20 BAB III BAHAN DAN METODE 3.1Waktu dan Tempat Penelitian

BAB III
BAHAN DAN METODE
3.1Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei hingga Nopember 2013.
Pengambilan sampel air laut dan sedimen di Pantai Karangsong, Kabupaten
Indramayu Jawa Barat. Penelitian utama dilakukan di Laboratorium Bioteknologi
Perikanan dan Kelautan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Pengukuran bobot
minyak dilakukan di Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Imu Pengetahuan
Alam Universitas Padjadjaran. Pengidentifikasian bakteri dengan uji biokimia
dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati
Institut Teknologi Bandung.
3.2 Alat dan Bahan
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi:
1.
Botol sampel steril dan plastik sampel untuk menyimpan sampel saat
kegiatan sampling
2.
Labu Erlenmeyer (Pyrex) ukuran 250 mL sebagai alat untuk menempatkan
media kultivasi (Agar) ataupun tempat kultivasi cair
3.
Gelas ukur (Iwaki) ukuran 5 ml, 10 ml, dan 100 ml sebagai alat untuk
mengukur volume bahan cair (medium atau reagent)
4.
Tabung reaksi sebagai wadah pengenceran atau pembiakan (kultivasi)
bakteri dalam media agar miring
5.
Rak tabung reaksi untuk menyimpan tabung reaksi
6.
Vortex mixer (Health H-VM-300) untuk menghomogenkan suspensi pada
awal kultivasi
7.
Timbangan analitik (Precisa Gravimetrics ketelitian 0,1 mg) untuk
menimbang medium dan sampel yang digunakan.
8.
Hot plate with magnetic stirer (Lab companion-speed 1000 rpm) untuk
memanaskan dan menghomogenkan medium agar
9.
Laminar flow cabinet sebagai ruang kerja aseptis dalam isolasi bakteri.
20
21
10.
Pipet untuk mengambil suspensi atau bahan cair dalam ukuran mililiter (ml)
11.
Mikropipet (Eppendorf) ukuran 10-100 μL dan 100-1000 μL untuk
mengambil suspensi atau bahan cair dalam ukuran mikroLiter (μL)
12.
Cawan petri sebagai tempat pembiakan (kultivasi) bakteri
13.
Jarum ose sebagai alat untuk memindahkan biakan mikroorganisme dalam
proses kultivasi
14.
L glass untuk meratakan suspensi bakteri.
15.
Bunsen sebagai alat bantu aseptisasi ruang kerja dan sterilisasi jarum ose
pada kegiatan kultivasi bakteri
16.
Autoclave sterilizer (Al american power/220V) untuk melakukan sterilisasi
alat dan medium
17.
General purpose incubator (Sheldon manufacturing inc.) untuk membiakkan
(inkubasi) mikroorganisme selama proses kultivasi.
18.
Incubator shaker (Zhicheng tipe ZHWY-1102C) untuk membiakkan bakteri
dalam medium cair
19.
Spektrofotometer (Thermo scientific model genesys 10uv) merupakan alat
untuk menghitung kepadatan bakteri berdasarkan karakteristik nilai
absorbansi
20.
Corong pisah sebagai alat untuk mengekstrasi isolat bakteri
21.
Rotari evaporator (Heidolph) untuk mengekstrasi pelarut dan minyak
22.
Desikator untuk menguapkan dan mendinginkan alat
23.
Kertas label untuk memberi label pada setiap alat yang digunakan
24.
Pengaduk kaca untuk mengaduk larutan
25.
Termometer skala 0°C-100°C ketelitian 0,1°C untuk mengukur suhu air
saat kegiatan sampling
26.
Kertas lakmus untuk mengukur pH medium
27.
Plastik wrap untuk merapatkan bagian pinggir cawan petri
28.
Alumunium foil sebagai alas timbangan saat menimbang medium
29.
Plastik untuk membungkus alat saat sterilisasi ataupun saat penyimpanan
30.
Kertas untuk membungkus alat yang digunakan saat sterilisasi ataupun saat
penyimpanan
22
31.
Mikroskop untuk mengamati koloni dan morfologi bakteri
32.
Kamera digital untuk dokumentasi kegiatan dan kondisi lingkungan saat
sampling
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi :
1.
Sampel Air Laut dan Sedimen yang pernah tercemar minyak bumi dari
Pantai Karangsong
2.
Crude Oil asal Pertamina UP VI Balongan sebagai sumber hidrokarbon
3.
Akuades atau air laut
4.
Reagen pewarna Gram (Karbol Gentian Violet, Lugol, dan Air Fuchsin)
5.
Media Stone Mineral Salt Solution + Ekstrak Ragi (SMSSe)
6.
Media SMSSe padat
7.
NaCl Fisiologis
8.
Natrium Nitrit 1%
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode observasi di laboratorium. Alur
penelitiannya yaitu dimulai dengan sterilisasi alat, penyiapan media, sampling
bakteri indigenous dari air laut dan sedimen yang pernah tercemar minyak bumi
asal Pantai Karangsong lalu dibawa ke laboratorium Bioteknologi Perikanan dan
Kelautan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran,
selanjutnya dilakukan isolasi bakteri penghasil biosurfaktan sampai didapat isolat
murni, lalu dilakukan uji emulsifikasi terhadap isolat murni tersebut. Isolat murni
penghasil biosurfaktan tertinggi selanjutnya diuji biodegradasi hidrokarbon.
Setelah diuji kemampuan menghasilkan biosurfaktan dan mendegradasi
hidrokarbon, isolat murni tersebut diidentifikasi jenisnya dengan uji biokimia.
23
3.4 Prosedur Penelitian
Diagram alir prosedur penelitian disajikan pada Gambar 1 di bawah ini.
Gambar 1. Diagram Alir Prosedur Penelitian
24
3.4.1 Sterilisasi Alat
Alat-alat yang akan digunakan dicuci terlebih dahulu dan dikeringkan.
Alat kemudian dibungkus dengan kertas pembungkus setelah itu dilakukan
sterilisasi basah atau uap dengan autoklaf dilakukan dengan memasukkan alat atau
medium yang akan disterilisasi ke dalam plastik tahan panas, selanjutnya
memasukkan alat yang sudah terbungkus tersebut ke dalam autoclave hingga suhu
121°C yang dipertahankan selama 15 menit pada tekanan 1 atm.
3.4.2 Penyiapan Media
a.
Media Stone Mineral Salt Solution + Ekstrak Ragi (SMSSe)
Media yang digunakan dalam isolasi, fermentasi bakteri penghasil
biosurfaktan dan uji biodegradasi hidrokarbon adalah dengan media SMSSe.
Untuk membuat media SMSSe padat ditambahkan bacto agar sebanyak 15
gram/liter aquadest. Komposisi media SMSSe dapat dilihat di Lampiran 4.
Penambahan bacto agar bertujuan agar media SMSSe dapat menjadi padat.
Masing-masing media yang telah disiapkan disterilisasi menggunakan
autoclave pada 121° C dengan tekanan 1 atm dan dipertahankan selama 15 menit.
3.4.3 Pengambilan Sampel Air dan Sedimen
Sampel yang diambil adalah air laut dan sedimen dari Pantai Karangsong
Kabupaten Indramayu Jawa Barat yang pernah terkena tumpahan minyak bumi.
Sampel air laut dan sedimen masing-masing diambil dari 4 titik yang berbeda di
pinggir pantai tanpa ulangan. Sampel air laut diambil cara memegang botol steril
bagian bawah dan mencelupkan botol steril 20 cm di bawah permukaan air
dengan posisi botol berlawanan dengan arah aliran (Lampiran 1).
Sedangkan untuk sampel sedimen diambil dari permukaan dasar perairan
dengan menggunakan grab sampler. Sampel air laut dan sedimen tersebut
dimasukkan ke dalam botol sampel steril dan diberi label serta disimpan dalam
kondisi dingin dalam cool box untuk menghindari terjadinya degradasi jumlah
bakteri bahkan kematian bakteri pada sampel. Setelah itu sampel segera
25
diperlakukan dengan tenggang waktu tidak lebih dari 24 jam, meliputi tahap
pengenceran sampai pengisolasian.
3.4.4
Isolasi Bakteri Penghasil Biosurfaktan
3.4.4.1 Pengenceran Sampel dan Isolasi Bakteri
Isolasi bakteri dari sampel air laut dan sedimen dilakukan dengan teknik
pengenceran bertingkat, yaitu sebanyak 1 ml air laut dan 1 gram sedimen
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berbeda yang masing-masing telah
ditambahkan 9 mL larutan NaCI fisiologis, vortex sebentar agar suspensi
homogen. Selanjutnya, sebanyak 1 mL suspensi diambil dari tabung pertama
kemudian dimasukkan ke dalam tabung pengencer pertama yang berisi 9 mL
NaCl fisiologis secara aseptis, setelah tabung pengencer kedua divorteks, 1 mL
suspensi dimasukkan ke dalam tabung pengencer kedua, begitu seterusnya hingga
pengenceran ketujuh. Teknik pengenceran bertingkat dapat dilihat pada Gambar 2
di bawah ini.
Gambar 2. Teknik Pengenceran Bertingkat
Masing-masing suspensi bakteri dari tabung pengenceran 10-5, 10-6 dan l0-7
diinokulasikan ke dalam media SMSSe + bacto agar dengan metode pour plate
sebanyak 0,1 ml. Setelah itu diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Bakteri
yang tumbuh dimurnikan lagi berdasarkan karakteristik morfologi yang sama
dengan teknik goresan pada media SMSSe + bacto agar sehingga didapatkan
26
koloni tunggal. Isolat-isolat murni yang didapat disimpan atau dipelihara pada
agar miring SMSSe + bacto agar dan diletakkan dalam refrigerator sebagai stok.
3.4.4.2 Karakterisasi Bakteri Penghasil Biosurfaktan
Masing-masing biakan murni diamati karakterisasi keragaman bakteri
meliputi morfologi koloni berupa ukuran, warna, bentuk, tepian, kenaikan
permukaan. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam waktu inkubasi. Selanjutnya,
dilakukan pengamatan bentuk dan warna sel bakteri dengan teknik pewarnaan
Gram (Lampiran 6). Pengamatan morfologi bakteri ini untuk melihat kemurniaan
bakteri yang telah diisolasi.
3.4.4.3 Penyiapan Inokulum untuk Prekultur
Inokulum untuk fermentasi dipersiapkan untuk melakukan uji emulsifikasi
dengan mengambil 1 ose isolat murni dari media SMSSe + bacto agar yang
ditumbuhkan pada 50 ml media SMSSe. Kultur diinkubasi dengan incubator
shaker pada suhu kamar kecepatan 200 rpm selama 3 hari. Setelah hari ke 3,
kemudian dihitung populasi sel bakteri sampai mencapai populasi 106 sel/ml
(Tabatabaee et al. 2005).
3.4.4.4 Fermentasi untuk Persiapan Uji Emulsifikasi
Prekultur yang telah dipersiapkan dipindahkan 1 ml (populasi 106) secara
aseptis ke dalam Erlenmeyer 250 ml yang telah berisi 50 ml larutan SMSSe
Selanjutnya diinkubasi dengan menggunakan incubator shaker pada temperatur
kamar dan kecepatan 200 rpm selama 3 hari. Bakteri yang berpotensi
menghasilkan biosurfaktan ditandai dengan terbentuknya busa (foam) pada larutan
fermentasi. (Tabatabaee et al. 2005). Kultur hasil fermentasi ini selanjutnya
digunakan untuk uji emulsifikasi.
27
3.4.5
Biodegradasi Total Petroleum Hydrocarbon
3.4.5.1 Peremajaan Bakteri
Tiga biakan murni bakteri terbaik dalam menghasilkan biosurfaktan di
media agar miring ditumbuhkan kembali di medium SMSSe padat dengan cara
menginokulasikan 1 ose biakan bakteri dari masing-masing biakan murni ke
dalam media di wadah cawan petri. Kultur diinkubasi selama 1-2 hari pada suhu
30°C.
3.4.5.2 Penyediaan Inokulum Biodegradasi
Bakteri pada SMSSe padat diinokulasikan ke dalam erlenmeyer 250 ml
berisi 100 ml SMSSe yang telah disterilisasi sebanyak 2-3 ose. Ke dalam media
ini ditambahkan minyak mentah sebanyak 0.1 % v/v sebagai sumber karbon.
Erlenmeyer diaduk selama 24 jam dengan rotari shaker pada temperatur ruangan
dengan kecepatan 120 rpm untuk menjaga agar proses berlangsung secara aerob.
3.4.5.3 Uji BiodegradasiTotal Petroleum Hydrocarbon
Dari setiap inokulum biodegradasi dalam media SMSSe diinokulasikan ke
dalam media SMSSe baru sebanyak 10 % v/v dan ke dalam media SMSSe cair
baru 100 ml ditambahkan 1 % v/v minyak mentah secara aseptik lalu diinkubasi
selama 4 hari (Diswanto dan Kardena 2010). Kultur bakteri dibuat duplo untuk
pembuatan kurva pertumbuhan bakteri dan uji biodegradasi bakteri.
3.4.5.4 Perhitungan Jumlah Koloni Bakteri
Jumlah koloni bakteri pendegradasi hidrokarbon dihitung dengan cara
mengambil 1 ml medium biodegradasi yang telah ditumbuhi bakteri setiap 12 jam
sekali selama 3 hari, kemudian dilakukan pengenceran bakteri dari 10-1 sampai 109
. Dari tiga pengenceran terakhir diinokulasikan ke dalam medium SMSSe padat
lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30°C dengan menggunakan metode pour
plate, kemudian dihitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh.Hasil penghitungan
bakteri dinyatakan dalam satuan Colony Forming Unit (CFU)/ml.
28
3.4.5.5 Pengukuran Kadar Minyak Bumi (TPH)
Pengukuran kadar minyak bumi didasarkan pada kelarutannya dalam
pengekstrak heksan atau kloroform. Setelah ekstraksi, pelarut diuapkan dan bobot
minyak mentah ditentukan dengan metode gravimetri berdasarkan SNI 06
6989.10-2004 (Lampiran 9), selain itu dihitung pula persentase biodegradasi
minyak mentah oleh bakteri.
Pengamatan proses biodegradasi Total Petroleum Hydrocarbon dilakukan
terhadap setiap kultur pada jam ke 0, 24, 48 dan 72 dengan menginjeksikan 6 tetes
natrium nitrit 1% untuk mematikan bakteri dan melihat persentase biodegradasi
minyak mentah setiap hari (Yani dan Akbar 2009).
3.4.6 Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri dilakukan pada isolat bakteri yang memiliki
kemampuan tertinggi menghasilkan biosurfaktan melalui karakterisasi morfologi
bakteri, pewarnaan Gram, serta aktivitas biokimianya (Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology). Proses identifikasi mikroorganisme dengan uji
biokimia digunakan beranekaragam media. Uji biokimia dilakukan untuk
mengidentifikasi bakteri berdasarkan enzim yang dihasilkannya. Enzim tersebut
terdiri dari enzim ekstraselular dan intraselular. Jenis uji media yang dianalisis
adalah uji hidrolisa pati, hidrolisa kasein, fermentasi laktosa, fermentasi sukrosa,
fermentasi glukosa, fermentasi mannitol, reduksi nitrat, katalase, indol, hidrogen
sulfida, metil merah, Vogus-Proskauer, sitrat, urease dan hidrolisa gelatin.
Komposisi yang digunakan sesuai dengan standar Microbiology Laboratory
Manual (Cappucino dan Sherman 2008). Gambar 3 merupakan uji yang dilakukan
terhadap bakteri target.
29
Gambar 3. Uji Biokimia pada Mikroorganisme
(Sumber: Cappuccino dan Sherman 2008)
3.5 Parameter Pengamatan
3.5.1 Morfologi Koloni Bakteri
Morfologi koloni bakteri diamati berdasarkan ukuran, warna, bentuk,
tepian, dan elevasi koloni bakteri yang tumbuh. Ukuran koloni terdiri dari
pintpoint (seperti titik), kecil, sedang, dan besar. Warna koloni bakteri antara lain
putih, kuning, merah, ungu. Bentuk koloni terdiri dari circular (bulat, bertepi),
irregular (tidak beraturan, bertepi), rhizoid (seperti akar, menyebar). Tepian atau
margin koloni bakteri yaitu entire (rata), lobate (berlekuk), undulate
(bergelombang), serrate (bergerigi), dan filamentous (seperti benang). Elevasi dari
koloni yaitu flat (datar, nyaris rata dengan medium), raised (ketinggian koloni
terlihat, namun rata pada seluruh permukaan), convex (cembung), umbonate
(cembung serta di bagian tengah lebih menonjol). Morfologi koloni bakteri dapat
dilihat pada Gambar 4.
30
Gambar 4. Morfologi Koloni Bakteri
(Sumber: Cappuccino dan Sherman 2008)
3.5.2 Bentuk dan Warna Sel Bakteri
Bentuk sel bakteri dapat dilihat setelah dilakukan proses pewarnaan
Gram.Bentuk sel bakteri terdiri dari bulat (coccus), batang (basil) dan spiral
(spirilia). Bakteri Gram positif ditunjukkan dengan warna ungu dan bakteri Gram
negatif ditunjukkan dengan warna merah. Umur isolat saat dilakukan pewarnaan
antara 24-48 jam.
3.5.3 Uji Emulsifikasi
Uji emulsifikasi dilakukan untuk mengetahui kemampuan biosurfaktan
dalam mengemuisi lapisan lemak. Dalam penelitian ini digunakan crude oil
sebagai substrat lemak yang akan diemulsi. Perbandingan antara kerosene dan
kultur cair adalah 6: 4. Dimasukkan 6 ml crude oil ke dalam tabung reaksi setelah
itu ditambahkan kultur cair 4 ml hasil fermentasi, kemudian divorteks dengan
kecepatan tinggi selama 2 menit. Setelah itu didiamkan selama 24 jam untuk
melihat kestabilan emulsi. Kemudian diukur indeks emulsifikasi dengan
menggunakan rumus Cooper dan Goldenberg (1987). Untuk menghitung indeks
emulsifikasi, digunakan rumus sebagai berikut:
31
3.5.4 Kadar Minyak atau Total Petroleum Hydrocarbon (TPH)
Kadar minyak bumi dalam media dihitung berdasarkan rumus SNI 06
6989.10-2004.
Keterangan:
A = berat labu + ekstrak (mg)
B = berat labu kosong (mg)
3.5.6 Persentase Biodegradasi Minyak Bumi
Untuk menentukan persentase biodegradasi dari minyak bumi yang terjadi
dapat diketahui dengan rumus :
Keterangan: % B
=
persentase biodegradasi
BMo
=
bobot minyak bumi awal (g)
BMn
=
bobot minyak bumi akhir (g)
Sumber: Herdiyantoro (2005)
3.5.7 Total Plate Count(TPC)
Perhitungan jumlah bakteri dilakukan dengan menggunakan metode
Total Plate Count (Cappucino dan Sherman 2008), dihitung dengan rumus
berikut:
(
)
32
Keterangan:
K
: banyak koloni (CFU/ml)
a,b,c
: jumlah koloni bakteri
e,f,g
: faktor pengenceran
3.6 Analisis Data
Data yang diperoleh dari penelitian ini adalah bakteri yang menghasilkan
biosurfaktan melalui uji emulsifikasi yang juga mampu menurunkan kadar Total
Petroleum Hydrocarbon (TPH). Data yang ada kemudian dianalisis secara
deskriptif dan ditampilkan dalam bentuk tabel dan gambar.