- Free Documents

A.
Prinsip Dasar HPLC Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut dengan bantuan pompa fasa
gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa
gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponenkomponen
campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solutesolut terhadap fasa diam.
Solutsolut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih
dulu. Sebaliknya, solutsolut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solutesolut
tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan
konsentrasi komponen dalam campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja
sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC. B.
Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja
Tinggi, yaitu . Fasa Gerak Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga
eluen atau pelariut. Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak
pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan fasa gerak untuk kromatografi gas. Dalam
kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa solute melewati kolom menuju
detector. Sebaliknya dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa
komponenkomponen campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan
solutesolut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu
keberhasilan proses pemisahan. Persyaratan fasa gerak HPLC Zat cair yang akan
digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut . zat
cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis. . zat cair
harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu
interpretasi kromatogram. . zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan
pada kolom. . zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak
beracun. . zat cair tidak kental. . sesuai dengan detektor. Jenis fasa gerak Fasa gerak untuk
kromatografi partisi, adsorpsi, dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa gerak
berinteraksi dengan komponenkomponen cuplikan. Akibatnya, waktu retensi sangat
dipengaruhi oleh jenis pelarut. Sebaliknya fasa gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat
non interaktif. Oleh karena itu, waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada
komposisi fasa gerak.
. Pompa Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang
berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa
yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan . Menghasilkan tekanan
sampai psi pons/in . Keluaran bebas pulsa . Kecepatan alir berkisar antara , mL/menit .
Bahan tahan korosi Dikenal tiga jenis pompa yang masingmasing memiliki kenutungan dan
kekurangannya yaitu pompa reciprocating, displacement dan pneumatic. Pompa
reciprocating Jenis pompa ini sekarang banyak dipakai. Pompa ini terdiri dari ruangan kecil
tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundurmaju yang dijalankan oleh
motor. Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Pompa
displacement Pompa ini menyerupai syringe alat suntik terdiri dari tabung yang dilengkapi
pendorong yang digerakan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung
tidak bergantung tekanan baik kolom dan viskositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini
bebas pulsa. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut mL dan tidak mudah
untuk melakukan pergantian pelarut. Pompa pneumatic Dalam pompa ini pelarut di dorong
oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunyai
keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan lt psi serta kecepatan alir bergantung
pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom. . Unit Sistem Penyuntikan atau
Penginjeksian Sampel Kadang kala, faktor ketidaktepatan pengukuran HPLC terletak pada
keterulangan pemasukan cuplikan ke dalam peking kolom. Masalahnya, kebanyakan
memasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena
itu, cuplikan yang dimasukkan harus sekecil mungkin, beberapa puluh mikroliter. Selain itu,
perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa
gerak. Berikut beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam sistem HPLC . Injeksi Syringe
Alat yang paling dulu dan paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe
disuntikkan melalui septum seal karet dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan
sampai psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit lebih baik dari dan sering lebih
jelek. . Injeksi stopflow Injeksi stopfloe adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran
pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan
langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut
dialirkan kembali. . Kran Cuplikan Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling
banyak digunakan. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua
langkah a sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan
masih berada dalam loop, b kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi
dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat digantiganti dan tersedia
berbagai ukuran volume dari hingga L. Dengan sistem pemasukan cuplikan ini
memungkinkan memasukkan cuplikan pada tekanan psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop
mikro tersedia dengan volume , hingga L.
waktu respon pendek sehinggatidak bergantung kecepatan alir . Detector berdasarkan
absorpsi UV merupakan detector HPLC yang paling banyak di pake. C. detector sepesifik
memberi respon terhadap beberapa sifat solute yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. sampel
air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat C atau C yang terikat pada silica gel. dapat
dilaksanakan pada suhu kamar. Detector HPLC dikelompokan ke dalam tiga jenis. D. Hasil
pemisahan dideteksi oleh detector.. yang penampakannya ditunjukan oleh perekam pencatat
recorder. cepat dan mudah melaksanakannya. . . yakni beberapa milliliter per menit. . tempat
terjadinya pemisahan campuran menjadi komponenkomponennya. detektor HPLC dapat
divariasi dan unik. tidak merusak cuplikan. Cara Kerja HPLC Mulamula solven diambil
melalui pompa. Beberapa kelebihan KCKT diantaranya ialah . Hal ini terutama sering
dilakukan untuk analisis senyawasenyawa hidrokarbon aromatic polisiklik PAH atau residu
pestisida dalam makanan. Terakhir. Sebaliknya. HPLC juga dapat menganalisis senyawa
yang tidak mudah menguap dan termolabil. detectoe yang bersifat umum terhadap solute
setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan. . Rekorder menghasilkan kromatogram
zatzat yang dipisahkan dari suatu sampel. . sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang
kemudian bersamasama dengan solven masuk ke dalam kolom. walaupun demikian
detector harus memenuhi persyaratan berikut cukup sensitive. stabilitas dan keterulangan
tinggi. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi berbutar. Detector Berbagai
detector untuk HPLC telah tersedia.realibilitas tinggi dan mudah digunakan. mudah
memperoleh cuplikan. ideal untuk molekul besar dan ion. pelarut pengembang bisa dipakai
berulang kali demikian juga dengan kolomnya. Kolom utama berisi fas diam. yang dipasang
tepat pada sampel loop. kromatografi cair kinerja tinggi KCKT atau HPLC High Performance
Liquid Chromatography mempunyai beberapa kelebihan. Suatu solven dengan polaritas
rendah. . daya pisahnya baik. yaitu detector umum memberi respon terhadap fasa gerak
yang dimodulasi dengan adanaya solute. Tahap pemekatan dengan ekstraksi solven dan
penguapan untuk memperkecil volum sering kali diperlukan sebelum pengerjaan sampel
dengan HPLC. Dengan pertolongan mikrosiring. respon linear terhadap solute. misalnya CH
berair yang secara bertingkat mengalami perubahan menjadi CHOH murni. dapat dihindari
terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis. Kolom Kolom HPLC biasanya
terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal.
Sebagai alternative lain. menjamin pemisahan yang baik pada C yang terikat pada silica gel.
. . Kelebihan HPLC Dibandingkan dengan kromatografi gas. . Pompa pemasuk solven pada
tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih psi dengan laju alir rendah. Tekanan solven di
atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. . diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven
yang kemudian langsung dimasukan kedalam kolom. peka. Detector elektrokimia paling
banyak dipakai terutama dalam HPLC penukar ion.
. HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak. Bandung ITB . untuk kolom cm.
alkaloid. . Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori lebih dari . alkaloid.
HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak. dengan fase diam berupa kolom dan
larutan tertentu sebagai fase geraknya Instrumentasi HPLC yaitu . Fasa Gerak . IV.
kromatografi cair kinerja tinggi KCKT atau HPLC High Performance Liquid Chromatography
mempunyai beberapa kelebihan. HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi
di daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak. segala senyawa jenis fenol. Cuplikan
dapat dipisahkan secara preparative. . DAFTAR KEPUSTAKAAN Drs. Kolom . Malang JICA
FMIPA UNM Sumar Hendrayana. KIMIA ANALITIK II. lipid dan gula. Aplikasi HPLC Dalam
Kehidupan HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. lipid dan gula.
Soebagio dkk. Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel . segala senyawa jenis
fenol.E. misalnya terpenoid tinggi. KIMIA PEMISAHAN. dan kromatografi dilakukan dalam
kondisi mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh dalam beberapa
menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. K dkk. Pompa .
Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna
untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongangolongan senyawa atau memisahkan
golongan senyawa menjadi komponenkomponennya. Cara Kromatografi Preparatif. misalnya
terpenoid tinggi. Detector Dibandingkan dengan kromatografi gas. Bandung Rosdakarya
Hostettmann. KESIMPULAN Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan analit berdasarkan
kepolarannya.
. Kromatografi cair kinerja tinggi pada dasarnya adalah bentuk peningkatan dari
kromatografi kolom. Oleh karena sampel yang digunakan sangat kecil lt g maka diperlukan
detector yang sangat peka. Pada KG yg dianalisis harus menguap. dll Bekerja pada HPLC
membutuhkan proses berat sebelum estimasi seperti filtrasi.HPLC/KCKT HPLC / KCKT
Kromatografi cair tingkat tinggi metoda kimia amp fisikokimia. Teknologi kolom partikel kecil
m ini memerlukan sistem pompa bertekanan tinggi yang mampu mengalirkan fase gerak
dengan tekanan tinggi agar tercapai laju aliran mL/menit. . Data yang diperoleh HPLC adalah
nonhomogen dan tidak pernah tanpa kebisingan fluktuasi dan kesalahan selama estimasi. .
.degassing. kolom dan juga menggunakan kemurnian nilai tertinggi dari pelarut. Sistem dan
Instrumen KCKT Sistem KCKT terdiri dari dua sub sistem yaitu sub sistem pemisahan dan
sub sistem pendeteksian detektor. berbeda dg KCKT analit dalam cairan fase gerak HPLC
teori Prinsip HPLC terlibat dalam pengujian adalah pemisahan senyawa dalam campuran
yang lebih efisien dan juga cepat dari pada kromatografi kolomtradisional. . . . Alihalih pelarut
diizinkan menetes melalui kolom di bawahgravitasi. Pada KCKT diperkenalkan penggunaan
fase diam yang berdiameter kecil dalam kolom yang efisien. itu adalah dipaksa melalui
tekanan tinggi gt atmosfer yang membuat jauh lebih cepat. Kelebihan memisahkan molekul
dr suatu campuran mudah melaksanakannya kecepatan analisis n kepekaan tinggi
menghindari dekomposisi resolusi yg baik mnggunakan berbagai macam detector dapat
dgnakan kmbali mudah mlkukan sample recovery Kekurangan Ini adalah teknik yang mahal
karena memerlukan instrumentasi mahal HPLC. . dll derivatisasi Sistem operasi
membutuhkan pelatihan sebelum HPLC dan efektif HPLCpemecahan masalah keterampilan.
buffer. .
. Arah pengaliran fase gerak harus selalu sama. Laju aliran pelarut mL/menit. Jenis detektor
untuk deteksi adalah detektor indeks bias. Sistem injektor sampel sampel diinjeksikan
langsung kedalam aliran pelarut dalam kolom dengan semprit mikro melalui septum injektor
menggunakan diafragma atau tanpa diafragma.. elektrokimia dan spektrometri massa.
fluoresensi. mm. dua jenis kolom kolom preparatif dan kolom analitik. . ultraviolet sinar
tampak. Jenis pompa yang dipakai pompa pneumatik. System KCKT Pemisahan n Pemasok
pelarut sampel detektor pendeteksia Skema PompapelarutkolomdetektorkoleksiKCKT
preparatif Suntikan sample integrator limbah . pompa endesakan tetap dan pompa torak.
Detektor Detektor dihubungkan dengan pipa baja tahan karat atau pipa jenis lainnya dengan
ujung keluaran kolom. yang banyak dipakai adalah sistem suntik katup kitar loop valve. ..
Kolom dapat dipanaskan sampai oC agar dihasilkan pemisahan yang lebih efisien. Pompa
Sistem pompa bertekanan tinggi mengalirkan pelarut / fase gerak dari bejana pelarut ke
kolom melalui pipa tekanan tinggi. . Panjang kolom antara cm . sampel yang diinjeksikan
melalui injektor kedalam kolom. Volume suntik biasanya L dengan keterulangan . Sistem
pemisahan sistem pemasok pelarut dengan bagian utamanya a. Ujungujung kolom
dihubungkan dengan pipa baja tahan karat melalui fiting dan terminator dari pompa/injektor
di ujung yang satu dan pada ujung yang lain dihubungkan dengan detektor. diameter dalam .
memantau aliran pelarut yang keluar dari kolom dalam waktu yang sebenarnya. Kolom untuk
pemisahan analitik diameter dalam yang kecil mm. .. tekanan psi. Sistem pendeteksian
terdiri dari detektor yang dihubungkan pada ujung akhir kolom. pompa yang mengalirkan
pelarut b. Kolom Kolom KCKT terbuat dari pipa baja tahan karat..
Adsorbsi. asam. menetukan kadar senyawasenyawa aktif obat. . dan proteinprotein dalam
cairan fisiologis. Pemisahan secara fisiko . pemisahan akan mengalami peningkatan dengan
kesetimbangan interaksi. produk hasil samping proses sintesis. dengan . yaitu perbedaan
stereochemistry melihat kelarutan melihat BM perbedaan muatan TINGGI KCKT
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi KCKT atau biasa juga disebut dengan High Performance
Liquid Chromatography HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan
baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI KCKT
MAKALAH KROMATOGRAFI PENDAHULUAN Kromatografi merupakan pemisahan fisiko
kimiawi. dan sampel. banyaknya lempeng dinyatakan dengan N. Makin banyak N terjadi
pelebaran puncak. High pressure tekanan tinggi bar biasanya memakai satuan kpa/kilo
paskal. Pemisahan ini dapat terjadi kalau interaksinya berulang. Low pressure tekanan
rendah . .kimiawi yang melibatkan interaksi antar fase gerak. Afinitas. Persamaan Van
Deemter H Dasar yang digunakan dalam pemisahan adalah . . . karena Senyawa tersebut
berjalan ke bawah mengalami difusi kalau dibawa fase gerak. atau produkproduk degradasi
dalam sediaan farmasi. KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar
senyawasenyawa tertentu seperti asamasam amino. Partisi.asam nukleat.
KROMATOGRAFI CAIR kromatografi. fase diam. Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu .
Kita dapat mengetahuinya dengan kuantitas ulangan yang dinyatakan dengan teori plate
terjadi pada setiap lempeng. Solute CAIR KINERJA TINGGI KROMATOGRAFI KCKT fase
Kalau Solute fase gerak geraknya fase gas diam fase gerak pada melihat dengan dengan
berdasrkan KINERJA fase diam Interaksi yang terjadi . Ion Exchange. Fase diam dan fase
gerak yang digunakan. N Makin banyak N.
jika ditarik cairan masuk. hal ini akan teramati pada spektrum yang puncakpuncaknya
terpisah. antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat
maka harus diturunkan dengan pendingin liebig/ ion exchange karena ikatannya bisa lepas
dan bisa juga terjadi bleeding. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut.Pada
HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil. Kolom dapat dibagi menjadi
kolom analitik dan kolom preparatif. Detektor Detektor diperlukan untuk mengindera adanya
komponen cuplikan di dalam eluen kolom dan mengukur jumlahnya. c. rentang tanggapan
liniernya lebar dan menanggapi semua jenis senyawa. cairan ditekan terjadi gesekan maka
digunakan pendingin dan tekanan tinggi cairan ditekan menggunakan pompa kemudian
didorong. Pompa Pompa pendesakan tetap dapat dibedakan menjadi pompa torak dan
pompa semprit. . injeksi dilakukan padakinerja atmosfir. bila valve difungsikan. stop flow
aliran dihentikan. Pada posisi load. Instrumentasi . dan kecepatannya untuk sampai ke
detektor waktu retensinya akan berbeda. Partikel kecil dari septum yang terkoyak akibat
jarum injector dapat menyebabkan penyumbatan. Septum septum yang digunakan pada kckt
sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. A. Temperatur pada HPLC digunakan
untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan sehingga KD tetap. tidak banyak berderau.
Loop valve tipe injector ini umumnya digunakan unutk menginjeksi volume lebih besar dari
dan dilakukan dengan cara automatis dengan menggunkan adaptor yang sesuai. sampel
diisi ke dalam loop pada kinerja atmosfir. yaitu a. Tapi septum ini tidak tahan dengan semua
pelarutpelarut kromatografi cair. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil
dan resolusi tidak diperngaruhi. . b. Ada macam system injector. Tekanan harus bar. volume
yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual. maka sampel akan masuk dalam kolom.
diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Campuran analit
akan terpisah berdasarkan kepolarannya. B. alatnya terdiri dari kolom sebagai fasa diam dan
larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung
pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. dan aliran dilanjutkan lagi. . Injector ini
dapat digunakan pada kinerja sampai atmosfir. . Detektor yang baik sangat peka. system
tertutup. Injektor Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom kepala kolom. Kolom
Kolom merupakan jantung kromatograf. Prinsip kerja Kerja HPLC pada prinsipnya adalah
pemisahan analitanalit berdasarkan kepolarannya. Ada dua ragam utama aliran henti dan
pelarut mengalir. Urutan skala polaritas golongan fluorocarbon lt golongan hidrokarbon lt
senyawa terhalogenasi lt golongan eter lt golongan ester lt golongan keton lt golongan
alkohol lt golongan asam. Pompa torak menghasilkan aliran yang berdenyut jadi
memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas
detektor yang stabil jika detektor peka terhadap aliran. tetapi tandonnya terbatas. Yang
paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan
tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.
Cara meminimalkan HETP . u kecepatan alir fase gerak o temperatur kolom diturunkan
untuk mengatasi difusi laminer . tR / W N dapat diperoleh dari hasil kromatogram dengan
menginjeksikan suatu senyawa sehingga mendapatkan puncak. non equilibrium mass
transfer C terjadi karena fase gerak ditambah terus sebelum terjadi keseimbangan o partikel
diperkecil. Efisiensi kolom dapat dilakukan dengan Van Deemter equation N L / HETP N .
Macam Macam Optimasi . difusi longitudinal B o memperkecil diameter partikel. N akan
maximal bila H minimal. difusi eddy A o supaya cairan tidak kemanamana perlu memperkecil
partikel o kerapatannya diperbesar . Rs yang bagus . Efisiensi kolom dapat diukur N. luas
area makin besar o ketebalan fase diam cair makin tipis o kerapatan diperbesar. tidak
bereaksi sesuai dapat mempunyai memungkinkan memperoleh dengan harganya Gambar
syaratsyarat tanpa dengan dengan melarutkan viskositas mudah cuplikan jika Instrumentasi
C. Jenisjenis UV Retraktif indeks konduktifitas Elektrokimia detektor / RI MS Vis Detector
detector Detector PDA ELSD Detector gerak cemaran kemasan detektor cuplikan rendah
diperlukan wajar . kerapatan diperkecil o u dipercepat.Tujuan Optimasi Memisahkan sampai
baseline dengan waktu seminimal mungkin. Optimasi Selektivitas .. yaitu kemampuan
memberikan small bath. Fase Fase gerak memiliki murni. Optimasi Efisiensi Kolom Adalah
jumlah keterulangan interaksi. u diperlambat supaya terjadi kesetimbangan o temperatur
dinaikkan .
adsorpsi perbedaan pada stereokimia orto lebih cepat dilepaskan ke fase gerak sedangkan
para paling lama dilepaskan tangan terikat partisi perbedaan pada kelarutan
senyawasenyawa yang akan dipisahkan ion exchange pada muatan senyawasenyawa .
Pada KG.macam zat. Jenisjenis KCKT Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak. K ns nm
dengan mengubah tersebut Optimasi ns / molekul dalam fase molekul dalam fase fase gerak
kelarutan dalam fase gerak akan Kapasitas nm diam gerak senyawa berbeda. . Tergantung
dari sifatsifat senyawa dan memilih berbagai interaksi yang ada dalam kolom. misalnya Silika
gel direaksikan dengan klorosilan Fase gerak bersifat polar Keuntungan kromatografi fase
terbalik Senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya Senyawa ionic dapat dipisahkan
Air dapat digunakan sebagi pelarut E. gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat
padat. Detektordetektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai
picogram gram. Untuk analisis yang tidak rumit uncomplicated. KCKT kolomnya dibedakan
menjadi a. waktu analisi kurang dari menit bisa dicapai Selektif Berbeda dengan KG.
pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Radiometri. a. Kromatografi Cair
mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Kemampuan zat padat
berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan
parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.Untuk menentukan
kemampuan kolom memisahkan. jumlah jumlah komposisi D. misalnya Silika gel Fase gerak
bersifat non polar b. Indeks Refraksi. Keuntungan dan Kerugian Keuntungan Cepat Waktu
analisis umumnya kurang dari jam. dll dapat juga digunakan dalam KCKT. Banyak analisis
yang dapat diselesaikari sekitar menit. Peka Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan
dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram gram dari bermacam.
Detektordetektor seperti Spektrofotometer Massa. Kromatografi fase terbalik Fase diam
sifatnya non polar. Kromatografi fase normal Kromatografi dengan kolom konvensional
dimana Fase diam normal bersifat polar.
Yogyakarta Skoog.and West DM. Analisis Kimia Kuantitatif.New York Mulja. Kolom dapat
dipakai lagi Berbeda dengan kolom kromatografi klasik. Mudah memperoleh kembali sampel
Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif kerusakan
pada komponen sampel yang diperiksa. b. Sixth.Holler. Surabaya Sastrohamidjojo. biasanya
diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik.DA.Florida Underwood.D. Ideal untuk molekul
besar dan ion zat zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah
.A.Pharmaceutical Analysis. Penerbit Erlangga. .. Suharman.. John Wiley amp Sons Inc.
Christian G.J Pharm.. Churchill Livingstone.G. Analisis Instrumental. Kromatografi.Harjono.
D. Sampel Perlu yang tenaga digunakan ahli Kerugian Mahal jumlahnya sedikit untuk
mengoperasikan Daftar Pustaka A. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali
untuk mengalissis zat zat tersebut. Anal. Analytical Chemistry. . . Banyak analisis yang bisa
dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi. Solvennya
dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion
memerlukan prosedur khusus.L. Jakarta Watson.Edinburg ..J.Clark.. Hardcourt Grace
College.Analytical Chemistry.FJ. oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan
mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Six Edition. . Biomed. Shafaati and B..
kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan. Airlangga University Press.
Universitas Gadjah Mada.Muhammad. kolom KCKT dapat digunakan kembali reusable .
didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan atm. Bagian ini menjelaskan bagaimana
pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis
dan kromatografi kolom. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari
komponenkomponen dalam campuran. Pada proses ini meliputi tekanan dan flow eluent.
Diagram alir HPLC Pada umumnya windows program HPLC menampilkan urutan dari
proses kerja HPLC.HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis.
Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode
pendeteksian yang dapat digunakan. Gambar di atas sebagai contohnya. Mari bro kita
pelajari tiap bagiannya Injeksi sampel port injection Bagian ini ada yang manual dan
otomatis. Tapi disini saya tunjukkan port injection manual. Dimana besarnya volume sampel
yang diinjeksi hanya sekitar l. untuk itu mari kita mempelajari secara bertahap. HPLC secara
mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. . Kolom dan
pelarut Membingungkan ya benar. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah
grafitasi. itu kesan pertama kali saat kita mempelajari fase dalam kromatografi. terlihat pada
gambar warna hijau dimulai dari injeksi sampelpompaflow eluentkolom terdapat dalam
termostatdetectorproses perhitungan hasil kromatogram. Ini membuatnya lebih cepat.
dengan alat penginjeksi yang disebutsyringe. Metodemetode ini sangat otomatis dan sangat
peka. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk
material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih
besar berinteraksi antara fase diam dan molekulmolekul yang melintasinya.
Ex perbandingan water acetonitril dan setiap analisa. senyawa yang non polar kemudian
akan lebih cepat melewati kolom. ingat bukan air. Senyawasenyawa polar dalam campuran
melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan
senyawasenyawa non polar. akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan
molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. yang mana tergantung pada polaritas
relatif dari pelarut dan fase diam. Fase balik HPLC Dalam kasus ini. molekulmolekul polar
dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.
methanol dan acetonitril biasa. ukuran kolom sama. Oleh karena itu. tiap senyawa
menggunakan perbandingan yang berbeda. Sebagai contoh. di dalamnya terdapat kolom. Ini
berarti bahwa molekulmolekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. pelarut polar
digunakan berupa campuran air. Fase normal HPLC Ini secara esensial sama dengan apa
yang sudah kita baca tentang kromatografi lapis tipis KLT atau kromatografi kolom. tapi ini
bukan merupakan bentuk yang biasa dari HPLC. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat
atraksi antara rantairantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika fase diam dan
molekulmolekul polar dalam larutan. tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui
pelekatan rantairantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik
berupa atom karbon atau .Pada gambar diterangkan bahwa pada analisa kali ini
menggunakan perlarut polar. Flow dan preasure dikerjakan oleh pompa. methanol dan
acetonitril. Ini adalah dasar HPLC like disolve liketolong dipahami lebih dalam Termostat
Thermostat dikenal sebagai alat pengatur suhu kolom. Oleh karena itu. . Sebuah kolom
sederhana memiliki diameter internal . Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa
digunakan dalam HPLC. Dalam kasus ini. Dari bagian inilah suatu zat dapat terdeteksi.
Senyawasenyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan
gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawasenyawa ini juga
akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen
sebagaimana halnya senyawasenyawa tersebut berada dalam molekulmolekul air atau
metanol misalnya. dari mengambil pelarut dalam botol hingga menyalurkan pelarut ke dalam
kolom. mm dan mungkin kurang/lebih dari nilai ini dengan panjang sampai mm. tapi ini
khusus untuk HPLC solvent. Oleh karenanya. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat
kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Ada dua perbedaan dalam HPLC.
senyawasenyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat
dalam kolom. Dimana tiap pelarut dapat diatur perbandingannya secara otomatis. Walaupun
disebut normal.
Banyak senyawasenyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang.
Untuk beberapa senyawa. jika kita menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk
mengidentifikasi senyawasenyawa. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel
diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa
itu. waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada tekanan yang digunakan
karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut flow pelarut berpengaruh pada
banyaknya pelarut yang melewati kolom kondisi dari fase diam tidak hanya terbuat dari
material apa. Jika kita menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan
sebuah detektor pada sisi yang berlawanan. tetapi juga pada ukuran partikel komposisi yang
tepat dari pelarut temperatur pada kolom Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara
hatihati. kita akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.
Detektor Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. .
Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan
ultraviolet.Waktu retensi Mengapa pembahasan waktu retensi saya letakkan di bagian kolom
Karena dari kolom inilah senyawa terpisah pada waktu tertentu waktu retensi.
Senyawasenyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Waktu retensi
didefinisikan sebagai waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom
menuju detektor.
Pelarut menyerapnya Tetapi berbeda. tetapi kita juga dapat menghubungkan jumlah dari
senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan. Jika kita menggunakan campuran
metanolair sebagai pelarut. tentunya. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau
dalam gambar sangat sederhana. senyawasenyawa akan menyerap dengan sangat kuat
bagianbagian yang berbeda dari specktrum UV. Misalnya. Area yang berada dibawah
puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor. kita dapat menggunakan waktu
retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh. Jika kita menginjeksi
suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada
instrumen. dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Kita juga
dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa yang
dihasilkan. Sepanjang kita mengontrol kondisi kolom. Kita akan heran mengapa pelarut yang
digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. kita atau orang lain sudah mengukur
senyawasenyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama. . X. dimana
masingmasing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan
menerap sinar UV. kita sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari
nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut. kita tidak hanya dapat merekam
waktu retensi dari senyawa tersebut. Interpretasi output dari detektor Output akan direkam
sebagai rangkaian puncakpuncak. menyerap pada panjang gelombang dibawah nm dan air
pada gelombang dibawah nm.Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah
senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. metanol. Mari beranggapan
bahwa tertarik dalam senyawa tertentu.
nhanang HPLC High Performance Liquid Chromatography LANSIDA comments HPLC High
Performance Liquid Chromatography atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair
kinerja tinggi KCKT dikembangkan pada akhir tahun an dan awal tahun an. area dibawah
puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Jika kita mempunyai dua
substansi yang berbeda dalam sebuah campuran X dan Y. harus berhatihati. Meskipun
demikian. Saat ini. area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah
puncak X. Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa
harus mengetahui waktu retensinya. Rangkaian HPLC pada spektrometer massa Ini
menunjukkan hal yang sangat menakjubkan Pada saat detektor menunjukkan puncak.
Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data
komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Dalam gambar. HPLC merupakan
teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat. Ini mungkin
disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X. ini akan hanya memberikan puncak yang
kecil. tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih
sedikit dibanding dengan X. dapatkah kita mengatakan jumlah relatifnya Kita tidak dapat
mengatakannya jika kita menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya. Ini
mungkin ada jumlah besar Y yang tampak. Misalnya. beberapa senyawa sementara
melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer
massa.Jika larutan X kurang pekat. SISTEM PERALATAN HPLC . tetapi jika diserap lemah.
Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk
mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil. baik
dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik.
kolom. detektor. dan sifat komponenkomponen sampel. fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran pelarutpelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi
atau menggunakan pelarutpelarut jenis alkohol. Selain itu.Instrumentasi HPLC pada
dasarnya terdiri atas wadah fase gerak. Untuk pemisahan dengan fase normal. Sementara
untuk fase terbalik fase diam kurang polar daripada fase gerak. pompa. Pompa .
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. polaritas fase diam.
Untuk fase normal fase diam lebih polar daripada fase gerak. Wadah pelarut kosong ataupun
labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. adanya gas dalam fase gerak
juga harus dihilangkan. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk
menghindari partikelpartikel kecil ini. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini .
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Pemisahan dengan fase
normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik. . Elusi dapat dilakukan dengan cara
isokratik komposisi fase gerak tetap selama elusi atau dengan cara bergradien komposisi
fase gerak berubahubah selama elusi yang analog dengan pemrograman suhu pada
kromatografi gas. Wadah Fase gerak dan Fase gerak Wadah fase gerak harus bersih dan
lembam inert. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase
terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril. dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Fase gerak atau eluen
biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan
berperan dalam daya elusi dan resolusi. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak
antara sampai liter pelarut. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan
pelarut. alat untuk memasukkan sampel tempat injeksi. wadah penampung buangan fase
gerak. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks
terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. sebab adanya gas akan
berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan
mengacaukan analisis.
atau polimerpolimer stiren dan divinil benzen. karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat
jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis. Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi
dengan menggunakan reagenreagen seperti klorosilan. Kebanyakan fase diam pada HPLC
berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi. baja tahan karat. Reagenreagen ini akan
bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugusgugus fungsional yang lain.
kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis
rutin. pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan
mL/menit. Kolom mikrobor mempunyai keuntungan yang utama dibanding dengan kolom
konvensional. yakni Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih
lambat l/menit. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC
adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa
harus inert terhadap fase gerak. reprodusibel. silika yang tidak dimodifikasi. dan pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan. . dan bebas dari gangguan. Ada jenis pompa dalam
HPLC yaitu pompa dengan tekanan konstan. Teflon. Pompa yang digunakan sebaiknya
mampu memberikan tekanan sampai psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan alir mL/menit. . Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya
residu gugus silanol SiOH. Kolom dan Fase diam Posisi pada saat menyuntik sampel Ada
jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. konstan. Posisi pada
saat memuat sampel . Untuk tujuan preparatif. Tujuan penggunaan pompa atau sistem
penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat. Tempat penyuntikan sampel Sampelsampel cair dan larutan
disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju
kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon
yang dilengkapi dengan keluk sampel sample loop internal atau eksternal. dan batu nilam.
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan
sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan. Meskipun
demikian. dalam prakteknya. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih
pekat. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas.
dan elektrokimia. Indeks bias x Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang.
Detektor HPLC Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi golongan yaitu detektor
universal yang mampu mendeteksi zat secara umum. Sangat sensitif terhadap suhu. tidak
bersifat spesifik. selektif tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda. dan
golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
selektif. . Stabil dalam pengopersiannya. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu
meminimalkan pelebaran pita. Fluoresensi Sensitifitas sangat bagus. yakni mampu
mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil. selektif. tidak dapat digunakan pada elusi
bergradien. Berdasarkan pada kedua pemisahan ini. paling sering Spektrofotometer x
digunakan. sedang. . Sensitifitas sangat bagus. Mempunyai respon terhadap solut yang
cepat dan reprodusibel. JENIS HPLC Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan
fase normal jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya atau fase terbalik
jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya.Oktadesil silika ODS
atau C merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan
senyawasenyawa dengan kepolaran yang rendah. dan tidak dapat digunakan pada elusi
bergradien Elektrokimia Konduktimetri Peka terhadap perubahan suhu Amperometri dan
kecepatan alir fase gerak. . sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan
HPLC . Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik
detektor seperti berikut Detektor Sensitifitas Kisaran Karakteristik g/ml linier Absorbansi
Uvvis Fotometer filter x Sensitivitas bagus. . Mempunyai sensitifitas yang tinggi. dan tidak
bersifat selektif seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa. maupun tinggi.
. Hanya mendeteksi solutsolut ionik. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan
konsentrasi solut pada kisaran yang luas kisaran dinamis linier. suatu detektor harus
mempunyai karakteristik sebagai berikut . Tidak peka terhadap perubahan suhu dan
kecepatan alir fase gerak. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase
gerak. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika
yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena
adanya kandungan air yang digunakan. Silikasilika aminopropil dan sianopropil nitril lebih
cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. . selektif terhadap
spektrometerphotogt x gugusgugus dan strukturstruktur diode array yang tidak jenuh.
Idealnya. detektor fluoresensi. seperti detektor UVVis.
dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan
fase diam seperti tipe kromatografi yang lain. Dengan demikian. Sebagai fase gerak adalah
campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. dan terakhir adalah
molekul yang jauh lebih kecil. atau berdifusi lewat fase diam. akan tetapi lewat diantara
partikel fase diam. retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik
serta oleh pH fase gerak. dengan jenisjenis HPLC sebagai berikut . peranan pH sangat
krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau
protonasi. atau dengan fenil. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga
dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau
menganalisis senyawa dengan berat molekul gt dalton. oktasilana. karenanya solut dapat
terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. Kromatografi
Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi
kolom dan kromatografi lapis tipis. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika
adalah hidrokarbonhidrokarbon nonpolar seperti dengan oktadesilsilana. Terbentuknya
spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah
dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. Kromatografi penukar ion KCKT penukar ion
menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak.
Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar. Pada silika dan alumina terdapat
gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Hal ini disebabkan solut dengan BM
yang besar tidak melewati porus. Fase diam yang paling populer digunakan adalah
oktadesilsilan ODS atau C dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Untuk solut
yang bersifat asam lemah atau basa lemah.fase terbalik. kemudian molekulmolekul yang
ukuran medium. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing
dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. Kenaikan kadar garam dalam
fase gerak menurunkan retensi solut. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai
muatan yang berlawanan. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan
menggunakan media air karena sifat ionisasinya. akan terelusi terlebih dahulu. Kromatografi
fase terikat Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda. .
Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya airalkohol dan juga pelarut
organik. HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau
berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut. . . . meskipun demikian sekitar kromatografi ini
memakai silika sebagai fase diamnya. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya
menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina. .
Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk
pemisahan sampelsampel ionik dan mengatasi masalahmasalah yang melekat pada metode
penukaran ion. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat
porus sehingga solut dapat melewati porus lewat diantara partikel. Kromatografi penukar ion
dengan fase gerak air. meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah
polistiren resin. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran. Selain klasifikasi di atas.
Nbromometilasam fosfat diisopropilisourea DNBDI.nitrobenzooksa.dinitrobenziloksiamin
hidroklorida DNBA. Fase diam mengandung gugusgugus molekul yang hanya dapat
menyerap sampel jika ada kondisikondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu
pada sampel yang sesuai sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi..
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein enzim dari campuran yang
sangat kompleks. . .asetoksikumarin. fluoroSNPA. Tujuan utama penggunaan derivatisasi
pada HPLC adalah untuk .Nkloronitrobenzooksao sekunder suksinimidilpnitrofenilasetat .
Dansil klorida dimetilaminiazobenzensulfinil DabsylCl. produk hasil derivatisasi harus stabil
selama proses derivatisasi dan deteksi. bromofenasil bromida PBPB Alkohol . Detektor yang
paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UVVis sehingga banyak metode yang
dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap
cahaya pada panjang gelombang tertentu. Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia
antara lain Gugus fungsional Reagen untuk dapat dideteksi Reagen untuk dapat dengan
UVVis dideteksi dengan Fluoresen Asamasam pnitrobenzilN.Nbromometilkaboksilat. Di
samping itu.dinitrobenzil klorida DNBC. . asam lemak. pmetoksikumarin. naftilisosianat NIC.
Asamasam amino dimetilaminiazobenzensulfinil Fluoresamin . diazol NBDF. keton
pnitrobenziloksiamin hidroklorida Dansil hidrazin PNBA. . Aldehid. Amin primer Fluoresamin
oftalaldehid OPA o Amin primer dan . . Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai
syaratsyarat sebagai berikut. DERIVATISASI PADA HPLC Derivatisasi melibatkan suatu
reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisikakimia suatu
analit.dinitrobenzil klorida DNBC.asamdinitrobenzilN.dinitrofenilasetat SDNPA. proses
derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin . pemisahan
terjadi karena interaksiinteraksi biokimiawi yang sangat spesifik. yakni produk yang
dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat
membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri.
asamdiisopropilisourea PNBDI. dimetilaminiazobenzensulfinil DabsylCl. serta sisa pereaksi
untuk derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi. juga dikembangkan suatu
metode untuk menghasilkan fluorofor senyawa yang mamapu berfluoresensi sehingga dapat
dideteksi dengan fluorometri. Kromatografi Afinitas Dalam kasus ini.Nsuksinimidil.diazol
NBDCl. naftilisosianat NIC. Meningkatkan deteksi Merubah struktur molekul atau polaritas
analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik Merubah matriks
sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik Menstabilkan analit yang sensitif.
fluoronitrobenzooksa.peptida DabsilCl oftalaldehid OPA kloronitrobenzooksa. .diazol
NBDF.diazol NBDCl. Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom
precolumn derivatization atau setelah analit keluar dari kolom postcolumn derivatization.