Isolasi MNC dari Darah Tepi (Peripheral Blood) Hematopoietic Stem

Hematopoietic Stem Cell
Stem Cell and Cancer Institute
Isolasi MNC dari Darah Tepi
(Peripheral Blood)
Workshop on Stem Cell Isolation, Culture, and Analysis
• Stem Cell yang bersifat pluripotent, yang
dapat berdiferensiasi menjadi bermacam
tipe sel darah: Sel myeloid (monosit dan
makrofag, neutrofil, basofil, eosinofil,
eritrosit, megakariosit, sel dendritik), dan
sel limfoid (sel T, sel B, sel NK).
Camy Febrero Surjadi
Jakarta, 17 Maret 2009
Berbagai Sumber Stem Cell
Stem Cell Darah Tepi
• Darah Tali Pusat (Umbilical Cord Blood)
Æ kaya akan stem cell
• Darah Tepi (Peripheral Blood)
Æ Kadar stem cell sedikit
Æ pre-treatment dgn G-CSF (Growth Colony Stimulating
Factor), jika kita ingin mengambil stem cell sumsum
tulang dari darah tepi
vena cubiti
• Sumsum Tulang (Bone Marrow)
• dll (lipoaspirate, pulpa gigi, dst)
Pemisahan Komponen Darah
• Teknik Gradien Densitas Æ berdasarkan
perbedaan densitas komponen darah
• Mempermudah isolasi MNC
• Memakai Ficoll Æ mengagregasikan sel
darah merah menjadi sedimen
• Ficoll Æmolekul polisakarida hidrofilik
yang memiliki densitas tinggi (± 2-7 nm)
Plasma
Blood cells
•Red blood cells
•Platelets
•Leukocytes
•Stem cells
(mononucleated cells)
1
Pemisahan Komponen Darah
centrifugation
Plasma, platelets
Plasma
platelets
Blood
Mononucleated cells
Ficoll
MNC (+stem cell)
Wash 2x
Ficoll
Granulosit,
eritrosit
Ficoll
Granulosit
eritrosit
Collect MNC
Penghitungan Jumlah Sel
Hemasitometer
• Perlengkapan yang dibutuhkan:
a) Hemasitometer,
b) Cell Counter
c) Trypan Blue,
d) Buffer PBS (untuk mengencerkan)
- Ditemukan oleh Louis-Charles Malassez
- Pertama kali dipakai untuk menghitung
sel darah tapi kemudian digunakan untuk
menghitung berbagai tipe sel
• Untuk menghitung viabilitas dan jumlah
total sel dari sampel yang dimiliki
Hemasitometer
Trypan Blue
• Ada 4 kuadran yang harus dihitung
1
2
4
3
Σ sel = A x 104 x Pengenceran x volume suspensi
A
• Ditemukan Paul Erlich pada tahun 1904
• Sifatnya menembus membran sel yang
mati sehingga mewarnai sel yang mati dan
membedakannya dari sel yang hidup
•
C34H28N6O14S4
2
Visualisasi di Hemasitometer
Cara Perhitungan Viabilitas
• Sel mati = blue, sel hidup = colorless
Sel hidup
Rerata Σ sel hidup
Rerata Σ sel total (hidup & mati)
100%
Sel mati
Hal-Hal yang Perlu Diperhatikan
Hal-Hal yang Perlu Diperhatikan
• Menghitung harus cepat dan tepat (4 kuadran)
• Tidak boleh ada gelembung sewaktu memipet
suspensi sel yang akan dihitung ke slide
chamber hemasitometer
• Bedakan antara sel mati dan sel hidup dengan
tepat
• Ingat area yang sudah dihitung
• Pastikan suspensi sel dengan trypan blue
tercampur rata demikian pula suspensi sel
yang akan dihitung sebelum dicampur
dengan trypan blue
• Hemasitometer harus bersih
• Pergunakan Buffer isotonis (PBS)
Stem Cell and Cancer Institute
THANK YOU
FOR YOUR ATTENTION
Materi bisa di-download di website SCI :
www.sci-indonesia.org
Selamat Datang Para Peserta
Workshop on Stem Cell Isolation,
Culture, and Analysis
Jakarta, 17 Maret 2009
3