OCR Document
advertisement
Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 RINGKASAN Penelitian tahun I mempunyai tujuan: memperoleh data keragaman bakteri kitinolitik baik keragaman morfologi, biokimia, dan genetik; mengetahui aktifitas kitinase dari bakteri yang diisolasi; dan mengetahui indikasi awal kemampuan menghambat pertumbuhan beberapa jamur patogen tanaman dari bakteri yang diisolasi. Untuk mencapai tujuan di atas dilakukan pekerjaan antara lain: melakukan penapisan bakteri kitinolitik dari berbagai sumber, melakukan pengamatan morfologi dan biokimia bakteri kitinolitik,mengukur aktifitas kitinase, melakukan uji indikasi penghambatan pertumbuhan jamur patogen oleh bakteri kitinolitik, dan melihat keragaman genetik bakteri kitinolitik. Semua pekerjaan ini sedang dan sudah dilakukan kecuali melihat keragaman genetik. Dari penelitian tahun I didapat sebanyak 41 bakteri kitinolitik yang berhasil diisolasi dengan variasi bentuk dan warna koloni, bentuk sel, dan sifat biokimianya. Dari isolat yang telah diuji terdapat 3 isolat yang memiliki aktifitas kitinase kasar tertinggi masing-masing isolat BKO1, BKO2, dan PSO1. Pengujian isolat bakteri terhadap Jamur F. semitectum mengindikasikan ada 5 isolat yang memperlihatkan kemampuan menghambat pertumbuhan jamur tersebut. Telaah yang dilakukan dalam penelitian ini pada gilirannya diharapkan memberikan informasi tentang biodiversitas mikroba yang memiliki potensi (bioprospecting) sebagai model bagi upaya pengelolaan sumber daya hayati khususnya di Sumatera, dengan keluaran yang diharapkan berupa diketahuinya mikroba novel, dan diketahuinya mikroba yang mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai agensia pengendali hayati jamur patogen tanaman dan untuk dikembangkan di bidang industri terkait, baik dalam bentuk massa sel, enzim, atau gen. iii Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 DAFT AR ISI Halaman LEMBAR IDENTITAS DAN PENGESAHAN ........................................ ii RINGKASAN.............. ....................................... .... .................................. iii PRAKA T A .......... ..... . ................. ........................... ................................ iv DAFT AR ISI.............................................................................................. v DAFT AR T ABEL ................................................... ................................. vi DAFT AR GAMBAR ......................... ....................... ................. ............. vii DAFT AR LAMPI RAN............. ............... ................................................ viii I. PENDAHULUAN.......................................................................... ......... 1 II. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN TAHUN KE-1 ................. 4 III. TINJAUAN PUST AKA ................ ..... ........................................ ....... 5 IV. METODE PENELITIAN .................. ................................ .................. 10 V. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................... ....... ............................ 13 VI.KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................. 21 VII.RENCANAIPENELITJAN TAHUN II............................................... 22 DAFTAR PUST AKA ......................... ...... ....... ..... .. ........ ...... ........ ...... 23 LAMPI RAN ..... .......................... ...................... ......... .......... ................. 26 v Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 DAFT AR T ABEL Halaman Tabel 1. Hasil isolasi dan pengamatan morfologi serta uji biokimia sederhana................................................................................................... 14 Tabel 2. Pengujian aktivitas kitinase bakteri kitinolitik setelah diinkubasi selama 96 jam secara kualitatif ................................................................. 15 Tabel 3. Pengukuran aktivitas kitinase kasar pada sam pel secara Kuantitatif……………………………………………………………….. 18 Tabel 4. Pengujian kemampuan daya hambat isolat bakteri kitinolitik terhadap pertumbuhan beberapa jamur patogen......................................... 19 vi Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 DAFT AR GAMBAR Halaman Gambar 1. Rantai polimer kitin .......................... ..................................... 5 Gambar 2. Sel isolat Bangka 01, Bangka 02, dan Sidimpuan diamati dengan mikroskop cahaya (perbesaran 10 x 100)........................ 17 vii Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 I. PENDAHULUAN Sebagai salah satu negara dengan biodiversitas sangat besar karena keragaman lingkungan, Indonesia menyediakan banyak sumber isolat mikroba yang memiliki nilai ekonomi penting. Pencarian isolat-isolat yang dapat digunakan dalam industri seperti isolat yang mampu menghasilkan enzim-enzim komersial perlu diupayakan. Salah satu pendekatan yang dapat dilakukan untuk mengeksplorasi kapasitas metabolisme mikroba adalah dengan cara mempelajari gen yang menyandi enzim yang terlibat dalam proses-proses kimiawi khusus (Cottrell et al. 2000). Banyak organisme seperti bakteri, jamur, tumbuhan tingkat tinggi, dan hewan menghasilkan kitinase yang mengkonversi kitin menjadi monomer atau oligomernya (Wen et al. 2002; Tsujibo et a/. 2003). Organisme ini biasanya memiliki beragam gen kitinase yang ekspresinya diinduksi oleh ekstraseluler kitin atau derivatnya. Bakteri memanfaatkan kitinase untuk asimilasi kitin sebagai sumber karbon dan nitrogen. Pada tumbuhan, enzim ini digunakan sebagai pertahanan melawan serangan organisme patogen yang mengandung kitin (Fujii and Miyashita 1993; Wu et al. 2001). Jamur dan serangga menggunakan enzim ini untuk morfogenesis dinding sel dan pembangun eksoskeleton (Shaikh and Desphande 1993). Mengingat jumlah kitin yang melimpah di alam sebagai komponen penyusun dari berbagai organisme, kitin diproduksi secara terus menerus. Dengan demikian kitin merupakan substrat yang selalu tersedia sehingga sebagian mikroba tanah dan air merupakan pendegradasi kitin yang baik. Bakteri kitinolitik menarik untuk diisolasi karena kemampuannya dalam menghidrolisis kitin menjadi derivat kitin. Derivat ini banyak dimanfaatkan dalam berbagai bidang seperti biokimia, bioteknologi, farmakologi, medis, dan industri, misalnya sebagai bahan kosmetik, kapsul obat, dan makanan hewan (Muzzarelli 1985). Kitin atau derivatifnya digunakan sebagai bahan bakar biologis atau sebagai bahan berharga lainnya dalam industri seperti obat antiinflamatori, immunoajuvan, antitumor, flokulan dalam pengolahan limbah, agensia anti fungi atau arthropoda hama, dan teknologi protoplast fungi (Sakka et al. 1991; Shaikh and Deshpande 1993; Ohno at al. 1996; Patil at al. 2000). 1 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 Bakteri kitinolitik juga berperan dalam pengendalian hama dan penyakit tanaman. Pleban et al. (1997) melaporkan Bacillus cereus strain 65 dapat melindungi tanaman kapas dari penyakit busuk akar oleh Rhizoctonia solani. Untuk mengaksas gen-gen kitinase pada bakteri dapat dilakukan dengan menggunakan pendekatan PCR-based dengan primer konservatif (Cottrell et al. 2000). Kitinase terdapat tersebar mulai dari bakteri, serangga, virus, tumbuhan, dan hewan (Fujii and Miyashita 1993; Ohno et al. 1996), dan memainkan peran yang penting dalam fisiologi dan ekologi (Ohno et al. 1996; Saito et al. 2001). Hal ini mungkin berhubungan dengan tersebarnya bahan kitin di alam seperti pada jamur, alga, nematoda, kelompok artropoda dan krustacea, mollusca, coelenterata, protozoa, dan fungi (Folders et al. 2001; Orikoshi et al. 2003). Meski demikian gen-gen penyandi kitinase bagi organisme merupakan gen non esensial (Cottrell et al. 2000). Metihat kenyataan ini eksplorasi kitinase dapat dilakukan dimana saja mulai dari tanah, rizosfer, air tawar, air laut, dan tumbuhan. Akhir-akhir ini, kitinase kembali menjadi perhatian karena adanya kemungkinan penggunaan enzim ini dalam pengendalian biologi organisme yang mengandung kitin dan juga untuk eksploitasi bahan kitin alami (Ohno et al. 1996), disamping kegunaan dalam bidang farmasi, dan industri (Sakka et al. 1991). Karena besarnya keragaman struktur cincin yang ada, tidak mengejutkan bahwa bakteri seringkali menghasilkan beberapa kitinase sekaligus (Svitil et al. 1997). Variasi dan korelasi dari gen-gen non esensial dengan filogeni gen rRNA-nya bisa jadi berbeda dari filogeni gen rRNA dari gen-gen esensial (Cottrell et al. 2000). Meskipun primer umum untuk gen kitinase belum bisa dirancang karena beragamnya gen ini (Fujii and Miyashita 1993; Svitil et al. 1997; Cotrell et al. 1999; Cottrell et al. 2000), namun dengan mengkaji semua bakteri penghasil kitinase boleh jadi konservasi gen di antara semua bakteri ini makin jelas (Cottrell et al. 1999). Kajian mengenai konservasi gen penghasil kitinase dapat dilakukan dengan membandingkan gen-gen melalui amplifikasi dengan menggunakan beberapa primer sekaligus (Cottrell et al. 2000). 2 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 Subjek penelitian Uji aktifitas kitinase dari bakteri, uji kemampuan menghambat pertumbuhan beberapa jamur patogen tanaman dari bakteri kitinolitik yang telah diisolasi, dan biologi molekuler keragaman bakteri kitinolitik. Lokasi penelitian Laboratorium Mikrobiologi PS Biologi FMIPA, USU, Medan Laboratorium Biologi RCMD FMIPA IPB, Bogor Hasil yang ditargetkan Tahun I: Memperoleh data keragaman bakteri kitinolitik baik keragaman morfologi, biokimia, dan genetik. Mengetahui aktifitas kitinase dari bakteri yang diisolasi Mengetahui indikasi awal kemampuan menghambat pertumbuhan beberapa jamur patogen tanaman dari bakteri yag diisolasi Tahun II: Memperoleh gambaran dari kemampuan atau aktifitas masing-masing bakteri kitinolitik dalam mendegradasi kitin dari beberapa jamur patogen tanaman pada kondisi lingkungan (pH, suhu, dan kadar garam) yang berbeda. Mengetahui gen penyandi bakteri kitinolitik yang potensial dalam mengendalikan pertumbuhan jamur patogen tanaman. Keterlibatan mahasiswa Penelitian ini melibatkan beberapa orang mahasiswa S1 PS Biologi FMIPA Universitas Sumatera Utara untuk penyelesaian skripsi. Melalui proyek ini telah 1 orang mahasiswa menyelesaikan studi S1. Satu orang mahasiwa baru mulai melakukan penelitian. Diharapkan beberapa mahasiswa lagi pada tahun II terlibat dalam penelitian ini. 3 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 II. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN TAHUN KE-1 TUJUAN KHUSUS Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh data keragaman morfologi, biokimia, dan genetik bakteri kitinolitik, dan mengetahui aktifitas enzim kitinase dari bakteri hasil isolasi, dan mengetahui indikasi awal kemampuan bakteri kitinolitik dalam menghambat pertumbuhan beberapa jamur patogen tanaman. MAN FAAT PENELITIAN Secara umum penelitian tentang biokimia dan biologi molekular kitinase di Indonesia seringkali ditekankan hanya pada 1 jenis kitinase yang berasal dari satu bakteri atau dari satu sumber (contoh Wenuganen 1997; Yurnaliza 2001). Telaah lebih menyeluruh akan memberikan gambaran sebaran gen ini di lingkungan serta memberikan pilihan yang lebih banyak dalam upaya pemanfaatan sumber daya genetik khususnya gen-gen kitinase untuk tujuan ilmu pengetahuan dan komersial seperti untuk agensia anti fungi atau arthropoda hama, obat anti-inflamatori, immunoajuvan, antitumor, flokulan dalam pengolahan limbah, dan teknologi protoplast fungi (Sakka et al. 1991; Shaikh & Deshpande 1993; Ohno et al. 1996; Patil et al. 2000) di Indonesia. Pemanfaatan mikroorganisme untuk mengendalikan penyakit tanaman merupakan bidang yang relatif baru. Pengendalian hayati jamur penyakit tanaman acap dilakukan dengan menggunakan mikroorganisme seperti jamur dan bakteri. Sekitar 40 produk pengendalian hayati penyakit tanaman kini beredar di dunia (Fravel et al. 1998), tidak diketahui mengenai produk serupa yang berasal dari Indonesia. Telaah yang akan dilakukan ini pada gilirannya diharapkan memberikan informasi tentang biodiversitas mikroba yang memiliki potensi (bioprospecting) sebagai model bagi upaya pengelolaan sumber daya hayati khususnya di Sumatera. Keluaran yang diharapkan berupa diketahuinya mikroba novel, dan diketahuinya mikroba yang mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai agensia pengendali hayati jamur patogen tanaman dan untuk dikembangkan di bidang industri terkait, baik dalam bentuk massa sel, enzim, atau gen. 4 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 III. TINJAUAN PUSTAKA Struktur dan Sumber-Sumber Kitin di Alam Kitin mempunyai rumus empiris (C6H9O4.NHCOCH3)n, merupakan zat padat yang tidak larut dalam air, pelarut organik, alkali pekat, asam mineral lemah, tetapi larut dalam asam-asam mineral yang pekat. Polisakarida ini mempunyai berat molekul tinggi dan merupakan polimer berantai lurus dengan nama lain β-(1-4 )-2-asetamida-2-dioksi-D-glukosa (N-asetil-D-Glukosamin). Rantai kitin antara satu dengan yang lainnya berasosiasi dengan ikatan hidrogen yang sangat kuat antara gugus N-H dari satu rantai dan gugus C=O dari rantai yang berdekatan. Ikatan hidrogen menyebabkan kitin tidak dapat larut dalam air dan membentuk formasi serabut (fibril). Berdasarkan penyusun rantai polimernya, kitin fibril dibedakan menjadi tiga jenis yaitu α-kitin, β-kitin dan γ-kitin (Cabib 1987). Pada serangga lebih dari 80% komponen kutikulanya merupakan kitin. Pada Crustacea, kitin melekat pada suatu matriks dari CaCO3 dan fosfat. Pada serangga matriksnya berupa proteinaceous yaitu protein yang sudah mengalami pentaninan (Cabib 1987). Kitin pada alga terutama ditemukan pada diatom laut dengan kandungan 10-15% berat kering. Lebih dari 80.000 ton kitin per tahun dihasilkan di perairan (Patil et al. 2000). Kitin pada jamur berbentuk mikrofibril yang memiliki panjang yang berbeda tergantung pada spesies dan lokasi selnya. Mikrofibril merupakan struktur utama dari dinding sel jamur yang terdiri atas jalinan rantai polisakarida yang saling bersilangan membentuk anyaman. Kandungan kitin pada jamur bervariasi dari 4-9% berat kering sel (Rajarathanam et al. 1998). 5 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 Kitinase Sistem tata nama kitinase masih menimbulkan kerancuan. Harman et a/. (1993) serta Sahai and Manocha (1993) membagi kitinase dalam tiga tipe yaitu: 1. Endokitinase (EC 3.2.1.14), yaitu kitinase yang memotong secara acak ikatan β-1,4 bagian internal mikrofibril kitin. Produk akhir yang terbentuk bersifat mudah larut berupa oligomer pendek N-asetilglukosamin (GIcNAc) yang mempunyai berat molekul rendah seperti kitotetraose. 2. Eksokitinase (EC 3.2.1.14) dinamakan juga kitobiosidase atau kitin 1,4-β-kitobiosidase, yaitu enzim yang mengkatalisis secara aktif pembebasan unit-unit diasetilkitobiose tanpa ada unit-unit monosakarida atau oligosakarida yang dibentuk. Pemotongan hanya terjadi pada ujung non reduksi mikrofibril kitin dan tidak secara acak. 3. β-1,4-N-asetilglukosaminidase (EC 3.2.1.30) merupakan suatu kitinase yang bekerja pada pemutusan diasetilkitobiose, kitotriose, dan kitotetraose dengan menghasilkan monomermonomer GIcNAc. Kitinase telah banyak dilaporkan dan diklasifikasikan dalam dua famili yaitu 18 dan 19 berdasarkan kemiripan sekuen asam amino (Tsujibo et al 2003). Famili 18 meliputi kitinase dari virus, bakteri, jamur, dan hewan, serta klas III dan V kitinase dari tumbuhan. Famili 19 mencakup klas I, II dan IV telah diidentifikasi dari tumbuhan. Baru-baru ini ditemukan klas IV famili 19 yang tersebar luas pada Streptomyces sp. (Watanabe et a/., 1999). Famili 18 dibagi dalam tiga subfamili yaitu A, B, dan C (Gao et a/. 2003). Bakteri kitinolitik seringkali menghasilkan berbagai gen kitinase, walaupun konstribusi enzim untuk degradasi kitin belum diketahui seeara menyeluruh (Tsujibo et a/. 2003). Kitinase yang dihasilkan mikroba memiliki berat molekul yang berkisar antara 20.000-120.000. Pada bakteri berat molekulnya antara 60.000-110.000, sedangkan aktinomisetes yaitu 30.000 atau lebih rendah. Pada jamur berat molekulnya lebih tinggi dari 30.000 dan pada tumbuhan sekitar 30.000 (Wang and Chang 1997). Mikroba Yang Menghasilkan Kitinase Aktinomisetes, bakteri, dan jamur merupakan organisme yang mampu memanfaatkan kitin sebagai sumber karbon dan nitrogen. Genus bakteri yang sudah banyak dilaporkan 6 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 memiliki kitinase antara lain Aeromonas, Alteromonas, Chromobacterium, Enterobacter, Ewingella, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Serratia, Vibrio (Chernin et al., 1998), Bacillus (Pleban et al. 1997), dan Pyrococcus (Gao et al. 2003). Koloidal kitin merupakan salah satu substrat yang dapat digunakan untuk menginduksi kitinase pada bakteri, jamur, dan aktinomisetes. Substrat ini mampu menginduksi enzim hidrolitik seperti N-asetilglukosamin, endokitinase dan kitobiosidase pada Aeromonas caviae (Inbar and Chet 1991), Enterobacter agglomerans (Chernin et a/. 1995), dan Bacillus cereus (Pleban et a/. 1997). Pengukuran Aktivitas Kitinase Pengukuran aktivitas kitinase dalam memecah substrat dapat dilakukan dengan beberapa cara seperti yang disebutkan dalam Jeaniaux (1966) dan Cabib (1987), yaitu: 1. Berdasarkan pengurangan substrat a. Metode viskosimetri yaitu aktivitas kitinase terhadap kitosan, glikol kitin atau karboksimetil kitin yang ditunjukkan oleh terjadinya penurunan viskositas substrat. b. Metode nefelometri (turbidimetri) yaitu pengukuran variasi kekeruhan suspensi koloidal kitin selama kitinolisis. Metode ini bersitat cepat dan akurat tetapi hanya cocok untuk enzim dengan aktivitas relatif tinggi. 2. Berdasarkan pembentukan produk akhir yaitu GIcNAc yang dibebaskan dari kitin dapat ditentukan dengan metode kolorimetrik dengan penambahan p-dimetilaminobenzaldehida (Metode Reissig, 1955). Satu unit aktivitas kitinase dinyatakan sebagai μmol GlcNAc yang dibebaskan selama 1 jam dalam kondisi yang ditetapkan. 3. Pengujian spektrofotometri yaitu menggunakan kromogen 3,4-dinitrofenil-tetra-Nasetikitotetraose sebagai substrat. 4. Pengujian sensitifitas kitinase menggunakan radiometri yaitu substrat diberi label 14C atau 3 H. Kadar produk diuji dengan menentukan radioaktifitasnya setelah penghilangan kitin yang belum dipecah dengan penyaringan atau dengan cara disentrifugasi. 7 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 Manfaat Kitinase dan Bakteri Kitinolitik Kitinase terdapat tersebar mulai dari bakteri, serangga, virus, tumbuhan, dan hewan (Fujii & Miyashita 1993; Ohno et al. 1996), dan memainkan peran yang penting dalam fisiologi dan ekologi (Ohno et a/. 1996; Saito et a/. 2001). Hal ini mungkin berhubungan dengan tersebarnya bahan kitin di alam seperti pada jamur, alga, nematoda, kelompok artropoda dan krustacea, mollusca, coelenterata, protozoa, dan fungi (Folders et al. 2001; Orikoshi et a/. 2003). Meski demikian gen-gen penyandi kitinase bagi organisme merupakan gen non esensial (Cottrell et al. 2000). Melihat kenyataan ini eksplorasi kitinase dapat dilakukan dimana saja mulai dari tanah, rizosfer, air tawar, air laut, dan tumbuhan. Kitinase berguna dalam produksi kitooligosakarida. Kitooligosakarida berperan sebagai pertahanan tanaman, juga digunakan dalam kesehatan manusia. Sebagai contoh, kitoheksaose dan kitoheptaose memperlihatkan aktivitas anti tumor. GlcNAc berguna sebagai obat anti inflamasi. Senyawa ini dalam tubuh manusia disintesis dari glukosa dan digabungkan dengan glikoprotein dan glikosaminoglikan (Patil et al. 2000). Dalam teknologi protoplas jamur, dibutuhkan bantuan kitinase untuk mengisolasi protoplas jamur. Protoplas digunakan untuk mempelajari sintesis dinding sel, sekresi enzim, transformasi steroid, dan mutagenesis. Kitinase juga berperan dalam produksi protein sel tunggal dari limbah kitin untuk makanan hewan (Shaikh and Desphande, 1993). Kitinase digunakan dalam pertanian sebagai pengendalian jamur patogen tanaman dan hama serangga. Organisme ini memiliki kitin pada penutup tubuhnya sehingga dapat didegradasi oleh enzim tersebut (Patil et al. 2000). Pseudomonas flourescens dapat mengendalikan Pythium ultimum dan Rhizoctonia solani dengan menekan pertumbuhannya (Nielsen et al. 1998). Sampson and Gooday (1998) meneliti kitinase dari Bacillus thuringiensis yang diujikan terhadap Culicoides nubeculosus dan Spodoptera littoralis, sedangkan Regev et al. (1996), meneliti sinergisme σ-endotoksin B. thuringiensis dan endokitinase bakteri terhadap larva S. littoralis. Menurut mereka kitinase yang dihasilkan bakteri dapat membunuh serangga sehingga dapat dijadikan agen pengendali biologis. Kombinasi dari σ-toksin dan kitinase dilaporkan lebih efektif dalam membunuh hama serangga (Patil et al. 2000). Akhir-akhir ini, kitinase kembali menjadi perhatian karena adanya kemungkinan penggunaan enzim ini dalam pengendalian biologi organisme yang mengandung kitin seperti jamur dan serangga dan juga untuk eksploitasi bahan kitin alami (Ohno et al. 1996),disamping 8 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 kegunaan dalam bidang farmasi, dan industri (Sakka et al. 1991). Pengendalian hayati jamur dengan menggunakan mikroorganisme kitinolitik didasarkan pada kemampuan mikroorganisme menghasilkan kitinase dan β-1,3-glucanase yang dapat melisis sel jamur (EI-Katatny et al. 2000). Kemampuan kitinolitik bakteri Aeromonas caviae telah digunakan untuk mengendalikan beberapa jamur patogen tanaman (Inbar & Chet 1995). Galur Serratia marcescens telah dimanfaatkan untuk mengendalikan jamur patogen seperti Sclerotium rolfsii (Ordentlich et al. 1988). Gen chiA dari S. marcescens telah pula dimanfaatkan melalui kloning pada Pseudomonas fIuorescens (Downing & Thomson 2000). Bakteri lain yang juga digunakan sebagai pengendali hayati komersial seperti P. syringae, Burkholderia cepacia, Bacillus subtilis, Agrobacterium radiobacter, Enterobacter cloacae, dan Streptomyces griseoviridis (Fravel et al 1998; McQuilken et at. 1998). Strategi untuk seleksi strain mikroorganisme berdasarkan kepada kriteria kemampuan kolonisasi, kemampuan kompetisi dan kemampuan menyesuaikan diri di lingkungan. (McQuilken et al. 1998). 9 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 IV. METODE PENELITIAN Pengambilan Contoh Contoh diambil dari berbagai habitat. Untuk bakteri tanah, contoh diambil di permukaan tanah, rizosfer, atau lumpur perairan. Untuk bakteri pada tumbuhan diambil di lubang tampungan air di pohon atau dalam tumbuhan pemakan serangga (Nephentes sp.). Sampai saat ini telah diperoleh isolat bakteri kitinase dari tanah pertanian, tanah lumpur, dan lubang tampungan air di pohon. Pengambilan contoh tanah, tumbuhan, dan air seperti dari hutan Taman Nasional Gunung Leuser (TNGL) Tangkahan Langkat dan Taman Nasional Batang Gadis Madina telah dilakukan. Pekerjaan isolasi sampai saat ini tetap masih dilakukan Penapisan Bakteri Penghasil Kitinase Bakteri kitinolitik biasa dijejak dengan pembentukan zona bening pada medium kitin atau dengan melihat kemampuan hidrolisis pada subtrat fluorogenik analog kitin (Cotrell et al. 1999). Dalam penelitian ini mikroba kitinolitik ditapis dengan menggunakan medium mengandung kitin. Mikroba diisolasi dari contoh dengan menggunakan medium garam koloidal kitin disesuaikan dengan kondis! lingkungan (kadar garam dan pH) dari mana isolat berasa!. Pembentukan halo di sekitar koloni sebagai hasil degradasi kitin dievaluasi. Nilai aktivitas hidrolisis secara kualitatif diperoleh dengan membagi diameter zona hidrolisis di sekitar koloni dengan besarnya diameter koloni isolat pada hari ke-4 (96 jam) setelah inkubasi (Widhyastuti and Dewi, 2001). Aktivitas enzim kasar kultur bebas sel ditentukan dengan menggunakan substrat koloidal kitin. Aktivitas khitinase dihitung berdasarkan selisih antara kadar N-asetil glukosamin (GlcNAc) yang dibebaskan pada perlakuan dengan kadar GlcNAc yang terdapat dalam kitinase kasar yang tidak diperlakukan (kontrol). GlcNAc yang dihasilkan dianalisis secara kolorimetri dengan metode Reissig (1955) dalam Jeaniaux (1966). Penampakan Morfologi dan Uji Biokimia Bakteri Penghasil Kitinase Karakterisasi sifat morfoJogi mencakup bentuk dan warna koloni, motilitas, bentuk sel, dan sifat gram. Motilitas diamati dengan menggunakan medium semi padat sulfide indole motility (SIM). Pewarnaan Gram dengan menggunakan kristal violet dan safranin digunakan untuk menentukan sifat gram. Sifat biokimia yang diamati mencakup uji sitrat dengan medium Simmons' Citrate agar, uji gelatin dengan medium nutrien gelatin, dan uji katalase dengan 10 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 menggunakan larutan 3% H2O2 (Cappuccino and Sherman, 1983). Pengukuran Aktivitas Kitinase Kasar Kitinase kasar diperoleh dari kultur 96 jam (Pleban et al., 1997). Kitinase kasar dari masing-masing Isolat dan substrat kitin (1% koloidal kitin (b/v) dalam 50 mM buffer fosfat, pH 6,8) dicampur dengan volume yang sama dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit. Reaksi dihentikan dengan memanaskan campuran dalam air mendidih selama 15 menit dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 20 menit. Aktivitas khitinase dihitung berdasarkan selisih antara kadar N-asetil glukosamin (GlcNAc) yang dibebaskan pada perlakuan dengan kadar GlcNAc yang terdapat dalam kitinase kasar yang tidak diperlakukan (kontrol). GlcNAc yang dihasilkan dianalisis secara kolorimetri dengan metode Reissig (1955) dalam Jeaniaux (1966). Satu unit aktivitas kitinase didefenisikan sebagai jumlah enzim yang membebaskan sebanyak 1 μmol GlcNAc/jam pada kondisi tertentu (Singh et al., 1999). Uji Penghambatan Pertumbuhan Beberapa Jamur Patogen Tanaman Hifa jamur Fusarium semitectum, Ganoderma boninense, dan Penicillium citrinum yang ditumbuhkan dalam media nutrien broth yang ditambah dengan 3% potato dextrose agar diambil seukuran 0.5x0.5 em, kemudian dikulturkan dalam media garam kitin. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar (28°C) selama 2 hari. Setelah jamur terlihat tumbuh kira-kira 0.5 cm dari hifa-terluar digores lurus bakteri kitinolitik dari hasil isolasi. Pengamatan dilakukan dengan melihat ada tidaknya zona hambat pertumbuhan setelah diinkubasi selama 2 hari. Ekstraksi DNA DNA genom total dari bakteri terkulturkan akan diekstraksi sebagai yang digambarkan oleh Sambrook et al. (1989). 11 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 Melihat Keragaman Genetik Bakteri Penghasil Kitinase Melalui Gen 168 rRNA Amplifikasi gen 16S-rRNA dilakukan dengan primer 63f dan 1387r (Marchesi et al., 1998) menggunakan Ready- To-GO PCR Beads (Pharmacia-Biotech, Uppsala, Sweden). DNA yang teramplifikasi akan diklon pada pGEM-T dan ditransfer dalam E. coli DH5α menggunakan metode yang digambarkan oleh Sambrook et al. (1989). Analisis Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) dilakukan dengan menggunakan metode seperti yang dilakukan oleh Desiliyarni et al. (1999) dengan elekroforesis minigel. Hubungan kekerabatan antar isolat dianalisis dengan program komputer Treecon (Van de Peer and De Wachter 1994). Isolat dengan pola pita yang berbeda digunakan untuk analisis selanjutnya. Hambatan Dalam Pekerjaan Sangat terlambatnya pencairan dana penelitian menyebabkan berubahnya beberapa rencana pekerjaan dalam hal metode dan waktu pelaksanaan. Dana penelitian baru diterima peneliti tanggal 13 September 2005, sedang laporan kemajuan harus diserahkan ke LP USU paling lambat tanggal 20 September 2005. Namun demikian perubahan rencana pekerjaan dan jadwal tidak merubah keseluruhan ini dari penelitian ini. Diharapkan sekali untuk tahun-tahun berikutnya dana penelitian dapat diterima peneliti secepat mungkin. Seberapa pekerjaan dalam metode yang berubah mencakup tidak digunakannya substrat p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosamine (pNP-GlcNAc) dan p-nitrophenyl-β-DN,N',N"-triacetylchitotriose [pNP-(GlcNAc)3 seperti yang dilakukan Folders et al. (2001) untuk mengukur aktivitas eksokitinase dan endokitinase. Dalam tahap pengerjaan Saat ini dilakukan uji penghambatan pertumbuhan terhadap jamur patogen tanaman seperti Fusarium semitectum, Ganoderma boninense, dan Penicillium citrinum yang merupakan jamur-jamur penyebab penyakit. Pekerjaan analisis genom yang dijadwalkan tengah JuliAgustus terpaksa ditunda dan dijadwal ulang, karena pekerjaan ini melibatkan institusi lain yaitu RCMD, Fakultas MIPA, IPS. Pekerjaan identifikasi dan uji aktivitas kitinase tetap dilakukan pada isolat-isolat yang baru didapat. 12 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 V. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Kitinolitik Isolasi yang telah dilakukan sampai saat ini dari contoh tanah, lumpur, dan cekungan penampung air pada tumbuhan dari beberapa daerah di Sumatera Utara dan Bangka, memperoleh 41 isolat bakteri kitinolitik, yaitu 22 isolat dari Sumatera Utara, 12 isolat dari Bangka, dan 7 isolat belum diberi kode. Beberapa sampel yang sudah diambil dari lapangan sedang dalam tahap isolasi bakteri kitinolitik. Diharapkan akan ada tambahan jumlah dan jenis bakteri kitinolitik setelah pekerjaan penapisan dan isolasi selesai. Berdasarkan tempat sampel, 3 isolat diisolasi dari lubang tampungan air pada tumbuhan, 2 sampel dari lumpur, sisanya dari tanah. Berdasarkan pengamatan morfologi yang telah dilakukan terhadap 34 isolat tersebut, diperoleh bentuk koloni yang bervariasi, yaitu 27 isolat berbentuk bulat, 5 isolat berbentuk bulat berombak, dan 2 isolat tidak teratur. Warna koloni barvariasi pula, yaitu 2 isolat berwarna putih bening, 3 isolat berwarna putih kuning, 1 isolat berwarna merah muda, dan 10 isolat berwarna krem. Dari 17 isolat yang telah dilakukan pewarnaan gram, 7 isolat bersifat gram positif dan 10 isolat bersifat gram negatif, dengan bentuk sel basil, pseudobasil, dan kokus. Umumnya semua isolat mempunyai sel berbentuk basil kecuali isolat BK01 dan TU01 berbentuk pse udobasil , serta isolat BK04 berbentuk kokus. Uji motilitas yang dilakukan terhadap semua isolat ini menunjukkan bahwa 12 isolat bersifat motil ditandai dengan adanya jejak pergerakan bakteri di dalam medium, sedangkan 5 isolat lainnya tidak motil. Isolat lainnya sedang dalam pengamatan sifat gram dan bentuk sel. Uji biokimia sederhana yang telah dilakukan terhadap 17 isolat seperti uji motilitas , gelatin, sitrat, oksidase, dan katalase, menunjukkan 3 isolat yaitu DS01, LK01, dan BK02, memperlihatkan reaksi positif terhadap semua uji yang dilakukan. Hasil uji katalase dengan penambahan larutan 3% H2O2 mengindikasikan bahwa semua isolat memiliki enzim katalase, ditandai dengan terbentuknya gelembung udara di sekitar koloni. Umumnya isolat menunjukkan oksidase positif ditandai dengan perubahan warna pada strip Bactident® 13 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 Oxidase menjadi warna biru atau biru-violet. Uji oksidase digunakan untuk melihat adanya enzim sitokrom oksidase sedangkan uji katalase membuktikan adanya enzim katalase yang berfungsi dalam penguraian H2O2 yang bersifat racun. Dari uji gelatinase dan uji sitrat, diketahui umumnya isolat tidak mampu menghidrolisis gelatin dan menggunakan sitrat. Menurut Cappuccino and Sherman (1983), uji positif gelatinase ditandai dengan medium gelatin yang tetap cair setelah dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama 30 menit, sedangkan keadaan positif pada uji sitrat ditandai dengan berubahnya medium dari hijau menjadi biru karena terjadi penghilangan asam dan peningkatan pH dalam media. Pengujian biokimia terhadap isolat-isolat lainnya sedang dilakukan. Hasil pengamatan morfologi dan uji biokimia sederhana selengkapnya ditunjukkan pada Tabel 1. Tabel 1. Hasil isolasi dan pengamatan morfologi serta uji biokimia sederhana 14 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 Semua isolat merupakan bakteri kitinolitik yang ditunjukkan dengan terbentuknya zona hidrolisis di sekitar koloni bakteri pada medium campuran kitin agar dan nutrient broth (3:1) setelah masa inkubasi 96 jam (Tabel 2). Isolat-isolat tersebut menunjukkan kemampuan yang berbeda-beda dalam merombak kitin. Aktivitas hidrolisis tertinggi dijumpai pada isolat KR04, SPO1, BKO1, dan BKO2, sedangkan yang paling rendah dijumpai pada isolat BKO7 dan BKO9. Aktivitas hidrolisis merupakan gambaran dari kemampuan isolat bakteri kitinolitik dalam merombak kitin, semakin besar nilai aktivitas hidrolisis, semakin besar diameter zona bening yang terbentuk di sekitar koloni. Tabel 2. Pengujian aktivitas kitinase bakteri kitinolitik setelah diinkubasi selama 96 jam secara kualitatif 15 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 Menurut Chemin et al. (1995), bakteri dapat menghidrolisis koloidal kitin setelah 72-96 jam yang ditumbuhkan pada campuran semiminimal agar dan nutrient broth dengan perbadingan 3:1, yang dicampur dengan koloidal kitin sebagai sumber karbon. Pleban et al. (1997) melaporkan zona jernih yang terbentuk di sekitar pertumbuhan bakteri menandakan adanya aktivitas kitinolitik di medium pertumbuhan. Besamya nilai perbandingan zona bening dengan zona pertumbuhan koloni bakteri menunjukkan besamya aktivitas nisbi enzim (Widhyastuti and Dewi 2001). 16 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 Tiga isolat yang menunjukkan aktivitas hidrolisis yang paling tinggi yakni SPO1, BKO1, dan BKO2 telah dilakukan pengujian aktivitas enzim kasar, sedang isolat KRO4 belum dilakukan uji aktivitasnya. Ketiga isolat ini memiliki bentuk koloni dan warna koloni yang sama yaitu bulat dan krem. Isolat BKO1 dan BKO2 bersifat gram negatif (-) dengan sel berbentuk basil dan pseudobasil, sedangkan SPO1 bersifat gram positif (+) dengan sel berbentuk basil (Gambar 2). Pengujian Aktivitas Kitinase Ketiga isolat yang terpilih di atas ditumbuhkan pada medium kitin cair untuk mengetahui kemampuannya dalam merombak kitin secara kuantitatif. Menurut Shaikh and Deshpande (1993), degradasi kitin secara enzimatik untuk menghasilkan GlcNAc bebas dilakukan oleh sistem kitinolitik, yang telat ditemukan pada mikroba, tumbuhan-tumbuhan dan hewan. Connell et al. (1998) mengatakan degradasi kitin oleh prokariot dan eukariot terjadi dalam dua tahap yang prosesnya melibatkan hidrolisis ikatan β-1,4 glikosida yang menghubungkan subunit GlcNAc. Pertama, endokitinase mengikat tetramer dan polimer GlcNAc untuk menghasilkan disakarida kitobiose. Kitobiase menghidrolisis kitobiose menjadi monomer GlcNAc pada tahap kedua. Enzim pendegradasi kitin umumnya oleh beberapa organisme diinduksi oleh kitosan, kitobiose, GlcNAc atau glukosamin. 17 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 Hasil pengujian aktivitas kitinase kasar menuniukkan isolat BKO1 memiliki aktivitas enzim yang tertinggi yaitu 0,0636 Unit, sedangkan aktivitas enzim terendah dihasilkan oleh isolat BK02 yaitu 0,0452 Unit. Isolat SP01 dengan aktivitas hidrolisis tertinggi yaitu 2,942 hanya menghasilkan aktivitas enzim sebesar 0,0550 Unit, sedangkan isolat BK01 dengan aktivitas hidrolisis 2,253 temyata menghasilkan aktivitas enzim tertinggi yaitu 0,0636 Unit (Tabel 3). Menurut Yurnaliza (2001), beberapa faktor yang diduga menjadi penyebab tidak berkolerasinya nilai aktivitas hidrolisis secara kualitatif dengan nilai aktivitas enzim secara kuantitatif adalah perbedaan jenis mikroba, kecepatan pertumbuhan setiap isolat pada medium padat dan cair, jumlah inokulum yang diberikan pada kedua medium, dan tipe enzim kitinase yang dihasilkan. Tabel 3. Pengukuran aktivitas kitinase kasar pada sampel secara kuantitatif Kehadiran enzim kitinolitik pada medium pertumbuhan yang diuji dapat dilihat dari reaksi pelepasan GlcNAc dari koloidal kitin. Jeuniaux (1966), melaporkan endokitinase adalah spesifik untuk polimer linier dari N-asetil-D glokosamin, tetapi tidak memutuskan kitobiose. Enzim ini menghidrolisis kitin menjadi kitobiose, kitotrinose, dan asetilglukosamin bebas juga dapat diproduksi ketika substrat adalah koloidal kitin. Uji Penghambatan Pertumbuhan Beberapa Jamur Patogen Tanaman Hasil pengujian daya hambat pertumbuhan beberapa jamur patogen tanaman mengindikasikan ada 5 isolat bakteri kitinolitik yang mampu menghambat pertumbuhan jamur ini. Pengujian baru dilakukan terhadap 1 jenis jamur saja (F. semitectum), dan 2 jenis jamur lainnya sedang dimulai untuk dilakukan pengujian. Diharapkan dan pengujian ini akan ada beberapa jenis isolat bakteri kitinolitik yang mampu menghambat pertumbuhan 2 jenis jamur ini. Kemungkinan adanya 1 isolat yang mampu menghambat pertumbuhan 2 atau 3 jenis jamur patogen ini sekaligus masih harus menunggu hasil uji. 18 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 19 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 Keragaman Genetik Bakteri Penghasil Kitinase Melalui Gen 16S rRNA Pengamatan terhadap keragaman genetik bakteri penghasil kitinase melalui gen 16S rRNA belum dapat dilakukan karena keterlambatan pencairan dana. Diharapkan pekerjaan ini dapat dilakukan setelah semua sampel telah ditapis. Perkiraan pekerjaan dapat dilakukan di bulan Desember 2005. 20 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006 VII. RENCANA /PENELITIAN TAHUN II Penelitian tahun II bertujuan untuk melihat pengaruh lingkungan terhadap kemampuan bakteri menghidrolisis kitin jamur patogen dan kitin lainnya, dan memperoleh data keragaman gen penyandi kitinase dari bakteri kitinolitik yang berpotensi sebagai agen pengendali hayati jamur patogen tanaman dengan menganalisis keragaman genetik dengan teknik PCR-RFLP dari gen kitinase yang diamplifikasi dengan menggunakan primer gen chiA, chiB, dan chiC. Dari kegiatan pokok tersebut diharapkan dapat menjadi dasar bagi pengembangan strain-strain lokal, atau gen penyandi kitinase untuk pengendalian jamur patogen tanaman atau tujuan lain proteksi tanaman. Untuk mencapai tujuan di atas disusun metode seperti: asai keriap, asai pada beberapa jamur patogen tanaman in vitro, asai aktivitas antifungi filtrat kultur isolat bakteri, asai pengaruh lingkungan terhadap aktivitas hidrolitik isolat bakteri, PCR dan kloning gen penyandi kitinase, dan melihat keragaman genetik gen kitinase. 22 Dwi Suryanto: Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase Pada Berbagai Jenis Bakteri,2005 USU Repository©2006
