Studi Pembungaan dan Isolasi Gen APETALA1

VI. UJI EKSPRESI GEN APETALA1 PADA BERBAGAI JARINGAN
TANAMAN KAKAO
Abstrak
Dengan telah diidentifikasi dan diisolasinya sejumlah gen pembungaan,
menunjukkan bahwa proses penting dari pembentukan organ reproduktif pada
tanaman tingkat tinggi telah berkembang dengan cepat. Tahap penting dalam
proses pembungaan adalah transformasi dari primordium bunga menjadi
primordia dari keempat tipe organ bunga (sepal, petal, stamen dan carpel).
Jumlah gen homeotik yang telah berhasil diisolasi dan dianalisis dari Arabidopsis
untuk ekspresi spatial dan temporalnya juga mengalami peningkatan dengan
pesat. Full-length AP1 telah berhasil diisolasi dari jaringan kuncup bunga kakao.
Reaksi RT-PCR telah digunakan dan menunjukkan bahwa teknik tersebut efektif
dalam memperlihatkan ekspresi gen pada berbagai jaringan tanaman. Tujuan
penelitian ini adalah untuk menguji ekspresi gen AP1 pada berbagai jaringan
tanaman kakao. Penelitian dilakukan di Plant Research International,
Wageningen, Belanda. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen AP1 diekspresikan secara diferensial pada berbagai jaringan tanaman kakao, dimana ekspresi
terkuat terjadi pada kuncup bunga, kemudian berturut-turut disusul bantalan aktif
dan bantalan pasif, sementara pada bantalan bertunas dan daun tidak
terekspresi. Terdapatnya ekspresi AP1 pada level yang tinggi dalam jaringan
kuncup bunga kakao, menunjukkan bahwa selain terlibat dalam transisi dari
perkembangan vegetatif menuju reproduktif, gen AP1 juga berperanan penting
dalam pembentukan organ bunga.
Kata kunci : gen pembungaan, organ bunga, RT-PCR, Full-length AP1.
Pendahuluan
Pengertian ekspresi gen ialah bagaimana informasi yang terkandung di
dalam suatu gen tersebut dimunculkan dalam pengendalian proses kehidupan.
Ekspresi gen terdiri atas dua tahapan, yaitu transfer informasi genetik dari DNA
ke dalam bentuk RNA yang disebut dengan transkripsi, dan selanjutnya penterjemahan informasi genetik yang terdapat pada RNA ke dalam bentuk
polipeptida yang disebut dengan translasi. Faktor transkripsi berperan penting
dalam pengaturan ekspresi suatu gen (Dale dan Schantz 2002).
Banyak gen pembungaan telah diisolasi dan dianalisis dari Arabidopsis
untuk menjelaskan ekspresi spatial dan temporalnya. Dengan berhasilnya isolasi
dan identifikasi sejumlah gen pembungaan tersebut menunjukkan bahwa studi
93
tentang pembentukan organ reproduktif pada tanaman tingkat tinggi telah
mengalami perkembangan yang cukup pesat. Tahap krusial dalam proses
pembungaan adalah transformasi dari primordia bunga menjadi empat tipe organ
bunga yaitu sepal, petal, stamen dan carpel (Angenent et al. 1992). Studi pada
Arabidopsis thaliana dan Antirrhinum majus telah menghasilkan kemajuan
substansial dalam mengidentifikasi gen yang berperan dalam proses perubahan
dari meristem vegetatif menjadi meristem bunga (Parfitt et al. 2004).
Studi ekspresi dan analisis mutan gen MADS-box pada spesies tanaman
secara luas menunjukkan bahwa peranan penting gen MADS-box adalah dalam
pengaturan perkembangan tanaman baik reproduktif (bunga, biji, buah) maupun
vegetatif (akar, daun). Pada Arabidopsis, setelah transisi dari perkembangan
vegetatif ke reproduktif, meristem bunga tersusun pada meristem infloresen dan
kemudian berkembang menjadi bunga dengan empat tipe organ (sepal, petal,
stamen dan carpel). Di sini gen AP1, CAL dan LFY berperan sebagai penanda
meristem bunga. Pada mutan ap1, sepal ditransformasi menjadi organ mirip
daun dan petal gagal untuk berkembang (Pelaz et al. 2001).
Pada Arabidopsis, tiga gen penanda organ bunga yaitu AP1, AP3 dan PI
menyandikan faktor transkripsi domain MADS dan diekspresikan dengan pola
yang terpisah secara spatial dalam bunga yang sedang berkembang (Jack et al.
1992; Mandel et al. 1992; Goto dan Meyerowitz 1994). AP1 mempunyai fungsi
utama sebagai penanda meristem bunga dan juga diperlukan untuk pembentukan organ sepal dan petal pada bunga. Mutasi AP1 mengakibatkan tidak
terbentuknya sepal dan petal, dimana pada tempal sepal terbentuk organ mirip
daun (Lowman dan Purungganan 1999).
Pada apel, dengan teknik RT-PCR van der Linden et al. (2002) telah
berhasil memperlihatkan gen MADS-box bunga apel yang diekspresikan pada
jaringan vegetatif. Gen MdMADS12 adalah gen mirip AP1 yang diekspresikan
94
pada daun, tunas vegetatif dan jaringan bunga dengan level yang sama, dan gen
tersebut terlibat dalam transisi dari stadia juvenil ke dewasa. Gen AGL8
merupakan gen yang memacu pembentukan bunga pada Arabidopsis, tetapi juga
diekspresikan pada jaringan carpel dan jaringan vascular daun, hal ini
menunjukkan bahwa gen tersebut diperlukan juga untuk pengaturan diferensiasi
sel (Hempel et al. 1997; Gu et al. 1998; Liljegren et al. 1998). Hasil tersebut
menunjukkan bahwa gen MADS-box yang aslinya diekspresikan pada bunga,
ternyata diekspresikan juga dan mungkin berfungsi pada jaringan vegetatif
(van der Linden et al. 2002).
Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji tingkat ekspresi gen AP1 pada
berbagai jaringan tanaman kakao.
Bahan dan Metode
Bahan Tanaman
Bahan tanaman yang digunakan adalah kuncup bunga kakao, bantalan
bunga
aktif
(mengandung
calon
bunga),
bantalan
bunga
pasif
(tidak
mengandung calon bunga), bantalan bertunas dan daun. Sampel diambil dari
Kebun Rajamandala, Bandung, milik PT Perkebunan Nusantara VIII Jawa Barat.
Setelah diambil dari pohonnya, sampel berbagai jaringan tanaman kakao
langsung dimasukkan dengan segera ke dalam nitrogen cair dan selama
perjalanan ke Belanda sampel disimpan dalam dry ice, untuk selanjutnya
disimpan pada suhu -80
o
C sampai dengan saat digunakan. Isolasi RNA,
perancangan primer, sintesis first-strand cDNA dan RT-PCR dilakukan di Plant
Research International, Wageningen, Belanda.
95
Isolasi RNA dari berbagai Jaringan Tanaman Kakao
Bahan kimia yang digunakan meliputi : bufer ekstraksi (100 mM Tris-Cl
pH 8.2; 1.4 M NaCl; 20 mM EDTA pH 8; 2% CTAB), nitrogen cair, PVPP, 10 M
LiCl, 3 M Na-asetat (pH 5.2), 2-merkaptoetanol, MilliQ grade water (MQ), etanol
absolut, etanol 70%, fenol (water saturated), kloroform : isoamil alkohol (24:1).
Prosedur yang digunakan adalah dari Asif et al. (2000), yang telah
dimodifikasi oleh Chaidamsari (2005) sebagai berikut : Satu gram jaringan
sampel digerus sampai halus dalam nitrogen cair dengan ditambah 1% PVPP.
Selanjutnya ditambahkan 15 ml bufer ekstraksi hangat (65 °C) ke dalam jaringan
beku dan 15 µl 2-merkaptoetanol kemudian diblender (dengan waring blender)
selama 30 detik. Homogenat dimasukkan ke dalam tabung sentrifus bersih
berukuran 30 ml kemudian diinkubasi pada 65 °C selama 1 jam dengan divorteks
pelan setiap 15 menit. Tabung didinginkan pada suhu kamar, kemudian ditambah
kloroform : isoamil alkohol (24:1) dengan volume yang sama dan dikocok hingga
kedua lapisan membentuk emulsi, sesekali tutup tabung dibuka pelan untuk
mengurangi kelebihan tekanan udara di dalamnya. Setelah sentrifugasi dengan
kecepatan 14.000 rpm pada suhu kamar selama 15 menit (BECKMAN Model
J2-21M, Rotor JA-20), larutan air (lapisan atas) diekstraksi ulang dengan
1 volume fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1), kemudian diulangi lagi
dengan 1 volume kloroform : isoamil alkohol (24:1). Lapisan atas dipindahkan ke
dalam tabung baru, kemudian ditambah 10 M LiCl hingga konsentrasi akhirnya
3 M dan RNA dibiarkan mengendap pada 4 °C selama semalam.
Setelah sentrifugasi 17.000 rpm pada 4 °C selama 20 menit, endapan
RNA dilarutkan dalam 500 µl MQ dan kemudian diekstraksi berturut-turut dengan
1 volume aqua fenol (pH 8), 1 volume fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1),
dan 1 volume kloroform : isoamil alkohol (24:1) masing-masing dengan
96
kecepatan 14.000 rpm pada 4 °C selama 15 menit. Setelah dipindahkan ke
tabung baru, lapisan air dicampur dengan 1/30 volume 3 M Na-asetat pH 5.2 dan
1/10 volume etanol absolut, kemudian disimpan di es selama 30 menit dan
selanjutnya disentrifus dengan microfuge (Hettich, Universal 16 R Microcentrifuge) pada 4 °C selama 25 menit dengan kecepatan 14.000 rpm. Tahap ini
secara efektif dapat menghilangkan polisakarida tanpa kehilangan secara berarti
RNA. Tahap ini bisa diulangi apabila masalah kontaminasi polisakarida (endapan
putih seperti jeli) masih ada. Setelah dipindahkan ke dalam tabung mikro baru
bebas RNase, supernatan dicampur dengan 1/10 volume 3 M Na-asetat pH 5.2
dan 3 volume etanol absolut, kemudian diinkubasi pada -70 °C selama 3 jam.
Setelah sentrifugasi pada microfuge dengan kecepatan 14.000 rpm pada 4 °C
selama 20 menit, endapan RNA dicuci dengan 70% etanol dingin, dikeringkan
dengan SpeedVac dan dilarutkan dalam 50 µl MQ. Selanjutnya diuji kuantitasnya
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 230, 260 dan 280 nm, serta
elektroforesis gel agarose 1%.
Perancangan Primer Homologous Spesifik AP1
Primer
homologous
spesifik
AP1
kakao
dirancang
sepanjang
20 nukleotida berdasarkan daerah homologi (conserved region) pada hasil
alignment sekuen AP1 kakao dengan program ClustalW. Berdasarkan hasil
alignment tersebut dapat ditentukan primer AP1 forward dan reverse.
Sintesis First-Strand cDNA dan RT-PCR
Prosedur yang digunakan adalah Enhanced Avian HS RT-PCR Kit (OneStep RT-PCR Reaction) dari SIGMA, dengan sedikit modifikasi pada PCR mix
dan program PCR nya. Volume PCR mix yang digunakan adalah 25 µl, terdiri
atas : 16 µl water atau reagen PCR, 2.5 µl 10x buffer PCR, 1.5 µl MgCl2 25 mM,
97
0.5 µl deoxyribonucleotide mix, 0.5 µl inhibitor RNase, 1 µl RNA template (~RNA
1.000 ng/µl), 1 µl primer AP1 forward 10 p mol/µl, 1 µl primer AP1 reverse 10 p
mol/µl, 0.5 µl eAMV-RT, 0.5 µl JumpStart AccuTaq. Program PCR nya sebagai
berikut : pre-PCR 45 °C selama 1 menit, first-strand synthesis pada 45 °C
selama 50 menit, initial denaturation 94 °C selama 2 menit, dilanjutkan dengan
denaturation 94 °C 20 detik, annealing 50 °C 30 detik, dan extension 70 °C
1 menit sebanyak 39 siklus, serta final extension 70 °C selama 5 menit. Hasil
PCR kemudian diperiksa dengan gel agarose 1%. Untuk memperbanyak stok
DNA hasil PCR dapat diamplifikasi lagi menggunakan primer AP1 forward dan
AP1 reverse dengan program PCR sebagai berikut : initial denaturation 94 °C
selama 2 menit, dilanjutkan dengan denaturation 94 °C 20 detik, annealing 50 °C
30 detik, dan extension 70 °C 1 menit sebanyak 39 siklus, serta final extension
70 °C selama 5 menit.
Sebagai kontrol (pembanding), diload total RNA dari berbagai jaringan
tanaman kakao dengan konsentrasi yang sama (dalam hal ini masing-masing
jaringan digunakan 1.000 ng RNA total).
Hasil dan Pembahasan
Isolasi AP1 dari berbagai Jaringan Tanaman Kakao
Mempelajari pembungaan pada tanaman kakao secara ilmiah sangat
menarik karena mempunyai karakteristik morfologi yang khas. Kakao merupakan
pohon dengan infloresen cauliflora, dimana sebagian besar bunganya muncul
secara berulang dari bantalan bunga yang sama pada setiap kali berbunga. Hal
ini menimbulkan pertanyaan apakah gen-gen yang terlibat dalam pembungaan
kakao tersebut diekspresikan secara konstitutif atau hanya diekspresikan pada
98
saat berbunga. Pertanyaan tersebut dapat dijawab dengan melihat pola ekspresi
gen pembungaan, misalnya dengan menggunakan teknik RT-PCR. Untuk
kepentingan tersebut diperlukan RNA total dengan kualitas yang baik dari
berbagai jaringan tanaman kakao. Namun demikian, isolasi RNA total dengan
kualitas yang baik sangat sulit dikarenakan jaringan tanaman kakao mempunyai
kandungan metabolit seperti lendir dan senyawa polifenol yang tinggi.
Hasil isolasi RNA dari berbagai jaringan tanaman kakao ditampilkan pada
Gambar 24, sedangkan kualitas dan kandungan RNA dari masing-masing
sampel tertera pada Lampiran 9. Gambar 24 memperlihatkan bahwa RNA total
dari berbagai jaringan tanaman kakao telah berhasil diisolasi dan RNA yang
dihasilkan tersebut mempunyai integritas yang baik yang ditunjukkan oleh
adanya dua pita yang kuat dari ribosomal RNA dalam elektroforesis. Lampiran 9
menunjukkan bahwa masing-masing sampel mempunyai kualitas RNA yang
sangat baik, dengan nilai rasio A260/A280 berkisar antara 1.97-2.09 dan rasio
A260/A230 berkisar antara 2.29-2.40. Kualitas RNA yang baik dari berbagai
jaringan tersebut menunjukkan bahwa prosedur yang digunakan selain telah
berhasil untuk mengisolasi RNA dari bunga sebagaimana pada percobaan
sebelumnya, juga dapat digunakan untuk mengisolasi RNA dari berbagai
jaringan lainnya.
M
1
2
3
4
5
Gambar 24 Hasil elektroforesis RNA total dari berbagai jaringan tanaman
kakao. Lini 1 = bunga, 2 = daun, 3 = bantalan bunga aktif,
4 = bantalan bunga pasif, 5 = bantalan bertunas,
M = 1 kb plus.
99
Keberhasilan dalam isolasi RNA dari jaringan bunga kakao pada
percobaan sebelumnya sangat menentukan terhadap keberhasilan dalam
percobaan uji ekspresi ini. Karena uji ekspresi ini dilakukan pada berbagai
jaringan tanaman kakao, sehingga diperlukan RNA template yang berasal dari
berbagai jaringan juga. Disamping itu dengan digunakannya teknik RT-PCR
dalam uji ekspres ini, walaupun hanya diperlukan RNA template dalam jumlah
yang sangat kecil tetapi kualitasnya harus tinggi. Berdasarkan data pada
Lampiran 9, dimana RNA yang dihasilkan dari semua sampel mempunyai nilai
rasio A260/A280 dan A260/A230 yang tinggi, maka menunjukkan bahwa RNA
tersebut mempunyai kualitas yang tinggi. Tingginya nilai rasio A260/A280 dan
A260/A230 menunjukkan bahwa RNA tersebut terbebas dari kontaminan protein
dan polisakarida atau polifenol, sehingga dapat digunakan sebagai template
pada reaksi selanjutnya.
Primer homologous spesifik AP1 kakao didesain sepanjang 20 nukleotida
berdasarkan daerah conserved pada hasil alignment beberapa sekuen AP1
kakao dengan program ClustalW. Berdasarkan hasil alignment tersebut dapat
ditentukan primer AP1 forward : 5’-ATGGGAAGAGGTAGGGTTCA-3’ dan AP1
reverse : 5’-CTTCTCCCATGTAGTGCCTG-3’, yang selanjutnya digunakan
dalam tahapan reaksi RT-PCR. Lokasi primer AP1 forward dan AP1 reverse
pada sekuen full-length AP1 dapat dilihat pada Lampiran 10.
Ekspresi AP1 pada berbagai Jaringan Tanaman Kakao
Pola ekspresi gen AP1 pada berbagai jaringan tanaman kakao dapat
dijelaskan dengan reaksi RT-PCR menggunakan primer homologous spesifik
AP1 kakao. RNA template diisolasi dari berbagai jaringan tanaman kakao, yaitu
jaringan bunga, bantalan bunga aktif, bantalan bunga pasif, bantalan bertunas
100
dan daun. Reaksi RT-PCR dilakukan dengan menggunakan protocol Enhanced
Avian HS RT-PCR Kit (One-Step RT-PCR Reaction) dari SIGMA, dengan diawali
sintesis first-strand cDNA menggunakan primer spesifik (AP1 forward dan AP1
reverse). Sebagai kontrol (pembanding), diload RNA total dari masing-masing
jaringan dalam jumlah yang sama, 1.000 ng. Dalam jumlah yang sama tersebut,
RNA total dari masing-masing jaringan ternyata menghasilkan pita dengan
ketebalan yang sama (Gambar 25, panel A). Namun demikian dari hasil RT-PCR
dengan primer spesifik, AP1 ternyata diekspresikan secara tidak sama dalam
setiap jaringan tanaman kakao (Gambar 25, panel B).
A
1000 pb
500 pb
1 kb-M
1
2
3
4
5
B
600 pb
400 pb
200 pb
Smart
Ladder
1
2
3
4
5
Gambar 25 Ekspresi AP1 pada berbagai jaringan tanaman kakao.
RNA total sebagai kontrol (A) dan hasil RT-PCR (B).
Lini 1 = jaringan bunga kakao, 2 = bantalan bunga aktif,
3 = bantalan bunga pasif, 4 = bantalan bertunas,
5 = daun.
101
Pada berbagai jaringan tanaman kakao tersebut, AP1 diekspresikan
secara diferensial dimana ekspresi paling kuat terjadi pada jaringan bunga,
kemudian disusul oleh bantalan bunga aktif (bantalan yang mengandung calon
bunga) dan bantalan bunga pasif (bantalan yang tidak mengandung calon
bunga). Pada bantalan bertunas dan daun, AP1 tidak terekspresi. Kuatnya
ekspresi pada jaringan kuncup bunga tersebut diduga bahwa selain sebagai
penanda meristem bunga peranan utama gen AP1 pada tanaman kakao
kemungkinan adalah dalam pembentukan organ bunga. Hal ini sesuai dengan
hasil pengujian Chaidamsari (2005), yang menyatakan bahwa ekspresi AP1
terjadi dengan tingkat yang rendah pada bantalan bertunas dan bantalan pasif,
dan semakin meningkat ekspresinya pada bantalan aktif, kuncup bunga, sepal
dan petal. Ekspresi AP1 juga terjadi pada ovary kakao, sedangkan pada daun
tidak terjadi ekspresi. Hasil tersebut memperkuat dugaan bahwa AP1 pada kakao
juga berperanan sebagai pengatur pembentukan organ bunga terutama sepal
dan petal, sebagaimana peranannya pada berbagai spesies lain.
Pada Arabidopsis, gen MADS-box AP1 merupakan gen kelas A dari
model gen ABC yang merespon perkembangan sepal dan petal. Fungsi gen
tersebut pada awal stadia perkembangan adalah menentukan penanda meristem
bunga dan pembentukan bunga. Pada kebanyakan tanaman tingkat tinggi, organ
bunga tersusun dalam empat whorl berbeda, yang berturut-turut berisi sepal,
petal, stamen dan carpel. Spesifikasi penanda organ bunga tersebut telah
dijelaskan dengan model gen ABC (Davies et al. 1999). Ekspresi gen kelas A
spesifik dalam pembentukan sepal pada whorl 1. Kombinasi gen kelas A dan B
spesifik dalam pembentukan petal pada whorl 2. Kelas B dan C spesifik dalam
pembentukan stamen pada whorl 3. Ekspresi gen kelas C saja akan menentukan
pembentukan carpel pada whorl 4. Kuatnya ekspresi AP1 pada sepal dan petal
dari bunga kakao (Chaidamsari 2005), menunjukkan bahwa gen TcAP1 yang
102
telah berhasil diisolasi tersebut termasuk dalam tipe gen kelas A, yang berfungsi
dalam pembentukan sepal dan petal.
Domain MADS merupakan daerah dimerisasi atau DNA-binding yang
sangat conserved yang terdapat sebagai faktor transkripsi. Gen MADS-box
menggambarkan keluarga besar multi gen yang terdapat pada vascular tanaman.
Pada angiosperm, sebagian besar keluarga gen MADS-box terlibat dalam
berbagai tahap perkembangan bunga dan memegang peranan kunci dalam
penentuan meristem bunga dan penanda organ (Riechmann dan Meyerowitz
1997). Pada Arabidopsis, paling tidak terdapat dua gen, APETALA1 dan LEAFY
yang diperlukan untuk transisi dari meristem vegetatif menjadi meristem bunga.
Gen AP1 telah diklon dan memperlihatkan peranannya dalam mengkode putative
faktor transkripsi yang mengandung domain MADS. RNA AP1 diekspresikan
secara seragam pada primordia bunga muda, dan selanjutnya menjadi terlokalisir
pada sepal dan petal. Analisis secara detail dari gen AP1 dalam meristem bunga
menunjukkan bahwa ekspresi gen tersebut terdeteksi pada stadia yang sangat
awal dari perkembangan meristem dan dilanjutkan pada stadia akhir dalam whorl
terluar. Hasil tersebut menunjukkan bahwa AP1 bertindak secara lokal untuk
spesifikasi penanda meristem bunga dan menentukan perkembangan sepal dan
petal (Mandel et al. 1992; Sawa et al. 1999).
Kelompok gen MADS-box mengkode faktor transkripsi yang terlibat dalam
fungsi biologis yang berbeda pada eukaryot (Riechmann dan Meyerowitz 1997).
Pada tanaman gen tersebut memainkan peranan sentral dalam perkembangan
bunga dan buah (Weigel 1995). Gen MADS-box yang lain diekspresikan pada
jaringan vegetatif, ovul dan embryo, menunjukkan bahwa kelompok gen tersebut
mempunyai peranan yang berbeda selama perkembangan tanaman (Rounsley
et al. 1995). Penemuan tersebut telah mendukung model gen ABC (AP1, AP3/PI
dan AG), yang secara luas mempunyai spesifikasi dalam perkembangan bunga
103
dan buah. Bahkan beberapa gen kelas A juga diekspresikan pada daun dan
batang (Rounsley et al. 1995; Alvarez-Buylla et al. 2000). Hasil penelitian van der
Linden et al. (2002) juga menunjukkan bahwa fungsi anggota keluarga gen
MADS-box tidak terbatas pada perkembangan organ bunga. Gen MADS-box
telah dijelaskan peranannya dalam inisiasi pembungaan dan penentuan
penanda meristem (Weigel 1995), perkembangan embryonik (Perry et al. 1999),
pembentukan akar (Alvarez-Buylla et al. 2000), perkembangan jaringan vascular
dan pembentukan biji dan buah (Buchner dan Boutin 1998; Gu et al. 1998;
Liljegren et al. 1998).
Dengan demikian, satu gen MADS-box dapat mempunyai fungsi yang
berbeda pada stadia perkembangan yang berbeda. Gen MdMADS2 apel yang
homolog dengan AP1 Arabidopsis misalnya, selain terekspresi pada meristem
infloresen juga berperanan pada semua stadia perkembangan bunga (Sung et al.
1999). Demikian juga gen MdMADS12 apel yang mempunyai homologi tinggi
terhadap group AP1 dari gen MADS-box, diekspresikan pada jaringan bunga
sebagaimana pada tunas dan daun dari pohon dewasa yang berbunga, pohon
dewasa yang tidak berbunga dan pohon juvenile, dengan tingkat ekspresi yang
paling tinggi terjadi pada daun, sedangkan pada batang tidak terekspresi (van
der Linden et al. 2002). Variasi ekspresi AP1 juga terjadi dalam hasil penelitian
ini, dimana level ekspresi paling kuat terjadi pada bunga kakao, sedangkan pada
bantalan bunga aktif dan bantalan bunga pasif secara berturut-turut ekspresinya
semakin berkurang. Sementara pada bantalan bertunas dan daun kakao AP1
tidak terekspresi.
Analisis filogenetik dari TcAP1 dan sekuen protein AP1 lainnya secara
jelas menempatkan TcAP1 ke dalam cluster AP1 daripada ke dalam cluster FUL
Arabidopsis atau FBP29 Petunia. Masuknya TcAP1 sebagai penanda AP1 sejati
lebih didukung oleh pola ekspresinya pada bunga, dimana TcAP1 diekspresikan
104
sebagai gen kelas A yang mengatur dua whorl terluar yang membentuk sepal
dan petal (Chaidamsari 2005). Pentingnya gen MADS-box di dalam menentukan
penanda organ bunga dicerminkan oleh konservasi fungsinya yang kuat ketika
mengalami evolusi dan kemampuan interaksinya dengan faktor transkripsi lain
dari keluarga MADS serta kemampuan ekspresi ektopiknya pada Arabidopsis
sehingga menghasilkan fenotipe yang sama (Pena et al. 2001; Kotoda et al.
2002; Benedito et al. 2004). Terekspresinya TcAP1 pada bunga dan bantalan
bunga kakao, tetapi tidak terekspresi pada jaringan daun, menunjukkan bahwa
TcAP1 tersebut terlibat dalam mengatur pembungaan kakao, yaitu pada stadia
awal perkembangan meristem bunga dan pada pembentukan organ sepal dan
petal dari bunga kakao.
Kesimpulan
Gen AP1 dierkspresikan secara diferensial pada berbagai jaringan
tanaman kakao, dimana ekspresi terkuat terjadi pada jaringan bunga, kemudian
bantalan aktif dan bantalan pasif, sementara pada bantalan bertunas dan daun
tidak terekspresi. Terdapatnya ekspresi AP1 pada level yang tinggi dalam
jaringan kuncup bunga kakao, menandakan bahwa selain terlibat dalam transisi
dari perkembangan vegetatif menuju reproduktif, gen AP1 juga berperanan
penting dalam pembentukan organ bunga.