Uji Efektivitas Antibakteri Ekstrak n-Heksan Pegagan

UJI EFEKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK n-HEKSAN PEGAGAN (Centella asiatica (L)
Urban) terhadap BAKTERI Escherichia coli dengan METODE BIOAUTOGRAFI
Muhammad Irfan Al Ghifary1, Prasetyorini2, Ike Yulia Wiendarlina3
1,2&3
Program Studi Farmasi, FMIPA, Universitas Pakuan, Bogor.
ABSTRAK
Escherichia coli merupakan salahsatu bakteri penyebab infeksi, banyak ditemukan dalam
usus besar sebagai flora normal yang dapat menyebabkan infeksi saluran kencing, gastroenteritris dan
meningitis pada bayi. Tumbuhan obat tradisional dapat dijadikan alternatif pencarian zat antibakteri,
karena pada umumnya memiliki senyawa aktif yang berperan dalam bidang kesehatan. Pegagan adalah
salahsatu tumbuhan yang digunakan oleh masyarakat Indonesia sebagai obat tradisional, berkhasiat
sebagai peluruh kencing, antibakteri, hipotensif, insektisida. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
golongan senyawa aktif dalam ekstrak n-heksan pegagan yang memiliki aktivitas terhadap bakteri
Escherichia coli. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut n-heksan.
Identifikasi senyawa aktif dalam ekstrak n-heksan pegagan dilakukan dengan Kromatografi Lapis
Tipis, menggunakan fase gerak n-heksan : etil asetat (4:1). Hasil KLT dilakukan uji bioautografi
dengan cara penempelan bercak kromatogram di atas media selama 30 menit, parameter yang
digunakan yaitu zona jernih pada lokasi bercak kromatogram yang ditempelkan di atas media. Hasil
penelitian diketahui terdapat 3 golongan senyawa yang terdeteksi dari kromatogram menggunakan
pereaksi bercak yaitu steroid dengan Rf 0,51; terpenoid dengan Rf 0,55 dan 0,75; dan alkaloid dengan
Rf 0,94. Hasil uji bioautografi tidak menghasilkan zona zernih, ini berarti ekstrak n-heksan pegagan
tidak mampu menghambat bakteri Escherichia coli dengan metode bioautografi
Kata kunci :
Pegagan (Centella asiatica (L) Urban), Escherichia coli, Bioautografi,
Kromatografi Lapis Tipis.
SUMMARY
Escherichia coli is one of the main bacteria causing the infection, there were found in the
normal flora of the colon which can cause urinary tract infections and meningitis in infants
gastroenteritris. Traditional medicine plants can be used as an alternative antibacterial agent, because
in general has active compounds that play a role in health. Centella asiatica is one of the main plants
used by the people of Indonesia as a traditional medicine, efficacious as a laxative urine, antibacterial,
hypotensive, insecticide. This research aims to determine the class of active compounds in the extract
of Centella asiatica n-hexane which has activity against Escherichia coli. Extraction was done by
maceration method using n-hexane solvent. Identification of the active compounds in the extract of
Centella asiatica n-hexane was done by Thin Layer Chromatography, using a mobile phase n-hexane:
ethyl acetate (4: 1). Bioautography Thin Layer Chromatography test results by attachment of the
chromatogram spots on the media for 30 minutes, the parameters used were clear zone on the
chromatogram were pasted spotting location on the media. The results showed that there are three
classes of compounds detected from the chromatogram using the reagent spots with Rf 0.51 steroids;
terpenoids with Rf 0.55 and 0.75; and alkaloids with Rf 0.94. Bioautografi test results didn’t produce
zone clear, this means n-hexane extract of Centella asiatica were not able to inhibit the bacteria
Escherichia coli by the bioautography method.
Keywords :
Gotu kola (Centella asiatica (L) Urban), Escherichia coli, Bioautography, Thin
Layer Chromatography.
PENDAHULUAN
Infeksi
merupakan
salahsatu
penyebab penyakit yang sering terjadi di
daerah beriklim tropis seperti Indonesia.
Infeksi dapat disebabkan oleh berbagai
mikroorganisme seperti bakteri, virus, riketsia,
jamur dan protozoa (Gibson, 1996) dan
menyebabkan munculnya tanda-tanda dan
gejala penyakit.
Escherichia coli merupakan salahsatu
bakteri penyebab infeksi, yaitu suatu kuman
oportunis yang banyak ditemukan dalam usus
besar sebagai flora normal yang dapat
menyebabkan infeksi saluran kencing yang
merupakan
infeksi
terbanyak
(80%)
gastroenteritris dan meningitis pada bayi,
peritonitis, infeksi lokal, kolesistitis, syok
bakterimia karena masuknya organisme ke
dalam darah dari uretra, kateterisasi atau
sistokopi, atau dari daerah septis pada
abdomen atau pelvis (Gibson, 1996).
Antibiotik
digunakan
untuk
mengendalikan populasi dan mengatasi
timbulnya infeksi atau gangguan kesehatan
yang disebabkan bakteri, dalam upaya
meningkatkan kesejahteraan dan kesehatan
masyarakat.
Penelitian-penelitian pencarian bahan
antibakteri telah banyak dilakukan terutama
dari berbagai jenis tumbuh-tumbuhan. Para
ilmuwan terus berusaha untuk mencari sumber
antibakteri baru, terutama yang mudah tumbuh
di Indonesia. Tumbuhan yang digunakan
untuk obat tradisional dapat dijadikan
alternatif pencarian zat anti bakteri, karena
pada umumnya memiliki senyawa aktif yang
berperan dalam bidang kesehatan (Salni dkk,
2011)
Tumbuhan
pegagan
(Centella
asiatica (L) Urban) merupakan salahsatu
tumbuhan yang digunakan oleh masyarakat
Indonesia sebagai obat tradisional. Pegagan
berkhasiat sebagai peluruh kencing (diuretika),
penurun panas (antipiretik), menghentikan
pendarahan
(haemostatika),
antibakteri,
antispasma,
antiinflamasi,
hipotensif,
insektisida, antialergi dan stimulant, ekstrak
herba mempunyai daya antibakteri terhadap
Staphylococcus
dan
Escherichia
coli
(Sudarsono dkk, 2002).
Metode bioautografi merupakan
metode yang spesifik untuk menentukan hasil
fraksi ataupun isolat senyawa murni yang telah
banyak digunakan sebagai salahsatu metode
pengujian aktivitas antibakteri. Metode ini
memiliki keuntungan antara lain mudah
pengerjaannya, ekonomis, tidak rumit, serta
dapat mendeteksi senyawa-senyawa yang
memiliki
aktivitas
sebagai
antibakteri
(Stahl,1985).
Amicelia (2010) melakukan uji
aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun
pegagan (Centella asiatica (L) Urban)
terhadap
Staphylococcos
aureus
dan
Escherichia coli dengan metode bioautografi.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa bercak
flavonoid dan tanin dengan Rf 0,02 dan bercak
saponin dengan Rf 0,57 aktif menghambat
pertumbuhan bakteri Staphylococcos aureus,
selain itu tidak ada bercak kromatogram yang
aktif menghambat pertumbuhan Escherichia
coli.
Untuk melakukan penelitian lebih
lanjut tentang pemanfaatan pegagan sabagai
antibakteri terhadap Escherichia coli yang
tidak ditemukan dalam ekstrak etanol daun
pegagan, maka dilakukan penelitian yang
dimaksudkan untuk mengetahui aktivitas
ekstrak n-heksan pegagan (Centella asiatica
(L) Urban Herba) yang diduga memiliki
aktivitas terhadap bakteri Escherichia coli.
BAHAN DAN METODE
Bahan-bahan yang digunakan antara
lain : pegagan (Centella asiatica (L) Urban),
n-heksan, biakan uji Escherichia coli, NaCl
fisiologis, Absence Broth, nutrient agar (NA),
air suling steril, alkohal 96%, minyak imersi
karbol-gentian-violet, larutan lugol, larutan
fuchsin, eluen n-heksan dan etil asetat,
pereaksi Liebermann-Bourchard, pereaksi
vanilin-asam sulfat, pereaksi Dragendorff.
.
Alat-alat yang digunakan antara lain :
rotavapor, moisture balance, grinder, ayakan
mesh no.30, kurs porselen, tanur, neraca
analitik, spatel, KLT (aluminium sheets silica
gel GF254), pipa kapiler, gunting, penggaris,
pensil, beaker glass, kertas saring, alumunium
foil, lampu UV, laminar air flow (LAF), lampu
spirtus, korek api, cawan Petri, pinset, ose,
gelas ukur, kompor listrik, hot plate,
Inkubator, labu erlenmeyer, kapas, batang
pengaduk, mikropipet, tabung reaksi, pipet
tetes, rak tabung, autoklaf, oven, objek glass,
cover glass, mikroskop.
METODE PENELITIAN
Pengumpulan Bahan Simplisia
Herba pegagan yang digunakan
diperoleh dari Balai Penelitian Obat dan
Aromatik Bogor (BALITRO) dan determinasi
herba pegagan dilakukan di Pusat Penelitian
LIPI Cibinong.
Pembuatan Serbuk Simplisia
Herba pegagan kering yang berasal
dari Balai Penelitian Obat dan Aromatik
Bogor (BALITRO) sebanyak 600 gram,
digiling dengan grinder stainless steel
sehingga menjadi serbuk dan kemudian diayak
dengan menggunakan mesh No. 30, sehingga
diperoleh serbuk simplisia. Serbuk disimpan
dalam wadah bersih, kering dan tertutup rapat.
Karakterisasi Serbuk Simplisia Pegagan
Uji Organoleptik dan Mikroskopik
Uji mikroskopik dilakukan pada
serbuk pegagan dengan menggunakan
mikroskop untuk melihat fragmen pengenal
dan uji organoleptik dengan menggunakan
panca indera untuk mendeskripsikan bentuk,
warna, bau dan rasa serbuk (Depkes RI, 2000).
Penetapan Kadar Air Serbuk Simplisia
Penetapan kadar air dilakukan dengan
menggunakan alat moisture balance dimana
dimasukan sampel sebanyak 1 gram di dalam
punch yang kemudian ditera. Ratakan sampel
hingga menutupi permukaan punch lalu
ditutup, dengan suhu 105ºC. Ditunggu hingga
terdengar bunyi bip yang menandakan bahwa
proses telah selesai. Pada layar akan tertera
persen kadar air dari sampel yang diujikan
secara otomatis. Kadar air simplisia pegagan
tidak lebih dari 7,6% (DepKes RI, 1995).
Penetapan Kadar Abu Serbuk Simplisia
Sebanyak 2,5 gram serbuk yang telah
digerus dan ditimbang seksama, dimasukkan
ke dalam kurs platina atau krus silica, ratakan
kemudian dipijarkan pada suhu 6000 C dalam
tanur hingga arang habis, didinginkan,
kemudian ditimbang. Jika dengan cara ini
arang tidak dapat dihilangkan, maka ditambah
dengan air panas, disaring melalui kertas
saring bebas abu. Dipijarkan sisa dan kertas
saring dalam krus yang sama. Filtrat
dimasukkan ke dalam krus, diuapkan,
dipijarkan hingga bobot tetap, ditimbang.
Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah
dikeringkan di udara. Kadar abu simplisia
pegagan tidak lebih dari 16,6% (DepKes RI,
1995).
Kadar abu = Bobot akhir serbuk x 100 %
Bobot awal serbuk
Ekstraksi Simplisia Herba Pegagan
Pembuatan ekstrak herba pegagan
dilakukan dengan cara maserasi menggunakan
pelarut n-heksan sebanyak 6 liter dan
digunakan 600 gram serbuk herba pegagan.
Serbuk dimasukkan ke dalam sebuah bejana,
tuangi dengan 75% bagian pelarut n-heksan
setara dengan 4,5 liter, ditutup, dibiarkan
selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil
diaduk setiap 6 jam sekali, disaring, diperas,
dicuci ampas dengan pelarut n-heksan 25 %
bagian setara dengan 1,5 liter, dipindahkan ke
dalam bejana tertutup, dibiarkan di tempat
sejuk dan terlindung dari cahaya selama 2 hari
setelah
itu
dienaptuangkan.
Maserat
dikumpulkan dan dilakukan pemekatan
dengan alat rotavapor (Depkes RI, 2004).
Rendemen Ekstrak Pegagan
Rendemen ekstrak n-heksan pegagan
dihitung dengan membandingkan berat awal
simplisia dan berat akhir ekstrak yang
dihasilkan.
Karakterisasi Ekstrak n-heksan Pegagan
Uji Organoleptik
Uji organoleptik pada ekstrak nheksan pegagan menggunakan panca indera
untuk mendeskripsikan bentuk, warna, bau dan
rasa ekstrak (Depkes RI, 2000).
Penetapan Kadar Air Ekstrak
Penetapan kadar air ekstrak dilakukan
dengan menggunakan alat moisture balance
dimana dimasukan sampel sebanyak 1 gram di
dalam punch yang kemudian ditera. Ratakan
sampel hingga menutupi permukaan punch
lalu ditutup, dengan suhu 105ºC. Ditunggu
hingga terdengar bunyi bip yang menandakan
bahwa proses telah selesai. Pada layar akan
tertera persen kadar air dari sampel yang
diujikan secara otomatis.
Penetapan Kadar Abu Ekstrak
Penetapan
kadar
abu
ekstrak
dilakukan dengan sebanyak 2,5 gram serbuk
yang telah digerus dan ditimbang seksama,
dimasukkan ke dalam kurs platina atau krus
silica, ratakan kemudian dipijarkan pada suhu
6000 C dalam tanur hingga arang habis,
didinginkan, kemudian ditimbang. Jika dengan
cara ini arang tidak dapat dihilangkan, maka
ditambah dengan air panas, disaring melalui
kertas saring bebas abu. Dipijarkan sisa dan
kertas saring dalam krus yang sama. Filtrat
dimasukkan ke dalam krus, diuapkan,
dipijarkan hingga bobot tetap, ditimbang.
Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah
dikeringkan di udara.
Kadar abu = Bobot akhir serbuk x 100 %
Bobot awal serbuk
Inokulasi Bakteri
a. Sterilisasi Alat
Alat yang digunakan pada uji
efektivitas bakteri dengan cara dicuci
kemudian dibungkus kertas polos terlebih
dahulu, lalu dimasukkan kedalam oven dengan
suhu 150ºC selama 2 jam, setelah itu alat-alat
siap digunakan.
b. Penyiapan Media
Media yang digunakan dalam
penelitian ini adalah nutrient agar (NA) dan
media cair broth. Cara pembuatan media ada
pada Lampiran 3.
c. Inokulum Bakteri
Konsentrasi larutan bakteri yang akan
digunakan untuk pengujian adalah 10-6
bakteri/ml. Inokulasi bakteri dilakukan dengan
cara pembuatan stok dan inokulum bakteri,
yaitu:

Biakan murni untuk pengujian digunakan
biakan berumur satu hari. Biakan
disuspensikan hingga homogen dengan
media cair broth.

Dibuat pengenceran serial 1:10, 1:100,
1:1000, dan seterusnya dengan cara
menyiapkan beberapa tabung reaksi yang
berisi 9 mL larutan NaCl fisiologis.
Bakteri yang disuspensikan diambil
sebanyak 1 mL kemudian dimasukkan ke
dalam tabung reaksi pertama dan dikocok
homogen maka akan diperoleh larutan
dengan konsentrasi 10-1.

Larutan pada tabung reaksi pertama
diambil sebanyak 1 ml kemudian
dimasukkan ke dalam tabung reaksi
kedua yang berisi 9 mL NaCl fisiologis
0,9 % steril dan dikocok homogen, maka
akan diperoleh dengan konsentrasi 10-2
dan seterusnya sampai diperoleh larutan
dengan konsentrasi 10-6.

Setelah bakteri diencerkan 10-6 kemudian
pipet 1 ml dan sebarkan ke permukaan
media.
Pembuatan Larutan Pereaksi
a. Pereaksi Liebermann-Bourchard
Asam asetat anhidrat 5 mL dicampur
secara hati-hati dengan 5 mL asam sulfat
pekat kemudian campuran ini ditambahkan
secara hati-hati ke dalam 50 mL etanol
absolut, setiap pencampuran zat dilakukan
dengan pendinginan.
b. Pereaksi vanilin-asam sulfat
Vanillin 1 gram dilarutkan asam sulfat 25
mL.
c. Pereaksi Dragendorff
Bismuth subnitrat (Bi (NO3)3) 0,17 gram
dilarutkan dalam aquades 8 mL dan asam
asetat glasial 2 mL, kemudian ditambahkan
potasium ioda 1,6 gram yang telah
dilarutkan dalam aquades 4 mL.
Deteksi
Senyawa
Ekstrak
n-heksan
Pegagan
Deteksi senyawa dilakukan dengan
cara Kromatografi Lapis Tipis, dilakukan dua
kali, yaitu untuk mendeteksi banyaknya bercak
senyawa yang terkandung dalam ekstrak nheksan pegagan dan uji bioautografi. Untuk
mendeteksi bercak, larutan ekstrak ditotolkan
dengan pipa kapiler pada lempeng KLT (silica
gel GF254). Kemudian dimasukkan ke dalam
bejana dielusi dengan eluen n-heksan dan etil
asetat dengan perbandingan (1 : 1) sebagai
perbandingan awal yang nanti akan diuji
kembali sampai mendapatkan perbandingan
eluen yang tepat. Setelah cairan elusi
mencapai batas rambat, lempeng plat KLT
dikeluarkan lalu dikeringkan dan disemprot
dengan pereaksi semprot. Bercak yang timbul
diamati dan dihitung Rf dari masing-masing
bercak. KLT untuk uji bioautografi dilakukan
dengan cara yang sama namun lempeng tidak
disemprot dengan larutan pereaksi semprot.
Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak nheksan Herba Pegagan
a. Pengujian Aktivitas Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri ini
menggunakan metode difusi kertas cakram,
dimana kertas cakram dicelupkan terlebih
dahulu ke dalam ekstrak pegagan dengan
konsentrasi 15%, 30%, dan 45% selama 15
menit kemudian dikeringkan selama 5 menit.
Disiapkan media cair nutrient agar
dengan suhu 450C, kemudian ditambahkan 0,2
ml suspensi bakteri uji, dicampur dan
dihomogenkan. Didiamkan hingga media
menjadi padat, lalu diletakkan kertas cakram
yang telah dicelupkan ke dalam ekstrak
pegagan dengan konsentrasi 15%, 30%, dan
45% di atas media agar dengan menggunakan
pinset steril, kemudian diinkubasi pada suhu
37oC selama 24 jam dalam inkubator, lalu
diamati dan diukur dengan menggunakan
penggaris atau jangka sorong Lebar Daerah
Hambat (LDH) masing-masing kertas cakram
terhadap pertumbuhan bakteri. LDH diukur
dari diameter zona bening yang terbentuk.
Pengujian ini dilakukan untuk masing-masing
konsentrasi
ekstrak
dengan
3
kali
pengulangan.
b. Uji Bioautografi
Disiapkan cawan Petri sedang
berdiameter 11 cm dan diisi dengan biakan
bakteri Escherichia coli sebanyak 0,6 ml yang
sudah diencerkan. Plat KLT yang telah kering
disterilisasi menggunakan sinar UV selama 30
menit, kemudian dimasukan ke dalam cawan
Petri yang telah berisi biakan bakteri
Escherichia coli selama 30 menit supaya
senyawa aktif berdifusi kedalam medium agar.
Lempeng kromatogram diangkat dengan hatihati ditempatkan dalam cawan Petri steril,
diinkubasi selama 24 jam. Pengamatan
dilakukan dengan melihat bercak atau daerah
bening yang tidak ditumbuhi oleh bakteri, nilai
Rf dari tiap zona yang terbentuk di ukur dan
membandingkan dengan plat kromatogram
pada deteksi senyawa ekstrak. Pengujian ini
dilakukan sebanyak 3 kali ulangan.
c. Pengecatan Gram
Pegecatan Gram dilakukan sebagai
uji kemurnian isolat bakteri Escherichia coli
sebagai bakteri dalam pengujian untuk melihat
bakteri yang digunakan tidak terkontaminasi
oleh bakteri jenis lain.
Disiapkan cawan Petri dari setiap
pengujian, diambil sebanyak satu ose bakteri
dari dalam cawan Petri uji, kemudian dibuat
preparat dengan film yang tipis. Preparat
diberi zat warna karbol-gentian-violet selama
3 menit, dibuang cat yang berlebihan dan
ditambahkan larutan lugol (tampa dicuci
terlebih dahulu) dibiarkan selama 1 menit,
dicuci preparat dengan alkohol 96% sampai
tidak ada lagi zat warna yang luntur kemudian
dicuci dengan air kran, dicat preparat dengan
larutan fuchsin selama 1 menit, dicuci dengan
air kran sampai bersih dan dihilangkan sisa air
mengunakan kertas saring. Diperiksa preparat
menggunakan mikroskop.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Determinasi
Berdasarkan
hasil
identifikasi/determinasi
tumbuhan
di
“Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani Pusat
Penelitian Biologi LIPI-Bogor menyatakan
bahwa tumbuhan yang dibawa merupakan
tumbuhan pegagan (Centella asiatica (L.)
Urb.) yang termasuk dalam suku Apiaceae.
Serbuk Simplisia Herba Pegagan
Dibuat serbuk simplisia herba
pegagan dari 25 kg herba pegagan basah
menghasilkan 1,6 kg simplisia kering yang
kemudian di grinder dan didapat serbuk
simplisia herba pegagan sebanyak 1,2 kg
dengan persen rendemen 75%.
Karakterisasi Serbuk Herba Pegagan
Penetapan Kadar Air Serbuk Herba
Pegagan
Penetapan kadar air simplisia
dilakukan menggunakan alat moisture balance,
dari penetapan diperoleh kadar air simplisia
pegagan sebesar 6,84% dimana kadar air yang
diperoleh telah memenuhi standar yaitu kadar
air simplisia pegagan tidak lebih dari 7,6%
(DepKes RI, 1995).
Penetapan Kadar Abu Serbuk Herba
Pegagan
Penetapan kadar abu dilakukan
dengan cara pembakaran menggunakan tanur
dengan suhu 6000C, dari penetapan ini
diperoleh kadar abu simplisia pegagan sebesar
10,23%. Kadar yang diperoleh telah
memenuhi standar yaitu kadar abu simplisia
pegagan tidak lebih dari 16,6% (DepKes RI,
1995).
Penetapan kadar abu berupa bahan
yang dipanaskan pada temperatur dimana
senyawa organik dan turunannya terdestruksi
dan menguap, sehingga tinggal unsur mineral
dan anorganik, menurut Winarno (1997)
terdapat 96% dari komposisi bahan pangan
atau tanaman adalah air dan bahan organik,
sedangkan sisanya adalah unsur mineral.
Unsur mineral dikenal sebagai zat anorganik
atau abu, dalam proses pembakaran bahanbahan organik terbakar tetapi bahan
anorganiknya tidak, karena itulah disebut abu.
Tujuan penetapan kadar abu memberikan
gambaran kandungan mineral internal dan
eksternal yang berasal dari proses awal sampai
terbentuknya ekstrak dan nilai maksimal atau
rentang yang diperbolehkan terkait dengan
kemurnian dan kontaminasi (Depkes RI,
2000).
Uji Organoleptik Serbuk Pegagan
Dilakukan uji organoleptik meliputi
bentuk, warna, rasa dan bau yang bertujuan
untuk memberikan pengenalan awal secara
objektif, serta digunakan untuk menguji
simplisia secara fisik selama penyimpanan
yang dapat mempengaruhi khasiat bahan.
Hasil uji organoleptik serbuk pegagan: bentuk
serbuk, warna hijau kelabu, rasa tidak berasa
dan bau aromatis.
Uji Mikroskopik Serbuk Pegagan
Dilakukan
pengamatan
serbuk
simplisia herba pegagan secara mikroskopik
dengan menggunakan mikroskop yang
bertujuan
untuk
mengenal
simplisia
berdasarkan ciri-ciri anatomi (Stahl, 1985),
dari hasil pengamatan didapatkan beberapa
fragmen pengenal antara lain yaitu hablur
kalsium oksalat, rambut penutup, serabut
sklerenkim, epidermis atas dengan mesofil dan
pembuluh kayu dengan penebalan spiral dan
jala.
Ekstraksi
Proses pembuatan ekstrak herba
pegagan diperoleh dengan cara ekstraksi
dengan metode maserasi, digunakan 600 gram
simplisia pegagan dengan 6 liter pelarut
dilakukan selama 5 hari dan tiap 6 jam
dilakukan pengocokan, kemudian dilakukan
penyaringan dan ampas yang diperoleh dicuci
menggunakan 25% bagian pelarut, setelah itu
hasil dikumpulkan dan dienaptuangkan selama
24 jam. Maserat yang diperoleh kemudian
pelarutnya dipisahkan dengan menggunakan
alat rotavapor dan selanjutnya dilakukan
pemekatan
dengan
cara
diuapkan
menggunakan waterbath sampai diperoleh
ekstrak kental (Gambar 5). Ekstrak yang
diperoleh ditimbang dan dihitung persen
rendemen ekstrak pegagan dan hasil persen
rendemen di dapat sebesar 2,41655 %.
Gambar 1. Ekstrak Kental Pegagan
Ekstraksi merupakan penyarian zat-zat
aktif dari bagian tanaman dengan tujuan untuk
menarik komponen kimia yang terdapat dalam
simplisia. Digunakan metode maserasi karena
metode ekstraksi ini merupakan cara yang
paling sederhana dan tidak memerlukan alat
khusus. Pelarut yang digunakan adalah nheksan. Dalam penggunaannya pelarut nheksan dalam penelitian ini diharapkan
kandungan zat aktif dalam simplisia yang
tertarik merupakan zat aktif yang bersifat non
polar, karena n-heksan merupakan pelarut
yang bersifat non polar yang dapat menarik
senyawa sedikit semi polar dan senyawa non
polar.
Prinsip dari maserasi adalah cairan
penyari akan masuk ke dalam sel melewati
dinding sel. Isi sel akan larut karena adanya
perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam
sel dengan di luar sel. Larutan yang
konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan
diganti oleh cairan penyari dengan konsentrasi
yang lebih rendah. Peristiwa tersebut berulang
sampai terjadi keseimbangan konsentrasi
antara larutan di luar sel dan di dalam sel.
Endapan yang diperoleh dipisahkan dan
filtratnya dipekatkan, digunakan rotavapor
untuk memisahkan cairan penyari, prinsip dari
rotavapor dengan pemanasan yang dipercepat
oleh putaran labu alas bulat, cairan penyari
dapat menguap di bawah titik didih pelarutnya
disebabkan oleh karena adanya penurunan
tekanan dengan bantuan pompa vakum, uap
larutan penyari akan menguap naik ke
kondensor dan mengalami kondensasi menjadi
molekul-molekul cairan pelarut murni yang
ditampung dalam alas bulat penampung
(Sudjadi, 1986).
Karakterisasi Ekstrak n-heksan Herba
Pegagan
Penetapan Kadar Air Ekstrak n-heksan
Herba Pegagan
Penetapan kadar air ekstrak herba
pegagan dilakukan menggunakan alat moisture
balance, dari penetapan kadar air ini diperoleh
kadar air ekstrak sebesar 2,75%.
Penetapan kadar air merupakan
pengukuran kandungan air yang berada di
dalam bahan, dengan tujuan memberikan
batasan minimal atau rentang tentang besarnya
kandungan air di dalam bahan dan nilai
maksimal atau rentang yang diperbolehkan
terkait dengan kemurnian dan kontaminasi
(Depkes RI, 2000). Air yang tersisa dalam
simplisia pada kadar tertentu dapat merupakan
media pertumbuhan kapang dan jasad renik,
menurut Ferdiaz et al., (1992) batas kadar air
minimal mikroba masih dapat tumbuh adalah
berkisar antara 14%-15%.
Penetapan Kadar Abu Ekstrak n-heksan
Herba Pegagan
Penetapan kadar abu dilakukan
dengan cara pembakaran menggunakan tanur
dengan suhu 6000C, dari penetapan ini
diperoleh kadar abu ekstrak 1,43%.
Uji Organoleptik Ekstrak n-heksan Herba
Pegagan
Dilakukan uji organoleptik meliputi
bentuk, warna, rasa dan bau yang bertujuan
untuk memberikan pengenalan awal secara
objektif, serta digunakan untuk menguji
simplisia secara fisik selama penyimpanan
yang dapat mempengaruhi khasiat bahan.
Hasil uji organoleptik ekstrak n-heksan:
bentuk kental, warna hitam, rasa tidak berasa
dan bau aromatis.
Deteksi Senyawa Ekstrak Pegagan
Deteksi senyawa ekstrak pegagan
dilakukan dengan cara kromatografi lapis tipis.
Dalam pemeriksaan kandungan zat di dalam
ekstrak dilakukan pencarian perbandingan
antar eluen agar pemisahan dapat terjadi
secara
optimal.
Digunakan
sebagai
perbandingan awal eluen n-heksan dengan etil
asetat yaitu (1:1), noda bercak merambat
terlalu jauh dan hanya menghasilkan 2 bercak,
kemudian dilanjutkan dengan perbandingan
(3:1) dari sini didapat hasil dengan 6 bercak
tetapi pemisahannya masih terlalu jauh, dicoba
perbandingan
eluen
sampai
dengan
perbandingan
(6:1).
Eluen
dengan
perbandingan (6:1) diperoleh 6 bercak dengan
5 bercak berkumpul di bawah, dengan melihat
bercak yang dihasilkan dari perbandingan
(1:1), (3:1), (4:1), (5:1) dan (6:1) didapat hasil
yang paling optimal mengalami pemisahan
yaitu dengan perbandingan eluen (4:1),
perbandingan ini yang digunakan untuk
deteksi senyawa dan pengujian golongan
senyawa
antibakteri.
Hasil
pemisahan
kandungan senyawa dalam ekstrak pegagan
didapatkan
kromatogram seperti
yang
disajikan pada Gambar 2 dan Tabel 1.
1 2
34 5
6
Gambar 2. Hasil pemisahan kandungan
golongan senyawa ekstrak pegagan secara
kromatografi lapis tipis (Eluen n-heksan
dan etil asetat, perbandingan (4:1))
Hasil pemisahan digunakan fase diam
aluminium sheets silica gel GF254 dengan
ukuran panjang 13 cm, diameter 1,5 cm dan
jarak pengembangan 10 cm, jarak penotolan 2
cm dari bawah dengan fase gerak eluen
campuran n-heksan dan etil asetat dengan
perbandingan (4:1).
Deteksi bercak hasil pemisahan
ditentukan secara kimia yaitu dengan
menyemprotkan lempeng KLT menggunakan
pereaksi bercak, digunakan 3 pereaksi bercak.
Tabel 1. Hasil pemisahan kandungan
golongan senyawa ekstrak pegagan secara
kromatografi lapis tipis
No.
Rf
bercak
1
0,23
2
0,28
Ekstrak n3
0,51
heksan
6
4
0,55
Pegagan
5
0,75
6
0,94
Dari hasil deteksi bercak golongan
senyawa diperoleh 3 bercak yang memberikan
hasil positif. Pereaksi bercak LiebermannBourchard dapat mendeteksi bercak golongan
senyawa triterpenoid ditandai dengan warna
noda bercak merah atau ungu dan mendeteksi
golongan senyawa steroid ditandai warna noda
bercak biru atau hijau, tetapi pada pemeriksaan
dengan menggunakan pereaksi bercak
Liebermann-Bourchard tidak terbentuk noda
bercak warna merah atau ungu, yang
menandakan adanya golongan senyawa
triterpenoid.
Tabel 2. Hasil pereaksi penampak bercak
Pereaksi
Golongan
Hasil
Hasil
bercak
senyawa
analisis
Warna
Triterpenoid bercak Negatif
Lieberm
merah
annRf 0,94
Bourcha
warna
rd
Steroid
Positif
bercak
hijau
Rf 0,51
Dragend
warna
Alkaloid
Positif
roff
bercak
Orange
Rf 0,55
dan
Vanilin
0,75
asam
Terpenoid
Positif
warna
sulfat
bercak
biru
Uji Aktitivitas Antibakteri Ekstrak nheksan Herba Pegagan Terhadap Bakteri
Escherichia coli
Uji Kemurnian Isolat Bakteri Escherichia
coli
Sampel
Jumlah
bercak
Uji ini bertujuan untuk menegaskan
bahwa bakteri uji yang digunakan telah murni.
Isolat bakteri uji yang di peroleh diamati
morfologi selnya dengan pengecatan Gram.
Pengecatan
Gram
dilakukan
untuk
membedakan bakteri yang bersifat Gram
positif atau Gram negatif dan bentuk sel.
Hasil
dari
pengecatan
Gram
menunjukan bakteri yang di uji benar dan
murni bakteri Escherichia coli, terlihat pada
Gambar 8 dari pengecatan bakteri uji berwarna
merah dan berbentuk batang yang merupakan
ciri dari bakteri Escherichia coli. Hasil dapat
dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Pengecatan Gram bakteri
Escherichia coli pembesaran 10 X 100
Escherichia coli merupakan bakteri
Gram negatif, pengecatan Gram dapat
membedakan bakteri Gram positif dan bakteri
Gram negatif. Bakteri Gram positif berwarna
biru yang disebabkan kompleks warna Kristal
violet-iodium tetap dipertahankan, sedangkan
bakteri Gram negatif berwarna merah karena
kompleks warna tersebut larut sewaktu
pemberian larutan pemucat dan kemudian
mengambil zat warna kedua yang berwarna
merah. Perbedaan hasil dalam pewarnaan
tersebut disebabkan perbedaan struktur,
terutama dinding sel kedua kelompok tersebut
(Waluyo, 2008).
Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak nheksan
Pegagan
Terhadap
Bakteri
Eschirichia coli
Pengujian
aktivitas
antibakteri
dilakukan untuk mengetahui daya aktivitas
antibakteri dari ekstrak n-heksan pegagan
terhadap bakteri Escherichia coli dengan
menggunakan metode Difusi Kertas Cakram.
Dilakukan 3 kali pengulangan dalam
pengujian dengan menggunakan 3 konsentrasi
ekstrak yaitu 15%, 30% dan 45% dan dengan
menggunakan kontrol positif kotrimoksazol.
Hasil lembar daerah hambat ekstrak n-heksan
pegagan dan kontrol positif dapat dilhat pada
Gambar 4.
hambat
kemudian
dilanjutkan
dengan
pengujian aktivitas antibakteri dengan
menggunakan metode bioautografi.
Uji Bioautografi
Pengujian bioautografi dilakukan
menggunakan plat KLT yang telah ditotolkan
ekstrak dan di elusi, setelah itu dilakukan
pengujian aktivitas antibakteri. Setelah
dilakukan inkubasi selama 24 jam hasil positif
ditandai oleh zona bening, kemudian diukur
zona
bening
dibandingkan
dengan
kromatogram yang tidak diujikan untuk
melihat bercak yang dapat menghambat
aktivitas bakteri. Hasil uji bioautografi dapat
dilihat pada Gambar 5.
A
Letak
Penotolan
Ekstrak
Gambar 5. Hasil uji bioautografi
B
Gambar 4. A. Uji aktivitas ekstrak nheksan pegagan terhadap Escherichia coli.
B. Kontrol positif dan negatif
Hasil pengamatan dan pengukuran
lebar daerah hambat yang terbentuk disekitar
kertas cakram menunjukan kecilnya aktivitas
dari masing-masing konsentrasi ekstrak nheksan pegagan yaitu dengan lebar daerah
hambat sebesar 1 mm, ini menunjukan ekstrak
n-heksan
pegagan
memiliki
aktivitas
antibakteri sangat kecil terhadap bakteri
Escherichia coli. Dari pengujian lebar daerah
Dari hasil uji bioautografi terlihat
tidak adanya noda bercak pada plat KLT yang
beraktivitas pada bakteri Escherichia coli di
tandai dengan tidak adanya zona bening yang
terbentuk.
Beberapa
sumber
mengatakan
pegagan dapat beraktivitas terhadap bakteri
Escherichia coli, Dzulkarnain dkk, (1996)
dalam tinjauan kepustaka tanaman obat
bersifat antibakteri di Indonesia, pegagan
memiliki daya aktivitas antibakteri terhadap
Escherichia coli. Januwati dan Yusron, (2005)
komponen minyak atsiri seperti sitronelal,
linalool, neral, menthol, dan linalil asetat.
Dengan adanya komponen tersebut dalam
minyak atsiri pegagan, tanaman ini memiliki
potensi sebagai sumber bahan pengobatan
terhadap anti penyakit yang disebabkan tujuh
jenis
bakteri
Rhizobacter
spharoides,
Escherichia coli, Plasmodium vulgaris,
Micrococcus luteus, Baccillus subtilis, Entero
aerogenes dan Staphyllococcus aureus.
Digunakan ekstrak n-heksan pegagan
untuk mengetahui golongan senyawa semi
polar dan non polar yang memiliki daya
aktivitas, dalam pengujian digunakan plat
KLT sebagai media pengujian antibakteri.
Deteksi golongan senyawa mengunakan plat
KLT didapat 3 golongan senyawa yakni
alkaloid, terpenoid dan steroid, dari hasil yang
diperoleh tidak satupun golongan senyawa
yang dapat beraktivitas terhadap bakteri
Escherichia
coli,
ini
kemungkinana
dikarnakan konsentrasi yang terdapat pada plat
KLT blum cukup untuk menghambat
pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan
mungkin dikarenakan oleh kandungan zat
senyawa dalam ekstrak pegagan tidak dapat
menghambat pertumbuhan bakteri dalam
keadaan terpisah dan ketebalan membran luar
dari suatu bakteri akan mempengaruhi
ketahanan bakteri terhadap suatu jenis
senyawa tertentu (Jawetz, dkk, 2001),
Escherichia coli merupakan bakteri Gram
negatif yang memiliki dinding sel yang lebih
kompleks terdiri atas 3 lapis peptidoglikan
berada diantara selaput luar dan selaput dalam
dinding sel (Gupte, 1990).
Kesimpulan
 Didapatkan tiga golongan senyawa yang
terdapat dalam ekstrak n-heksan pegagan
dari hasil deteksi kromatografi lapis tipis
yaitu steroid, alkaloid dan terpenoid.
 Uji efektifitas ekstrak n-heksan herba
pegagan melalui metode bioautografi tidak
menghasilkan daya aktivitas antibakteri
terhadap bakteri Escherichia coli
Saran
 Perlu dicari kandungan minyak atsiri dari
pegagan dengan cara destilasi uap.
 Perlu dilakukan ekstraksi dengan pelarut
semi polar untuk menarik senyawa-senyawa
semi polar yang berkemungkinan berfungsi
sebagai antibakteri.
 Perlu dilakukan uji bioautografi dengan
mengunakan metode Bioautografi agar
overlay dan Bioautografi langsung.
DAFTAR PUSTAKA
Amicelia O., 2010, Uji Aktivitas Antibakteri
Ekstrak Etanol Daun Pegagan
(Centella asiatica (L) Urb) Terhadap
Staphylococcus
aureus
dan
Eschericia coli Dengan Metode
Bioautografi,
Skripsi,
Fakultas
Farmasi Universitas Ahmad Dahlan,
Yogyakarta.
BPOM RI., 2010, Serial Data Ilmiah Terkini
Tumbuhan Obat Pegagan (Centella
asiatica (L) Urban), penerbit: BPOM
RI., Jakarta.
Clark J. 2007. Kromatografi Lapis Tipis.
http://www.chem-istry.org/materi_kimia/instrumen_anali
sis/kromatografi1/kromatografi_lapis
_tipis/. Di akses pada tgl 05-05-2012.
DepKes RI. 1977. Materia Medika Indonesia,
Jilid 1. Jakarta.
,RI. 1986. Sediaan Galenik. Direktorat
Pengawasan Obat dan Makanan.
Jakarta.
_____. RI. 1995. Farmakope Indonesia edisi
IV. Direktorat Jendral Pengawas Obat
dan Makanan. Jakarta.
,RI. 2000. Parameter Standar Umum
Ekstrak Tumbuhan Obat. Direktorat
Jendral Pengawasan Obat dan
Makanan. Jakarta.
,RI. 2004. Penetapan Kadar Air.
Direktorat Jendral Pengawasan Obat
dan Makanan. Jakarta.
Dzulkarnain B., Sundari D, dan Chozin A.
1996.
Tinjauan
Kepustakaan
Tanaman Obat Bersifat Antibakteri di
Indonesia. Pusat Penelitian dan
Pengembangan Farmasi. DepKes RI,
Jakarta.
Eni K., Estie. Dan Darmono, 2008, Sensitivitas
Metode Bioautografi Kontak dan
Agar Overlay dalam Penentuan
Senyawa
Antikapang,
Fakultas
Farmasi UP, Jakarta.
Ferdiaz, D. N. Andarwulan, H. Wijaya, dan N.
L. Puspitasari. 1992. Teknik Analisis
Sifat
Kimia
dan
Fungsional
Komponen Pangan. PAU Pangan dan
Gizi, IPB, Bogor.
Fitri Kusuma S.A., 2010, Escherichia coli,
Makalah, Fakultas Farmasi UNPAD,
Bandung.
Gembong T., 2005, Taksonomi Tumbuhan
Obat-obatan,
Cetakan
kedua,
penerbit: Gadjah Mada University
Press, Yogyakarta.
Gibson, J. M., 1996, Mikrobiologi dan
Patologi Modern untuk Perawat,
Cetakan Pertama, Buku Kedokteran
EGC, Jakarta.
Rohman
A., 2009. Kromatografi
Analisis
Obat.
Graha
Yogyakarta
untuk
Ilmu,
Roth H.J. dan Blascke G., 1988. Analisis
Farmasi. Diterjemahkan oleh Sarjono
K. dan Slamet I. Yogyakarta:
Penerbit UGM
Salni, Hanifa M. dan Ratna W.M., 2011.
Isolasi Senyawa Antibakteri dari
Daun
Jengkol
(Pithecolobium
lobatum Benth) dan Penentuan Nilai
KHM-nya, Jurusan Biologi FMIPA,
Universitas Sriwijaya, Sumatera
Selatan.
Gupte, S., 1990, Mikrobiologi Dasar, Ed.3,
Bina Aksara, Jakarta.
Stahl
E., 1985. Analisis obat secara
kromatografi
dan
mikroskopi.
Diterjemahkan oleh Padmawinata K
dan Sudiro I. Bandung: Penerbit ITB.
Handika D.Y., 2009, Analisis Komponen
Antibakteri Ekstrak Etanol Rimpang
Jahe (Zingiber officinale Rose)
Terhadap Bakteri Staphylococcus
aureus dan Escherichya coli dan
Bioautografinya, Fakultas Farmasi
Universitas
Muhammadiya,
Surakarta.
Sudarsono P., Gunawan D., Wahyuono S.,
Donatus I.A. dan Purnomo, 2002.
Tumbuhan Obat II Hasil Penelitian,
Sifat-sifat, dan Penggunaan, Pusat
Studi Obat Tradisional – UGM Sekip
Utara, Yogyakarta
Harborne, J. B. 1987. Metode Fitokimia
Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan. Terjemahan Padmawinata
K, Soediro I, Niksolihin S. Terbitan
Pertama. Institut Teknologi Bandung.
Bandung.
http://id.wikipedia.org/wiki/Pegagan senin, 3110-2011 jam 05.13WIB
Jawezt, E. Melnick, J.L and L.A. Adel berg,
1986.
Mikrobiologi
Kedokteran
(Medical Microbiolgy). 20th Edition.
Alih bahasa; Edi Nugroho dan R.F
Maulany. Penerbit Buku Kedokteran,
EGC, Jakarta.
Jawetz, E., J.C. Melnick dan E.A. Adelberg,
2001. Mikrobiologi Kedokteran,
Salemba Medika, Jakarta.
Sudjadi, Drs., 1986. Metode Pemisahan. UGM
Press, Yogyakarta
Sunatmo T. I., 2007. Eksperimen Mikrobiologi
dalam
Laboratorium.
Ardy
Agency, Jakarta.
Supardi, I., dan Sukamto, 1999. Mikrobiologi
Dalam Pengolahan Dan Keamanan
Pangan, Penerbit Aumni, Bandung.
Waluyo L. 2008. Teknik dan Metode Dasar
dalam Mikrobiologi. UMM Press.
Malang.
Winarno, F. G. 1997. Kimia Pangan dan Gizi.
Gramedia. Jakarta.