Pada medium NA-Hg 25 ppm, persentase pertumbuhan

Pada medium NA-Hg 25 ppm, persentase
pertumbuhan bakteri bervariasi antara 53-85%.
Penurunan persentase pertumbuhan jelas teramati
pada medium NA-Hg 30-50 ppm, dimana pada
konsentrasi 30 ppm persentase pertumbuhannya
menjadi 20-45%, konsentrasi 35 ppm lebih rendah
lagi yaitu 18-30%, konsentrasi 40 ppm hampir
seragam yaitu 20-25%, konsentrasi 45 ppm menjadi
5-25% dan konsentrasi 50 ppm persentase
pertumbuhan 8%-15%. Namun secara keseluruhan,
hampir semua genera Bacillus yang diuji memiliki
resistensi cukup baik sampai dengan konsentrasi 25
ppm dengan persentase pertumbuhan ≥ 50%.
Jika dilihat dari persentase pertumbuhan
pada konsentrasi 30 ppm HgCl2 (Tabel 1) maka
isolat yang menunjukkan kisaran resistensi yang
cukup tinggi adalah isolat S1 dan DA11. Persentase
pertumbuhan kedua isolat ini di atas 40%,
sedangkan isolat SA1 dan SS19 di bawah 30%.
Kontrol positif yang digunakan (Bacillus subtilis
dan Bacillus cereus) menunjukkan persentase
pertumbuhan yang berbeda. Bacillus cereus
memiliki persentase pertumbuhan di atas 40%,
sedangkan Bacillus subtilis di bawah 30%. Jika
dibandingkan dengan kontrol positif, maka isolat S1
dan DA11 memiliki kisaran resistensi yang
sebanding dengan Bacillus cereus, sedangkan isolat
SA1 dan SS19 memiliki kisaran resistensi yang
sebanding dengan Bacillus subtilis.
Berdasarkan
pada
persentase
pertumbuhannya (Tabel 1), isolat S1 dan DA11
dapat dikatakan lebih unggul daripada isolat yang
lain, sehingga kedua isolat ini berpotensi menjadi
agen bioremediasi merkuri. Jika dibandingkan antar
dua isolat unggul tersebut maka isolat DA11 lebihi
potensial
daripada
isolat
S1.
Persentase
pertumbuhan isolat DA11 pada kisaran HgCl2 yang
lebih tinggi yaitu 30-50 ppm relatif lebih konstan.
Kemampuan isolat Bacillus untuk tumbuh
pada medium yang mengandung merkuri
menunjukkan resistensi isolat Bacillus terhadap
merkuri. Mekanisme resistensi merkuri pada bakteri
genera Bacillus yang diuji melalui mekanisme
reduksi enzimatik dari ion merkuri (Hg2+) menjadi
merkuri volatil yang bersifat kurang toksik (Hg0).
Mekanisme ini disebabkan keberadaan satu set gen
mer operon yang menyandi gen untuk resistensi
merkuri. Mer operon terdiri dari sekelompok gen
yang mengkode protein dengan fungsi regulasi,
transportasi, dekomposisi dan reduksi merkuri
(Narita et al., 2003). Mer operon pada bakteri
Bacillus terletak di dalam plasmid, genom dan
transposon (Narita et al., 2003, Kannan et al., 2006)
Mer operon yang menyandi gen resistensi
terhadap merkuri terdiri dari beberapa gen yaitu gen
merR, mer D, merP, merT, merC, merF, mer A dan
merB. Gen merR dan mer D memiliki peran dalam
proses regulasi. Gen regulator merR mengontrol
ekspresi mer operon dengan menyandi protein
khusus yang mengontrol proses transkripsi gen
operon mer yang lain sedangkan gen merD
bertindak sebagai repressor. Transkripsi operon mer
distimulasi dengan adanya Hg2+ (Brown et al.,
2003; Foster & Ginnity, 1985). Gen merP, merT,
mer C, merF berperan dalam proses transport Hg2+
ke dalam sel. Enzim merkuri reduktase yang
disandi oleh gen merA berperan untuk mereduksi
Hg2+ menjadi Hg0 (Brown et al., 2003). Gen merB
menyandi enzim organomercuy lyase yang
berfungsi untuk memutus ikatan C-Hg pada
senyawa merkuri organik (Leonhauser et al., 2007).
Mekanisme reduksi enzimatis terjadi
melalui beberapa tahapan. Proses diawali dengan
masuknya ion Hg2+ ke dalam sel. MerP merupakan
protein periplasma yang berfungsi untuk
menyimpan sementara Hg2+ di periplasma
kemudian melewatkan ion Hg2+ ke transporter inner
membran yaitu merT. Dari merT, ion Hg2+ akan
menuju merkuri reduktase dimana sisi pengikatan
substratnya terdapat pada bagian C-terminus. Disini
Hg2+ akan direduksi menjadi Hg0 dengan adanya
transfer elektron dengan NADPH sebagai donor
elektron dan Hg2+ sebagai akseptor electron (Brown
et al., 2002).
Perbedaan pertumbuhan genera Bacillus
yang diuji disebabkan adanya perbedaan adaptasi
genotip dan fenotip genera Bacillus terhadap
cekaman merkuri. Perbedaan adaptasi fenotip dan
genotip isolat terjadi karena terdapat perbedaan
strain pada isolat Bacillus yang diuji (Barkay &
Olson, 1986). Perbedaan tersebut juga disebabkan
perbedaan susunan mer operon pada masingmasing isolat dan perbedaan jumlah plasmid yang
dimiliki tiap isolat Bacillus (Narita et al., 2003).
Perbedaan jumlah plasmid yang dimiliki oleh
bakteri terjadi karena adanya transfer horizontal
plasmid antar bakteri dan jumlah plasmid sangat
mempengaruhi tingkat resistensi karena sebagaian
besar mer operon Bacillus berlokasi di plasmid
(Kannan et al., 2006).
Mekanisme resistensi kedua yang mampu
dilakukan beberapa anggota species Bacillus selain
mekanisme
enzimatis
adalah
bioadsorpsi.
Bioadsorpsi pada genera Bacillus diantaranya
dengan pembentukan polisakarida kompleks,
pertukaran ion dan ikatan ligan (Srinath et al,
2002). Beberapa anggota species Bacillus mampu
menghasilkan eksopolimer yang terdiri dari
polisakarida, protein, asam organik, asam nukleat
dan lipid. Beberapa gugus fungsional yang mampu
melakukan pertukaran ion dan pembentukan
kompleks dengan logam termasuk merkuri adalah
karboksil, amino, karbonil dan hidroksil. Bacillus
subtilis merupakan salah satu species yang telah
diketahui mampu melalukukan proses bioadsorpsi
terhadap ion merkuri (Hg2+) dengan adanya
eksopolimer poli asam glutamat (Inbaraj et al.,
2009).
Karakterisasi Molekuler Menggunakan
Enzim Restriksi Endonuklease
Karakterisasi molekuler variasi fragmen
genom
Bacillus
dilakukan
dengan
menggunakan dua enzim restriksi yaitu AluI
dan NcoI yang kemudian dibandingkan dengan
spesies referensi yaitu Bacillus subtilis
ATCC6633 dan Bacillus cereus ATCC1178.
Sekuen pengenal pada enzim AluI adalah 5’
AG/CT 3’ sedangkan sekuen pengenal pada
NcoI adalah 5’ C/CATGG 3’ (Li et al., 2008;
Williams, 2005). Enzim restriksi hanya akan
memotong DNA pada sekuen spesifik yang
dikenali sehingga ukuran dan jumlah DNA dari
proses restriksi yang dihasilkan juga akan
berbeda (Tuboly et al., 2005). Seperti halnya
hasil uji resistensi pada medium yang
mengandung merkuri, hasil karakterisasi
molekuler genom Bacillus dengan kedua
enzim tersebut juga menunjukkan adanya
variasi fragmen genom. Hal ini dapat
menunjukkan bahwa ada perbedaan susunan
genetik genom antar anggota genera Bacillus.
Perbedaan tersebut dibuktikan dengan adanya
perbedaan jumlah dan ukuran pita DNA (band)
yang dihasilkan karena adanya perbedaan
sekuen yang dikenali oleh masing-masing
enzim restriksi (Gambar 2 dan Tabel 3).
banyak yang ditunjukkan dengan band yang terlihat
tebal, sedangkan band dengan ukuran 650 bp, 92 bp
dan 80 bp ketebalannya tidak seragam untuk
masing-masing isolat. Adanya keempat band
tersebut mungkin bisa menunjukkan bahwa isolat
ini termasuk genera Bacillus. Band-band lain
seperti band DNA berukuran 1773, 1250, 1000,
800, 500, 400, 200, 163, 138 dan 113 bp berbeda
untuk tiap isolat. Isolat SS19 memiliki band
berukuran 800, 500, 163 dan 138 bp yang tidak
dimiliki isolat SA1 dan DA11, sedangkan isolat
DA11 memiliki band berukuran 113 bp yang tidak
dimiliki isolat SA1 dan SS19. Band-band yang
berbeda ini menunjukkan adanya variasi genetik
antar isolat Bacillus walaupun isolat tersebut
termasuk ke dalam genera yang sama.
Tabel 2. Jumlah dan panjang fragmen genom
hasil restriksi enzim AluI isolat Bacillus
Tabel 2 merupakan tabulasi keberadaan
band seperti terlihat pada Gambar 5. Dari Gambar 5
dan Tabel 2, terlihat bahwa isolat S1 tidak
menampakkan band DNA. Hal ini kemungkinan
disebabkan karena kesalahan teknis selama aplikasi
metode, diantaranya pengambilan DNA hasil isolasi
yang kurang mencukupi, akibat tidak tercampurnya
DNA dalam buffernya sehingga hanya buffer yang
terambil saat proses restriksi. Selain itu, konsentrasi
DNA yang dihasilkan dari proses isolasi
kemungkinan juga relatif kecil.
Tabel 3. Persentase similaritas berdasarkan
pola fragmentasi DNA dengan enzim AluI
Gambar 2. Pola fragmentasi genom Bacillus
dengan menggunakan enzim restriksi AluI dengan
marker GelPilot 100 bp Plus Ladder (100) (cat. No.
230945) dan isolat kontrol Bacillus subtilis (BS)
dan Bacillus cereus (BC)
Hasil elektroforesis DNA hasil restriksi
dengan enzim AluI menunjukkan bahwa semua
isolat Bacillus dan isolat kontrol (Bacillus subtilis
dan Bacillus cereus) memiliki band dengan ukuran
650 bp, 175 bp, 92 bp dan 80 bp. Band dengan
ukuran 175 bp dimiliki dengan jumlah relatif