metode tes paternitas terbagi atas metode analisis DNA dan metode konvensional. Tes paternitas dengan menggunakan analisis DNA merupakan analisis informasi genetik yang sangat spesifik dalam membedakan ciri setiap individu, sehingga dapat memastikan (hampir 100%) bahwa sesorang adalah ayah biologis si anak atau bukan. Sedangkan metode konvensional dengan analisis fenotip dibagi menjadi tiga, yaitu 1. Sistem sel darah merah terdiri dari: sistem ABO, Rhesus (Rh), MNS, Kell (K), Duffy (Fy), Kidd (Jk), Lutheran. 2. Sistem biokimia meliputi pemeriksaan plasma protein dan enzim sel darah merah terdiri dari: haptoglobin (Hp), phosphoglucomrantaie (PGM), Esterase D (EsD), Erythrocyte Acid Phosphatase (EAP), Glyoxalase (GLO), Adenosine Deaminase (ADA), Adenylate Kinase (AK), Group specific Component (GC), Gm dan KM. 3. Human Leucocyte Antigen (HLA) yang mengidentifikasi antigen pada leukosit. 2.3. SAMPEL DAN PENYIAPAN SAMPEL UNTUK TES DNA Hampir semua sampel biologis tubuh seperti darah dan bercak darah, seminal, cairan vaginal, dan bercak kering, rambut (baik rambut lengkap dengan akarnya atau hanya batang rambut), epitel bibir (misal pada puntung rokok), sel buccal, tulang, gigi, saliva dengan nukleus (pada amplop, perangko, cangkir), urine, feces, kerokan kuku, jaringan otot, ketombe, sidik jari, atau pada peralatan pribadi dapat digunakan untuk sampel tes DNA, tetapi yang sering digunakan adalah darah, rambut, usapan mulut pada pipi bagian dalam (buccal swab), dan kuku. Untuk kasus-kasus forensik, sampel sperma, daging, tulang, kulit, air liur atau sampel biologis lain yang ditemukan di tempat kejadian perkara (TKP) dapat dijadikan sampel tes DNA. (4,5,6) Tahap pengambilan dan penyimpanan bahan atau sampel merupakan tahapan yang vital, dan harus dilakukan dengan prinsip-prinsip di bawah ini: (6) 1. Hindari tempat yang terkontaminasi DNA dengan tidak menyentuh objek secara langsung dengan tangan, tidak bersin atau batuk di dekat barang bukti. 2. Menggunakan sarung tangan bersih untuk pengumpulan barang bukti. Sarung tangan harus diganti untuk setiap penanganan barang bukti yang berbeda 3. Setiap barang bukti harus disimpan terpisah. 4. Bercak darah, bercak sperma, dan bercak lainnya harus dikeringkan dahulu sebelum disimpan. 5. Sampel harus disimpan pada amplop atau kertas setelah dikeringkan. Jangan menggunakan bahan plastik karena plastik dapat mempercepat degradasi molekul DNA. Setiap amplop harus ditandai nomor kasus, nomor bukti, waktu pengumpulan. 6. Bercak pada permukaan meja atau lantai dapat diambil dengan swab kapas steril dan alkohol. Keringkan kapas tersebut sebelum dibawa. o 7. Di laboratorium, sampel DNA disimpan dalam kulkas bersuhu 4 C atau dalam o freezer bersuhu -20 C. Sampel yang akan digunakan dalam waktu yang lama, o dapat disimpan dalam suhu -70 C. Secara umum DNA dapat rusak akibat pengaruh lingkungan seperti paparan sinar matahari, terkena panas, bahan kimia, air dan akibat kerja enzim DNAase yang terdapat dalam jaringan sendiri. Untuk itu terhadap berbagai bahan sampel tersebut harus diberi perlakuan sebagai berikut: (4,7) 1. Jaringan, organ dan tulang. (8) Bila masih segar, ambil tiap bagian dengan pinset lalu masukkan masing-masing bagian ke dalam wadah tersendiri. Beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, simpan di pendingin lalu kirim ke laboratorium. Namun bila sampel tidak lagi segar (busuk), ambil sampel, bungkus dengan kerta alumunium, dan bekukan o pada suhu -20 C. Beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, lalu kirim ke laboratorium. 2. Darah dan bercak darah (seperti darah pada pakaian, karpet, tempat tidur, perban). - Darah o (7,8) Darah cair dari seseorang. Ambil dengan menggunakan semprit. Masukkan ke dalam tabung yang diberikan pengawet EDTA ± 1 ml darah. o Beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, simpan dalam termos es, lemari es atau kirim ke laboratorium. Darah cair di TKP. Ambil dengan menggunakan semprit, pipet atau kain. Masukkan ke dalam tabung yang berisikan pengawet EDTA. Bila membeku, ambil dengan menggunakan spaltel. Beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, simpan di termos es, lemari es, atau kirim ke laboratorium. o Darah cair dalam air/salju/es. - Sesegera mungkin, ambil secukupnya, masukkan ke dalam botol. Hindari kontaminasi, beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, simpan atau kirim ke lab. Bercak darah basah. o Ditemukan pada pakaian Pakaian dengan noda ditempatkan pada permukaan bersih dan keringkan. Setelah kering, masukkan kantong kertas atau amplop. Beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, kirim ke laboratorium. o Ditemukan pada benda. Bila benda kecil biarkan kering, tetapi pada benda besar, hisap bercak tersebut dengan kain katun dan keringkan. Masukkan amplop, beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, dan kirim ke laboratorium. o Ditemukan pada karpet atau benda yang dapat dipotong. Potong bagian yang ada nodanya. o Tiap potongan diberi label yang jelas, sertakan potongan yang tidak ada nodanya sebagai kontrol. Kirim ke laboratorium. Percikan darah kering Gunakan celotape, tempelkan pada percikan noda. Masukkan celotape tersebut kedalam kantong plastik. Beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, kirim ke laboratorium. 3. Sperma dan bercak sperma.(8) - Sperma cair. a. Hisap dengan semprit, masukkan ke dalam tabung. b. Atau dengan kapas, keringkan. c. Beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, lalu kirim ke laboratorium. - Bercak sperma pada benda yang dipindah (misalnya pada celana). a. Bila masih basah, keringkan. b. Bila kering, potong pada bagian yang ada nodanya, dan masukkan ke dalam amplop. c. Beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, lalu kirim ke laboratorium. - Bercak sperma pada benda besar yang bisa dipotong (misalnya pada karpet). o Potong pada bagian yang bernoda. o Masukkan ke dalam amplop. o Beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, lalu kirim ke laboratorium. - Bercak pada benda yang tidak dapat dipindah dan tidak menyerap (misal: lantai). o Kerok bercaknya, lalu masukkan kertas. o Lipat kertas hingga membungkus kerokan, masukkan ke dalam amplop. o Beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, lalu kirim ke laboratorium. 4. Urine, saliva dan cairan tubuh yang lain. - Sampel cair (8) a. Urine atau saliva dimasukkan ke dalam tempat steril. b. Simpan di pendingin, beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, lalu kirim ke laboratorium. - Bercak urine, saliva a. Dugaan noda, dikerok atau potong lalu kumpulkan. b. Masukkan amplop, beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, lalu kirim ke laboratorium. 5. Rambut dan gigi. - Rambut. (8) a. Cabut beberapa helai rambut (10-15 helai) dengan akarnya. Hatihati bila tercampur dengan darah b. Tempatkan pada wadah, beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel. Kirim ke laboratorium. - Pulpa Gigi a. Cabut gigi yang masih utuh. Sampel gigi sebaiknya tidak dirusak oleh endodontia. b. Masukkan ke dalam kantong plastik, beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel. 2.4. TEKNIK TES DNA Beberapa kelebihan tes DNA dibandingkan dengan pemeriksaan konvensional lainnya adalah sebagai berikut: (7,9) 1. Ketepatan yang lebih tinggi. Sebagai contoh dalam pemeriksaan suatu bercak darah sebelum ditemukannya pemeriksaan DNA dilakukan pemeriksaan golongan darah. Hasil pemeriksaan golongan darah yang tidak cocok akan menyebabkan orang yang dicurigai tersingkir sebagai sumber darah tersebut, namun jika cocok maka merupakan suatu kemungkinan saja. Sedangkan hasil pemeriksaan DNA terhadap bercak darah tersebut akan nyaris sempurna dalam menentukan siapa sumber bercak darah tersebut. 2. Kestabilan yang tinggi. Pada kasus-kasus dimana bukti sebagai sampel sudah membusuk, maka hanya tes DNA yang masih dapat dilakukan, karena DNA bersifat tahan pembusukan dibandingkan protein. 3. Pilihan sampel yang luas. Penyebaran DNA hampir pada seluruh bagian tubuh membuat sampel untuk tes DNA dapat diambil dari berbagai bagian tubuh kecuali sel darah merah. 4. Dapat mengungkap kasus sulit Hanya tes DNA yang dapat dilakukan untuk pemecahan kasus-kasus sulit yang tidak dapat dipecahkan oleh metode konvensional antara lain seperti: penentuan keayahan, kasus incest, kasus paternitas dengan bayi dalam kandungan, kasus paternitas dengan bayi yang sudah meninggal dan kasus paternity tanpa kehadiran sang “ayah”. 5. Dapat mengungkap kasus perkosaan dengan banyak pelaku, pemeriksaan DNA dapat memastikan berapa orang pelaku dan siapa saja pelakunya. 6. Sensitifitas yang amat tinggi Sensitifitas tes DNA dapat mencapai 99,9 %. Tes DNA juga dapat dilakukan pada sampel dengan jumlah kecil dengan metode PCR. Adapun jenis-jenis teknik analisa DNA adalah sebagai berikut: (10) 1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Teknik pertama yang digunakan analisa DNA dalam bidang forensik adalah RFLP. Polimorfisme yang dinamakan Restriction Fragment Leght Polymorphism (RFLP) adalah suatu polimorfisme DNA yang terjadi akibat variasi panjang fragmen DNA setelah dipotong dengan enzim retriksi tertentu menjadi fragmen Variable Number Of Tandem Repeat (VNTR). Teknik ini dilakukan dengan memanfaatkan suatu enzim restriksi yang mampu mengenal urutan basa tertentu dan memotong DNA (biasanya 4-6 urutan basa). (10,11) Urutan basa tersebut disebut sebagai recognition sequence. Enzim restriksi ini dihasilkan oleh bakteri dan dinamakan menurut spesies bakteri yang menghasilkannya. Enzim yang berbeda memiliki recognition sequence yang berbeda, sehingga panjang segmen tersebut bervariasi pada tiap orang, hal ini disebabkan karena titik potong enzim yang berbeda dan panjang segmen antara titik potong juga berbeda. (11,16) Analisa yang dihasilkan adalah variasi pada panjang fragmen DNA yang telah ditentukan. Setelah selesai, pola RFLP tampak seperti kode batang (bar code). Saat membandingkan hasil analisa dua sampel, pola batang pada autoradiograf dibandingkan untuk menentukan apakah kedua sampel tersebut berasal dari sumber yang sama. (8,12) Proses pada teknik RFLP diawali dengan proses pemotongan dengan menggunakan enzim restriksi tertentu menjadi segmen-segmen yang berbeda. Kemudian dengan menggunakan gel yang dialiri arus listrik, potongan DNA diurutkan berdasarkan panjangnya. Proses ini dinamakan electrophoresis, dan prinsip pada proses in adalah potongan DNA yang lebih pendek bergerak lebih cepat daripada yang lebih panjang. Gambar 2. Analisis DNA dengan RFLP URL: http://www.scq.ubc.ca/dna-fingerprinting-in-thestandardization-of-herbs-and-nutraceuticals/ Untuk mendeteksi adanya segmen yang bersifat polimorfik maka dilakukan suatu prosedur yang disebut sebagai Southern Blooting. Dalam prosedur ini pada gel ditambahkan suatu zat kimia yang berfungsi untuk memisahkan rantai ganda menjadi rantai tunggal, kemudian membran nilon diletakkan diatas gel dan bahan penyerap diatas membran nilon. Cairan akan bergerak ke dalam bahan penyerap bersama potongan DNA rantai tunggal. (7,13) Kemudian dengan menggunakan fragmen pendek DNA (DNA probe) yang mengandung petanda radioaktif maka akan dideteksi DNA yang berasal dari lokasi pada genome yang memiliki ciri yang jelas dan sangat polimorfik. Pada proses ini DNA probe akan berikatan dengan potongan DNA rantai tunggal dan membentuk DNA rantai ganda pada bahan nilon. DNA probe yang tidak berikatan akan dicuci. Membran nilon yang berisi potongan DNA yang telah ditandai dengan DNA probe selanjutnya ditransfer pada selembar film X-ray. Pada proses ini akan tampak hasil berupa kode batang yang disebut autorad. Pola inilah yang dibandingkan untuk mengetahui apakah kedua sampel bersal dari sumber yang sama. Pada teknik RFLP tidak hanya digunakan satu DNA probe, diamana DNA probe yang berbeda menandai lokus yang berbeda. (7,13) Keunggulan RFLP adalah sifatnya yang kodominan, cukup berlimpah dalam arti lokus-lokus yang dipergunakan untuk RFLP dapat menunjukkan ratusan variasi untuk tiap lokus, mampu memeriksa lebih dari satu lokus, serta frekuensi polimorfismenya tinggi karena hipervariabilitas pada tiap lokus. Selain itu, penanda ini mudah dipetakan dalam peta genetik, serta tidak mudah berubah hasilnya bila diulang (stabil). Karena bukan berbasis PCR, penanda ini tidak spesifik spesies sehingga bisa digunakan untuk perbandingan peta genetik spesies yang berbeda-beda. Dengan demikian jika dua sampel berasal dari sumber yang berbeda, RFLP mampu membedakannya menggunakan jumlah lokus yang lebih sedikit. RFLP dapat menentukan apabila sebuah sampel berasal dari lebih satu sumber dan dapat membedakan sumbernya dengan baik. (7,11,13) Namun kelemahannya, penanda ini memerlukan DNA dalam jumlah besar, memakan waktu lama (± 3 hari), serta melibatkan penggunaan pelabelan isotop radioaktif pada teknik yang pertama kali digunakan. Kelemahan yang terakhir ini dapat diatasi setelah ditemukan teknik tanpa radioaktif. (7,11,13) 2. Polymerase Chain Reaction (PCR) Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu metode untuk memperbanyak DNA template tertentu dengan enzim polymerase DNA. Reaksi teknik ini didesain seperti meniru penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup, hanya pada segmen tertentu dengan bantuan enzim DNA polymerase sebanyak 20 hingga 40 siklus (umumnya 30 siklus), dengan tingkat akurasi yang tinggi. Proses ini berlangsung secara in-vitro dalam tabung reaksi sebesar 200 µl. Walaupun dengan sampel DNA yang sedikit atau sudah mulai terdegradasi, PCR mampu menggandakan atau mengkopi DNA template hingga miliaran kali jumlah semula sehingga dapat diperoleh informasi. (7,10,13,14) Gambar 3. Siklus copy DNA template pada PCR. URL: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.htm l Sampel DNA yang disiapkan untuk metode PCR dapat dianalisa menggunakan beberapa cara. Secara umum variasi per lokus sampel DNA yang disiapkan melalui PCR lebih rendah daripada variasi pada RFLP. Dengan demikian hasil dapat diperoleh dari sampel yang kurang secara kualitas maupun kuantitas namun kekuatan diskriminasinya lebih rendah dengan jumlah lokus yang sama. Kekuatan metode Analisa PCR adalah kemampuan untuk menganalisa beberapa lokus secara bersamaan dengan proses yang otomatis. (7,10,13) PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu secara cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath), berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Tapi sekarang mesin Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan. (14) Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah: (14) a. DNA Primer. DNA primer adalah sepasang DNA rantai tunggal atau oligonukleotida pendek yang memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, dibuat secara sintetis, dan dirancang agar menempel mengapit pada daerah tertentu yang diinginkan, serta mampu menunjukkan urutan DNA yang akan diperbanyak, menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. b. dNTP (deoxynucleoside triphosphate). dNTP atau building blocks merupakan ‘komponen’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. c. Buffer. Buffer yang biasanya digunakan terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. d. Ion Logam. i. Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja. ii. Ion logam monovalen, kalsium (K+) e. Master-Mix Master-mix terdiri dari 32 µl air. 5 µl PCR-Buffer (dengan Mg ). 5µl dNTP-Mix. 2 µl D1S80 Primer-Mix. 2+ 1 6 1 µl Taq Polymerase 45 µl (per orang). Proses yang terjadi pada teknik ini serupa dengan cara DNA memperbanyak jumlahnya dalam sel. Ada tiga tahap yang dilakukan di laboratorium. Pertama, proses yang dinamakan Denaturation, yaitu dengan memanaskan segmen atau urutan DNA rantai ganda o pada suhu 96 , sehingga DNA rantai ganda akan memisah menjadi rantai tunggal. Tahap kedua yaitu proses Annealing atau Hybridization, pada proses ini setiap rantai tunggal tersebut dipersiapkan dengan cara mengikatkannya dengan DNA primer. Tahap ini dilakukan o dengan menurunkan suhu hingga ke kisaran 40–60 C selama 20-40 detik. Tahap Ketiga, disebut Extension atau Elongasi. Pada tahap ini, DNA polymerase ditambahkan dan dilakukan peningkatan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, yaitu o suhu 70-72 C. Kemudian, DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai dengan pasangannya, dilanjutkan dengan proses replikasi. Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung, dan lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi. Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut, yaitu tahap Pra-denaturasi. Tahapan ini dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase. Tahap terakhir yang dilakukan setelah siklus PCR terakhir disebut tahap Final Elongasi. Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72 oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap rantai tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Gambar 4. Proses PCR yang terjadi di Laboratorium. URL: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.htm l (10) Keunggulan PCR dibandingkan RFLP adalah: a. Simpel dan mudah dilaksanakan di laboraturium. b. Hasil diperoleh dalam waktu singkat (dalam beberapa hari) c. Oleh karena kapasitas produksi segmen DNA yang tidak terbatas maka metode yang berdasarkan PCR memungkinkan untuk menganalisa DNA dalam jumlah sangat sedikit. Kekurangan metode PCR adalah: (10,12) a. Mudah terkontaminasi Kontaminasi merupakan masalah yang besar pada PCR karena sistem ini memperbanyak DNA yang ada dengan tingkat akurasi yang tinggi. Sebuah molekul DNA dapat menjadi jutaan bahkan milyaran DNA dalam waktu tiga jam, jika ada sebuah molekul DNA bakteri atau kontaminan lain tercampur maka molekul tersebut juga akan diperbanyak dalam laju yang sama sehingga akan terjadi salah kesimpulan. b. Kebanyakan lokus dalam PCR memiliki alel lebih sedikit dibandingkan VNTR pada metode RFLP. c. Tidak seperti VNTR yang menggunakan area yang tidak berfungsi, beberapa lokus dari PCR adalah gen yang fungsional, ini berarti telah terjadi seleksi alam yang menyebabkan perbedaan yang lebih besar dari subgroup populasi. 3. Short Tandem Repeats (STRs) Metode STRs (Short Tandem Repeats) adalah salah satu metode analisis yang berdasar pada metode Polymerase Chain Reaction (PCR). STRs (Short Tandem Repeat) adalah suatu istilah genetik yang digunakan untuk menggambarkan urutan DNA pendek (2 – 5 pasangan basa) yang diulang. Genome setiap manusia mengandung ratusan STRs. Metode ini paling banyak dikembangkan karena metode ini cepat, otomatis dan memiliki kekuatan diskriminasi yang tinggi. Dengan metode STRs dapat memeriksa sampel DNA yang rusak atau dibawah standar karena ukuran fragmen DNA yang diperbanyak oleh PCR hanya berkisar antara 200 – 500 pasangan basa. Selain itu pada metode ini dapat dilakukan pemeriksaan pada setiap lokus yang memiliki tingkat polimorfisme sedang dengan memeriksa banyak lokus dalam waktu bersamaan. Teknik yang digunakan adalah multiplexing yaitu dengan memeriksa banyak lokus dan berbeda pada satu tabung. Dengan cara ini dapat menghemat waktu dan menghemat sampel. Analisis pada teknik ini didasarkan pada perbedaan urutan basa STRs dan perbedaan panjang atau pengulangan basa STRs. (7,10) Namun metode STRs memiliki kelemahan yaitu mensyaratkan penggunaan tiga belas lokus sedangkan DNA inti hanya memliki dua salinan molekul dalam setiap sel. Hal ini menyulitkan untuk menganalisis ketigabelas lokus tersebut, terutama pada laboratorium dengan prasarana sederhana. (15) 4. Y-Short Tandem Repeats (Y-STRs) Y-STRs adalah STRs yang ditemukan pada kromosom Y. Y-STRs dapat diperiksa menggunakan jumlah sampel kecil dan rusak dengan metode dan alat yang sama dengan pemeriksaan STRs pada kromosom autosomal. Karena kromosom Y hanya terdapat pada pria maka Y- STRs dapat berguna untuk menyaring informasi genetik yang spesifik dari pria yang yang menjadi sampel. Gambar 5. Sebuah STR profil manusia parsial. URL: http://www.thefullwiki.org/Short_tandem_repeat Pemeriksaan Y-STRs dapat digunakan untuk memeriksa sampel tanpa sperma yang bercampur antara sampel laki-laki dan perempuan, seperti sampel darah atau air liur yang diambil dari korban kasus perkosaan. Pemeriksaan ini juga dapat mendeteksi profil pria ketika hanya profil wanita yang tampak jelas saat menggunakan STRs. Karena kromosom Y tidak mempunyai homolog pada genom manusia, maka disebut hemizygous. Kromosom Y tidak mempunyai partner yang sama seperti pada kromosom autosomal. Walaupun ia berpasangan selama pembelahan sel, rekombinasi genetik yang terjadi hanya sedikit atau tidak ada sama sekali, hal ini diwariskan kepada keturunannya. Y-STRs sangat berguna untuk menyelesaikan kasus disputed paternity pada anak laki-laki, karena kromosom Y diturunkan oleh ayah kepada anak laki-laki. (7,13) 5. Mitochondrial DNA (mt-DNA) Aplikasi penggunaan mt-DNA dalam identifikasi forensik dimulai pada tahun 1990. Mitokondria adalah partikel intraselular yang terdapat di luar nukleus dalam sitoplasma sel. Mitokondria mengandung DNA kecil berupa molekul berbentuk sirkular yang terdiri dari 16569 pasangan basa yang dapat diidentifikasi. Setiap sel mengandung 100 – 1000 mitokondria. Ciri khas dari mt-DNA adalah pola penurunannya. Tidak seperti DNA inti yang tersusun dari kombinasi separuh DNA orang tua, mt-DNA hanya mengandung DNA ibu. Mitokondria diturunkan melalui sel telur tidak melalui sperma walaupun sperma secara struktural juga mengandung mitokondria dalam jumlah kecil, hal ini disebabkan karena bagian mitokondria sperma tidak masuk ke dalam sel telur sehingga hanya mitokondria ibu yang secara normal diturunkan pada anaknya. (7,10) mt-DNA bersifat seperti kromosom Y yang tidak mempunyai homolog pada genom manusia, maka disebut hemizygous hal ini menyebabkan mt-DNA dan Kromosom Y diturunkan secara spesifik. Jika dari pemeriksaan mt-DNA dapat mengetahui garis ibu, maka dari pemeriksaan Kromosom Y dapat mengetahui garis ayah pada anak laki-laki. Perbedaan yang terlihat bahwa mt-DNA adalah marker sitoplasmik yang diturunkan ibu kepada semua anaknya sedangkan Kromosom Y adalah marker nuklear yang hanya diturunkan seorang ayah pada anak laki-lakinya. (7) 6. CODIS (Combined DNA Index System) CODIS merupakan analisis DNA yang baru dikembangkan FBI. FBI memilih 13 STR yang digunakan sebagai deretan lokus utama standar dan meningkatkan pengembangan kemampuan laboraturium untuk melakukan pemeriksaan pada lokus tersebut. Laboratorium di seluruh dunia menggunakan lokus yang sama. Pengumpulan 13 lokus utama meningkatkan kemampuan diskriminasi. Kemungkinan ditemukan kecocokan antara dua orang yang tidak berhubungan berdasarkan random di Caucasian Amerika adalah satu diantara 575 trilyun. Angka kemungkinan ini lebih kecil dibandingkan UK system. FBI secara aktif dilibatkan dalam pengumpulan data frekuensi populasi pada grup dan subgrup populasi yang berbeda. Populasi ini kemudian dibagi lagi, misalnya data dari Jepang, Cina, Korea dan Vietnam. Pada dunia bagian barat terdapat data untuk Bahamian, Jamaica dan Trinidadian. (10,12,13,16) FBI menyediakan software sebagai fasilitas pada penggunaan CODIS, termasuk pelatihan penggunaan sistem serta menyediakan dukungan bagi laboraturium untuk melakukan analisis DNA. CODIS menggunakan dua indeks atau putunjuk untuk melakukan pemeriksaan pada kasus kriminal dengan analisis dna. Convicted Offender Index mengandung profil narapidana yang melakukan tindakan criminal. The Forensik Index mengandung profil DNA dari fakta yang didapatkan pada kasus criminal misalnya (10) darah atau semen. Kedua indeks ini didapatkan dengan komputer. Teknologi DNA bagi kepentingan forensik Pada kriminalitas dengan kekerasan, darah atau jaringan lain dalam jumlah kecil dapat tertinggal di tempat kejadian perkara (TKP) atau pada pakaian atau barang-barang lain milik korban atau penyerangnya. Jika ada perkosaan, air mani dalam jumlah kecil dapat ditemukan dari tubuh korban, jika jaringan atau air mani cukup tersedia, maka laboratorium forensik dapat menentukan jenis darah atau jenis jaringan dengan menggunakan antibodi untuk menguji protein permukaan sel yang spesifik. Akan tetapi, pengujian seperti ini membutuhkan jaringan yang agak segar dalam jumlah yang relatif banyak. Selain itu, karena terdapat banyak orang dalam populasi dengan jenis darah atau jaringan yang sama, pendekatan ini hanya dapat mengarah ke seseorang tersangka; pendekatan ini tidak dapat memberikan bukti kuat tentang pelakunya. Di lain pihak, pengujian DNA dapat mengidentifikasi pelaku dengan derajat kepastian yang jauh lebih tinggi, karena urutan DNA setiap orang itu unik (kecuali untuk kembar identik). Analisis RFLP dengan Southern blotting merupakan metode ampuh untuk pendeteksian kemiripan dan perbedaan sample DNA dan hanya membutuhkan darah atau jaringan lain dalam jumlah yang sangat sedikit (kira-kira 1.000 sel). Misalnya, dalam kasus pembunuhan metode ini dapat digunakan untuk membandingkan sample DNA dari tersangka, korban, dan sedikit darah yang dijumpai di TKP. Probe radioaktif menandai pita elektroforesis yang mengandung penanda RFLP tertentu. Biasanya saintis forensic menguji kira-kira lima penanda; dengan kata lain hanya beberapa bagian DNA yang diuji. Akan tetapi, rangkaian penanda dari suatu individu yang demikian sedikit pun sudah dapat memberikan sidikjari DNA, atau pola pita spesifik yang berguna untuk forensic karena probabilitas bahwa dua orang (yang bukan kembar identik) akan memiliki rangkaian penanda RFLP yang tepat sama adalah sangat kecil. Autoradiograf meniru jenis bukti yang disajikan kepada para juri dalam pengadilan percobaan pembunuhan. Saat ini, sebagai ganti RFLP, variasi dalam panjang DNA satelit semakin banyak digunakan sebagai penanda untuk penyidikjarian DNA. DNA satelit terdiri atas urutan basa yang berulang secara tndem (berurut) di dalam genomnya. Urutan satelit yang paling bermanfaat untuk keperluan forensic ialah mikrosatelit yang panjangnya kira-kira 10-100 pasangan basa, yang memiliki unit berulang hanya beberapa pasangan basa, dan yang sangat bervariasi dari satu orang ke orang yang lain. Misalnya satu individu dapat saja memiliki unit ACA yang berulang 65 kali pada satu lokus genom, 118 kali pada lokus kedua, dan seterusnya, sementara individu lain agaknya akan memiliki jumlah pengulangan yang berebeda pada lokus-lokus tersebut. Lokus genetic polimorgik tersebut biasanya disebut perulangan tandem sederhana (STR – simple tandem repeat). Fragmen restriksi yang mengandung STR bervariasi ukurannya di anatara individu-individu Karena perbedaan dalam panjang STR, dan bukannya disebabkan oleh perbedaan jumlah tempat restriksi di dalam daerah genom, seperti dalam analisis RFLP. Semakin banyak penanda yang diperiksa dalam suatu sampel DNA akan semakin unik sidikjari DNA menggambarkan satu individu. PCR sering digunakan untuk secara elektroforesis. Karena kekuatan selektifnya, PCR sangat bernilai dalam jumlah yang sangat kecil. Sampel jaringan sekecil 20 sel sudah mencukupi untuk PCR. Bagaimanakah kehandalan sidikjari DNA ini? Sidikjari DNA seseorang akan benarbenar unik jika memang layak untuk melakukan analisis fragmen restriksi pada seluruh genom orang tersebut. Pada prakteknya, seperti yang telah dijelaskan, pengujian sidikjari DNA berfokus hanya pada kira-kira lima daerah yang sangat kecil dari suatu genom. Akan tetapi, daerah DNA yang dipilih merupakan daerah yang diketahui sangat bervariasi dari satu orang ke orang lainnya. Pada sebagian kasus forensik, probabilitas dua orang memiliki sidikjari DNA yang sama ialah antara satu dalam 100.000 hingga satu dalam satu miliar. Angka yang tepat bergantung pada jumlah penanda yang dibandingkan dan pada frekuensi penanda ini dalam populasinya. Informasi tentang bagaimana berbagai penanda yang sama berada dalam kelompok etnik yang berbeda adalah merupakan kuncinya karena frekuensi penanda ini dapat sangat berbeda dari frekuensi pada populasi itu secara keseluruhan. Data seperti itu sekarang telah membuat para saintis forensik dapat membuat perhitungan statistik yang sangat akurat. Dengan demikian, meskipun ada masalah-masalah yang timbul dari data statistik yang tidak mencukupi, kesalahan manusia (human error), atau bukti cacat, sidikjari DNA sekarang diterima sebagai bukti penguat oleh pakar hukum dan saintis sejenis. Banyak argumentasi mengatakan bahwa bukti DNA lebih handal daripada saksi mata dalam menempatkan tersangka pada TKP. Pengadilan pembunuhan O.J. Simpson pada tahun 1995 membuat ”sidikjari DNA” menjadi istilah rumah tangga, dan jenis bukti ini akan memiliki dampak forensik yang meningkat. (17) DAFTAR PUSTAKA Cantor Charles, Spengler Sylvia. Primer www.ornl.gov/hgmis/publicat/primer/toc. on Molecular Genetiks. URL: http:// 1. Kolbinsky L, Levine, Margolis-Nuno H. 2007. Analysis DNA Forensik. Chelsea House of Publishing Infobase, New York. M. Gunawan Abdillah. Tahapan Tes DNA. URL: http:// www.klikp21.com Anonim.. Forensic DNA Testing. URL: http:// www.800dnaexam.com/forensic_DNA_ testing.aspx Andraea Petrophylla. Tes DNA. URL: http://www.ripiu.com/article/read/klik4orofit-tes-dna. Anonim. Pengumpulan Sampel, Ekstraksi DNA, http://www.freewebs.com/pengumpulansampeldna.htm dan Kuantifikasi DNA. URL: 2. Modul Bahan Ajar, Proyek Pengembangan Kewirausahaan Melalui Integratif Bahan Ajar Kriminalistik. Buku II. Jakarta: Universitas Indonesia, 2000. 3. Putu Sudjana L Hoediyanto. Pengumpulan dan Cara Pengiriman Bahan Pemeriksaan Analisa DNA. Bagian/Instalasi Ilmu Kedokteran Forensik. FK UNAIR – RSU dr. Soetomo. Surabaya. Anonim. Pusdokkes Polri The Indonesian police centre for medical and Health Service. URL: http://www.pusdokkes.polri.go.id/naskah/dokpol/ladokpoli.html. Samuels Julie E., Asplen Christopher The Future of Forensik DNA Testing, Prediction of the Research and Development Working Group. URL: http://www.denverda.org/DNA/ ForensikDNAArticles.htm Anonim. Polimorfisme Panjang Berkas Restriksi URL: http://id.wikipedia.org/wiki/ Polimorfisme Panjang_Berkas_Restriksi Curran Thomas. Forensik DNA Analisys : Technology and Aplication. Available at: http ://www. denverda. org/DNA/Forensik_ DNA_ Articles.htm. Accessed on: August 10, 2009. 4. Norah Rudin & Keith Inman. Introduction to Forensik DNA Analysis. 2 York Washington DC: CRC Press LLC, 2002 nd ed. London New Anonim. Mengenal PCR (Polymerase Chain http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerase-chain-reaction/ Reaction) URL: Anonim. URL. http://www.chem-is-try.org/artikel.../di-balik-teknologi-tes-dna Anonim. DNA Genetik Testing-Paternity and Forensik Use. URL: http://www.genetiks.edu.au 5. Neil A. Campbell. Biologi Jilid I. Edisi V. Jakarta: Erlangga, 2002.
