Tingkat Resistensi Merkuri Dan Variasi Fragmen Genom Bakteri

Tingkat Resistensi Merkuri Dan Variasi Fragmen Genom Bakteri Bacillus
Dari Kali Mas Surabaya
Tutut Arinda*, Maya Shovitri1,
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya
Gedung H Kampus ITS Sukolilo, Surabaya 60111, Indonesia
Abstrak
Bacillus merupakan bakteri yang dapat ditemukan di berbagai macam habitat seperti lingkungan yang
tercemar merkuri. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui kisaran resistensi genera Bacillus
terhadap merkuri dengan metode streak plate secara aseptis pada medium nutrient agar yang
mengandung HgCl2 dengan konsentrasi 10-50 ppm dan mengetahui keanekaragaman genetik isolat
Bacillus menggunakan metode analisis genom menggunakan enzim restriksi AluI dan NcoI. Isolat
yang digunakan adalah isolat koleksi laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi, Jurusan Biologi
FMIPA-ITS, yaitu S1, SA1, SS19, DA11, dengan species referensi Bacillus cereus dan Bacillus
subtilis. Hasil uji resistensi menunjukkan semua isolat Bacillus yaitu isolat S1, SA1, SS19 dan DA11
serta isolat kontrol mampu tumbuh pada medium NA-Hg sampai dengan konsentrasi 50 ppm, dengan
persentase pertumbuhan yang berbeda tergantung pada kemampuan isolat masing-masing.
Berdasarkan pola fragmentasi genom setelah dipotong dengan enzim AluI terlihat bahwa nilai
persentase similaritas antara isolat SA1 dengan isolat Bacillus subtilis sebesar 47.1% dan isolat SA1
dengan isolat Bacillus cereus sebesar 57.1%. Karena sedikitnya jumlah fragmen genom yang
dihasilkan enzim NcoI maka nilai persentase similaritas antar isolat tidak dapat ditentukan.
Kata Kunci : Bacillus, enzim restriksi endonuklease, keanekaragaman genetik, merkuri, resistensi
Abstract
Bacillus is a bacteria that can be found in various habitats such as mercury-contaminated
environment. The purpose of this study was to determine the range of genera Bacillus mercury
resistance with streak plate aseptically on nutrient agar medium containing HgCl 2 concentrations of
10-50 ppm and to determine the genetic diversity of Bacillus isolates using genome analysis with NcoI
and AluI restriction enzymes. Isolates used is a collection of Microbiology and Biotechnology
laboratory, Department of Biological Science, ITS, namely S1, SA1, SS19, DA11, with reference
species Bacillus cereus and Bacillus subtilis. Resistance test results showed that all isolates of Bacillus
S1, SA1, SS19 and DA11 and control isolates able to grow on NA-Hg medium with concentrations up
to 50 ppm, with different percentages of growth depends on the ability of each isolates. Based on the
fragmentation pattern of the genome after cutting with the AluI enzyme seen that the percentage of
similarity between isolates of Bacillus subtilis with SA1 47.1% and isolates of Bacillus cereus with
SA1 57.1%. Due to the small number of genomic fragments generated by NcoI enzyme then the
percentage of similarity between isolates can not be determined.
Key words : Bacillus, genetic diversity, mercury, resistance, restriction endonuclease enzyme
*Coresponding Author Phone: 085733033494
1
Alamat Sekarang : Jurusan Biologi FMIPA ITS
1. Pendahuluan
Kali Mas merupakan sungai di
Surabaya yang berfungsi sebagai bahan baku
air minum PDAM Surabaya (Budiman et al.,
2008). Kadar merkuri di sedimen Kali Mas
bagian tengah terukur 0,105 ppm (Shovitri et
al., 2010) dan telah melebihi ambang batas
yang ditetapkan Pemerintah melalui Peraturan
Pemerintah no. 82 tahun 2001 yaitu 0,001
ppm. Pada tahun 2011, kadar merkuri di
sedimen Kali Mas bagian hilir terukur 6,38
ppm (Widiyanti, 2011), konsentrasi merkuri ini
jauh melebihi ambang batas yang ditetapkan
dan sangat berbahaya mengingat akibat yang
ditimbulkan.
Pencemaran
merkuri
di
lingkungan dapat menyebabkan gangguan
kesehatan, diantaranya kerusakan hati dan
ginjal serta gangguan sistem syaraf dan
pencernaan manusia (Manohar et al., 2002),
sehingga fenomena pencemaran merkuri ini
perlu mendapat perhatian.
Perairan yang tercemar merkuri
merupakan lingkungan yang ekstrim bagi
makhluk hidup, tetapi secara alamiah terdapat
bakteri yang mampu hidup pada kondisi
tersebut, bakteri tersebut dinamakan bakteri
resisten merkuri (BRM) (Kannan &
Krishnamoorthy, 2006). BRM mampu
mengembangkan mekanisme resistensi untuk
mengatasi lingkungan yang tercemar merkuri
karena BRM mempunyai gen resisten merkuri
yaitu gen mer operon. Mer operon pada BRM
terdiri dari beberapa gen yang berfungsi untuk
mengubah organomerkuri menjadi merkuri
anorganik dan mereduksi merkuri anorganik
Hg2+ menjadi merkuri Hg0 yang mudah
menguap (Huang et al., 2002).
Bacillus merupakan bakteri yang dapat
ditemukan di berbagai macam habitat seperti di
tubuh hewan, tanah halofil, akar tanaman,
termasuk lingkungan yang tercemar merkuri
(Kim et al., 2011; Nevado et al., 2010). Genera
Bacillus
memiliki
beberapa
manfaat
diantaranya untuk produksi enzim, antibiotik,
pelarut, dan insektisida alami pada tanaman
(Ouattara et al., 2011; Wu et al., 2006).
Sebaliknya, ada juga Bacillus yang bersifat
patogen bagi manusia dan hewan yaitu B.
anthracis (Abee et al., 2011). Bacillus juga
merupakan bakteri yang resisten terhadap
banyak logam berat seperti Hg, Cr, As dan Se
(Badjoeri, 2008) sehingga Bacillus berpotensi
digunakan sebagai agen bioremediator
pencemaran merkuri. Berdasarkan penelitian
Badjoeri (2008) spesies Bacillus megaterium
mampu mereduksi kadar merkuri sampai 98%.
Saat ini Laboratorium Mikrobiologi
dan Bioteknologi Program Studi Biologi ITS
Surabaya telah mempunyai koleksi isolat
Bacillus yang diisolasi dari Kali Mas Surabaya
sebanyak 39 isolat yang resisten terhadap 10
ppm HgCl2 (Widiyanti, 2011). Berdasarkan uji
pendahuluan yang telah dilakukan, terdapat
empat isolat Bacillus yang memiliki kemurnian
yang
stabil
berdasarkan
pengamatan
makroskopik dan mikroskopik (Lampiran 1)
serta karakter biokimia yang konsisten
(Lampiran 2), sehingga empat isolat Bacillus
ini dipilih untuk penelitian ini. Sebagai
pembanding digunakan dua isolat Bacillus
yang
sudah
direkomendasikan
secara
komersial yaitu Bacillus cereus ATCC1178
dan Bacillus subtilis ATCC6633.
Menurut penelitian yang dilakukan
Badjoeri (2008) bakteri genera Bacillus
memiliki tingkat resistensi yang berbeda-beda
terhadap merkuri. Adanya perbedaan tingkat
resistensi terhadap merkuri dapat disebabkan
oleh perbedaan susunan genetik dari genom
Bacillus. Mengingat banyaknya isolat Bacillus
yang dimiliki serta potensi Bacillus sebagai
agen bioremediator merkuri yang besar maka
perlu dilakukan suatu penelitian untuk
mengetahui kisaran resistensi terhadap merkuri
dan keanekaragaman genetik dari isolat bakteri
Bacillus tersebut.
Susunan genetik diantara genera
Bacillus dapat berbeda walaupun termasuk ke
dalam satu genera yang sama sesuai dengan
fungsi ekspresi gen tersebut (Huang et al.,
1999), sehingga untuk melihat perbedaan
tersebut dapat dilakukan dengan suatu metode
untuk mengungkap perbedaan genetiknya.
Salah satu metode yang dapat digunakan untuk
mengungkap keanekaragaman genetik pada
bakteri adalah metode analisis genom
menggunakan enzim restriksi endonuklease
(Tuboly et al., 1995). Metode ini merupakan
salah satu metode karakterisasi molekuler
menggunakan profil fragmen DNA hasil
pemotongan menggunakan enzim restriksi
endonuklease pada DNA genom suatu bakteri.
Enzim restriksi endonuklease yang
dapat digunakan untuk analisis genom adalah
enzim AluI dan NcoI. Enzim AluI memotong
molekul DNA pada urutan nukleotida 5’AG/CT-3’ sedangkan enzim NcoI memotong
molekul DNA pada urutan nukleotida 5’C/CATGG3’ (Li et al., 2008; William, 2005).
Pemotongan menggunakan enzim restriksi
dapat digunakan untuk mengetahui keberadaan
sisi pemotongan suatu enzim di dalam genom
bakteri. Keberadaan sisi pemotongan yang
berbeda pada setiap bakteri akan menghasilkan
variasi pola fragmen hasil restriksi yang
diperoleh. Perbedaan pola fragmen hasil
restriksi dapat digunakan sebagai penanda
dalam studi keanekaragaman genetik pada
bakteri (Akamine et al., 2009).
2. Metodologi
Penelitian dilakukan pada bulan Januari
sampai dengan bulan Juni 2012 di
Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi
Program Studi Biologi ITS Surabaya dan
Laboratorium ITD (Institute of Tropical
Disease) Universitas Airlangga Surabaya.
Isolat Bakteri
Isolat bakteri yang digunakan adalah
bakteri resisten merkuri dari Kali Mas
Surabaya koleksi Laboratorium Mikrobiologi
dan Bioteknologi Program Studi Biologi ITS
Surabaya yaitu isolat dengan kode S1, SA1,
SS19 dan DA11, Bacillus cereus ATCC1178
dan Bacillus subtilis ATCC6633.
Uji Resistensi Genera Bacillus Terhadap
Merkuri
Uji resistensi genera Bacillus terhadap
merkuri dilakukan dengan menumbuhkan
bakteri pada medium selektif Nutrient Agar
(NA) yang mengandung HgCl2 (yang
selanjutnya
dikode
NA-Hg)
dengan
konsentrasi yaitu 10 ppm (sebagai kontrol), 15
ppm, 20 ppm, 25 ppm, 30 ppm, 35 ppm, 40
ppm, 45 ppm dan 50 ppm. Uji resistensi
menggunakan metode streak pada tabung
reaksi. Isolat bakteri dinokulasikan secara
aseptis ke medium NA-Hg kemudian
diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator
dengan suhu 37oC dan diamati koloni yang
tumbuh. Pertumbuhan koloni dibandingkan
dengan kontrol.
Karakterisasi Molekuler Menggunakan
Enzim Restriksi Endonuklease
Kultivasi dan Pemanenan Bacillus
Satu koloni isolat bakteri Bacillus
diinokulasikan ke dalam medium Nutrient
Broth (NB) sebanyak 25 ml kemudian
diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang
dengan menggunakan rotary shaker. Kultur
cair sebanyak 2.6 ml diinokulasikan ke dalam
medium NB sebanyak 25 ml kemudian
diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang
dengan
menggunakan
rotary
shaker.
Kemudian 3.5 mL kultur bakteri tersebut
dimasukkan ke microconcentrator dan
disentrifugasi dengan kecepatan sampai
diperoleh volume sampel 140 µL (Sambrook
et al., 1989).
Ekstraksi DNA
Proses ekstraksi DNA dilakukan sesuai
dengan prosedur dalam QIAamp® Viral RNA
Mini Handbook. Buffer AVL sebanyak 560 µL
ditambahkan ke dalam microtube 1.5 mL yang
telah berisi sampel yang telah disiapkan
sebelumnya.
Campuran
dihomogenisasi
dengan menggunakan vortex selama 15 detik.
Campuran diinkubasi pada suhu ruang selama
10 menit kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan rendah. Ethanol 96% sebanyak 560
µL ditambahkan pada campuran dan
dihomogenkan dengan menggunakan vortex
selama 15 detik kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan rendah. Campuran diambil
630 µL dan dimasukkan ke dalam QIAamp
Mini column dalam collection tube dan
disentrifugasi dengan kecepatan 6000 g (8000
rpm) selama 1 menit. QIAamp Mini column
diambil dan ditempatkan pada collection tube
yang baru. Sampel disentrifugasi kembali
dengan kecepatan 6000 g selama 1 menit.
Sebanyak 500 µL buffer AW1 ditambahkan ke
dalam sampel dan disentrifugasi dengan
kecepatan 6000 g selama 1 menit. QIAamp
Mini column diambil dan ditempatkan pada
collection tube yang baru. Sebanyak 500 µL
buffer AW2 ditambahkan ke dalam sampel dan
disentrifugasi dengan kecepatan 20000 g
(14000 rpm) selama 3 menit. QIAamp Mini
column diambil dan ditempatkan pada
collection tube yang baru kemudian
disemtrifugasi dengan kecepatan 20000 selama
1 menit. QIAamp Mini column diambil dan
ditempatkan pada 1.5 mL microtube dan
ditambahkan 60 µL Buffer AVE kemudian
diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit.
Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 6000
g selama 1 menit dan disimpan pada suhu 40oC.
Restriksi DNA Genom
Restriksi genom pada penelitian ini
menggunakan enzim restriksi AluI dan NcoI.
Aplikasi enzim restriksi AluI (Invitrogen) dan
NcoI (Invitrogen) pada genom dilakukan
secara terpisah. Untuk enzim AluI, DNA
genom diambil sebanyak 10 µl, ditambahkan 1
µl enzim restriksi, 5 µl 10x buffer dan 34 µl
ddH2O. Campuran diinkubasi pada suhu 37oC
selama 2 jam. Untuk enzim NcoI, DNA genom
diambil sebanyak 5 µl, ditambahkan 1 µl
enzim restriksi, 5 µl 10x buffer dan 39 µl
ddH2O. Reaksi dihentikan dengan menyimpan
hasil restriksi pada freezer -40oC (Sambrook et
al., 1989). DNA genom yang sudah direstriksi
kemudian disebut dengan sampel.
Elektroforesis DNA Sampel
Bubuk agarose 1.5 gr dilarutkan dalam
100 ml TAE 1x kemudian dipanaskan dalam
water bath sampai agarose larut lalu
didinginkan sampai suhu 60oC. Larutan
agarose kemudian dituang ke dalam cetakan,
setelah itu comb dipasang dan didiamkan
hingga mengeras. Setelah gel mengeras comb
diambil dan ditambahkan TAE sampai seluruh
bagian gel terendam (Sambrook et al., 1989).
Sampel 10 µL dimasukkan ke dalam
microtube dan ditambah dengan 1 µL Loading
buffer (Invitrogen), dihomogenkan dengan
vortex kemudian dituang ke dalam sumuran
elektroforesis. 1 µL DNA marker dimasukkan
ke dalam microtube dan ditambah Loading dye
1 µL (Vivantis) kemudian dituang ke dalam
sumuran elektroforesis. Genom yang tidak
direstriksi sebanyak 10 µl juga dicampur
dengan loading dye 1 µL sebagai kontrol
negatif.
Perangkat
Elektroforesis
disambungkan dengan sumber listrik dan
dinyalakan dengan voltase 120 volt selama 1
jam. Setelah semua DNA bermigrasi ke anoda,
gel diangkat dan direndam dalam larutan
buffer elektroforesis yang mengandung
ethidium bromida selama 10 menit. Pola
fragmentasi DNA pada gel agarose diamati
dengan Ultra Violet (UV) iluminator dan
divisualisasikan dengan cara di foto
menggunakan kamera digital (Sambrook et al.,
1989).
3. Hasil dan Pembahasan
Resistensi
Merkuri
Genera
Bacillus
Terhadap
Uji resistensi isolat bakteri genera
Bacillus dilakukan dengan menumbuhkan
bakteri pada medium selektif NA-Hg dan
dibandingkan dengan spesies referensi yaitu
Bacillus subtilis ATCC6633 dan Bacillus
cereus ATCC1178 sebagai kontrol positif.
Hasil uji resistensi genera Bacillus terhadap
merkuri menunjukkan bahwa semua isolat
bakteri mampu tumbuh pada medium NA-Hg
sampai konsentrasi 50 ppm walaupun
pertumbuhannya tidak seragam. Kemampuan
isolat bakteri untuk tumbuh pada medium
selektif
dinyatakan
dengan
persentase
pertumbuhan (Tabel 1). Hal ini menunjukkan
bahwa bakteri uji dari genera Bacillus
termasuk golongan bakteri dengan resistensi
tinggi terhadap merkuri (Bacteria Highly
Resistant to Mercury atau BHRM), karena
bakteri yang termasuk dalam golongan BHRM
adalah bakteri yang mampu tumbuh pada
medium selektif dengan konsentrasi Hg ≥ 25
ppm (De & Ramaiah, 2007).
Tabel 1.
Persentase (%) pertumbuhan Bacillus pada
medium mengandung merkuri
Seluruh isolat genera Bacillus mampu
tumbuh 100% pada media NA-Hg 10-20 ppm
(Gambar 1). Pertumbuhan bakteri sangat bagus
yang diperlihatkan dengan pertumbuhan yang
merata pada seluruh medium atau mengikuti
garis yang dibuat dengan metode streak.
Sedangkan persentase pertumbuhan mulai
bervariasi pada media NA-Hg konsentrasi 2550 ppm. Pertumbuhan bakteri terlihat tidak
merata dan ada koloni-koloni bakteri yang
terpisah-pisah.
Penurunan
persentase
pertumbuhan ini disebabkan karena tingkat
toleransi bakteri terhadap merkuri mulai
menurun.
Gambar. 1. Pertumbuhan bakteri genera
Bacillus pada medium selektif (a) NA-Hg10
ppm (b) NA-Hg 15ppm (c) NA-Hg 20 ppm