Enzim : Sifat

ENZIM (SIFAT – SIFAT UMUM)
Kontribusi : Wheny
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Enzim merupakan polimer biologik yang mengatalisis lebih dari satu proses
dinamik yang memungkinkan kehidupan seperti yang kita kenal sekarang. Sebagai
determinan yang menentukan kecepatan berlangsungnya berbagai peristiwa fisiologik,
enzim memainkan peranan sentral dalam masalah kesehatan dan penyakit. Pemecahan
makanan untuk memasok energi serta unsur-unsur kimia pembangunan tubuh
(building blocks); perakitan building blocks tersebut menjadi protein, membran sel,
serta DNA yang mengkodekan informasi genetik; dan akhirnya penggunaan energi
untuk menghasilkan gerakan sel, semua ini dimungkinkan dengan adanya kerja
enzim-enzim yang terkoordinasi secara cermat. Sementara dalam keadaan sehat
semua proses fisiologis akan berlangsung dalam cara yang tersusun rapi serta teratur
dan homeostatis tetap dipertahankan, homeostatis dapat mengalami gangguan berat
pada keadaan patologis. Sebagai contoh, cedera jaringan hebat yang mencirikan
penyakit sirosis hepatis dapat menimbulkan gangguan berat pada kemampuan sel
membentuk enzim-enzim yang mengatalisis berbagai proses metabolisme penting
seperti sintesis ureum. Ketidakmampuan mengubah ammonia yang toksik menjadi
ureum yang nontoksik sebagai akibat dari penyakit tersebut akan diikuti dengan
intoksikasi ammonia, dan akhirnya koma hepatikum. Suatu spektrum penyakit genetik
langka tetapi yang sering sangat menurunkan keadaan umum penderitanya dan kerap
fatal, memberi contoh-contoh tambahan dramatis tentang konsekuensi fisiologis
drastis yang dapat menyertai gangguan terhadap aktivitas bahkan hanya satu enzim.
Menyusul suatu cedera jaringan berat (misal, infark jantung atau paru, cedera
remuk pada anggota gerak) atau pertumbuhan sel yang tidak terkendali (misal,
karsinoma prostat), enzim yang mungkin khas bagi jaringan tertentu akan dilepas ke
dalam darah. Dengan demikian, pengukuran terhadap enzim intrasel ini didalam
1
serum dapat memberikan informasi diagnostik dan prognostic yang tidak ternilai bagi
dokter.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat dirumuskan beberapa
permasalahan sebagai berikut:
1)
Klasifikasi Enzim berdasarkan tipe dan mekanism reaksi.
2)
Enzim memerlukan koenzim.
3)
Enzim murni berfungsi sangat penting bagi pemahaman struktur, fungsi,
mekanisme reaksi, dan pengaturan enzim.
4)
Enzim dapat ditemukan di dalam organel spesifik
1.3 Tujuan
Berdasarkan rumusam masalah maka makala ini bertujuan sebagai berikut:
1)
Mengetahui Klasifikasi Enzim berdasarkan tipe dan mekanism reaksi.
2)
Mengetahui bahwa Enzim memerlukan koenzim.
3)
Mengetahui Enzim murni berfungsi sangat penting bagi pemahaman struktur,
fungsi, mekanisme reaksi, dan pengaturan enzim.
4)
Mengetahui Enzim dapat ditemukan di dalam organel spesifik
2
BAB II
PEMBAHASAN
2.1 ENZIM
DIKLASIFIKASIKAN
BERDASARKAN
TIPE
DAN
MEKANISME REAKSI
Satu abad lalu, baru ada beberapa enzim yang dikenal dan kebanyakan di
antaranya mengatalisis reaksi hidrolisis ikatan kovalen. Semua enzim ini diidentifikasi
dengan penambahan akhiran –ase pada nama substansi atau substrat yang
dihidrolisisnya. Jadi, lipase menghidrolisis lemak (Yunani lipos), amilase
menghidrolisis pati (Yunani amylon), dan protease menghidrolisis protein. Meskipun
banyak sisa peristilahan ini masih tetap bertahan sampai sekarang, pemakaiannya
sudah terbukti tidak memadai ketika ditemukan berbagai enzim yang mengatalisis
reaksi yang berbeda terhadap substrat yang sama, misal, oksidasi atau reduksi
terhadap fungsi alcohol suatu gula. Sementara akhiran -ase tetap digunakan, nama
enzim yang ada sekarang ini lebih menekankan pada tipe reaksi yang dikatalisisnya.
Sebagai contoh, enzim dehidrogenase mengatalisis pengeluaran hidrogen, sementara
enzim transferase mengatalisis reaksi pemindahan gugus. Dengan semakin banyaknya
enzim yang ditemukan, ketidakjelasan juga semakin tak terelakkan, dan kerap kali
tidak jelas enzim mana yang tengah dibicarakan oleh seorang penyelidik. Untuk
mngatasi permasalahan ini, International Union of Biochemistry (IUB) telah
mengadopsi sebuah sistem yang kompleks tetapi tidak meragukan bagi peristilahan
enzim yang didasarkan pada mekanisme reaksi. Meskipun kejelasan dan pengurangan
keraguan tersebut membuat sistem nomenklatur IUB dipakai untuk ujian riset, nama
yang lebih pendek tetapi kurang begitu jelas tetap digunakan dalam buku ajar dan
laboratorium klinik. Karena alasan tersebut, sistem IUB hanya disampaikan secara
sepintas.
1) Reksi dan enzim yang mengatalisis reaksi tersebut membentuk enem kelas,
masing-masing mempunyai 4-13 subkelas.
2) Nama enzim terdiri atas 2 bagian. Nama pertama menunjukkan substrat.
Nama kedua, yang berakhir dengan akhiran –ase, menyatakan tipe reaksi yang
dikatalisis.
3) Informasi tambahan, bila diperlukan untuk menjelaskan reaksi, dapat
dituliskan dalam tanda kurung pada bagian akhir; misal, enzim yang mengatalisis
3
reaksi L-malat + NAD+  piruvat + CO2 + NADH + H
+
diberi nama 1.1.1.37 L-
malat: NAD+ oksidoreduktase (dekarboksilasi).
4) Setiap enzim mempunyai nomor kode (EC) yang mencirikan tipe reaksi ke
dalam kelas (digit pertama), subkelas (digit kedua), dan subsubkelas (digit ketiga).
Digit keempat adalah untuk enzim spesifik. Jadi, EC 2.7.1.1 menyatakan kelas 2
(transferase), subkelas 7 (transfer fosfat), subsubkelas 1 (alcohol merupakan aseptor
fosfat). Digit
terakhir
menyatakan heksokinase atau
ATP:
D-heksosa 6-
fosfotrasferase, sebuah enzim yang mengatalisis pemindahan fosfat dari ATP ke
gugus hidroksil pada atom karbon keenam molekul glukosa.
2.2 ENZIM MEMERLUKAN KOENZIM
Banyak enzim yang megatalisis proses pemindahan gugus dan reaksi lain
memerlukan, di samping substratnya, sebuah molekul organik sekunder yang dikenal
sebagai koenzim karena tanpa koenzim, enzim tersebut tidak aktif. Koenzim akan
memperbesar kemampuan katalitik sebuah enzim sehingga menjadi jauh melebihi
kemampuan yang ditawarkan hanya oleh gugus fungsional asam aminonya, yang
menyusun massa enzim tersebut. Koenzim yang berikatan secara erat dengan enzim
lewat ikatan kovalen atau gaya nonkovalen kerap kali disebut sebagai gugus
prostetik.. Koenzim yang mampu berdifusi secara bebas umumnya berfungsi sebagai
unsur pembawa (yang didaur ulang secara kontinu) hydrogen (FADH), hidrida
(NADH dan NADPH), atau unit-unit kimia seperti gugus asil (koenzim A) atau gugus
metil (folat), membawanya bolak-balik antara tempat pembentukannya dan
pemakaiannya. Oleh karena itu, koenzim yang disebut belakangan ini dapat dianggap
sebagai substrat sekunder.
Jenis-jenis enzim yang membutuhkan koenzim adalah enzim yang mengatalisis
reaksi oksidoreduksi, pemindahan gugus serta isomerisasi, dan reaksi yang
membentuk ikatan kovalen (kelas IUB 1,2,5, dan 6). Reaksi lisis, termasuk reaksi
hidrolisis yang dikatalisis oleh enzim-enzim pencernaan, tidak memerlukan koenzim.
2.2.1 Koenzim Dapat dianggap Sebagai Subtrat Sekunder
Untuk dua laasan penting, akan sering kali membantu untuk menganggap
koenzim sebagai substrat sekunder. Alasan pertama, perubahan kimia di dalam
koenzim terjadi tepat mengimbangi perubahan kimia yang berlangsung di dalam
4
substrat. Sebagai contoh, dalam reaksi oksideruduksi, jika satu molekul substrat
dioksidasi, satu molekul koenzim akan direduksi.
Aalsan kedua untuk memberi koenzim penghargaan yang sama adalah bahwa
aspek reaksi ini mungkin mempunyai makna fisiologik mendasar yang lebih besar.
Sebagai contoh, peran penting kmampuan otot yang bekerja secara anaerob untuk
mengubah piruvat menjadi laktat tidak terletak pada piruvat ataupun laktat. Reaksi
tersebut semata-mata bertujuan mengoksidasi koenzin NADH yang tereduksi menjadi
NAD+. Tanpa NAD+ glikolisis tidak dapat berlanjut dan sintesis ATP Anaerob (dan
dengan demikian, aktivitas kerjannya) akan terhenti. Di bawah keadaan anaerob,
reduksi piruvat menjadi laktat menghasilkan oksidasi ulang NADH dan memunkinkan
sintesis ATP. Reaksi lain dapat melakukan funsi ini sama baiknya. Sebagai contoh
pada bakteri atau ragi yang tumbuh secara anaerob, metabolit yang berasal dari
piruvat bertindak secara oksidan bagi NADH dan mereka sendiri berada dalam
keadaan tereduksi.
OH
O
CH
H3C
O
C
C
H3C
I-Laktat
O
C
Piruvat
NAD+
NADH + H+
Gambar : NAD+ bekerja sebagai kosubstrat dalam reaksi laktat hidrogenase.
5
Tabel . Mekanisme bagi regenerasi Anaerob NAD+
Oksidan
Produk Tereduksi
Bentuk Kehidupan
Piruvat
Laktat
Otot, bakteri laktat, ragi
Asetaldehid
Etanol
(yeast) Eschrichia coli
Dihidroksiasoton fosfat
-Gliserofosfat
bakteri heterolaktat
Fruktosa
Matinol
2.2.2 Fungsi Koenzim sebagai Reagensia Pemindah Gugus
Tipe reaksi biokimia pemindahan gugus
D–G+A
A–G+D
Yang memindahkan gugus molekul fungsional (G) dari molekul donor (D-G)
kepada sebuah molekul aseptor akhir (misal, reaksi dahidrogenasi) atau sebagai
pembawa gugus intermediet (misal, reksi transaminasi). Diagram berikut melukiskan
konsep yang disebut terakhir ini.
D– H
D
A–H
KoE
KoE - H
A
Meskipun diagram ini mengesankan pembentukan hanya satu kompleks KoE-G
tunggal saat berlangsungnya seluruh reaksi, sebenarnya ada berbagai kompleks
intermediet KoE-G yang dapat terlibat dalam suatu reaksi tertentu (misal,
transaminasi).
Jika gugus yang dipindahkan merupakan hydrogen, adalah biasa untuk
menggambarkan hanya “separuh reaksi” di sebelah kiri:
D– H
D
KoE
KoE - H
6
Bahwa hal ini sebenarnya merepresentasikan hanya suatu kasus khusus dari
pemindahan gugus yang biasa dapat paling mudah dipahami dalam pengertian reksi
yang berlangsung di dalam sel utuh.
2.2.3 Koenzim Dapat Diklasifikasikan Menurut Gugus yang Pemindahannya
Dipermudah oleh Koenzim tersebut
Berdasarkan konsep di atas, kita dapat mengklasifikasikan koenzim sebagai
berikut:
Untuk pemindahan gugus bukan hydrogen:
Gula fosfat
KoA-SH
Tiamin pirofosfat
Piridoksal fosfat
Koenzim folat
Biotin
Koenzim kobamida (B12)
Asam lipoat
Untuk pemindahan hidrogen:
NAD+, NADP+
FMN, FAD
Asam lipoat
Koenzim Q
2.2.4 Banyak Koenzim Merupakan Derivat Vitamin B dan Derivat Adenosin
Monofosfat
Vitamin B membentuk bagian dalam struktur banyak koenzim. Vitamin B
nikotinamida, tiamin, riboflafin dan asam pantotenat merupakan unsur esensial
yang membentuk koenzim bagi oksidasi serta reduksi biologik, dan koenzim
kobamida serta asam folat berfungsi dalam metabolisme satu karbon. Banyak
koenzim mengandung adenin, ribose, serta fosfat, dan merupakan darivat adenosin
monofosfat (AMP). Contoh-contohnya mencakup NAD+ dan NADP+.
7
2.3 ENZIM MENGATALISIS REAKSI SPESIFIK ATAU REAKSI TIPE
Kesanggupan enzim mengatalisis satu reaksi spesifik dan pada hakikatnya tidak
mengatalisis reaksi yang lain mungkin merupakan sifat enzim yang paling signifikan.
Laju proses metabolisme karenanya dapat diatur oleh perubahan dalam efisiensi
katalitik enzim spesifik. Banyak enzim mengatalisis jenis reaksi yang sama
(pemindahan fosfat, reduksi-oksidasi, dl) dengan hanya sejumlah kecil substrat yang
secara structural berhubungan, kendati sering pada kecepatan reaksi yang secara
bermakna lebih rendah. Berbagai reaksi dengan substrat alternatif ini cenderung
terjadi kalau substrat terdapat dalam konsentrasi yang tinggi. Meskipun kadar
sedemikian jarang ditemukan di dalam sel hidup, kadar ini dapat diciptakan di
laboratorium. Disini, substrat alami dan sintetik alternatif digunakan untuk
memfasilitasi pendeteksian enzim dan penelitian mengenai mekanisme katalitiknya.
Gambar : Pelekatan tiga titik sebuah substrat ke tapak – aktif enzim yang berbentuk
planar
2.3.1 Enzim Memperlihatkan Spesifisitas Optis
Kecuali enzim epimerase (rasemase) yang mengatalisis interkonversi isomer
optis, umumnya semua enzim akan memperlihatkan spesifisitas optis absolut untuk
paling tidak suatu porsi molekul substrat. Dengan demikian, enzim dari lintasan
glikolisis dan oksidasi langsung akan mengatalisis interkonversi gulafosfat-D tetapi
tidak gulafosfat-L. Dengan beberapa pengecualian (misal, enzim D-asam amino
oksidase pada ginjal), kebanyakan enzim mamalia bekerja pada isomer-L asam
amino.
Spesifisitas optis dapat meluas hingga satu porsi tertentu atau hingga
keseluruhan melekul substrat tersebut. Enzim glikosidase menggambarkan kedua
ujung ekstrem. Enzim ini mengatalisis hidrilisis ikatan glikosida antara gula dan
8
alcohol, bersifat sangat spesifik untuk bagian gula serta untuk ikatan ( atau ), tetapi
relatif nonspesifik untuk aglikon (porsi alcohol).
2.3.2 Enzim Bersifat Spesifik bagi Tipe Reaksi yang Dikatalisisnya
Enzim untuk proses lisis (enzim lisis) bekerja pada kelompok kimia khusus,
misal, enzim glikosidase pada glikosida, pepsin serta tripsin pada ikatan peptida, dan
esterase pada senyawa-senyawa ester. Berbagai substrat peptida yang berbeda dapat
diserang oleh hanya satu enzim sehingga mengurangi jumlah enzim pencernaan yang
seharusnya diperlukan. Enzim protease dapat pula mengatalisis proses hidrolisis
senyawa ester. Penggunaan ester sebagai substrat untuk sintesis telah mempermudah
penelitian terhadap mekanisme kerja enzim protease.
Enzim-enzim lisis tertentu memperlihatkan spesifisitas yang lebih tinggi. Enzim
kimotripsin menghidrolisis ikatan peptida; pada reaksi ini, gugus karboksil berasal
dari asam amino aromatik fenilalanin, tirosin, atau triptofan. Enzim karboksipeptidase
dan aminopeptidase melepas asam-asam amino satu persatu, masing-masing secara
berturutan, dari ujung terminal karboksil atau terminal amino rantai polipeptida.
Meskipun beberapa enzim oksidoreduktase memanfaatkan NAD+ dan NADP+
sebagai akseptor elektronnya, kebanyakan hanya menggunakan salah satu di
antaranya. Secara umum, enzim oksidoreduktase yang berfungsi dalam proses
biosintesis sistem-sistem mamalia (misal, sintesis asam lemak atau sterol)
menggunakan NADPH sebagai reduktan sementara enzim yang berfungsi dalam
proses penguraian (misal, glikolisis, oksidasi asam lemak) menggunakan NAD+
sebagai oksidan.
2.4 AKTIVITAS KATALITIS YANG DIMILIKI ENZIM MEMFASILITASI
PENDETEKSIAN ENZIM TERSEBUT
Jumlah enzim yang kecil di dalam sel mempersulit pengukuran kadarnya di
dalam ekstrak jaringan atau cairan. Untungnya, aktivitas katalitis yang dimiliki enzim
dapat menjadi sarana pemeriksaan yang sensitive dan spesifik bagi pengukuran kadar
enzim itu sendiri. Kemampuan mengatalitis transformasi ribuan, puluhan ribu, atau
bahkan lebih molekul substat menjadi produk dalam periode waktu yang singkat
memberikan kepada setiap molekul enzim kemampuan untuk secara kimiawi
menguatkan keberadaannya.
9
Untuk mengukur kadar enzim di dalam sebuah sampel ekstrak jaringan atau
cairan biologik lain, kecepatan reaksi yang dikatalitis oleh enzim dalam sampel
tersebut harus ditentukan. Dalam kondisi yang tepat, hasil pengukuran kecepatan
reaksi harus sebanding dengan jumlah enzim yang ada. Karena jumlah molekul atau
massa enzim yang ada sukar ditentukan, hasil pengukuran tersebut dinyatakan dalam
unit enzim.. Jumlah relatif enzim dalam berbagai ekstrak kemudian dapat
dibandingkan. International Union of Biocemistry mengartikan satu unit aktivitas
enzim sebagai 1 mikromol (1 mol; 10-6) substrat yang bereaksi atau produk yang
ditransformasikan per menit.
2.4.1 Kadar Dehidrogenase Tergantung-NAD+ Diukur pada 340 nm
Dalam
reaksi
yang
melibatkan
NAD+
atau
NADP+
(enzim-enzim
dehidrogenase), sifat NADH atau NADPH (tetapi bukan NAD+ atau NADP+ ) yang
menyerap cahaya dengan panjang gelombang 340 nm (Gambar 8-4) membawa
manfaat. Oksidasi NADH menjadi NAD+ terjadi disertai dengan penurunan densitas
optik (OD, optical density) pada 340 nm, yang proporsional dengan jumlah NADH
yang dioksidasi. Demikian pula, kalau NAD+ direduksi, OD pada 340 nm akan
meningkat sebanding dengan jumlah NADH yang terbentuk. Perubaahan OD pada
340 nm ini dapat dimanfaatkan bagi pemeriksaan analisis kuantitatif setiap enzim
dehidrogenase yang bergantung NAD+ atau NADP+ sebagai berikut. Bagi enzim
dehidrogenase yang mengatalitis oksidasi NADH oleh substratnya yang teroksidasi,
kecepatan penurunan OD pada 340 nm akan berbanding lurus dengan konsentrasi
enzim. Oleh karena itu, hasil pengukuran kecepatan oenurunan OD pada 340 nm
memungkinkan kita menyimpulkan kuantitas enzim, yang dinyatakan dengan unit
aktivvitas, yang terdapat di dalam sampel biologik tertentu seperti serum atau ekstrak
jaringan
.
10
1
Densitas Optik
0,8
0,6
NADH
0,4
0,2
NAD+
0
200
250
300
350
400
Panjang gelombang (nm)
Gambar : Spektrum Absopsi NAD+ dan NADH. Densitas yang tampak di sini adalah
untuk 44 Mg/L, larutan di dalam sebuah sel dengan lintasan cahaya 1 cm NADP+
mempunyai spectrum yangmasing-masing analog dengan spectrum NAD+ dan
NADH.
2.4.2 Kadar Banyak Enzim Dapat Diukur dengan Merangkaikannya pada
Enzim Dehidrogenase
Pada contoh diatas, laju pembentukan produk (NADH) diukur untuk
menentukan aktivitas enzim. Enzim selain dehidrogenase diukur kadarnya lewat
pengukuran kecepatan kemunculan produk (atau, yang lebih jarang dilakukan, lewat
pengukuran kecepatan hilangnya substrat). Sifat-sifat fisiokimiawi produk atau
substrat akan menentukan metode spesifik yang dipilih untuk mengukur kadar enzim.
Cara yang sering dan mudah dilakukan adalah “merangkaikan” (coupling) produk
reaksi dengan sebuah enzim dehidrogenase, dengan produk srbagai substrat.
11
2.5 ENZIM MURNI BERFUNGSI SANGAT PENTING BAGI PEMAHAMAN
STRUKTUR, FUNGSI, MEKANISME REAKSI, DAN PENGATURAN
ENZIM.
Tujuan yang ingin dicapai dalam pemurnian enzim adalah mengisolasi enzim
spesifikasi dan ekstra sel “Mentah” (crude) yang mengandung banyak komponen lain.
Molekul-molekul kecil dapat disingkirkan lewat dialysis atau filtrasi gel, asam nukleat
melalui pngendapan dengan antibiotik streptomisin, dan seterusnya. Permaslahannya
adalah memisahkan enzim yang kita kehendaki dari ratusan protein yang mempunyai
stuktur kimia dan fisika yang seupa.
Perjalanan suatu pemurnian tipikal dan enzim hati dengan pemulihan yang baik
serta pemurnian keseluruhan yang besarnya mencapai 490 kali lipat.
Glukosa
ATP, Mg 2+
HEKSOKINASE
ADP, Mg2+
Glukosa-6-Fosfat
NADP+
GLUKOSA-6-FOSFAT
DEHIDROGENAE
NADP
6-Fosfoglukonolakton
+ H+
Enzim Diperoleh dari Sumber-Sumber Alami atau dari Sel Tempat Enzim
Tersebut Siekspresikan oleh Gen yang diKlon.
Dulu, riset awal terhadap enzim terbatas pada protein yang dapat dimurnikan
dari sel-sel binatang, tanaman, atau bakteri tempat enzim tersebut terdapat secara
alami. Sekarang, teknologi DNA rekombinan
telah memungkinkan ilmuwan
memprouksi protein di dalam sel tempat protein tersebut normalnya tidak ditemukan.
Sel-sel hospes tipikal adalah bakteri dan ragi yang secara kuantitas mudah tumbuh.
Kemmapuan mengekspresikan protein rekombinan pada tingkat yang relatif tinggi
menjadikan para ilmuwan mempu mengisolasi enzim yang sulit dimurnikan karena
konsentrasi rendahnya di dalam sel tempat mereka ditemukan secara alami. Lebih
lanjut, melalui perubahan DNA yang mengkodekan protein melalui mutagenesis
12
berorientasi –tapak (site-directed mutagenesis), para Ilmuwan dapat menambah,
menghilangkan, atau mengubah asam-asam amino spesifik dalam enzim rekombinan
untuk untuk memfasilitasi penentuan peran fungsional dan strukturalnya. Perubahan
dapat
pula
dilakukan
untuk
membuat
protein
lebih
mudah
dimurnikan.
Bagaimanapun, pmurnian enzim dan sumbernya yang alami tetap merupakan hal yang
penting, khususnya guna mengidentifikasi sifat serta peran modifikasi posstranslasi
yang yang berfungsi mengatur lokasi enzim serta efisiensi katalik.
Pemurnian Dilakukan menggunakan Kromatografi pada pertukaran Ion atau
pada Penyangga Penyisih Ukuran.
Porosdur pemurnian klasik yang bermanfaat adalah pengendapan dengan berbagai
konsentrasi garam (umumnya garam ammonium atau natrium sulfat) atau pelarut
(aseton atau etanol), pemanasan diferensial atau denaturasi PH Diferensil, sentifugasi
diferensial, filtrasi gel, dan elektroferosis. Adsopsi selektif dan elusi protein dari zat
penukar anio selulosa, yaitu deitilaminoetil (DEAE) selulosa dan zat penukar anion
selulosa, yaitu karboksimetil selulosa (CMC, carbokxymethylcellulose) juga telah
memberikan hasil yang sangat baik bagi pemurnian protein secara cepat dalam jumlah
besar.
Sebagi contoh,PH ekstrak ekuesosa jaringan hati diatur hingga 7, 5 yang pada PH ini,
sebagian besar protein akan memiliki muatan netto negatif. Campuran protein dapat
larut ini kemudian dialirkn lewat kolom selulosa DEAE pada PH 7.5 bemuatan negatif
akan terikat ke DEAE lewat interkasi muatan yang berlawanan, sementara protein
yang tidak bermuatan atau yang mempunyai muatan positif mengalir langsung lewat
kolom tersebut. Kemudian, kolom selulosa DEAE ini dielusikan menggunakan
gradien NaCl, yang memiliki kisaran dari konsntrasi rendah hingga tinggi, dan
dilarutkan dalam pendapan denganPH 7,5. karena Cl- bersaing dengan protein untuk
berikatan ke penyangga yang bermuatan positif, protein untuk elusikan secara selektif;
protein yang memiliki ikatan paling lemah diikat paling awal, dan protein yang
memiliki ikatan paling kuat diikat palinh akhir. Pemisahan protein analog dolakukan
mengyunakn penyangga bermuatan negatif seperti karboksimetilselulosa atau
fosfoselulosa pada PH yang sedikit lebih rendah untuk memastikan bahwa protein
bermuatan lebih positif.
Pemisahan protein dapat pula dilakukan pada baha berpori yang dikenal sebagai
“ayakan molecular”.. Kalau campuran protein dialirkan lewat kolom yang
13
mengandung ayakan molecular, protein yang berukuran kecil akan tersebar baik di
dalam ruang antar partikel maupun di dalam ruang internal atau pori-pori penyangga.
Ketika campuran protein dengan ukuran yang berbeda-beda mengalir lewat kolom,
mobilitas protein yang berukuran kecil akan terhambat, relatif terhadap protein yang
ukurannya terlalu besar untuk masuk ke dalam pori- poi ini. Dengan demikian,protein
berukuran besar akan muncul dari dalam kolom sebelum protein yang berukuran
kecil.
Tabel : Rangkuman skema pemurnian enzim tipikal
Fraksi Enzim
Aktivitas
Protein
Aktivitas
Pemulihan
Total (mU)1
Total (mg)
Spesifik
Keseluruhan
(mU/mg)
Homogenat hati mentah
100.000
10.000
10
(100)
Cairan supernatan, pemusingan 100.000 x g
98.000
8.000
12, 2
98
Endapan [NH4]2SO4 40 – 50 %
90.000
1.500
60
90
Endapan aseton 20 – 35 %
60.000
250
240
60
Fraksi kolom DEAE 80 – 110
58.000
29
2.000
58
Endapan [NH4]2SO4 43 – 48 %
52.000
20
2.600
52
Kristal pertama
50.000
12
4.160
50
Rekritalisasi
49.000
10
4.900
49
Penyangga Kromatografi Afinitas Mampu Mengenali Regio Enzim Spesifik
Ciri yang menonjol pada kromatografi afinitas adalah kemampuannya untuk
secara selektif mengeluarkan satu protein tertentu, atau yang paling sering, sejumlah
kecil protein tertentu, dari campuran protein yang kompleks. Teknik ini menggunakan
suatu ligand tak bergerak yang mengadakan interaksi spesifik dengan enzim yang
ingin dimurnikan. Kalau campuran protein tersebut dipanjankan pada ligand tersebut.
Protein yang tidak di kehendaki akan mengalir lewat kolom dan dibuang. Protein
yang di kehendaki kemudian akan dielusikan dari ligan yang tak bergerak memakai
cairan elusi yang umumnya berupa larutan garam atau ligand berbentuk larut dengan
konsentrasi tinggi. Permunian yang dicapai melalui teknik kromatografi afinitas ini
sangat mengesankan dan sering melebihi hasil yang mungkin di peroleh dengan
pemakaian sejumlah teknik klasik secara berturutan
Ligand yang di suka adalah substrat serta derivat koenzim atau zat perwarna
organic yang bertindak sebagai nukleotida atau analog koenzim yang berikatan secara
14
kovalen dengan sebuah penyangga inert (misal, NAD-Spandex, Blue Sepharose).
Ligand ini secara khas berikatan dengan penyangga lewat molekul penghubung.Yang
mempunyai panjang tiga hingga delapan atom karbon.
Pada kromatografi yang bersifat hidrofobik, hidrokarbon, alkil atau aril akan
terikat ke penyangga seperti sephadex. Retensi protein pada penyangga ini melibatkan
interaksi hidrofobik antara rantai alkil dan regio hidrofobik pada protein tersebut.
Protein kemudian di masukan ke dalam larutan yang menggandung garam dengan
konsentrasi tinggi (misal, [NH4]2SO4) dan dielusikan dengan garam yang sama yang
memiliki gradien menurun.
Teknologi DNA Rekombinan Dapat Menjadi Sumber Enzim Yang Kaya
Banyak gen yang mengkodekan enzim telah diklon, ditentukan rangkaiannya, dan
disisipkan ke dalam vector yang berasal dari plasmid atau faga tempat gen tersebut
dapat di kontrol oleh suatu promoter yang kuat. Promoter tersebut dapat “mendorong”
produksi enzim rekombinan hingga mencapai taraf yang jauh lebih tinggi
dibandingkan dengan yang terdapat pada sumber – sumber alam. Dengan
menggunakan promoter yang diatur oleh zat penginduksi (inducer) kimia spesifik,
ekspresi enzim rekombinan dapat diatur secara cermat. Umumnya vector ekspresi
semacam ini disisipkan ke dalam mikroorganisme yang mudah tumbuh seperti
Escherichia coli atau ragi untuk memproduksi enzim rekombinan.
Protein Fusi Rekombinan Dimurnikan dengan kromatograsi afinitas
Disamping menghasilkan sumber yang kaya akan enzim, yang sangat memfasilitasi
pemurnian, teknologi DNA rekombinan dapat digunakan untuk menciptakan protein
termodifikasi yang dapat dimurnikan dengan kromatografi afinitas. Cara yang umum
dilakukan adalah dengan mengikatkan kepada gen, sejumlah rangkaian nukleutida
yang k\mengkodekan ekstensi protein sehingga terbentuk protein fusi yang
merupakan ligand yang baik bagi penyangga afinitas spesifik. Salah satu pendekatan
yang popular adalah denngan mengikatkan rantai yang terdiri atas lima atau enam
asam amino histidin atau sebagai alternatif lain, domain pengikat substrat untuk enzim
glutation S-trasferase kepada gugus terminal amino atau karboksil enzim yang
bersangkutan. Protein fusi rekombinan trsebut kemudian dapat dimurnikan pada
kolom afinitas yang berisi ion logam bivalen terikat seperti Ni2+ (untuk fusi dengan
polihistidin) atau glutation terikat (untuk protein fusi glutation S-trasferase) (Gambar
8-6).Protein fusi sering mengandung tapak (site) pembelahan untuk protease yang
sangat spesifik seperti trombin, pada regio yang menghubungkan kedua bagian dari
15
protein fusi tersebut. Hal ini memungkinkan pengeluaran domain fusi tambahan
tersebut setelah pemurnian afinitas.
GST
Enzim
GST yang mengkodekan plasmid
DNA Hasil klon
Dengan tapak trombin
yang mengkodekan enzim
Ligasikan menjadi satu
GST
T
Enzim
Lakukan tranfeksi sel, tambahkan zat
Penginduksi, kemudian lakukan
pemecahan zat
Alirkan kedalam kolom afinitas glutation
(GSH)
GST
Enzim
GST
lakukan alusi dengan GSH proses dengan
trombin
GST
Enzim
GST
Gambar : Penggunaan protein –fusi glutation S-tranferae (GST) untuk pemurnian
enzim rekombinan
16
Elektroforesis Gel Poliakrilamida Dapat Mendeteksi Kontaminan
Penilaian homogeneitas protein paling baik dilakukan dengan elektroforesis gel
poliakrilamida (PAGE, polyacrylida gel electrophoresis) di bawah berbagai kondisi.
Yang paling popular di antaranya adalah elektroforesis gel poliakrilamida atau PAGE
dengan sodium dodesil sulfat (SDS), suatu detergen ion yang memisahkan protein
multimerik menjadi protomer. Karena setiap ikatan peptida mengikat kurang lebih dua
buah molekul SDS, polipeptida tersebut memiliki muatan negatif yang kuat. Dengan
demikian, jarak yang ditempuh setiap polipeptida ketika bermigrasi kearah anoda
bergantung pada massa molecular relatifnya (Mr). Sebagai alternatif lain, PAGE dapat
dilaksanakan dalam kondisi asli yaitu, tanpa adanya SDS atau denaturan lain sehingga
struktur kuaterner dan kerap kali pula aktivitas katalitik enzimnya dapat
dipertahankan. Dalam PAGE dua dimensi (O’Farrell), dimensi pertama memisahkan
protein yang terdenaturasi berdasarkan nilai pl-nya dengan melakukan ekuilibrasi
protein tersebut di dalam medan listrik yang mengandung urea dan dengan gradien pH
yang dipertahankan oleh amfolit terpolimerisasi. Setelah pemrosesan dengan SDS
selesai, dimensi kedua kemudian memisahkan protein berdasarkan ukuran molecular
unit protomernya.
2.6 ENZIM DAPAT DITEMUKAN DI DALAM ORGANEL SPESIFIK
Susunan spasial dan kompartementalisasi enzim, substrat, serta kofaktor di
dalam sel mempunyai makna yang teramat penting. Sebagai contoh, di dalam sel-sel
hati, enzim untuk glikolisis terdapat di dalam sitoplasma sedangkan enzim untuk
siklus asam sitrat di dalam mitokondria. Distribusi enzim diantara berbagai organel
subselular dapat dipelajari setelah dilakukan fraksionasi homogenat sel melalui
sentrifugasi berkecepatan tinggi. Kandungan enzim pada setiap fraksi kemudian
diperiksa.
Penentuan lokasi suatu enzim tertentu didalam sebuah sel atau jaringan pada
keadaan yang relatif tetap acapkali dilakukan dengan prosedur histokimiawi
(“histoenzimologi”). Sayatan tipis jaringan yang dibekukan (frozen section) dengan
ketebalan 2 hingga 10m diproses dengan substrat untuk suatu suatu enzim tertentu.
Di mana terdapat enzim, di situ akan terbentuk produk dari reaksi yang dikatalisis
enzim tersebut. Jika terwarna dan tidak larut, produk akan tetap berada di tempat
17
pembentukannya dan mengungkap lokasi enzim. Histoenzimologi menghasilkan
gambar grafik dan pola yang relatif bersifat fisiologik mengenai distribusi enzim.
2.7 ISOZIM MERUPAKAN BENTUK YANG MEMPUNYAI PERBEDAAN
FISIK TETAPI DENGAN AKTIVITAS KATALISIS YANG SAMA
Kalau teknik pemurnian enzim diaplikasikan, sebagai contoh kepada enzim
malat dehidrogenase yang berasal dari sumber yang berbeda (misal, hati tikus dan
escherichia coli), kita akan melihat dengan jelas bahwa sekalipun enzim malat
dehidrogenae yang berasal dari hati tikus maupun E coli akan mengatalisis reaksi
yang sama, sifat-sifat fisik dan kimiamereka memperlihatkan banyak perbedaan
bemakna. Bnetuk – bentuk fisik berbeda dari aktivitas yang ama juga dapat ditemukan
dalam berbagai jaringan organisme yang sama, dalam tipe-tipe sel yang berbeda,
dalam kompartemen sunselular, atau dalam organisme prokaryotik seperti E coli.
Temuan ini diperoleh sebagai hasil penerapan prosedur pemisahan elektroforentik
pada pemisahan bentuk-bentuk aktivitas enzimatik tertentu yang berbeda secara
elektroforetis.
Pemisahan dan Identifikasi Isoenzim memiliki Nilai Diagnostik
Isozim laktat dehidrogenase dalam serum dapat dilihat dengan melakukan
elektroforesis terhadap sampel serum pada bahan penyangga pati, agar atau gel
poliakrilamoda, yang biasanya dilakukan dengan PH 8,6. isozim tersebut mempunyai
muatan yang belainan pada pH 8,6 ini dan bermigrasi menuju lima daerah yang
berlainan pada elektoferogram. Isozim tersebut dideteksi berdasarkan kemampuan
masing –masing isozim. Mengatalisis proses reaksi suatu zat pewarna yang tidak
berwarna menjadi bentuk yang berwarna dan tidak larut.
Campuran Assay dehidrogenase tipikal mengandung NAD+ suatu substrat
terteduksi , bentuk teroksidasi zat pewarna redoks seperti nitroblue tetrazolium
(NBT), pembawa (carrier) electron intermediet yang diperlukan bagi pemindahan
elektron dari NADH ke NBT, serta pendapat serta ion pengaktif jika dibutuhkan..
18
(Laktat)
SH2
LAKTAT DEHIDROGENASE
NAD+
S
(piruvat)
NADH + H+
PMS Tereduksi
PMS Teroksidasi
NBT Teroksidasi
NBT tereduksi
(Tidak berwarna)
(Formazan Biu)
Gambar : reaksi yang dirangkaiakn untuk mendeteksi aktivitas laktat dehidrogenase
pada sebuan elektroferogram. (NBT, netroblue tetrazolium, PMS, phenazine
methosulfate).
Isozim merupakan produk dari gen yang berkerabat erat.
Enzim oligomerik dengan protomer yang tidak sama bisa terdapat. Yang sering,
satu jaringan mengahsilkan terutama satu jenis protomer, sementara jaringan lain
menghasilkan protomer lain. Bila protomer-protomer ini dapat brgabung melalui
berbagai cara untuk membangun sebuah enzim yang aktif (misal, tetramer),
terbentuklah isozim dengan aktifitas enzimatik tersebut.
Isozim laktat dehidrogenase memiliki perbedaan pada tingkat stuktur kuanternernya.
Molekul oligomerik laktat dehidrogenase stuktur kuanternernya. Molekul oligomerik
laktat dehidrogenase (berat molekul 130.000) terdiri atas empat protomer dengan dua
tipe, yaitu tipe H dan M (berat molekul sekitar 34.000). hanya molekul tetramiklah
yang mempunyai aktivitas katalitik. Jika urutan tidak penting, protomer ini dapt
dikambinasikan melaLui cara berikut :
HHHH
HHHM
19
HHMM
HMMM
MMMM
Markert
telah
menggunakan
sejumlah
kondisi
yang
diketahui
dapat
membongkar dan membentuk kembali struktur kuanterner untuk menerangkan
hubungan antar isozim laktat dehidrogenase. Pemecahan dan pembentukan kembali
laktat dehidrogenase –I1 atatu laktat dehidrogenase –I5 homogen tidak emnghasilkan
isozim yang baru.
2.8 ANALISIS
KUANTITATIF
ENZIM
PLASMA
TERTENTU
MEMPUNYAI MAKNA DIAGNOSTIK.
Enzim plasma nonfungsional tidak melakukan sembanrang fungsi fisiologik ynag
diketahui di dalam darah. Substrat sering tidak ditemukan di dalam plasma, dan enzim
sendiri terdapat di dalam darah manusia normal dengan kadar sampai sejuta kali lipat
lebih rendah daripada kadar di jaringan. Keberadaan enzim di dalam plasma dengan
kadar yang meningkat diatas nilai normalnya menunjukkan peningkatan laju
kerusakan jaringan.
2.9 ENZIM
ENDONUKLEASE
RESTRIKSI
MEMFASILITASI
PENEGAKAN DIAGNOSIS PENYAKIT GENTIK
Penegakan diagnosis penyakit genetic telah memperoleh dorongan yang luar
biasa dari perkembangan teknologi DNA rekombinan. Meskipun semua penyakit
molecular telah lama diketahui terjadi sbagai akibat perubahan DNA, teknik untuk
pemeriksan langsung terhadap rangkaian DNA, teknik untuk pemeriksaan langsung
terhadap rangkaian DNA baru belakangan ini tersedia. Pengembangan pelacakan
hibridasi untuk fragmen DNA telah menghasilkan sejumlah teknik penapisan prenatal
dengan sensitivitas yang memedai guna menentukan ada tidaknya kalainan herediter,
teknik ini dilakukan dengan memetakan enzim retriksi DNA yang berasal dari sel-sel
janin dalam cairan amnion atau dengan memeriksa produk yang dihasilkan
menggunakan oligonukleotida sebagai senyawa primer untuk reaksi rantai
polimerase, (PCR, polymerase chain reaction). Pada prinsipnya berbagai pelacak
terhadap DNA dapat dilakukan untuk menengakan diagnosis sebagaian besar penyakit
genetik. Sebuah pelacak terhadap DNA yang dibuat terhadap suatu bagian gen untuk
sub unit hemoglobin normal dapat mendeteksi fragmen restrisik yang emmendek atau
tidak ada akibat delesi di dalam gen tersebut, sebagaiman terjadi pada sebagian
penyakit talasemia-, dan pada tipe-tipe talasemia - serta -, ∆ yang langka.
20
HASIL
DIGESTI
RESTRIKSI
YANG
SUDAH
TERLACAK
DAPAT
MENGUNGKAPKAN GEN HOMOLOG DENGAN RANGKAIAN BASA
BERBEDA.
Pelacak DNA dapat pula digunakan mendeteksi rangkaian DNA yang
behubungan erat dengan gen. Pemeriksaan analisis ini dapat dikembangkan untuk
mendeteksi berbagai variasi kromosom spesifik (perbedaan dalam rangkaian antar
kromosom homolog). Digesti DNA oleh enzim retriksi endonuklease akan
menghasilkan peta restriksi berbeda-beda (pola fragmen DNA) dari gen-gen
homologyang mengandung rangkaian basa yang berlainan . fenomena ini diberi nam
“polimorfisme panjang fragmen restriksi”.
Bagi penyakit genetic yang
berhubungan dengan RFLP,seorang manusia yang menjadi pembawa penyakit
tersebut akan membawa satu kromosom dengan gen normal dan satu kromosom lagi
dengan gen cacat.
RNA KATALITIK
Meskipun jelas bukan merupakan protein, asam ribonukleat (RNA) tertentu
akan memperlihatkan aktivitas katalitik yang sangat spesifik bagi substrat tertentu.
RNA ini yang memenuhi semua kriteria klasik untuk didefinisi sebagai enzim, disebut
ribozim. Meskipun substrat yang dikatalisis oleh ribozim hanya terbatas pada ikatan
fosfodiester RNA, spesifitas kerjanya sepenuhnya sebanding kerja enzim yang klasik.
Ribozim mengatalisis reaksi trans esrterifikasi dan akhirnya reaksi hidrolisis ikatan
fosfodiester dalam molekul RNA. Reaksi ini diperlancar oleh gugus OH.
21
BAB III
PENUTUP
3.1 KESIMPULAN
1.
Enzim merupakan katalisator yang mengatur kecepata berlangusngnaya
berbagai proses fisiologik
2.
Cacat pada fungsi enzim sering menyebabkan penyakit
3.
Enzim yang mengatalisis reaksi yang melibatkan pemindahan gugus isomerisasi,
oksido-reduksi, atau sintesis ikatan kovalen memerlukan substrat yang dikenal
dengan koenzim
4.
Sebagian besar enzim bersifat sangat spesifik terhadap substratnya, koenzim
serta tipe reaksi yang dikatalisisnya. Meskipun demikian, beberapa enzim
protease juga memecah ester. Bagi enzim yang bekerja pada substrat dapat pula
ikut bereaksi, tetapi umumnya dengan kecepatan yang lebih rendah.
5.
Pengukuran aktivitas enzim merupakan hal sentral bagi penentuan kuantitas
enzim dalam riset atau laboratorium klinik.
6.
Aktivitas enzim dehidrogenase yang bergantung –NAD(P)+ diperiksa secara
spektrofotomentris dengan mengukur perubahan absorbsi pada 330 mm yang
menyertai oksidasi atau reduksi NAD (P)H.
7.
Perangkaian enzim lain pada dehidrogenase dapat memperlancar analisisnya.
8.
Untuk menyelidiki struktur mekanisme kerja, dan pengaturan aktivitasnya,
enzim harus dimurnikan hingga mencapai homogeneitas sekitar 95%.
9.
teknik pemurnian enzim mencakup presipitasi selektif dengan pelarut garam
atau organic dan kromatografi pada penyangga pertukaran ion, filtrasi gel,
afinitas substrat, ligand zat warna, atau interaksi hidrofobik.
10. kemampuan memanfaatkan teknik rekombinan DNA untuk mengekspresikan
enzim dalam tubuh hospes yang dipilih telah membawa revolusi dalam teknik
pemurnian enzim dengan menghasilkan enzim dalan jumalh besar yang dalam
sebagian besar keadaan, mudah dimurnikan hingga mencapa homogeneitas.
11. Kemajuan pemurnian dinilai dengan mengukur peningkatan aktifitas spesifik
suatu enzim (aktivitas per unit masa) dan homogenitas akhir lewat elektroforesis
gel poliakrilamida (PAGE).
12. Penentuan lokasi enzim intrasel yang tepat disimpulkan lewat teknik histokimia
dan fraksionasi sel, yang dirangkaiakn dengan analisis enzimatik, terhadap
22
sayatan jaringan atau fraksi homogenat sel, isozim, bentuk yang secara fisik
berbeda pada enzim nonfungsional di dalam serum menunjukan kerusakan pada
jaringan tertentu manusia, dan memberikan informasi diagnostik seta prognostic
yang berharga.
13. Kemampuan enzim restriksi endonuklease mendeteksi perubahan yang sangat
kecil pada struktur gen telah memungkinkan dokter mendiagnosis penyakit
genetic akibat mutasi yang menghasilkan enzim yang cacat atau enzim
nonfungsional.
14. RNA katalitik yang dikenl sebagai ribozim mengatalisis reaksi hidrolisis yang
sangat spesifik ikatan fosfodiester pada RNA. Reaksi ini amat penting dalam
berbagai pristiwa pemrosesan yang terlibat di dalam maturasi pra-mRNA
3.2 SARAN
Peranan enzim dalam kesehatan sangat penting, untuk itu manusia hendaknya
lebih menjaga kesehatan. Dan kami penyusun mengharapkan masukan untuk
penyempurnaan makalah ini.
23
KEPUSTAKAAN
Murray, Robert K, 1996, Harper’s, Biochemistry
Mc. Gilvery, Robert W, And Gerald W, 1983
Page David, 1981.
Triman Jr, 2007 Materi Biokimia, Surabaya
24
25
26