teknologi fermentasi

m.K. Dasar Teknologi Mikrobial
TIN 232 2(2-0)
“KEBUTUHAN NUTRISI DAN
PERANCANGAN & PENYIAPAN MEDIA
PERTUMBUHAN MIKROBA”
Departemen Teknologi Industri Pertanian
FATETA IPB
2011
SKEMA PROSES MIKROBIOLOGIS
(FERMENTASI/KULTIVASI)
Proses Hulu
Penyiapan Inokulum
Mikroba
Penyiapan/ formulasi Media
Sterilisasi
Inokulasi
secara
aseptik
Perakitan dan strerilisasi bioreaktor
Proses Hilir
Fermentasi
(Pengontrolan :
suhu, pH, aerasi,
agitasi dan busa)
Pemanenan & Pemurnian
Sampling
Analisis hasil
fermentasi
• Pertumbuhan mikroba memerlukan :
a. Lingkungan fisik (suhu, pH, efek mekanis/agitasi dan Aw)
harus terpenuhi agar mikroba dapat tumbuh
b..Senyawa kimiawi sbg nutrisi (sumber karbon, sumber
nitrogen dll dan O2 terlarut)
Perlu media kultur yang sesuai
(media = nutrien yang dipersiapkan untuk pertumbuhan
mikroba di laboratorium/industri)
• Pemahaman dan pengaturan sumber nutrisi dapat pula
digunakan untuk seleksi, identifikasi dan mempelajari mikroba
spesifik
MEDIA KULTUR
• Kegunaan  Untuk menumbuhkan dan
mengembangbiakkan mikroba, sehingga diperoleh
produk yang diinginkan
• Fungsi utama media :
Sumber energi
Bahan pembangun sel
Akseptor elektron dalam reaksi bioenergetik
(reaksi yang menghasilkan energi)
Syarat Media :
1. Mengandung semua nutrisi yang dibutuhkan :
sumber C, sumber N, garam mineral dan faktor
pertumbuhan (growth factor = nutrien organik esensial
yang tidak diproduksi oleh mikroba, sehingga harus diberi
suplemen, contoh : asam amino, vitamin)
2. Kondisi media harus sesuai dengan sifat fisiologis
mikroba (misalnya suhu, pH, kekentalan media dan
tekanan osmosis)
3. Media harus dalam keadaan steril, sehingga tidak terjadi
kontaminasi oleh mikroba lain
Persamaan reaksi :
C + N + Lain-lain  sel mikroba + produk + CO2 + H2O + panas
Klasifikasi Nutrisional Mikroba :
• Organisme dapat menggunakan sumber energi :
senyawa kimia  kemotrof
cahaya  fototrof
• Organisme dapat menggunakan sumber karbon :
senyawa anorganik (CO2) ototrof (self-feeders)
senyawa organik (gula, protein, lemak)  heterotrof
(tergantung dari bentuk kehidupan lain)
(tabel klasifikasi nutrisional)
Beberapa spesies mikroba tidak mengikuti klasifikasi
nutrisional tsb, contoh : Rhodospirillum rubrum bersifat
fotoheterotrof, tetapi bila ada O2, dapat bersifat kemoheterotrof
Klasifikasi Nutrisional Bakteri & Organisme Lain
Kelp. Nutrisi
Sumber
Energi
Sumber
Karbon
Kemoototrof
Seny.
Anorganik
sederhana
CO2
Kemoheterotrof
Seny.
Organik
Seny
Organik
Fotoototrof
Cahaya
CO2
Fotoheterotrof
Cahaya
Seny
Organik
Contoh
Bakteri nitrifikasi,
hidrogen, besi & sulfur
Kebanyakan bakteri,
fungi, protozoa & hewan
Bakteri sulfur ungu &
hijau, alga,
Cyanobacteri &
tanaman
Bakteri non sulfur ungu
& hijau
 Digunakan secara luas untuk taksonomi bakteri dan khamir
NUTRISI MIKROBA
Nutrisi yg diperlukan sel mikroba terdiri atas :
• Unsur Makro (macronutrients) : unsur C, O, N, H, P, S,
Mg2+ , K+.
 diperlukan pd konsentrasi ≥ 10-4 M.
• Unsur Mikro (micronutrients/trace elements) ;
Mo2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+, Fe2+, Ca2+, Na+, vitamin, hormon
pertumbuhan, dan prekursor
Peran Unsur Makro
Unsur
C
N
H
O
S
P
K
Mg
Fungsi Fisiologis
Konstituen bahan organik sel. Sering sebagai sumber
energi
Konstituen protein, asam nukleat, koenzim
Bahan organik sel dan air
Bahan organik sel dan air. Diperlukan pd respirasi
aerobik.
Konstituen protein dan bbrp koenzim
Konstituen asam nukleat, fosfolipida, nukleotida, dan
bbrp koenzim
Kation anorganik dlm sel, dan kofaktor bbrp enzim
Kofaktor utk banyak enzim dan klorofil. Ada pd dinding
sel dan membran.
Kebutuhan
(M)
>10-2
10-3
10-4
10-4--10-3
10-4--10-3
10-4--10-3
Unsur Mikro
• Kekurangan unsur kelumit (trace elements)
menyebabkan fase lag lebih panjang, menurunkan laju
pertumbuhan spesifik (μ) dan rendemen produk.
• Tiga kategori unsur kelumit:
• Unsur kelumit yg paling banyak diperlukan adalah Fe,
Zn, dan Mn  merupakan kofaktor penting.
• Unsur kelumit yg diperlukan utk pembentukan produkproduk spesifik, adalah Cu, Co, Mo, Ca, Na, Cl, Ni, dan
Se.
• Unsur kelumit yg jarang dibutuhkan, spt B, Al, Si, Cr, V,
Sn, Be, F, Ti, Ga, Ge, Br, Zr, W, Li, I.
•  penggunaan harus diperhatikan karena toksik pd
konsentrasi ≥ 10-4 M.
Sumber Karbon
•
Setelah diuraikan menjadi molekul yang lebih kecil,
sumber karbon digunakan sebagai bahan dasar
sintesis polisakarida, protein, lipida dan asam
nukleat.
 Jenis dan konsentrasi sumber karbon mempengaruhi
pertumbuhan dan pembentukan produk
 umumnya glukosa lebih baik dibandingkan jenis
gula lain
 Bahan penyusun utama sel mikroba (±50 % bobot
kering)
 Jenis sumber karbon :
1. Karbohidrat : bahan yang mengandung pati
(jagung, tapioka, kentang, dll) atau bahan yang
mengandung gula (molase/tetes tebu, whey dll).
2. Minyak tumbuhan (minyak kelapa sawit, minyak
jagung, minyak biji kapas, minyak kedelai, dll).
3. Alkohol dan asam organik sederhana  proses
hilir (pemanenan hasil) lebih sederhana.
4. Metan dan metanol untuk produksi Protein Sel
Tunggal (PST)
5. n-alkana (C12-C18) untuk produksi asam organik,
asam amino, antibiotik, dll.
Dasar pemilihan sumber C (karbon) dalam industri a.l :
- Kemudahan diuraikan oleh mikroba
 semakin sederhana, semakin mudah dikonsumsi
oleh mikroba
- Kemudahan penanganan
 tidak mengandung zat pengotor & siap digunakan
Contoh : gula rafinasi bebas ion logam untuk
produksi asam sitrat  toksik
- Ketersediaan
 mudah diperoleh setiap saat, tidak musiman
- Harga
 pada industri etanol dan PST biaya sumber karbon
sangat besar
SUMBER NITROGEN
 Nitrogen digunakan sebagai bahan dasar untuk
sintesis protein, asam nukleat dan vitamin
 Jenis dan konsentrasi sumber nitrogen
mempengaruhi pertumbuhan dan pembentukan
produk. Contoh produksi antibiotik dihambat oleh
sumber N yang mudah dikonsumsi mikroba
 Jenis sumber N :
1. N anorganik : garam ammonium atau nitrat, gas
amoniak
2. N organik : hidrolisat protein, asam amino, urea,
corn steep liquor, tepung kedelai, tepung ikan,
ekstrak khamir dll
Sumber N dapat mempengaruhi pH kultur penting diketahui
saat pemilihan sumber N, contoh :
Garam ammonium
menurunkan pH,karena ion NH4+ bergabung dengan sel
mikroba dan melepaskan H+
Gas ammoniak (NH3 ) & nitrat
 pH meningkat
Ammonium nitrat
mula-mula menurunkan pH saat ammonia dikonsumsi,
selanjutnya pH meningkat saat nitrat dikonsumsi
Urea
 Mempunyai buffering capacity yang sangat baik
GARAM MINERAL
 Sulfur (dalam bentuk NH4SO4) digunakan sebagai
koenzim, asam amino dan komponen sel lainnya.
 Fosfor (dalam bentuk K2HPO4 dan KH2PO4)
digunakan sebagai bahan asam nukleat, fosfolipida,
ATP dan buffer
 K, Mg, Mn, Fe dan Ca berfungsi sebagai kofaktor
enzim selain untuk pertumbuhan, Fe juga merupakan
bagian dari sitokrom, Ca dipakai dalam pembentukan
spora.
 Unsur Kelumit (trace element) : Co, Mo, Zn dan Cu
merupakan bagian dari enzim tertentu.
Unsur Mikro (mikronutrien/trace elements)
• Beberapa ion : contoh Mg2+, Fe3+, dan PO43-, dapat
mengendap dalam media  diperlukan bahan pengkelat
(chelating agent)
• Bahan pengkelat mempunyai “ligand” (spt gugus karboksil,
amin, mercapto) utk mengikat ion logam  membentuk
senyawa kompleks yg larut dalam air
• Contoh Bahan Pengkelat :
Asam sitrat, EDTA, polifosfat, histidin, tirosin, dan sistein
 Bahan pemula (prekursor) sintesis suatu senyawa,
karena tidak dapat disintesis oleh mikroba sendiri,
contohnya :
- purin atau pirimidin untuk sintesis asam nukleat
- -alanin untuk sintesis asam pantotenat
 Vitamin, contohnya :
- biotin untuk produksi MSG
- Ca-pantotenat untuk produksi cuka
 Induser untuk produksi enzim, contoh :
- pati pada produksi α-amilase
- berbagai protein pada produksi protease
Anti Busa
 Kebanyakan proses mikrobiologis menghasilkan busa yang
umumnya diakibatkan oleh protein yang terdenaturasi pada
antarmuka udara-cairan fermentasi
 Terjadinya busa dapat menyebabkan sel terlempar dari media
 otolisis yang melepaskan protein
 Cara mengatasi : - alat pemecah busa atau
- Melakukan pemurnian parsial nutrien kompleks dan
memodifikasi parameter fisik (pH, suhu, aerasi dan
agitasi) untuk pembentukan busa oleh komponen
media  aplikasi terbatas
- Busa tidak dapat dicegah, sehingga diperlukan
senyawa antibusa (silikon, asam lemak & turunannya,
poli propilen glikol, sulfonat dll)  kelemahan :
menurunkan laju transfer oksigen, shg hrs digunakan minimal
METODE PREPARASI MEDIA
• Media yang dibeli dalam bentuk komersil, misalnya
nutrient agar, nutrient broth
 biasanya resepnya tertulis di kemasan.
Tinggal mengikuti resep tersebut
• Jika dalam media terdapat sumber nitrogen/ protein,
maka saat sterilisasi, pisahkan antara sumber
karbon dengan nitrogen karena dapat
menyebabkan reaksi browning (pencoklatan)
 sumber C tidak dapat digunakan lagi oleh m.o
• Jika berupa pati, maka konsentrasinya maksimal
2% karena dapat menggumpal jika dipanaskan.
BAHAN DASAR MEDIA PERTUMBUHAN
BAKTERI
Nutrient agar :
- beef extract
- pepton
- agar
- air
3g
5g
15 g
1000 g
Nutrient broth:
- beef extract
- pepton
- air
3g
5g
1000 g
Agar miring
(media padat)
Propagasi
(media cair)
BENTUK KOMPOSISI & JENIS MEDIA
Dipengaruhi oleh jenis mikroba yang digunakan,
senyawa penyusun media, komposisi campuran
dan tujuan penggunaannya
BENTUK MEDIA
Media Padat : ditambah agar ± 1,5 % (b/v)  agar miring &
substrat padat  onggok, sekam dll
Media Cair (tidak menggunakan agar)  propagasi & fermentasi
substrat cair
Media Semi Padat (menggunakan agar sebanyak 50 % atau
kurang dari jumlah agar yang digunakan pada media
padat)  untuk pengujian sifat fisiologis mikroba
 Bahan baku untuk media merupakan komponen
utama biaya produksi (dapat mencapai 70 %)
 Media dapat berpengaruh terhadap :
- Pertumbuhan dan pembentukan produk
- Perubahan pH selama fermentasi
- Pembentukan busa
- Bentuk morfologi mikroba
- Jenis fermentor yang digunakan atau sebaliknya.
 Substrat metanol memerlukan fermentor ICI
(Imperial Chemical Industry : airlift/ loop reactor 
sinambung dg pembuangan panas & gas)
 Substrat padat memerlukan fermentor baki (tray
fermentor)
Kriteria Pemilihan Bahan Media Kultivasi :
• Biaya & Ketersediaan  murah, konsisten
kualitasnya, dan tersedia sepanjang tahun (tidak
musiman)
• Penanganannya mudah, baik dlm bentuk cair
maupun padat, selama transportasi dan
penyimpanan (misal pengaturan suhu, Rh dll))
• Kebutuhan sterilisasi dan tidak terdenaturasi oleh
panas
• Kemudahan formulasi, pencampuran, viskositas,
aerasi, dan pembentukan busa selama kultivasi dan
pemanenan
• Perolehan produk yg diharapkan (rendemen), laju
produksi, efisiensi (produkl per gram substrat yg
digunakan)
Jenis Media Khusus :
Penggunaan media tidak hanya untuk pertumbuhan dan
pengembangbiakan mikroba, namun juga untuk tujuan
khusus, seperti isolasi, seleksi, evaluasi dan diferensiasi
isolat mikroba yang didapatkan
1). Media Selektif : Media yang hanya ditumbuhi oleh satu
atau lebih jenis mikroba tertentu, tetapi menghambat atau
mematikan mikroba lainnya. Contohnya “media SS”
(Salmonella-Shigella untuk menumbuhkan bakteri
Salmonella-Shigella)  lihat komposisi media
- Metil biru pada media EMB  bakteri Gram (-) tidak tumbuh
- Kristal violet pada media MacConkey's)
- Konsentrasi NaCl tinggi (7 % pada media MSA)
menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak dikehendaki
Contoh : Agar SS (agar Salmonella Shigella)
SS Media Formula / Liter
Beef Extract...............................................................................5 g
Enzymatic Digest of Casein...................................................2.5 g
Enzymatic Digest of Animal Tissue........................................2.5 g
Lactose....................................................................................10 g
Bile Salts................................................................................8.5 g
Sodium Citrate.......................................................................8.5 g
Sodium Thiosulfate................................................................8.5 g
Ferric Citrate.............................................................................1 g
Brilliant Green................................................................0.00033 g
Neutral Red........................................................................0.025 g
Agar......................................................................................13.5 g
pH akhir : 7.0 ± 0.2 at 25°C
Agar SS (agar Salmonella Shigella) :
media selektif didasarkan atas derajat penghambatan
bakteri gram positif dengan menggunakan bile salts,
brilliant green dan sitrat
Perbedaan bakteri “enteric” (E.coli) :  laktosa
Mampu memfermentasi laktosa menghasilkan asam +
indikator neutral red terbentuk koloni warna merah
Mikroba yang tak mampu memfermentasi latosa 
membentuk koloni tak berwarna
Contoh : mikroba patogen Salmonella dan Shigella.
sodium thiosulfate dan ferric citrate  untuk mendeteksi
pembentukan H2S (koloni dengan warna hitam di
tengahnya)
Agar Salmonella Shigella
Media Selektif : Agar EMB
E. coli mampu memfermentasi
Laktosa  koloni hijau metalik
pada Agar EMB
E. aerogenes : koloni
pink, sering spt mata
ikan pada agar EMB
Proteus vulgaris &
Salmonella typhimurium
(Gram -) tumbuh pd agar
EMB tapi tdk bisa
memfermentasi laktosa
Staphylococcus aureus
Gram (+) dihambat oleh
eosin & metil biru (EMB)
www.midlandstech.edu/.../sel_diff_media.html
2). Media Diferensial
Media yang digunakan untuk membedakan antara
jenis-jenis mikroba pada agar cawan.
Contohnya : media Agar Darah untuk pertumbuhan
bakteri hemolitik.
3). Media Penguji
Media yang digunakan untuk pengujian
senyawa tertentu dengan bantuan mikroba.
Contohnya : media penguji antibiotika
4). Media Diperkaya (enrichment)
 Media yang digunakan untuk memberi kesempatan
terhadap jenis mikroba tertentu untuk tumbuh dan
berkembang biak lebih cepat dari mikroba lain.
Contohnya untuk memisahkan bakteri penyebab penyakit
tipus (Salmonella typhi)
Enteric plating
Media Pertumbuhan
• Defined Media
 mengandung jumlah tertentu senyawa kimia murni
yang komposisinya diketahui.
Contoh : glukosa, (NH4)2SO4, KH2PO4, MgCl2.
 Hasil kultivasi terkontrol dan reprodusibel.
• Complex media
 mengandung senyawa alami yang komposisi
kimiawinya tidak diketahui dengan pasti (kompleks).
 Biasanya juga mengandung faktor pertumbuhan,
vitamin, hormon, unsur kelumit, sehingga menghasilkan
sel yang lebih banyak.
Contoh : pepton, molase, ekstrak khamir, corn step liquor.
PRINSIP FORMULASI MEDIA
 Konstituen kimiawinya harus memenuhi kebutuhan
dasar mikroba untuk :
 Pertumbuhan biomassa dan pembentukan produk
 Memasok energi untuk biosintesis dan
pemeliharaan sel
CARA :
1) Analisis Komposisi Sel
Komposisi sel mikroba menjadi dasar pedoman
penyusunan media.
Misalnya menentukan jumlah minimal N, S, P, Mg,
dan K serta unsur kelumit (trace element)
(Fe, Zn, Cu, Mn, Co, Mo, B)
2) Analisis Stoikiometri untuk Pertumbuhan dan
Pembentukan Produk
Reaksi :
Sumber C dan energi + Sumber N + Kebutuhan lain
 biomassa sel + produk + CO2 + H2O + panas
Secara kuantitatif dapat dihitung jumlah nutrien
minimal untuk menghasilkan sejumlah biomassa
atau jumlah substrat untuk menghasilkan sejumlah
produk tertentu.
3) Kebutuhan Biokimiawi Spesifik
Beberapa mikroba tidak dapat mensintesis nutrien
spesifik tertentu (asam amino, vitamin, nukleotida),
sehingga harus ditambahkan dari luar = “growth
factor”. Contoh : khamir membutuhkan biotin,
thiamin dan riboflavin
Komposisi Sel Mikroba
Unsur
Bakteri
Khamir
Kapang
50 – 53
45 – 50
40 – 63
Hidrogen (H)
7
7
Nitrogen (N)
12 – 15
7.5 – 11
7 – 10
Fosfor (P)
2.0 – 3.0
0.8 – 2.6
0.4 – 4.5
Sulfur (S)
0.2 – 1.0
0.01 – 0.24
0.1 – 0.5
K
1.0 – 4.5
1.0 – 4.0
0.2 – 2.5
N
0.5 – 1.0
0.01 – 0.1
0.02 – 0.5
Ca
0.01 – 1.1
0.1 – 0.3
0.1 – 1.4
Mg
0.1 – 0.5
0.1 – 0.5
0.1 – 0.5
Cl
Fe
0.5
0.02 – 0.2
0.01 – 0.5
0.1 – 0.2
Karbon (C)
KOMPOSISI TIPIKAL Untuk M.O
Unsur
Karbon
Nitrogen
Fosfor
Sulfur
Magnesium
Sumber : Wang et al. (1978)
% bobot kering
50
7-12
1-3
0.5-1.0
0.5
Contoh:
Bila diinginkan mensintesis 30 g/L massa khamir,
maka kira-kira formulasi media adalah sbb.
Komponen media
Sumber karbon :
- Metanol
- Etanol
- Glukosa
- Heksadekana
(NH4)2SO4
KH2PO4
MgSO4
Trace element
Konsentrasi (g/L)
60
40
60
30
12
1.3
1.5
10-4