prinsip dasar teknik-teknik dna rekombinan, analisis

PRINSIP DASAR TEKNIK-TEKNIK DNA REKOMBINAN, ANALISIS TRANSKRIP DAN ANALISIS PROTEIN BB Biogen, Bogor - http://biogen.litbang.deptan.go.id
PRINSIP DASAR TEKNIK-TEKNIK DNA REKOMBINAN,
ANALISIS TRANSKRIP DAN ANALISIS PROTEIN
Belum dikategorikan - Sabtu, Januari 05, 2013
http://biogen.litbang.deptan.go.id/index.php/2013/01/prinsip-dasar-teknik-teknik-dna-rekombinan-analisis-transkrip-dan-analisis-protein/
Pemahaman mendasar mengenai prinsip yang ada pada teknik-teknik rekayasa genetik penting untuk dimiliki oleh mereka yang terkait dalam bidang tersebut.
Prinsip dasar teknik-teknik tersebut meliputi prinsip yang berhubungan dengan ekspresi gen, mulai dari transkripsi dari DNA sampai dengan modifikasi
protein. Selain itu, DNA rekombinan juga merupakan hal penting yang perlu dipahami karena terkait dengan perpindahan materi genetik dan teknik kloning.
Untuk menganalisa DNA, seseorang perlu memahami ciri-ciri DNA seperti untai ganda, bermuatan
negatif karena gugus fosfat, sensitif terhadap perubahan pH dan banyak memiliki domain untuk ikatan
dengan molekul lain (DNA, RNA atau protein). Gen, yang merupakan unit pewaris sifat bagi organism,
biasanya dipindahkan dari satu individu ke individu lain melalui DNA rekombinasi yang biasanya terjadi
pada saat pembelahan sel pada siklus meiosis. Perpindahan materi genetik ini biasanya memanfaatkan
daerah yang homolog antar kromosom atau pada kromosom yang sama. Mekanisme ini adalah untuk
memastikan bahwa sifat dari induk betina dan jantan tertransfer secara genetik.
Kloning adalah pengkopian (proses perbanyakan) secara genetik sehingga dihasilkan molekul-molekul
yang identik. Teknik kloning memanfaatkan prinsip dari DNA rekombinasi dengan menggunakan
enzim-enzim yang bekerja saat itu. Enzim-enzim tersebut meliputi enzim restriksi yang dapat memotong
DNA, ligase yang menggabungkan DNA, serta plasmid yang merupakan materi genetik untuk
memperbanyak (mengklon) fragmen DNA yang diinginkan.
Untuk memperoleh materi genetik (DNA atau RNA), dilakukan ekstraksi. Ekstraksi DNA dan RNA
sedikit berbeda satu sama lain. RNA sebagai molekul yang lebih tidak stabil dibandingkan DNA
memerlukan penanganan yang lebih. Peralatan yang digunakan harus bebas dari RNAse. Sedangkan
ekstraksi DNA dapat dibagi menjadi dua: ekstraksi DNA total (genom) dan ekstraksi DNA plasmid.
Ekstraksi DNA plasmid biasanya menggunakan alkalin lisis dengan memanfaatkan karakter plasmid yang
kecil dibandingkan dengan kromosom. Dengan bantuan NaOH, SDS dan potasium asetat, plasmid dapat
terdenaturasi (menjadi untai tunggal) dan kembali pada struktur alaminya, sedangkan kromosom yang
sudah terdenaturasi akan sulit untuk kembali beruntai ganda. Pengendapan nukleotida dapat dibantu oleh
etanol atau 2-propanol.
Hasil dari ekstraksi nukleotida diverifikasi dengan beberapa cara seperti melihat panjang gelombangnya,
atau dengan elektroforesis agarosa yang kemudian divisiualisasi dengan bahan seperti etidium bromida
atau SYBR green. RNA yang mudah terdegradasi memerlukan penanganan dengan alat dan bahan yang
bebas dari RNAse dan/atau mengandung RNAse inhibitor.
Materi genetik untuk yang dimanfaatkan untuk kloning adalah fragmen DNA, yang bisa juga merupakan
gen itu sendiri. Kalau sumber materi adalah RNA, maka dilakukan reverse transkripsi atau transkripsi
balik dari RNA ke DNA. Pembuatan cDNA dari mRNA dapat dilakukan dengan RT-PCR dengan primer
oligo dT yang memanfaatkan poli A dari mRNA. Plasmid yang sudah dimodifikasi dengan penambahan
fragmen DNA disebut plasmid rekombinan, yang dapat diketahui melalui teknik skrining dan seleksi
page 1 / 2
PRINSIP DASAR TEKNIK-TEKNIK DNA REKOMBINAN, ANALISIS TRANSKRIP DAN ANALISIS PROTEIN BB Biogen, Bogor - http://biogen.litbang.deptan.go.id
dengan bantuan marker.
Analisis transkrip atau RNA merupakan pengkajian terhadap ekspresi gen, karena ekspresi gen
ditunjukkan oleh terbentuknya RNA. Ekstraksi RNA harus memperhatikan waktu setelah sampel diambil,
karena ekspresi gen mengalami perubahan yang sangat cepat. Sampel biasanya dimasukkan ke dalam
nitrogen cair untuk menghentikan perubahan ekspresi gen. Beberapa metode yang memanfaatkan RNA
antara lain microarray (pada genom secara keseluruhan, pada gen-gen tertentu atau pada Single
Nucleotide Polymorphism).
Selain DNA dan RNA, protein yang merupakan produk dari translasi RNA adalah komponen penting
dalam memahami kerja sel. Analisis protein merupakan analisis struktur/ konformasi yang melihat
interaksinya dengan molekul lain. Protein memiliki daerah yang berperan dalam memberikan fungsi dari
protein tersebut yang disebut domain dan juga memiliki subunit yang bisa bergabung untuk melakukan
aktivitasnya. Deteksi protein dilakukukan dengan menggunakan Western blotting, ELISA maupun
immunostrip yang semuanya memanfaatkan antibody yang dapat berinteraksi dengan protein yang diuji.
Analisis fungsi protein biasanya dilakukan dengan melihat perubahan struktur protein dan
membandingkan dengan hipotesa fungsinya. Karena fungsi protein terkait dengan strukturnya. Untuk
mengubah struktur protein, DNA yang mengkode protein dimutasi pada daerah yang diduga paling
berperan dalam struktur protein tersebut. Analisis kemudian dilakukan dengan menggunakan substrat dari
protein dan juga bahan-bahan untuk mendeteksi fungsi protein terhadap substrat (seperti bahan yang
bermuatan radioaktif).
Pemahaman mengenai teknik-teknik biologi molekuler ini dapat lebih diperdalam lagi pada buku-buku
metode penelitian yang membahas secara khusus teknik-teknik biologi molekuler (seperti buku “PCR
(THE BASICS (Garland Science) oleh M. J. McPherson dan S. G. Moller (Mar 30, 2006) yang
membahas mengenai teknik PCR dari bab pertama sampai terakhir), atau melalui situs-situs yang
memberikan informasi lengkap mengenai teknik-teknik tersebut (termasuk juga di youtube.com dan
forum-forum diskusi ilmiah) dengan memanfaatkan fasilitas internet.
_______________________________________________
PDF generated by BB Biogen, Bogor
page 2 / 2
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)