LAPORAN AKHIR PENELITIAN KARAKTERISASI GEN CTX ISOLAT

PSI
34
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
KARAKTERISASI GEN CTX ISOLAT Vibrio cholerae DARI
PENDERITA DAN SUMBER AIR MINUM KLB DIARE DI
BOGOR TAHUN 2009
Oleh:
drh. Khariri, M.Biomed.
PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN
-
BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN
KEMENTERIAN KESEHATAN RI
2012
LAPORAN AKHIR PENELlTIAN
KARAKTERISASI GEN CTX ISOLAT Vibrio cholerae DARI
PENDERITA DAN SUMBER AIR MINUM KLB DIARE DI
BOGOR TAHUN 2009
Oleh:
drh. Khariri, M.Biomed.
PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN
BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN
KEMENTERIAN KESEHA TAN RI
2012
ABSTRAK
Penyakit kolera masih menjadi masalah kescha1an yang cukup serius di
Indonesia. Kolera adalah diare yang disebabkan oleh hakte ri Vibrio chulercie
dengan gejala yang bervariasi dari diare yang ringan sampai berat yang ditandai
dengan feses seperti air cucian beras. Bakteri Vibrio cholerae masuk ke dalam
tubuh manusia melalui makanan dan minuman, b iasanya masuk ke dalam tubuh
melalui air minum, makanan laut, atau lainnya yang telah terkontaminasi oleh
bakteri terseb ut. Angka kejadian kasus kolera yang tinggi umurimya te1jadi di
negara-negara yang sedang berkembang karena belum baiknya higiene, sanitasi
serta penyediaan air minum yang tidak memadai. Vihrio cholerae banyak ditemui
di permukaan air yang terkontaminasi dengan tinja yang mengandung bakteri
tersebut, sehingga lingkungan terutama air memegang peran utama dalam
terjadinya wabah penularan di tempat kolera berjangkit sebagai endemik
Penelitian bertujuan untuk mengetah ui karakteristik gen ctx isolat Vihrio
cholerae dari penderita diare dan isolat l i ngkungan pada Kejadian L uar Binsa
(KLB) diare Bogar tahun 2009. Sampel yang digunaknn dalam penelitian udul:1h
semua isolat bakteri Vibrio cholerae yang diisolasi dari feses pe nderita diarc dan
lingkungan pada KLB Kabupaten Bogar tahun 2009 yang be�jumlah 3 1 isolat.
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif laboratorium. Penelitian dilakukan
di Laboratorium Bakteriologi Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Keseha1an
dari Januari sampai Mei 2012. Tahapan penelitian meliputi identifikasi serogroup
dan serotipe bakteri Vibrio cho/erae, ekstraksi DNA bakteri Vibrio clwlerne.
deteksi gen ctx Vibrio cholera dengan metode PCR dan elektroforesis, serta
karakterisasi gen ctx Vibrio cholerae dengan sek uensing. Analisis hasil
sekuensing dilakukan dengan metode deskriptif.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua isolat Vibrio cholera Kejadian
Luar Biasa (KLB) Bogar tahun 2009 merupakan Vibrio cholerae serogroup 01
serotipe Ogawa dan mengandung gen ctx. Karakteristik gen ctx isolat Vibrio
cho/erae identik antar penderita diare. Hasil sekuesing ctxA dari seluruh isolat
n1enunjukkaQ terdapat single mutation pada sampel dengan kode 2009.CS.09
yaitu pada posisi basa ke 608 yang mengalami perubahan basa Timin menjadi
Adenin (608T>A). Hasil sekuesing ctxB dari seluruh isolat menunjukkan bahwa
seluruh isolat mengalami mutasi substitusi pada basa 997 yang mengalami
substitusi dari timidin menjadi citosin (997T>C) dan pada basa I 085 yang
mengalami substitusi dari timid in menjadi citosin (I 085T>C)
Kata Kunci
: Vibrio cholerae,
gen
ctx,
diare, lingkungan
II
DAFTAR ISi
HALAMAN JUDUL
SURAT KEPUTUSAN PENELITIAN
PERSETUJUAN ETIK
ABS TRAK
DAF TAR ISI . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. I!
DAF TAR GAMBAR . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... IV
DAFTAR TABEL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
DAFTAR LAMPIRAN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v1
DAFTAR S INGKATAN . . . ..................... . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . .
vu
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
.
.
I.
II.
III.
IV.
.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .
PENDAHULUAN
MANFAA T PENELITIAN... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
TUJUAN PENELITIAN. . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . ... . . . . .... . . . . . . . ...
TINJ AUAN PUSTAKA . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .....
4 . 1 . Vibrio cholerae..................... ....... . . .............................
4. 1 . 1 . Klasifikasi dan Karakteristik Vibrio cho!erae ... ... ... .. .. .....
4. 1 .2. Patogenesis dan Faktor Virulensi Vibrio cholerae... ... ... ...
4 . 1 .3. Cholera Toxin (CT) dan Toxin Co-regulated
Pilus (TCP) .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...
4.1 .4. Zonula Occludens Toxin (ZOT) . .. .. . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .
·4. 1 .5. Accessory Cholerae Enterotoxin tAce). . ............... .. . . . . . . .
4 . 1 .6 Toksin Lain pada Vibrio cho!erae............ . . . . . . . . . .. .. . . . .. ..
4.2. Epidemiologi Vibrio cholerae... ... . . . ... ... ... ... .. . . . . .. . . . . .. . . ... . .. .
4.3. Diagnosis Vibrio cholerae............ . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .... . . . . .
4.3 . 1 . Diagnosis konvensional .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..........
4.3.2. Metode Pemeriksaan dengan PCR . . . . . . . . ... .. .... . . . . . . ..... ... ...
I
4
5
5
5
5
9
IO
15
I7
18
21
22
22
22
V. METODOLOGI PENELITIAN . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . '. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
5 . 1 . Kerangka Konsep Penelitian. . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. .. 25
5.2. Tempat dan Waktu Penelitian . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . 25
5.3. Jenis Penel itian. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .... . . . . . . . . . . . ... . . . . . .. .. . . . . . . . . . . .. 2 5
5.4. Besar Sampel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . 26
5.5. Variabel Penelitian . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . ... . . . . . . . . . . . . . 27
5.6. Bahan dan Alat. . . . . . . . .. . . ...... . . . . . . .. . . . . . . . ... . . . . .. . ...... .. . . . . . . . . . 26
5.6. 1 . A lat Penelitian . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... . . . . . . ...... . . ... 26
5.6.2. Bahan Penelitian . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . ............. 26
5.7. Prosedur Kerja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... . . . . . .. . . . . 27
5 . 7. I . Isolasi dan ldentifikasi Vibrio cholerae .. . .. . .. . . . . . . .. .... .. . . .. 2 7
5. 7.2. ldentifikasi Spesies Vibrio cholerae ... . . . . ... .. . .. . . . . . .. . . . . . . . . 28
5.7.3. Identifikasi Serotipe Vibrio cholerae ... ....... ... ... . ... .. ........ 28
5.7.4. Ekstraksi DNA Vibrio cholerae ... ... . . . .. ... ... ... ... . ... .. . ... . . . 29
5.7.5. Polymerase Chain Reaction (PCR) ... . . . . . . . . . ... .... . . . . . . . . . . . . . 30
5.7.6. Elektroforesis ... ... . .. ... ... ... . . . ... ... ... ... ...... . . . . . . . . . ... .. . .... .. 3 1
5.7.7. Purifikasi Produk PCR ... ... ... .. ... .. . ... . . . . . . ... ... . . . . ... . . . . .... . . 31
5.7.8. Sekuensing ... .. ... ... . . . . ..... .... .. . . . ... . . . .. . . . . ... ... ....... .... ...... 3 1
.
.
.
.
.
.
.
.
.
111
.
5.7.9. Analisis Hasil Sekuensing . . . ...... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2
VI.HAS IL PENELITIAN . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . .... . .. .. ... .. . 33
6.1. Kultur Ulang Isolat Vibrio cholerae . . . ... ... ... .. ... .. . ... .. . ... .... .... .. 33
6.2. Identifikasi Sero group dan Serogtipe Vibrio cholerae.............. 34
6.3. Deteksi Gen ctx . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
6.4. Sekuensing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . 3 6
.
6.5. Perbandingan Gen ctx antara Isolat yang Diuji dengan Referensi
dari Genebank . . .. .. .. . . .. . . . . . . . ... . .. ... ...... . . . .. .. .. . . .. .... .... .. ..
40
VII.PEMBAHASAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1
VI.KESIMPULAN DAN SARAN . . .. . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8. l Kesimpulan... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. .. ...
8.2 Saran . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
46
47
D.A.FTAR PUSTAKA .. . . . . . . . . . . . . . ... . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . .
LAtvl Pl RAN
PERSETUJUAN ATASAN YANG BERWENANG
48
JV
OAFTAR GAMBAR
Garnbar 1 . 1 .
CSN dan kejadian kolera di Indonesia .. . . . .. . . .. .. ........................
Gambar 4.1.
Vibrio cholerae dengan
Gambar 4.1.
Koloni
Garnbar -L3.
Skema mekanism �
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...........
I0
Garnbar 4.4.
Struktur 3 dimensi molekul toksin kolera . ........ .................... ....
12
tight junction . . . ..................
17
Gambar 5 . 1 .
Kerangka Pikir Pene!itian. . ....... . . .. .. ... . . .. . . . . . . . . . . .. . . ..................
25
Garnbar 6. I.
Pertumbuhan isolat
Gambar 6.2.
Hasil elektroforesis amplifikasi gen
Gambar 6.3.
Hasil elektroforesis amplifikasi gen crxB dengan gel agarosa 2%..
36
Pensejajarnn nuklcotida ct:-;A dari semua isolat sampel ... . . . . . . . .....
37
Gambar
Gambar
4.5.
6.4.
Gambar 6.5.
.
pewarnaan Gram .. . . . . . . . . . . . ... ................
.
Vibrio cholerae pada medium TCBS . .
..
kc1:ia
toksin kolera (CT)
.
..
. . . . . . . . .. . .. ..............
.
Sel epitel intestinal yang menunjukkan
Vibrio cholerae pada
.
ctxA dengan gel agarosa 2%...
Pensejajaran asam amino gen crx sub
sampel
medium TCBS . . . . . . . .. ...
3
7
8
34
36
unit A dari semua isolat
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
Gambar 6.6.
Pensejajaran nukleotida ctxA dari semua isolat sampel . . . .. ... .. .. . .
39
Gambar 6.7.
Pensejajaran asarn amino gen
.
crx
sub unit A dari semua isolate
sampel . .. . . . . . .. . ... . . . ... . .. . ..... . . . . . . ... . . .. .. . . .. . . . . .. . . ... .. . . . . . . .. . .
.
Gambar
6.8.
Pensejajaran
asam
40
amino ctxB dari semua isolat yang digunakan
dalam penelitian dengan beberapa strain dari beberapa tempat
...
v
=
3
-
-
--
41
DAFTAR TABEL
-� 4.1.
Uji biokimia Vibrio cholerae. ......... . .. .... . . . . .... .... .... . ........ ..... . .. ..
23
-abel 5.1.
Uji antisera monovalen Vibrio cholerae.
. ..... .. . .. . . . . ...
29
Tciliel 5.2
Primer amplifikasi gen
, . . . . . . . . . . . ..............
30
Tabet
Hasil Identifikasi Serogroup dan serotipe Vibrio cholerae 0 I ..
6. 1.
.
ctx
........ . . . . . . . . . . .
Vibrio choferae
Vl
. . . . . .
. . .
.
. . .
.. ....
35
DAFT AR LAMPIR4N
:...p
.am iran 1
Lokasi pengambilan sampel pada saat KLB diare d i Bogor .... . ..
52
::..ampiran 2
Hasil isolasi Vibrio cholerae dari KLB diare di Bogor . . . .. .. . .....
53
Lampiran 3
Sumber asal sampel yang menghasilkan isolat V cho!erae . . ....
54
.
.
.
.
..
VII
..
DAFT AR SINGKATAN
ACE
=
accessory Cholera Enterotoxin
AD P
=
adenosine diphosfate
AMP
adenosine monophosphate
APW
alkali peptone water
ARFs
=
ADP ribosylationfactors
ATP
adeno.sin tri fosfat
CAMP
cyclic adenosine monophosphate
CEF
=
cell elongation. factor
CHO
=
chinese hamster ovary
CT
cholera Toxin
KIA
=
KLB
=
=
MIO
NCT
mac conkey agar
motility indol ornithine
=
PBS
new cholera toxin
phosphate buffer saline
OD
=
PKC
=
PPPL
=
RTX
SLT
kejadian luar biasa
heat-labile toxin
LT
M\:A
kliger iron agar
optical density
protein kinase C
pengenda/ian penyakil dan pe11yeha1an /i11gk1111gan
repeat in toxin
=
shiga like toxin
TCBS
thio sulphate citrate bile sucrose
TCP
toxin Co-regulated Pilus
TDH
=
thermostable direct hemolysin
vcc
=
vibrio cholerae cytolysin
VPI
=
vibrio pathogenicity island
WHO
world health organization
zo
zonula occludens
ZOT
=
zonula occludens toxin
Vlll
I.
LATAR BELAKANG
Diare adalah buang air besar (defekasi) dengan feses berbentuk cair atau
setengah padat karena adanya kandungan air pada feses yang lebih banyak dari
b ia sanya . Menurut Badan Kesehatan Dunia (World Health Organization), diare
adalah
buang air besar encer dan cair dengan frekuensi lebih dari tiga kali dalam
satu hari. sementara diare akut adalah diare yang te1jadinya mendadak dan
berlangsung singkat dalam beberapa jam
.
Diare akut karena infeksi dapat
disebabkan oleh infeksi bakteri, parasit, dan virus, namun infeksi yang sering
terjadi biasanya disebabkan oleh bakteri. Diare yang disebabkan ol eh bakteri
Vibrio cholerae
(d i sebut dengan kolera) merupakan salah satu
pe ny ak it
yang
disebabkan oleh enterotoksin yang dihasilkan Vibrio cholerae dan membentuk
koloni di dalam usus kecil. Gejala-gejala yang ditimbulkan meliputi muntah.
berak
seperti air cucian beras dalam jumlah
banyak
yang mengakibatkan
dehidrasi, kehilangan elektrolit dan naiknya keasaman darah. Pada
kasus yang
berat, penderita terus menerus buang air besar disertai muntah, sehingga penderita
kehilangan cairan serta elektro}jt dengan cepat dari saluran pencemaan. Hal ini
menyebabkan renjatan keasaman metabolik dan a pabi la tidak diobati dapat
menyebabkan kematian.
Vihrio cholerae
1•2
merupakan bakteri gram negatif, berbentuk basil (batang)
dan bersifat motil (dapat bergerak), memiliki struktur anto gen ik dari antigen
flagelar H dan antigen
sornatik
0.
gamma-proteobacteria. mesofilik dan
kemoorganotrof. berhabitat alami di lingkungan akuatik dan umumnya berasosiasi
dengan eukariot. Suhu optimum untuk pertumbuhan Vibrio cholerae adalah pada
suhu 18-37 °
C. Dapat tumbuh pada berbagai jenis media, termasuk media
tertentu yang mengandung garam mineral dan asparagin sebagai sumber karbon
dan
nitrogen. Vibrio cholera tumbuh baik pada agar thio su(fat citrate bile sucrose
(TCBS), yang menghasilkan koloni berwarna kuning.2•3
Berdasarkan antigen 0, Vibrio cholerae dibedakan atas Vibrio cholerae
01,
Vibrio cholerae
non-OJ dan Vibrio cho!erae 0 1 39. Hanya Vibrio cholerae
01 yang dianggap memproduksi enterotoksin yang menyebabkan kolera endemik
2
dan
epidemik.
Belakangan
I 'ihrio
chu/erae
0139
d i k et ahu i
memproduksi
enterotoksin dalam jumlah yang besar seperti pada Vibrio cholerae 0 I . 7•8
Vibrio cholerae 0 I dibagi lagi menjadi
3 serotipe atau subtipe yakni :
Serotipe Ogawa yang mempunyai antigen 0 faktor A dan B.
Serotipe Inaba yang mempunyai antigen 0 faktor A dan C.
Serotipe Hikojima yang rnempunyai antigen 0 faktor A, B, C.
Sementara berdasarkan reaksi biologis Vibrio cholerae 0 I di bedakan biotipe yang
klasik dan El tor.
3 •8• 12
Bakteri Vibrio cholerae masuk ke dalam tubuh manusia melalui makanan
dan minurnan. biasanya masuk ke dalam tubuh melalui air minum, makanan laut,
atau lainnya yang telah terkontaminasi oleh hakteri 1ersebut. Vibrio cholerae
kemudian akan menghasilkan 1oksin yang menyebabkan usus halus melepaskan
sejumlah besar cairan yang banyak mengandung garam dan mineral. Mekanisme
patogen
toksin
Vibrio
cholerae
disebabkan
karena
meningka1nya
sekresi
enterotoksin yang merangsang kegiatan enzirn adenil siklase di dalam sel-sel
lendir usus. Hal ini mengakibatkan pengubahan adenosin tri fosfat (ATP) menjadi
adenosin mono fosfat siklik (CAIV1P) yang menyebabkan sekresi elektrolit ke
dalam rongga usus sehingga berakibat pada kehilangan cairan dalam jumlah besar
dan
ketidakseimbangan elektrolit. Tnfeksi bakteri ini dapat rnengaki batkan
gastroenteritis yang ditandai de ngan buang air besar berdarah disertai rnuntah
berdarah, demam dan sakit kepala. Bila tidak segera' mendapa1kan pe11olongan,
6 11
ha! ini dapat mengakibatkan kema1ian akihat dehidrasi dan kl�laps sirkulasi. · Angka kejadian kasus kolera yang tinggi umumn'.''a ter:jadi di negara­
negara yang sedang berkembang dikarenakan karena belum baiknya higiene,
sanitasi serta penyediaan air minum yang tidak memadai. Vibrio cho!erae banyak
ditemui di permukaan air yang terkontan1inasi dengan tinja yang mengandung
kuman tersebut, sehingga l ingkungan terutama air memegang peran utama dalam
te�jadinya wabah penularan di tempat kolera be�jangkit sebagai endemik.
7·11
Penyakit kolera dapat menjadi epidemi atau kejadian luar biasa yang
menimpa masyarakat suatu daerah yang melebihi perkiraan. Kotera merupakan
wabah penyakit yang telah membunuh jutaan manusia di dunia.
Menurut
Kementerian Kesehatan RI (2004), kejaclian luar biasa (KL13) adalah timbulnya
J
�
meningkatnya kejadian kesakiran dan atau kematian yang berrnakna secara
-epidemiologis pada suatu daerah dalam kurun waktu tertentu dan merupakan
Leadaan yang dapat rnenjurus pada terjadinya wabah.
2•8• 14
Pada tahun 2003 Badan Kesehatan Dunia (WI-IO) menerirna laporan
.. :.575 kasus kejadian kolera dari 45
negara dan
1.894
orang
dilaporkan
meninggal. Pada tahun 2008 Badan Kesehatan Dunia (WHO) rnenerirna laporan
190.130 kasus kejadian kolera dengan jurnlah korban meninggal sebanyak 5.143.
_
Iayoritas kasus kolera tersebut te1:jadi di sebagian besar negara Afrika. Indonesia
:erca1at angka kejadian luar biasa kolera dari tahun 1993-1998 dan sebanyak 9%
disebabkan oleh bakteri Vibrio cholerae 01. Dari 7 provinsi angka kejadian
olera yang tertinggi adalah daerah Bandung, Garut dan Timika. Sernentara pada
Ou.Jan Juni 2005 menurut Dirjen P2PL Kementerian Kesehatan terdapat KLB
kolera di daerah Tangerang yang memakan korban 20 orang dari 362 kasus. Pada
tahun 2008 KLB kolera terjadi di Papua Timika yang menewaskan hampir I 08
orang antara bulan April sampai Agustus 2008 sedangkan pada tahun 2009
2 9 10
tercatat KLB kolera terjadi di Bogor. • •
·
·
-r-"'
edan
�
•
l
-
·
-
"
v
n;
fl•
. ':; Batam "
�-
'
\.. .....,
/
'··
·
..- .,\., \
.,
"----->)
• Hospital-based surveilla n�
/'), Outbr<u1 koccurrenct!S
Gambar 1.1. Peta penyebaran kolera di Indonesia.
Kejadian kolera di Indonesia yang masih cukup tinggi menjadi tantangan
dan tugas penting untuk para pemerhati kesehatan dan juga masyarakat pada
am umnya.
Studi dan penelitian tentang kolera menjadi topik penting yang
menarik untuk terus dikembangkan. Salah satu studi yang dilakukan adalah
dengan menggali dan mempelajari lebih dalam tentang identifikasi gen penghasil
4
role.sin Vibrio cholerae (ctx) yang
me rup akan
faktor penting sebagai gen utama
yang menyebabkan diare berat dalam kejadian kolera. Meskipun Vibrio cholerae
memproduksi banyak toksin namun cholera toxin (ctx) me ru pakan toksin yang
paling be rpera n dalam menimb ulkan diare berat. Studi di Indonesia yang telah
dilakukan sebelumnya masih terbatas pada deteksi gen
ctx
dan belum sampai
karakterisasi gen ctx, untuk itu pe r !u dilakukan penelitian Jebih dalam tentang
karakteristik gen ctx dari strain Vibrio cholerae yang ada di Indonesi a . Studi
semacam ini sangat berkai ta n dengan ep ide mio !og i penyakit kolera yang
diharapk an
dapat
memberikan
masukan
dalam
rangka
pencegahan
dan
pengendal ian penyakit kolera di Indonesia.2
li i
Pada pen e t an ini akan sulit ditelusuri asal sumber kontaminasi yang
pertama kali, apakah kontaminasi dimulai dari !ingkungan yang masuk ke orang
yang sehat atau lingkungan yang terkontaminasi dari
o rang
yang telah terinfeksi
Vibrio cholerae.
ll.
MANFAAT PENELITIAN
Manfaat dari penelitian ini adalah sebagai berikut:
k
1. Sebagai bahan pendidi an kepada masyarakat agar tidak mengkonsumsi
air minum, makanan laut, atau lainnya yang' telah te rkontam in asi oleh
bakteri Vibrio cholera:
2. Sebagai bahan pendidikan kepada masyarakat untuk lebih menJaga dan
memeli ha ra arti pen t in g kesehatan lingkungan sehingga dapat mencegah
lingkungan terkontaminasi oleh bakteri Vihrio cholera:
3. Sebagai sumber informasi dalan1 perencanaan dan pcngembangan program
penanganan k ese hat an l ingk ung an dalarn rangka penanggulangan kasus
dia re yang disebabkan infe ksi Vibrio cholerae;
4. Sebaga i sumban gan bagi i!mu pengetahuan bahwa terdapat faktor resiko
dari lingkungan yang dapat mempengaruhi kej ad ian infeksi
cholera.
Vibrio
5
ID.
TUJUAN PENELITIAN
a. Tujuan Umum :
Mendapatkan karakteristik gen ctx isolat Vibrio cholera dari penderita
diare dan lingkungan pada KLB Bogar tahun 2009.
b. Tuj uan Khusus :
1. Mengidentifikasi serogroup isolat Vibrio cho!erae dari penderita diare
dan lingkungan pada KLB Bogor tahun 2009;
2. Mengidentifikasi serotipe isolat Vibrio cholerae dari penderjta diare
dan lingkungan pada KLB Bogor tahun 2009;
3 . Mendeteksi gen ctx isolat Vibrio cholerae dari penderita diare dan
lingkungan pada KLB Bogar tahun 2009;
..+. Mengidentifikasi
karakteristik gen ctx
isolat
Vibrio cho/erae dari
penderita diare dan lingkungan pada KLB Bogor tahun 2009;
5. Membandingkan karakteristik gen ctx antara isolat Vibrio cholerae dari
penderita diare dan iso1at lingkungan pada KLB Bogor.
IV. TINJAUAN PUSTAKA
-tl. Vibrio cholerae
-t.1 . 1 . Klasifikasi dan Karakteristik Vibrio cholerae
Vibrio cholerae adalah salah satu bakteri yang rnasuk dalam
famili
f'ibrionaceae dan merupakan bagian dari genus Vibrio. Bakteri Vibrio choferae
pertama
kali
ditemukan
oleh Robe11 Koch
pada
tahun
1884. Bakteri ini
merupakan jenis bakteri yang sangat penting dalam dunia kedokteran karena dapat
:menyebabkan diare berat yang disebut kolera. Bakteri Vibrio cholerae banyak
ditemui pada pennukaan air yang terkontaminasi feses yang mengandung bakteri
;ersebut, sehingga penularan penyakit kolera dapat melalui air, makanan dan
sanitasi yang buruk. 7•8
6
Terdapat lebih dari delapan spesies Vibrio yang patogen terhadap manusia
diantaranya adalah spesies Vibrio cholerae dan Vibrio parahaemolyticus. Berikut
ini adalah beberapa spesies Vibrio yang penting dalam dunia kedokteran antara
8
Jain:
-
Vibrio cholerae serogroup 0 1 dan 013 9 yang merupakan bakteri yang
menyebabkan kolera epidemik dan pandemik, serta Vibrio cholerae serogroup
01 dan non 0139 yang menyebabkan diare yang mirip kolera, namun
non
gejala
yang
ditimbulkan
masih
jarang
dan
ringan
ditemui
infeksi
ekstraintestinal.
-
Vibrio parahaemolyticus yang menyebabkan gastrointestinal dan kemungkinan
dapat menimbulkan infeksi ekstraintestinal.
-
Vibrio vulnificus,
Vibrio mimicus.
Vibrio hollicae,
Vibrio jluvialis, Vibrio
damsel. Vibrio anginoly1ic11s. T 'ihrio merschnikovil yang merupakan penyebab
infeksi pada telinga, Iuka, jaringan lunak dan infeksi ekstraintestinal namun
jarang terjadi.
Vibrio cholerae merupakan bakteri Gram negatif dengan bentuk batang
bengkok seperti koma yang berukuran 0,5 µm
x
1,5
-
3,0 µm, tidak berspora,
hidup secara aerob atau anaerob fakultatif, bergerak dengan flagel yang monotrik.
Vibrio cholerae berhabitat alami di lingkungan akuatik dan umumnya berasosiasi
dengan eukariot. Vibrio cholerae pada biakan tua dapat menjadi berbentuk batang
lurus (gambar
2.1).7•8
9
Klasifikasi dari Vibrio cholerae adalah sebagai berikut:
Kingdom
: Bacteria
Phylum
: Proteobacteria
Class
: Gamma Proteobacteria
Order
: Vibrionales
Family
: Vibrionaceae
Genus
: Vibrio
Species
: Vibrio cholerae
Suhu optimum untuk pertumbuhan Vibrio cholerae adalah pada suhu
37°C. Bakteri ini dapat tumbuh pada berbagai jenis medium, termasuk medium
yang mengandung garam mineral dan asparagin sebagai sumber karbon dan
7
cicrogen. Vibrio cholerae tumbuh baik pada medium selektif agar 1hiosulpha1e
citrate bile sucrose (TCBS), dan menghasilkan koloni berwama kuning karena
kemampuannya meragi sukrosa (gambar 2.2). 7•8
Garn bar 4. 1 . Vibrio.cholerae dengan pewarnaan gram
10
Salah satu ciri khas dari Vibrio cholerae adalah kemampuannya tumbuh
pada pH yang sangat tinggi (8.5 - 9.5) dan akan cepat mati dalam keadaan asam.
Vibrio cholerae mampu meragi sukrosa dan manosa tanpa menghasilkan gas
tetapi tid ak
meragi arabinosa.
Bakteri ini
juga
dapat merubah nitarat menjadi
nitrit. Ciri khas lain yang membedakan Vibrio cho!erae dari bakteri enterik gram
negatif lainnya yang tumbuh pada agar darah adalah pada hasil uji oksidasi yang
positif. Biakan Vibrio cholerae dalam medium pengayaan air pepton alkaii
APW) pada suhu ruang selama 6 jam akan tampak pertumbuhan bakteri pada
lapisan pennukaan medium. Medium air pepton alkali ini berfungsi sebagai
medium transport yang penting untuk spesimen feses atau usapan dubur dari
tersangka kasus kolera. 7
r
!O!MIM-
8
Gambar 4.2. Koloni Vibrio cholerae pada medium TCBS (sumber foto Khariri)
Semua Vibrio cho/erae mempunyai antigen flagel H yang sama. Antigen
flagel H ini bersifat tahan panas. Antibodi terhadap antigen flagel H tidak bersifat
protektif dan pada uji aglutinasi berbentuk mvan. Antigen somatik 0 merupakan
zruigen yang penting dalam pembagian group secara serologi pada Vibrio
cholerae. Antigen somatik 0 ini terdiri dari lipoposakarida. Pada reaksi aglutinasi
ZAan berbentuk seperti pasir. Antibodi terhadap antigen 0 dapat bersifat protektif.
Pembagian Vibrio cholerae berdasarkan antigen 0 (serogroup) adalah
sebagai berikut
a.
7' 1 1
Vibrio cholerae 01
1. Biotipe :
- El Tor
- Klasik
2.
Serotipe: - Ogawa: mempunyai antigen 0 faktor A dan B
- Inaba: mempunyai antigen 0 faktor A dan C
- Hikojima: mempunyai antigen 0 faktor A, B , C
b.
Vibrio cholerae non-01
c.
Vibrio cholerae 0139
Pembagian biotipe secara epidemiologis sangat penting karena dapat
�gunakan untuk menentukan sumber infeksi atau sumber KLB. Biotipe El Tor
�pakan
biotipe yang dominan dan dij umpai di banyak negara, sedangkan
9
io1ipe klasik banyak di Bangladesh, Pakistan dan India. Di Indonesia, biotipe
lklasik belum pernah dijumpai sepa11jang sejarah kolera yang telah terjadi, yang
:!<la
di Indonesia hanya biotipe El Tor. Namun demikian, studi epidemiologi
iotipe lebih lanjut sebaiknya dilakukan untuk mengetahui adanya biotipe lainnya
di Indonesia. 7
4.1.2. Pa to gen es is dan
Yirulensi
Faktor V irulensi Vibrio clzo/erae
adalah
ukuran
patogenitas
organisme.
Tingkat
viru!ensi
berbanding lurus dengan kemampuan organisme menyebabkan penyakit. Tingkat
viruJensi dipengaruhi oleh jumlah bakteri, jalur masuk ke dalam tubuh inang,
mekanisme pertahanan inang, dan faktor virulensi bakteri. Secara eksperimental
irulensi diukur dengan menentukan jumlah bakteri yang menyebabkan kematian,
sakit. arau lesi dalam waktu yang ditentukan setelah introduksi.
8
Pada keadaan normal, bakteri Vibrio cholerae hanya patogen terhadap
r:ianusia. Seseorang dengan keasaman lambung yang normal memerlukan dosis
10
infeksi. sebanyak I 0 atau lebih sel bakteri Vibrio chn/erae dalam cairan agar
c!apat terjadi infeksi, hal ini dikarenakan bakteri ini sangat sensitif terhadap
suasana !ambung yang asam. Jika bakteri masuk ke da!am tubuh bersama
makanan maka dosis infeksi
Vibrio
cholerae menjadi 102-10.i sel karena makanan
dapat menetralisir keasaman lambung. Pada proses pengobatan atau keadaan lain
.
�ang dapat menurunkan keasaman lambung membuat seseorang lebih sensitif
terhadap infeksi Vibrio cholerae. Patogenesis Vibrio cholerae ditentukan oleh
ombinasi dari beberapa gen virulensi. Pada Vibrio cholerae terdapat enam
elompok gen virulensi yaitu faktor regulator toxR, cholera toxin enzymatic sub
unit A (gen ctxA),
ompU),
toxin coregulated pi/us (lcpA), outer membrane protein
accessory cholera toxin (ace), dan zonu!a occludens toxin (zot).9·11
Mekanisme patogen Vibrio cholerae disebabkan karena meningkatnya
sekresi enterotoksin yang merangsang kegiatan enzim adenil siklase di dalam sel­
sel lendir usus. Hal ini mengakibatkan pengubahan Adenosin Tri Pospat (ATP)
menjadi adenosin
mono pospat
siklik
(cAMP) yang
menyebabkan
sekresi
elektrolit kedalam rongga usus sehingga berakibat pada kehilangan cairan dalam
1umlah besar dan
ketidak seimbangan elektrolit. lnfeksi bakteri
ini dapat
10
mengakibatkan gastroenteritis yang ditandai dengan buang air besar berdarah
£sertai muntah berdarah, demarn dan sakit kepala. Bila tidak segera mendapatkan
penolongan, dapat mengakibatkan kematian akibat dehidrasi dan kolaps sirkulasi
11
gambar 2.3).9·
Normal
Cbo le<•
oAoxln
»
·,.
. ' t.
,
,-tniestinal epithelial Ct'llls
�
� � .I�n��:
testine"'
;
_::
Nonna! •on niov�mcnt. Na· from
10 o�. "0 net c1- movBmt;1on1
·
•
:
Adof'�y1
Small
lumen
y
�-V.-_
�
ch _
o_
le _
ra
_ e��������
Infected
�GM1
V,bno
cycll\!!Jft
,,,,. ;;w­
ATP_...· Cycllc AMP:- .....
....
.....
c/10"""" tcxln
�
Al":tlvaHon of epitt1eriar
adenyl cycJase
chofara ?O)(in
�
Hco.- + K> + c1
Vibno cholerae c..it
by
-�-"':
Na'"' fY\Ovement
net
•
blockoo..
Cr moverT"M;tnt to lumen
toxin p<oduction
Na·
Co1oru.zat100 and
Cholera Toxin, Mechanism of Action
Massive water movement
to
the lurnen
Gambar 4.3. Skema mekanisme kerja toksin kolera dalam menyebabkan diare13
Pada awalnya dari beberapa kejadian pandemi kolera yang terjadi di dunia
banya
Vibrio cholerae 01
yang
dianggap memproduksi enterotoksin yang
menyebabkan kolera endemik dan epidemik. Naml.m pada pandemi ketujuh
�hasil diidentifikasi bahwa terdapat serogroup lain Vibrio cholerae yang juga
:nemproduksi enterotoksin dalam jum lah yang besar seperti pada Vibrio cholerae
Ol. serogroup terebut adalah serogroup 0139. 12
".1.3. Cholera Toxin (CT ) dan Toxin Co-regulated Pi/us (TCP )
Toksin Vibrio cholerae merupakan faktor
virulensi pada kejadian kolera,
penyakit diare parah yang be1tanggung jawab terhadap morbiditas dan mortalitas
-ang signifikan di seluruh dunia. Dua deten11inan, cholera enterotoksin (CT) dan
_
toxin coregulated pilus (TCP)
m e rupakan
faktor penting yang bertanggung jawab
;.erhadap virulensi Vibrio cholerae. Vibrio cholerae tidak bersifat invasif, bakteri
ini tidak masuk ke dalam aliran darah tetapi tetap berada di saluran usus. Pada
11
Slat te1jadi infeksi Vibrio cho ierae me!alui makanan dan minuman terkontaminasi
:.mg tertelan, maka setelah melewati pertahanan asam lambung Vibrio cholerae
:nenghasilkan dua faktor virulensi yang menyebabkan kolera yakni toxin co­
regulated pi/us (TCP) yang berperan dalam proses kolonisasi pada intestinal dan
cholera
toxin (CT) yang menyebabkan seseorang mendapatkan gejala yang khas
pad.a diare ko!era. Genom Vibrfo cholerae mempunyai dua kromosom yakni
homosom I berukuran 3 Mb dan kromosom II berukuran I Mb. Pada kromosom I
rerdapat faktor virulen yang terkenal yakni CT dan TCP. CT dikode oleh gen
ax.AB, sementara TCP ter!etak pada daerah yang disebut
Vihrio pathogenicity
island (VPI).11•12
Toksin kolera terdiri dari dua sub unit yaitu sub unit A dan sub unit B .
Toksin kolera sub unit A mengandung 1 sub unit A (acrii·e ) dan sub unit B
mengandung 5 sub unit B (binding). Sub unit A mempunyai 1 komponen yakni
.-\I dan A2 9 (gambar 2.4). Toksin berikatan pada reseptor gangliosida pennukaan
set inang melalui 5
sub unit B selanjutnya terjadi perubahan konformasi
holotoxin, yang memungkinkan presentasi sub unit A pada permukaan sel. Setelah
coksin berikatan dengan reseptor kemudian sub unit A masuk kc dalam sel lkatan
disulfida dari sub unit A berkurang dan kemudian membebaskan komponen A 1
dan
A2.
Komponen
A1
bertugas meningkatkan
aktivitas
adenil
siklase
mengakibatkan perubahan Adenosin Tri Pospat (ATP) menjadi adenosin mono
pospat siklik (cAMP). Produksi cyclic AMP yang men1ngkat akan mengakibtkan
terhambatnya absorbsi NaCl dan merangsang ekskresi klorida yang menyebabkan
hilangnya cairan, NaCl, kalium dan bikarbonat.9
-
;,_
_
_
-�•!
li! 'rnlf
� !
�
-=� ;===
dil:ilii
I
J
Z>
�:
l!ll �
••
� w
•�-
! 11}
: ---:"
� ll.cl.
12
Gambar 4.4. Struktur 3 dimensi molekul toksin kolera (merah: sub unit A 1.
1i
kuning: sub unit A2, biru: sub unit B) .
Bakteri Vibrio cholerae mengeluarkan toksin kolera (CT) dan berikatan
C'.engan reseptor pada gangliosida GMl
yang mengandung galactose,
Cr::%tylgalac10samine, glucose. dan N-acerylneuraminic acid.
N­
Interaksi ikatan
·
:!::t:ara toksin kolera dengan reseptor diperantarai oleh sub unit B. Ikatan antara
t::hin kolera dan reseptor akan meningkat dengan adanya neuraminidase yang
=:produksi oleh Vibrio cholerae. Target intraseluler toksin kolera adalah enzim
.:3denil siklase yang berada pada membran basolateral �el epitel intestinal. Setelah
·n
kolera berikatan dengan sel. maka ada waktu sekitar 1 5-60 menit sebelum
aknil siklase diaktifkan. Hal ini te1jadi untuk memberi kesempatan peptida A I
k dapat be11ranslokasi melalui membran sel dan melakukan kontak dengan
•ein G. Sub unit A masuk ke dalam sel secara endositosis. Peptida A 1
;,,.ktifkan oleh ADP ribosy/a1ion factors (ARFs) dan menyebabkan transfer ADP
-:""!Josa dari NAD ke sub unit protein G. Protein G akan menyebabkan aktifitas
:a:!enil siklase dan meningkatkan siklik AMP
dari ATP. Peningkatan produksi
Sllik AMP akan menghambat absorpsi NaCl dan merangsang ekskresi klorida.
'3!lg menyebabkan hilangnya cairan, NaCl, Kali um dan Bikarbonat.
�
9•11
Toksin kolera sub unit B monomer berbentuk kecil, kompak, dan
c:.erupakan
sub unit yang sangat terstruktur. Toksin kolera sub unit B pentamer
distabilkan dengan berbagai interaksi, diantaranya ikatan hidrogen diantara sub
l
I
llllf
l
li
lff � H t
_
�
'
!
T
-�
13
unit B yang merupakan ha! yang penting. Jumlah ikatan hidrogen antara sub unit
B tunggal dan molekul tetangganya adalah
30
pada CT atau 26 pada LT. Setiap
sub unit membentuk tujuh jembatan garam pada CT atau empat jembatan garam
pada LT dengan tetangga masing-masing, sehingga total lebih dari 20 jembatan
garam antar-sub unit pada pentamer, dengan sepuluh terlokalisasi dalam pusat
pori. Choleragenoid atau CTB pentamer lebih stabil dengan interdigitasi yang
ketat kelompok hidrofobik pada interfase sub unit. 1
5
Permukaan bagian dalam pada cincin sub unit B merupakan bagian yang
hidrofobik, dengan jumlah total tidak kurang dari 2S positif dan l S negatif yang
melapisi dinding pusat. Monomer termasuk dalam bentuk pentamer untai enam
antiparalel
untai
p
dengan
helai
dari
sub
unit
berikutnya,
menghasilkan
penampilan cincin dengan permukaan luar yang halus. Pentamer memiliki
diameter keseluruhan sekitar 64
A
dan tinggi
40 A.
Pada semua toksin dari
kelompok ABS terdapat pusat pori atau saluran sepanjang lima kali lipat dari
sumbu perakitan BS. Batas-batas pori berbentuk kerucut yang dibentuk panjang,
dikemas s�cara erat, paralel a heliks.
Enzimatik fragmen A l
dibentuk oleh
banyak
elemen
15
terdiri dari satu ·domain dengan bentuk baji,
tetapi
tidak
sekundernya dan terdiri dari 192 asam amino.
terlalu
teratur elemen
struktur
Fragmen ini diorganisasi dalam
riga struktur berbeda. Pertama 1 32 asam amino membentuk unit globuler kompak
yang terdiri dari campuran a heliks dan helai p (A 1 ) . Struktur (A1 h (residu 1 33161) membentuk sebuah jembatan panjang antara domain kompnk (A I ) 1 dan
(Al )3 . Struktur (A I )1 bertindak sebagai tambatan molekul seperti A2. Mata rantai
.-\1)2
meluas sebesar 23
A
dari permukaan distal bebas (A 1 ) 1 dekat situs katalitik
:nterfase (A 1 ) 1 /A2. Rantai (A I h distal cukup fleksibel dan menjadi semakin
:.eratur saat mendekati situs nick yang terletak sepanjang tepi. Struktur globular
--�ga (A I h dibentuk dari residu 3 1 .C-tenninal yang mengelilingi jembatan
.:::!SUlfida dan menghubungkan fragmen A I dan A2. Potongan ini terletak jauh dari
-.l/A2 dan interface A/B dan mungkin sebagai tempat berikatan NAD dan
S"Jbstrat. Hal ini memungkinkan rantai A l untuk bertindak baik sebagai ADP­
nl>osyltransferase dan NAD-glycohydrotase.9• 13
14
Toksin kolera rantai A2 terdiri dari ci heliks yang saling berdekatan.
Sebaliknya. rantai A2 LT dibagi menjadi tiga segmen, sebuah amino-terminal
helix panjang (residu 197-224), panjang rantai diperpanjang melalui pori dari sub
unit B pentamer (residu 225-23 l ), dan C-terminal heliks kecil (Residu 232-236).
Urutan dari empat residu terakhir dari rantai A2 pada CT (KDEL) dan pada LT
RDEL) meniru sinyal retensi endoplasma.
Residu KDEL berada di luar
pembukaan sentral pori dengan sedikit atau tanpa stabilisasi dengan sub unit B.
�feskipun tetrapeptida ini terlihat jelas dalam peta kepadatan elektron CT, residu
yang sesuai secara acak dalam struktur kristal LT. Delesi terminal residu keempat
memiliki pengaruh yang kecil pada oligomerisasi sub unit B tetapi secara
signifikan mengurangi stabilitas holotoxin. 9
Toksin kolera Rantai A2. bagaimanapun, berbagi sebuah interfase yang
luas dengan rantai A ! dan sub unit
B pentamer. Rantai
A2 juga berinteraksi
dengan erat dengan kelima sub unit B. Sub unit A2 melewati pori sentral dari B
pentamer baik sebagai terusan helix (CT) atau sebagai rantai yang diperpanjang
dan berakhir di. C-terminal dengan helix yang pendek (LT). Diameter pori cukup
lebar untuk menampung rantai A2 sebagai heliks. Kestabilan kontak dalam pori
antara rantai A2 dan Sub unit B sangat hidrofobik, dengan sangat sedikit ikatan
hidrogen spesifik.
16
Reseptor toksin pertama kali diidentifikasi oleh King dan Van Heyningen
1973), yang mengamati bahwa ganglioside GMl mencegah CT terhadap
·
peningkatan permenbilitas pada kapiler kulit kelinci (membirukan kulit pada saat
pengujian). mencegah CT menginduksi akumulasi cairan di ilea! loop usus
·elinci, dan menghambat aksi CT pada sistem adenilat siklase dalam usus halus
pada kelinci percobaan. CT dan LT berikatan dengan ganglioside GM 1 . CT tidak
berikatan dengan ganglioside lainnya yang terkait, seperti GM2, GMJ, dan
lainnya, sedangkan LT dapat berinteraksi dengan reseptor kelas kedua yang tidak
dikenali
oleh
CT.
Pengenalan
memperlibatkan sakarida GM 1
spesifik
yang
pada
GMI
pada CT,
tidak terikat toksin,
dan
sel
tidak
sebaliknya
penambahan endogen GM I memungkinkan imun sel sebelumnya yang akan
diserang. Lima molekul GMl pada permukaan membran terikat oleh lima situs
9 13
ikatan yang identik pada toksin B pentamer. •
15
Bagian dari sakarida GM I berikatan dengan ABS heksamer lengkap dan
juga dengan B pentamer tetap i tidak dengan sub unit B monomer. Ada lima situs
ikatan toksin, dan ikatan GM I
ke lima situs dikenal sanagat koperasi.
Neuraminidase yang dihasilkan oleh Vibrio cholerae dapat meningkatkan jumlah
reseptor dengan
bertindak sebagai gangliosida pada tingkat
tinggi
untuk
mengkonversikannya ke GMI . 1 7
Interaksi LT atau C T sub unit B pentamer dengan G M ! menyebabkan
o:>erubah biru sekitar 12 nm pada emisi fluoresensi maksimum tryptophan. Karena
hanya ada satu residu triptofan (Trp-88) di setiap B monomer, keterlibatannya
rlalam reseptor ikatan jelas ditunjukkan. Pembentukan formasi kompleks antara
CT dan GM I menghasilkan energi transfer antara bagian residu indol
rlan turunan dansil dari GM 1. menunjukkan bahwa residu dalam atau
triptofan
dekat situs
rcseptor ikatan. CT dan LT mengikat secara khusus bagian oligosakarida dari
ganglioside GM I . kom p onen normal dari luar membran sel. Toksn ABS lain
9
mengenali Gangliosida Jain.
.
4.1.4. Zonula Occludens Toxin (zot)
Zot merupakan salah satu toksin lain yang diproduksi Vibrio cholerae
!Cfilg menyebabkan sekresi cairan ke dalam lumen usus. Produksi toksin tersebut
dikode oleh gen zot yang terletak pada kromoson 1. Intestital Zonula occludens
70)
merupakan junction antar sel yang dibatasi oleh ·dua membran plasma clan
nerada pada pemrnkaan apikal sel epitel. Pada keadaan normal intestital ZO
:ne m punya i
aktifitas untuk membatasi dan
mencegah difusi molekul larut air
;nelalui ruang interseluler kembali ke dalam lumen. Pada keadaan terjadinya
�eksi Vibrio cholerae, toksin zot menyebabkan mukosa usus menjadi lebih
permeab e l sehingga air serta elektrolit masuk ke dalam lumen karena tekanan
;lldrostatik dan menyebabkan diare. 19
Zot yang merupakan toksin Vibrio cholerae akan berinteraksi dengan
.;eseptor yang terdapat pada permukaan intestinal. Toksin ini akan mengarahkan
:;Jembukaan tight junction intestinal
.
dan menghidrolisis fosfatidil inositol
Kemudian akan mengaktivasi fosfolipase C
untuk melepaskan 1 ,4,5 trifosfat inositol dan
53.silgliserol. Protein kinase C (PKC)
a
dependent kemudian diaktifkan dan
16
�erjadi proses kaskade yang menyebahkan pelebaran tight junction intestinal dan
berakibat pada keluamya cairan ke lumen.18
Epitel usus merupakan interfase terbesar antara lingkungan eksternal dan
iingkungan internal host, dan merupakan barier utama dimana molekul dapat
dengan baik diserap atau dilepaskan. Saat ini sudah terbukti bahwa zonula
occl udens memainkan peran utama dalam mengatur permeabilitas epitel dengan
mempengaruhi aliran cairan paraseluler dan zat terlarut. Zonula occfudens (ZO)
merupakan antar persimpangan khusus di mana dua membran plasma dipisahkan
.-2 nm, yang ditemukan dekat permukaan apikal sel dalam epitel sederhana, dan
r:iembentuk gasket di sekitar seL Persimpangan terdiri dari percabangan jaringan
penyegel, masing-masing untai bertindak secara independen satu dengan yang
.::tin. Oleh karena itu, efisiensi persimpangan mencegah bagian ion meningkat
secara eksponensial dengan jumlah untai. Setiap untai terbentuk dari deretan
protein transmembran yang melekat pada kedua membran plasma. dengan domain
el.straseluler bergabung satu sama lain secara langsung. Meskipun lebih banyak
;:irotein. jenis utama adalah claudin dan occludin. 1 9
Tight junction
bergabung dengan cytoske!eton se! yang berdekatan secara
acrsama-sama yang akan mencegah fluida bergerak melalui celah-celah antar sel
�
difusi lateral membran protein intrinsik antara domain apikal dan basolateral
C::::ri
membran plasma (gambar 2.5). Zonula occludens bertindak untuk: (i)
=enjaga sel bersama-sama, (ii) memblokir pergerakart protein membran antara
rennukaan apikal dan basolateral dari sel, yang memungkinkan fungsi-fungsi
. usus dari setiap petinukaan, dan (iii) mencegah bagian molekul dan ion melalui
roang antar sel. Oleh karena itu, bahan harus benar-benar masuk ke dalam sel
dengan difusi atau transpor aktif) untuk !o!os melalui jaringan. Zonula occludens
=embatasi atau mencegah difusi molekul larut da!am air melalui ruang antar sel
jalur paraselular) kembali ke lumen. Difusi didorong oleh konsentrasi gradien
-:mg
dibuat dengan proses transpor aktif transepitelial. Pada beberapa tahun
::=rakhir, banyak hal yang telah ditemukan mengenai struktur, fungsi, dan regu!asi
ct:!ri right junction.
Namun mekanisme yang tepat melalui bagian mana untuk
cereka beroperasi masih tidak lengkap dipahami.
20•21
1 '7
!
I
Basolateral
Surface
0
0
�
0
N
Syste�Circufatioo
�
::::::
�
---...
Gambai· 4.5. Sel epitel intestinal yang menunjukkan tightjunction
4.1.5. Accessory Cholera Elllerotoxin
19
(Ace)
Accessory cholera enterotoxin (Ace) merupakan toksin yang berpotensi
menyebabkan diare kolera dengan cara meningkatkan transpor membran ion
transeluler. Pada penelitian dengan menggunakan model sel T84, toksin Ace dapat
meningkatkan perbedaan potensial yang berakibat sekresi cairan. Melalui sinyal
second messenger Ca2+ terhadap
sel epitel
mukosa
usus
ini
akan
terjadi
mekanisme sekresi bikarbonat dan klorida ke dalam lumen usus.22
Ace telah diidentifikasi oleh Trucksis dkk. ( 1 993) sebagai enterotoksin
potensial
ketiga pada
menunjukkan
memungkinkan
bah\.va
Vibrio cholerae. Ekstrak toksi'll pada hewan percobaan
Ace
meningkatkan
untuk . berkohtribusi
diare
transportasi
pada
ion
kolera.
transelular,
Ace
yang
meningkatkan
::.ubungan arus pendek (Isc) pada jaringan ileum kelinci dalain chamber dan dalam
;:node! sel epitel usus, dan hal itu menyebabkan sekresi cairan pada ilea! loop
telinci. Seperti halnya CT namun berbeda dengan Zot, Ace meningkatkan beda
ootensial daripada konduktivitas jaringan.22
Mekanisme kerja Ace telah digambarkan oleh Trucksis dkk.
(2000)
daJam
� T84, sel tumor koJon manusia yang menyerupai morfoJogis sel crypt dan
:=emelihara transportasi elektrolit. Cell line ini mensekresi er dalam merespon
sekretagog, efek yang dirnediasi melalui mekanisrne cAMP, cGMP, atau Ca+2.
�kan isme sekresi oleh Ace melibatkan Ca2+ sebagai messeger kedua, dan toksin
_
18
ini menstimulasi novel Ca2�-dependenr secara smerg1.
Peran Ace dalam
patogenesis kolera belum ditentukan dengan menggunakan mutan isogenik pada
:nanusia. Telah dikemukakan bahwa Ace dapat berkontribusi pada fase awal dari
sekresi usus pada infeksi Vibrio cholerae sebelum timbulnya sekresi yang
dirangsang oleh aksi yang lebih lambat toksin kolera.23
.t.1.6.
Toksin Lain pada Vibrio c/10/erae
Selain toksin diatas, Vibrio cholerae juga memproduksi beberapa toksin
hin yang tidak mempunyai peran besar dalam kejadian diare kolera. Beberapa
toksin tersebut antara lain hemolysin I cytolysin, RTX toxin, Chinese hamster
ovary (CHO) cell elongation factor (Cef), New cholera toxin (NCT), Shiga-like
toxin (SL T). Thermostable direct hemolysin (TDH), Heat-stable enterotoxin of
oonagglutinable vibrios (NAG-ST), dan toxin W0-7 . 1 2
Hemolisin merupakan eksotoksin yang dapat merusak membran sel darah
::ierah yang disekresikan oleh Vibrio yang patogen. Produksi cytolysin atau
emolysin (VCC) dikode oleh gen hlyA, yang merupakan elemen genetik yang
consen·ed pada bakteri Vibrio cholerae. Pembagian Vibrio cholerae menjadi
,;oripe klasik dan El Tor didasarkan pada uji hemolisis menggunakan darah
domba. VCC diduga dapat menyebabkan gastroenteritis pada manusia walaupun
ml tersebut masih diperdebatkan. Pada percobaan menggunakan
kelinci, efek
ksin Vib6o cholerae menyebabkan hemolisis dengan cara membentuk lubang
?Ori-pori pada critrosit kelinci. Sementara dengan menggunakan sel intestinal
manusia pada kultur jaringan menyebabkan efek sitolisis. Hal ini berakibat pada
pengeluaran klorida dari mukosa kolon manusia.24
Toksin RTX adalah famili bakteri yang mensekresi sitotoksin yang
:produksi oleh beragam kelompok patogen Gram negatif. Toksin ini mempunyai
xberapa fitur umum seperti organisasi gen umum, maturasi pasca-translasi. dan
ekspor keluar dari sel bakteri melalui sistem sekresi tipe I (T l SS). Toksin RTX ini
::mumnya terbagi dalam dua kategori yaitu hemolysin yang mempengaruhi
oerbagai jenis sel dan leukotoksin dengan jenis sel dan spesies tertentu.
Contohnya termasuk E.
coli alpha-hemolysin
(HlyA), Bordetella pertussis
19
adenylat
cyclase
hemolysin
toxin,
leukotoxin (LtxA), dan Pasteurella
Acrinobacillus
actinomycetemcomilans
haemolytica leukotoxin
(LktA).2 5•26
Studi klinis dengan strain vaksin konsisten melaporkan tingkat residu diare
dan aktivitas reaktogenik. Pencarian keberadaan toksin lainnya menyebabkan
penemuan toksi n sepe1ti Zot dan Ace. Namun,
tanpa gen
crx, zot, ace
dan
hlyA
Vibrio cholerae
galur
CVD 1 1 0
masih menyebabkan diare ringan, hal ini
menunjukkan masih terdapat toksin tambahan. Aktivitas sekresi enterotoksin
sering dicirikan dalam sistem model seperti pada sel
Chinese Hamster Ovmy
(CHO) assay atau melalui akumulasi cairan dalam percobaan tikus. Morfologi
pemeriksaan sel
CHO dilakukan dalam kultur jaringan dengan mikroskop cahaya
menunjukkan pemanjangan sel
CHO dengan adanya faktor virulensi dari beberapa
bakteri patogen termasuk CT. Akti\'itas sitotoksik diukur dalam satuan
unit
CHO. Satu
CHO didefinisikan sebagai kebalikan dari pengenceran yang menyebabkan
sel memanjang >50%. Aktivitas spesifik untuk CT adalah sekitar l OOOx I 06 unit
CHO per mg protein. Aktivitas elongasi sel CHO sebagian dimumikan dan
ditemukan
j
menyebabkan
akumulasi
cairan
dalam
model
tikus,
menun ukkan enterotoksik alam, dan itu disebut faktor elongasi CHO
Pada tahun 1983, di laporkan dari India bahwa beberapa
sehingga
(CEF). 3 1
Vibrio cholerae
01 strain lingkungan nontoksinogenik yang gaga! berhibridisasi dengan probe CT
atau LT, dapat menyebabkan akumulasi cairan dalam ilea! loop kelinci dan diare
!>3-da anak kelinci. Kultur filtrat dari strain ini mampn menyebabkan akumulasi
cairan. Filtrat juga meni ngkatkan pem1eabilitas kapiler kulit kelinci, tetapi tidak
rnenyebabkan wama biru keputihan atau nekrosis. Toksin dalam kultur filtrat
tidak dapat dinetralkan pada kulit kelinci atau tes ileaJ loop dengan antiserum
CT
ar.au sub unit A dan B. Toksisitas untuk loop dan kulit akan hilang ketika kultur
illtrat dipanaskan sampai 100°C selama 10 menit. Toksin ini ditetapkan sebagai
ksin kolera yang baru dan dianggap menjadi penyebab diare pada strain
dwlerae
er. Penelitian berikutnya pada
:-or strain
Vibrio cholerae 0 1
Vibrio
biotipe klasik dan El
CT+ dan CT yang berasal dari spesimen klinis dan lingkungan
5ungkapkan bahwa NCT dihasilkan oleh strain
01 I non-0 139.
32
Vibrio cholerae
0 I , 0 1 39, non-
20
Shiga-like Toxin (SLT) atau verotoxins, dinamai berdasarkan prototipe
roksin yang dihasilkan jenis Shigella dysenteriae tipe 1 , dan juga diproduksi oleh
srrain E. coli tertentu, sebagai penyebab diare berdarah dan diare tidak berdarah di
seluruh
dunia.
SLT
bersifat
sitotoksik
pada
kultur
sel
jaringan
tertentu,
enterotoksik pada ilea) loop kelinci, dan neurotoksik (menyebabkan kelumpuhan
anggota badan dan kematian) pada kelinci dan tikus.33
Thermostable Direc1 He molysin (TOH) adalah toksin putatif yang secara
epidemiologis terkait dengan kasus gastroent eritis pada manusia � ang disebabkan
oleh Vibrio parahaemolyticus. Produksi TOH secara rutin diuji melalui hemolisis
eritrosit tipe
p
yang dimasukkan ke dalam media khusus yang disebut agar
Wagatsum. Reaksi hemolitik dikenal sebagai fenomena Kanagawa. Hemolisin ini
diberi nama Thermostable Direct Hemolysin (TOH). karena toksin stabil pada
pemanasan ( 1 00°C,
I 0 menit), dan aktivitas hemolitik tidak meningkat pada
penambahan Jesitin, menunjukkan aktivitas secara langsung terhadap eritrosit.
Aktivitas biologis TOH mencakup hemolisis pada eritrosit berbagai spesies.
silotoksisitas, toksisitas I etaI terhadap hewan percobaan kecil. dan peni ngkatan
0
3�
permea bilitas pembuluh darah pada kulit kelinci. Keberadaan toksin TOH belum
dilaporkan pada Vibrio cholerae 0 I , tetapi toksin ini ditemukan dalam plasmid
seperti dalam lokasi kromosom pada beberapa Vibrio cholerae non-01 .35
Beberapa
strain
Vibrio
cholerae
non-0 I
ditemukan
terkait
dengan
penyakit yang secara klinis tidak dapat dibedakan dari J<olera, sementara beberapa
srrain lain menyebabkan demam dan diare berdarah. Sebagian besar strain Vihrio
cholerae non-01 tidak menghasilkan CT. Pertama kali dijlaskan tipe barn heat­
stab/e enterotoxin (ST) pada Vibrio cho/erae non-0 I yang menunjukkan 50%
bomologi urutan asam amino dengan enterotoksigenik ST dari ETEC E. coli.
Seperti ST pada E. coli, NAG-ST Vibrio cholerae menyebabkan akumulasi cairan
dengan cepat pada uj i yang dilakukan dengan menggunakan hewan percobaan
likus .
Terjadinya
NAG-ST
pada
isolat
ditemukan pada bakteri Vibrio choierae
non-0 I
cukup
rendah
dan
jarang
O I . 36·37
Sebuah toksin ekstraseluler diidentifikasi pada suatu strain Vibrio cholerae
El Tor Inaba yang diisolasi dari wabah kolera di Kota Warangal Andhra Pradesh
India selatan. Jenis ini diasumsikan sebagai Vibrio cholerae
W07,
ditemukan
21
canpa gen ctx Vibrio cholerae, ace atau zot sebagaimana ditentukan dengan studi
hibridisasi,
tetapi
masih
menyebabkan penyakit yang
mirip
kolera.
Kultur
supernatan strain ini menyebabkan akumulasi cairan pada uji ilea! loop kelinci,
perpanjangan dari sel Chinese Hamster Ovmy (CHO) dan pembulatan sel Vero.
Toksin ini merupakan antigen yang berbeda dari CT, Zot, Ace atau hemolisin, dan
disebut toksin W07 berdasarkan tata nama dari strain induk. Produksi maksimal
W07 diamati dalam medium AKI ( 1 ,5% Bacto Peptone. ekstrak yeast 0,4%, NaCl
0.5%,
0,3% filter-sterilized NaHC03 pada pH 7.4) disesuaikan dengan pH 8,5 dan
37°C.38
Dibandingkan dengan CT, toksin W07 empat kali lebih sedikit dalam
menstimulaasi terjad inya akumulasi cairan. Meskipun toksin W07 mirip dengan
CT pada beberapa sifatnya. antibodi poliklonal terhadap toksin W07 tidak
bereaksi silang dengan CT atau LT E. coli pada imunodifusi atau pada uji
imunoblot.
Toksin
ini
dianggap
menginduksi
apoptosis
pada
sel
Hep-2
berdasarkan deteksi DNA nucleosomal dalam merespon W07 dan adanya histon
yang terkait fragmen DNA dalam sitosol dengan deteksi kematian sel ELISA.
Toksin W07 telah di laporkan 111enyebabkan perubahan dalam transportasi usus
pada tikus dengan mengubah tingkat Ca2+ intraseluler I ekstraseluler. Pada kolera
yang menunjukkan gejala seperti yang berhubungan dengan Vibrio Cholerae
W07, toksin W07 mungkin memainkan peran penting dalam mengubah tingkat
mediator kunci pada jalur sinyal transduksi yang berbeda'. 39
4.2.
Epidemiologi Vibrio cltolerae
Pertama kali kejadian penyakit kolera ditemukan di sekitar sungai Gangga
dan Brahmaputra di India Timur dan Pakistan Timur.
Pada tahun 1 884 Robert
Koch mengisolasi kuman tersebut yang disebut Vibrio cholerae. Kolera yang
endemik
di
Asia dan
yang
merupakan
pandemik besar pada abad
ke
19
disebabkan oleh Vibrio cholerae klasik, serotipe Ogawa dan Inaba. Di Indonesia,
tercatat pertama kali pada tahun 1 93 7 muncul kolera di Sulawesi Se Iatan yang
waktu itu dikenal dengan nama Celebes. Penyakit ini disebabkan oleh suatu
biotipe Vibrio cholerae yang disebut El Tor, sesuai dengan nama tempat pertama
l *c ;;;38:i
il!lf'i'M4•• 4l!llM
.
':3i
"
•iii§JEZT
J
22
diidentifikasi kali di kampus karantina jemaah haji di dekat E l Tor Semenanjung
67
Sinai oleh Gotschlich pada tahun 1905. •
Di dalam sejarah kolera terdapat tujuh pandemi yang melanda dunia.
Organisme penyebab dari empat pandemi yang pertama belum dapat dikenali
pada saat itu, tetapi dua pendemi yang berikutnya diketahui disebabkan oleh
Vibrio cholerae
01 biotipe klasik. Pandemi ketujuh teljadi pada bulan Januari
tahun 1 96 1 , berasal dari kota Makasar yang rnerupakan pandemi pertama yang
disebabkan oleh Vibrio cholerae 0 I biotipe El tor. Saat pandemi ketujuh ini
meluas, Vibrio cholerae 0 1 biotipe Eltor menggeser biotipe klasik yang menjadi
penyebab pandemi sebelumnya. Saat ini Eltor merupakan biotipe yang dominan
dijumpai di seluruh dunia. Diperkirakan sekitar 5,5 juta kasus kolera terjadi setiap
tahunnya di Asia dan Afrika, 8 %
kasus cukup berat sehingga memerlukan
perawatan rumah sakit dan 20 % kasus ini berakhir dengan kematian sehingga
jumlah kematian berkisar 120,000 kasus per tahun.
4.3.
7
Diagnosis Vibrio cltolerae
Diagnosis untuk identifikasi bakteri f' ibrio choleroe dapat d ilakukan
dengan menggunakan metode kultur konvensional maupun dengan menggunakan
ceknik biomolekuler yang masing-masing mempunyai kelebihan dan kekurangan.
43.1.
Diagnosis Konvensional
Diagnosis untuk menentukan Vibrio cholerae secara konwnsional dapat
dilakukan dengan kultur. Baban perneriksaan dapat diambil dari swab rektal, feses
ataupun muntahan. Kultur Vibrio cholerae dapat dilakukan dengan dua cara yaitu
secara langsung menanam bahan pemeriksaan ke medium selektif agar thiosulfat
drrate bile salts sucrose
(TCBS), dan secara tidak langsung yaitu bahan
pemeriksaan ditanam terlebih dahulu di media perbenihan alkaline peptone water
APW) dan diinkubasi selama 1 8
-
20 jam pada suhu 37°C. Dari media
perbenihan APW selanjutnya dapat dilakukan subkultur ke media TCBS.3·7
Untuk identitikasi Vibrio cholerae dapat dilakukan dengan melakukan
serangkaian uji biokimia seperti yang ada pada tabel 2 . 1 . Uji kemudian
23
dilanjutkan dengan uj i serologi untuk konfirmasi isolat yang diidentifikasi sebagai
Vibrio cholerae dengan cara reaksi aglutinasi antigen somatik (antigen
0).7
Tabel 4. 1 . Uji biokimia Vibrio cholerae
REAKSI BIOKIMIA
HASIL REAKSI
+
Oksidase
+
Pertumbuhan tanpa penambahan NaCl
Alkali I Asam
KIA ( Kligler Iron Agar )
+++
MIO ( Motility Indole Ornithine )
SSS ( Sucrose Semi Solid )
+
Lysine
.,...
Ornithine
+
Arginine
+
Maltose
Arabinose
Kelebihan diagnosis konvensional dengan kultur adalah sensititasnya yang
sangat tinggi ( 1 - 1 0 CFU/mL ), dan metode ini merupakan baku emas
dalam
mendiagnosa diare yang disebabkan oleh Vibrio cholerae. Sedangkan kekurangan
metode ini adalah memerlukan waktu beberapa hari agar sampel sampai ke
laboratorium
dan
identifikasinya
memerlukan
waktu
2-3
hari
serta
harus
dilakukan oleh tenaga laboratorium yang terlatih dan umumnya pada kasus
kejadian luar biasa kolera fasilitas mikrobiologi tidak tersedia. 7
�.3.2.
Metodc Pemeriksaan dengan PCR ( Polimerase Chain Reaction )
Reaksi
berantai
polimerase atau
lebih
umum
dikenal
sebagai
PCR
(Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik
ini akan dapat menghasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat
sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Metode
PCR merupakan salah satu cara yang dapat digunakan untuk d i agnosis cepat
bakteri Vibrio cholerae . Adanya bakteri Vibrio cholerae dari sampel feses atau
rectal swab dapat dideteksi dengan metode PCR ini. Metode ini dilakukan dengan
menggunakan primer spesifik dari gen Vibrio cho!erae.
41
24
Inti dari tehnik ini adalah amplifikasi fragmen genom Dr\A (yang sudah
diisolasi) dengan menggunakan primer ol igonukloetida. Unsur yang penting
dalam PCR (Master Mix) adalah: 50
•
Template DNA
•
Primer
Oligonukleotida
(panjang
biasanya
2
sebanyak
1 8-20
pasang
buah
basa)
yang
komplementer
masing-masing
dengan
susunan mulai dari 3· (dikenal dengan forward dan reverse). Primer
harus didesain unik dan tidak terdapat di tempat lain dari susunan
DNA untuk mencegah amplifikasi bagian lain dari DNA. Untuk itu
di perlukan
informasi
tentang
susunan
genorn
DNA,
untuk
menentukan daerah spesifik (biasanya conserved region).
•
Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari 4 macam,
yaitu dATP, dTTP, dGTP. dan dCTP
•
Enzim
DNA
polymerase.
yang
berasal
dari
bakteri
Thermus
aquaticus yang hidup pada tempat dengan temperatur tinggi c 1 0o·c
atau lebih)
•
2
Mg + sebagai kofakor
•
Larutan
buffer yang membuat
lingkungan
ionik
dan pH
yang
optimum bagi reaksi PCR.
Tehnik
ini dilakukan dengan menggunakan alat thermo cycler untuk
.
ampl ifikasinya dan hasil PCR d i baca dengan elektroforesis menggunakan gel
agarosa.
50
�
; - 1·
25
V. METODE PENELITIAN
5.1. Kerangka Konsep Penelitian
Vibrio cholera
Makanan
Lingkungan
Minuman
Diare
Diare berat
Diare ringan
Vibrio cholera
Vibrio cholera
Non
0 1 , 0 1 39
0 1 . Non 0 1 39
Faktor virulensi
Gen ctx
Variabilitas genetik
5.2.
Tempat Penelitian dan Waktu
Penelitian
dilakukan di
Laboratorium Bakteriologi, Pusat Biomedis dan
Teknologi Dasar Kesehatan.
Waktu penelitian dilakukan selama delapan bulan, yaitu pada bulan Mei
sarnpai dengan bulan Desember tahun
5.3.
2012.
Jenis Penelitian
Jenis
penelitian
ini
adalah
penelitian
deskriptif
laboratorium
dengan
menggunakan arsip sampel dengan disain penelitian adalah eksperimen
laboratorium.
26
5.4. Besar Sampel
Untuk penelitian ini tidak diperlukan perhitungan sampel minimal karena
sampe1 adalah seluruh isolat Vibrio cholerae yang diambil dari arsip sampe!
yaitu bahan biologi tersimpan (BBT) yang tersimpan di Laboratorium
Bakteriologi Badan Litbangkes yang merupakan hasil isolasi dari penderita
diare dan isolat lingkungan pada KLB Kabupaten Begor tahun 2009 yang
berjumlah 3 I isolat.
5.5. Variabcl
Variabel pada penelitian ini adalah li ngkungan yang terkontaminasi. spesies
dan serotype bakteri, karakteristik gen ctx isolat Vibrio cholerae dari
penderita diare dan isolat dari lingkungan pada KLB Kabupaten Bogor tahun
2009.
5.6. Bahan dan Prosedur Kerja
1. Alat
Jarum ose, batang pengaduk, cawan petri, erlenmeyer, hot plate, lemari
pendingin, bunsen, lampu UY, pipet mikro. 1rnter hath, inkubator, objek glass,
Rotary shaker
inkubator. laminar air flo11·, serta alat gelas standar lainnya,
mesin PCR, seperangkat alat elektroforesis, sentrifugator. timbangan digital,
vortex, alat sekuensing.
2. Bahan
TCBS agar, NaCL, peptone, phosphate buffer saline (PBS), ethanol absolut,
alkohol 70%, antisera polivalen Vibrio cholerae, antisera monovalen ogawa
Vibrio cholerae,
antisera monovalen inaba V ibrio cholerae, mueller hinton
agar (MHI), akuades steril, tissue towel. sabun cuci tangan antiseptik, aerosol
barier tips ( 1 0, 20, I 00, 200, 1000 µI), biohazard bag, sarung tangan nitril non
powder (M, L), aluminium foil, gas elpij i, DNA ekstraction kit, DNA PCR kit,
I Ox TBE. loading dye, 100 bp DNA Ladder, Primer ctxA (F) dan Primer ctxA
(R), Primer ctxB (F) dan Primer c1xB (R), ultra pure agarose, ethidium
bromide, 1 ,5 ml nuclease free tube, thinwal I individual tube 0,2 ml, big dye
27
terminator V 3 . I cycle sequencing. big dye terminator purification kit, dye X
2,0 spin kit, buffer EDT A.
3.
Prosedur Kcrja
Metode baku untuk kultur bakteri
digunakan untuk mengisolasi dan
mengidentifikasi bakteri.
a. Isolasi dan ldentifikasi Bakteri Vibrio cholerae
Sampel dari penderita diambil dari swab rectal yang dibawa ke Laboratorium
Bakteriologi Badan Litbangkes dengan menggunakan medium transport cary
blair. Penyimpanan dan pengiriman sampel pemeriksaan dilakukan pada suhu
kamar. bukan suhu dingin, karena Vibrio cholerae lebih peka terhadap suhu
dingin dibanding kuman-kuman enterik. Swab rectal kemudian dimasukkan ke
medium pengayaan alkaline pepton water (APW) dan diinkubasi selarna 1 8-20
jam pada suhu 37°C. Cairan pada bagian paling atas biakan AP\V diambil dan
ditanamkan pada lempeng TCBS yang merupakan media selektif untuk
pertumbuhan / 'ibrio cholerae dan diinkubasi selama 1 8-20 jam pada suhu
3 7°C. Koloni yang tumbuh pada media TCBS dipindahtanamkan ke dalam
media biokimia. Sampel dari lingkungan diambil dari sumber air yang
digunakan untuk minum dan juga untuk mengolah makanan. Sampel air
ditambahkan dengan alkaline pepton water (APW) pekat dengan perbandingan
�
berbandi11g 1 . misalkan 200 ml air ditambah dengan 50 ml alkaline rcpton
water (APW) dan kemudian diinkubasi selama 1 8-20 jam pada suhu ]7°C.
Tahapan berikutnya sama seperti pada sampel swab rectal. Vibrio cho/erae
yang berhasil diisolasi kemudian dimasukkan dalam tube yang berisi TSB
gliserol 20% dan kernudian disimpan pada lemari penyimpanan sampel
dengan suhu -80°C.
Vibrio cholerae
dihidupkan kembali dari stok strain dengan menumbuhkan di
medium air pepton alkali
3 7° C, kemudian diinokulasikan pada subkultur
pada medium TCBS 37°C 24 jam, setelah inkubasi 24 jam diambil koloni
yang spesifik dan dilanjutkan dengan reaksi biokimia dan serologi dari koloni
yang spesifik. Hasil strain yang didapat akan dilanjutkan dengan ekstraksi
28
DNA
Vibrio cholerae.
Pipe! tetes
steri I
digunakan untuk mengambil sampel
lalu dimasukkan ke dalam pot salep yang tclah disterilisasi dengan
menggunakan alkohol. Ke dalam sampel kemudian
media
Alkaline
selama
5
ditambahkan
225
ml
Pepton Water (APW). Erlenmeyer digoncang dan dikocok
menit, lalu diinkubasi selama 6 jam pada
Rotary Shaker Inkuharor.
Sampel kcmudian ditanam di dalam media Thiosulfat Citrate Bile Sucrose
(TCBS) Agar. Koloni wama kuning dengan ukuran 2-3 mm diambil dengan
jarum Ose dan kemudian dipindahkan dan ditanam dalam media CHROM
agar Vibrio. Setdah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C, diamati koloni
yang tumbuh.
Koloni wama biru kehijauan atau biru terang dalam media
CHROM agar Vibrio adalah bakteri
Vibrio cholerae.
Selanjutnya koloni
dipindahkan dengan jarum Ose ke dalam media Kligler Iron Agar (KIA) dan
media Mo ti l it y lndonl..' Orni1hine ( \ 1 1 0 ). d i i nkubasi selama 24 jam pada suhu
°
37 C. Isolasi dan identifikasi Vibrio cholerae j uga dilakukan pada sampel air
yang diambil dari li ngkungan tempat
KLB .
.
b. ldentifikasi Spesics Bakteri
Vibrio cholerae
Disiapkan sediaan gelas dan diteteskan satu tetes antisera polivalen
cholerae
Vibrio
terlebih dahulu, kemudian diambil spesimen dengan menggunakan
ose dan dicampur dengan antisera yang telah diteteskan. Kemudian diaduk
sambil sedia11 gelas digoyang-goyangkan. Dilihat ada tidaknya aglutinasi. Bila
terbentuk aglutinasi dilanjutkan dengan <:ntisera monovalen ogawa dan inaba.
c.
Identifikasi Serotype Bakteri Vibrio cholerae
Satu tetes antisera polivalen
Vibrio choleroe
Inaba dan Ogawa diteteskan pada
kaca objek, Jalu ditambahkan salah satu suspensi isolat bakteri yang diduga
bakteri
Vibrio cholerae.
Penambahan isolat bakteri dilakukan dengan cara
dioleskan satu ose isolat tersebut mulai dari pinggir tetesan antisera monovalen
Vibrio cholerae
,
lalu diaduk dan amati terbentuknya aglutinasi. Terbentuknya
aglutinasi ditandai dengan pembentukan endapari berupa pasir halus. Bila
terbentuk aglutinasi hal ini menandakan bahv.,1a uji positif dan kultur dapat
29
d iny atak an sebagai kultur bakteri
Vibrio
cholerae.
Uji d i katakan positif
serotype Inaba, Ogawa dan Hikojima bila :
SerOLype V. Cholerae 01
Ag l ut i nas i
Amisera Ogawa
Antisera lnaba
Ogawa
+
-
Inaba
-
+
Hikojima
+
+
d. Ekstraksi DNA Vibrio cholerae
Deteksi gen ctx
Vibrio cholerae
ekstraksi DNA dari ba kteri
dilakukan melalui beberapa tahapan. yaitu
r ihrio cholerae.
am pli !i J...a:;i 0(\; ...\ target dengan
menggunakan mesin pol ym erase chain reaction tPCR) dan kemudian
konfirmasi dengan elektroforesis. Sebelum memulai proses ekstraksi DNA,
terlebih dahulu panaskan heat block sampai suhu mencapai 56°C. P i pet 20 µI
Prdtease (atau proteinase K) ke dalam 1 ,5 ml m i crocentrifuge tube.
Tambahkan 200 µI sampel ke microcentrifuge tube. Gunakan sampai 200 �ti
suspensi bakteri dalam 200 µI PBS. Tambahkan 200 µI Buffer AL pada
sampel kemudian vortex selama 1 5 detik. Inkubasi pada 56°C selama 30
menit
dan 95°C
selama
15
menit. Spin down tabl.\ng microcentrifuge 1,5 ml
untuk mengha pu s tetes dari dalam tutup. Tambahkan 200 µI ethano l absolute
(96-1 00%) ke dalam sampel, dan vortex selama 1 5 detik. Setelah itu
centrifuge dengan tabung microcentrifuge 1,5 m l untuk menghapus tetes dari
bagian dalam tutupnya. Dengan hati-hati masukkan ke dalam mini spin kolom
tanpa
membasahi rim, tutup dan centrifuge pada 8000 rp m selama l menit.
Buang supernatant dan ganti collection tube. Dengan hati-hati buka kolom
spin mini dan tambahkan 500 µl Buffer A W I tanpa mem basahi rim. Tutup
topi dan centrifuge pada 8000 rpm selama
1
menit. Buang supernatant dan
ganti collection tube. Dengan hati-h ati bu ka ko l om sp i n mini dan tambahkan
500 µI buffer A W2 tanpa membasahi rim. Tutup topi dan centrifuge dengan
kecepatan penuh 14.000 rpm selama 3 menit. Tempatkan kolom spin mini
da lam tabun g 1 ,5 ml microcentrifuge bersih, dan membuang tabung be risi
J
-
koleksi filtrat. Hati-hati terbuka kolom spin tambahkan 1 50 µI Buffer AE atau
air suling. Inkubasi pada suhu kamar ( 1 5-25°C) selama 1 menit, dan kemudian
centrifuge pada 8000 rpm selama 1 menit. Buang spin column dan sampel siap
digunakan untuk PCR. Apabila sampel tidak langsung digunakan untuk PCR,
maka sampel dapat disimpan pada suhu -80°C untuk waktu yang lama.
e. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan mesin PCR Biorad. Sebelumya
disiapkan terlebih dahulu PCR mix dengan menambahkan komponen­
komponen ke dalam tabung reaksi steril 1 ,5 ml. Komponen PCR mix untuk I
kali reaksi terdiri dari nuklease free water 5,5 µl, 2x PCR master mix 1 2,5 µl,
Primer F dan Primer R masing-masing 0.5 µI. dan Taq polymerase 1 µI.
Sekuen primer F dan primer R yang digunakan untuk ctxA dan crxB dapat
dilihat pada tabel 3.2.
Ta�el 3.2. Primer amplifikasi gen crx l 'ihrio cholerae
Target
Sekuen Primer
ctxA (F)
ctxA (R)
ctxB (F)
ctxB (R)
5 '-CTCAGACGGGATTTGTTAGGCACG-'3
5 '-TCTATCTCTGTAGCCCCTATTACG-' 3
5 ' ATGATTAAATTAAAATTTGG'3
5 ' TTAATTTGCCATACTAATTGC'3
Produk
Amplifikasi
302
302
375
375
Untuk menyiapkan PCR master mix lebih dari satu reaksi, kalikan jumlah
volume dengan jumlah reaksi yang dibutuhkan dan tidak lupa selalu
menyiapkan sekurang-kurangnya I atau 2 lebih dari reaksi yang dibutuhkan.
Campurkan semua komponen dengan vorteks dan disentrifus beberapa detik,
kemudian aliquot ke dalam tabung 200 µl masing-masing 20 µ1. Tambahkan
kedalam tabung yang telah diisi master mix tersebut dengan Template DNA
sebanyak 5 µ1. Mesin PCR diprogram dengan tahapan predenaturasi pada suhu
94°C selarna 5 menit, denaturasi pada suhu 94°C selama I menit, annealing
(pengikatan) pada 55°C selama 1 Menit, extention (pemanjangan) pada suhu
31
72°C selama 1 Menit, dan elongation (pemanjangan akhir) pada suhu
72°C
selama 7 menit. Proses PCR dilakukan sebanyak 3 5 siklus.
f.
Elektroforesis
Hasil P C R masing-masing sebanyak 6 µI kemudian dicampur dengan loading
dye 1 µI. Masukkan ke dalam well gel agarosa 2% di dalam elektroforesis
chamber. Saiah satu well diisi dengan marker sebanyak l 0 µI. E!ektroforesa
dilakukan pada tegangan 100 volt selama 45 menit. Gel kemudian di letakkan
di dalan1 alat pengamat DNA (Gel Doc) dan diamati dibawah lampu UV. Pada
elektroforesis kontrol negatif yang digunakan adalah akuades. Pada foto dapat
dilihat pola pita DNA yang ukurannya diketahui melalui perbandingan dengan
ukuran pita-pita standar "I 00 bp DNA ladder". dimana ukuran pola pita gen
ctxA adalah 302 bp dan gen clxB adalah 3 75 bp.
g. Purifikasi Produk PCR
Hasil dari elektroforesis akan dilakukan konfirmasi dengan sekuensing
menggunakan Genetic Analyzer (GA3 I 30) dari Applied Biu.sytem, yang
bertujuan melihat urutan nukleotida gen ctx Vibrio cholerae pada isolat Vibrio
cholerae penderita diare dan isolat l ingkungan pada KLB diare di Bogor tahun
2009.
Sebelum dilakukan sekuensing, produk PCR yang dihasilkan dimumikan
terlebih dahulu. Isopropanol 75% ditambahkan ke masing-rnasing tube produk
PCR sebanyak 60 µI dan d i inkubasi pada suhu 4°C selama 1 5 menit,
kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi selama 1 5 menit lalu supematan
dibuang. Langkah selanjutnya adalah penambahan etanol 70 % sebanyak 60 µI
dan disentrifugasi selama 15 meni t. Supernatan dibuang dan dikeringkan
dengan angin selama l jam. Produk presipitat digunakan langsung untuk
sekuensing.
h.
Sekuensing
Sekuensing dilakukan
dengan menggunakan 5
ul
dari
Big dye
(ABI
®
®
Prism BigDye Terminator v3 . 1 Cycle Sequencing Kit). 4 pl dari Sx sequence
32
buffer menggunakan kit siap pakai. 0.5 µI dari 10 µM primer dan produk PCR
yang diperkirakan 1 - 50 ng (estimasi 1 00 - > 2000 bp) dari produk PCR.
Reaksi PCR di lakukan dengan kondisi : tahap pertama 96°C selama 1 menit,
kemudian tahap kedua menggunakan 25 siklus : 96°C se!ama l 0 detik, 50°C
selama 5 detik clan 60 °C selama 4 menir dan 4°C sampai digunakan untuk
analisis selanjurnya. Sebelum analisis sekuen, untuk menghilangkan dye
berlebih digunakan Big Dye Ex yaitu campuran antara I 0 µI SAM soluaon
dengan 45 µI buffer solution. Sampel dianalisis menggunakan sistem sekuen
DNA 3 1 30 (Applied Biosystems), fmol DNA sequencing System; Promega
dan tehnik sekuense flourecent (dRodhamine Terminator Cycle Sequencing
kit; Applied Biosystem) menggunakan ABT 377 automatic sequencer.
i.
Analisis Hasil Sekuensing
Analisis hasil sekuensing dilakukan dengan metode deskriptif. Sekuen DNA
hasi! sekuensing dibandingkan antara isolat yang satu dengan lainnya, baik
antara isolat penderita diare dengan isolat lingkungan, dan juga dibandingkan
ant ara isolat yang dl gunakan dalam penelitian ini dengan isolat Vibrio
cholerae lain yang dilaporkan dari berbagai tempat di dunia yang diakses
melalui gene bank. Urutan nukleotida fragmen gen ctx Vibrio cholerae sub
unit A dan sub unit B sesuai urutan yang sama diposisikan sejajar (aligned)
menggunakan program SeqScape v2.5 dan BioEdi•t 5.0.6. Urutan nukelotida
yang sudah disejajarkan d!ubah kemudian rnenjadi bentuk protein sesuai asam
amino yang dikode oleh triplet kodon tersebut.
33
Stok bakteri Vcholerae penderita
Optional :
diare dan lingkungan
APW enrichment
TCBS
TCBS
KIAJvtIO,SSS
Lysine, Arginine, Ornithine. Maltose, Arabinose, Oxidase
Antiserum Polyvalent 0 I
Negatif
Positif
Antiserum
Antiserum 0 1 3 9
Ogav.,1a dan Inaba
Positif 0 1 3 9
Positif Ogawa,
I naba atau H ik OJ· ima
1
-_
_
_
_
_
�
Ekstraksi DNA
Deteksi Gen dengan PCR, elektroforesis, sequensing
g
Membandingkan karakteristik en isolat dari
penderita diare dan isolat dari lingkungan
Keterangan :
A
B
C
=
identifikasi spesies Vibrio cholerae
identifikasi serotype Vibrio cholerae
deteksi gen penghasil toksin Vibrio cholerae
VI. HASIL PENELITIAN
6.1.
Kultur Ulang Isolat Vibrio cholerae
°
Setelah diinkubasi selama 1 8-24 jam pada suhu 37 C, kemudian
diamati koloni yang tumbuh. Semua isolat penderita diare dan lingkungan
34
yang dikultur kernbali pada agar TCBS menunjukkan pertumbuhan bakteri
Vibrio cholerae. Koloni
Vibrio ch olera e memiliki morfo logi yang besar
dengan diameter 2-3 mm, permukaan yang halus, agak datar, bagian tengah
burarn
dan
bagian
pinggir terang,
berwarna
kuning
( meragi
sukrosa).
Pertumbuhan isolat Vibrio cholerae yang diturnbuhkan kembali pada agar
TCBS dapat dilihat contohnya seperti yang tarnpak pada gambar 4 . 1 .
Gambar
6.2.
6. 1 . Pertumbuhan isolat Vibrio cholerae pada medium TCBS Agar
ldentifikasi Serogroup dan Serotipe Bakteri Vibrio c/10/erae
Has ii
uj i
agl utinasi
dengan
antisera
.
poli mien
r 'ihrio
cho/erae
menunjukkan hasil positif pada semua isolat penderita diare dan lingkungan.
sehingga dapat dinyatakan bahwa seluruh isolat KLB diare di Bogor tahun
2009 merupakan bakteri Vibr io cholerae serogroup 0 1 . Semua kultur juga
menunjukkan hasil positif pada uji aglutinasi dengan menggunakan antisera
monovalen Vibrio cholera e Ogawa, sehingga dapat dinyatakan bahwa kultur
tersebut merupakan Vibrio cholerae 0 I serotipe Ogawa. Hasil identifikasi
Serogroup dan serotipe Vibrio cholerae dapat dilihat pada tabel
4. 1 .
35
Tabel 6. 1 . Hasil Identifikasi Serogroup dan serotipe Vibrio cholerae
Asal Sampel
Jumlah
Penderita Diare
Lingkungan
6.3.
26
5
Antisera
Polivalen
26
Antisera Monovalen
Antisera Ogawa Antisera Inaba
26
0
5
5
0
Deteksi Gen ctx Vibrio cltoferae
Hasil amplifikasi produk PCR sepan_1ang sekitar 300-400 basa
kemudian dilihat dengan menggunakan elektroforesis dan dilihat dengan
pencahayaan ultraviolet. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan
campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda yang dapat digunakan untuk
menentukan
ukuran
molekul
dalam
pita
sampel
dengan
melakukan
eiektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel.
Pita pada lajur sampel tersebut dapat dibandingkan dengan pita marka untuk
menentukan ukuran masing-masing sampel.
.
Terlihat dari foto bahwa hasil clektroforesis dari seluruh isolat yang
digunakan dalam penelitian ini menunj ukkan hasil positif gen ctx V ibrio
cholerae dengan adanya pita pada semua lajur. Pita -pada semua lajur sampel
dicocokan dengan band ladder (marka) untuk mengetahui jumlah pasang basa
DNA yang terdeteksi dan terisolasi dari sampel. Panjang pita yang diharapkan
disini adalah 302 bp untuk gen ctx Vibrio cholerae·sub unit A dan 375 untuk
gen ctx sub unit B sedangkan pada kontrol negatif tidak akan terbentuk pita.
Pada pembacaan elektroforesis produk amplifikasi gen
ctx
sub unit A
didapatkan hasil pita yang terbentuk dari semua lajur sarnpel yang kemudian
dicocokan dengan penanda menunjukkan bahwa semua sampel positif gen
etc
Vibrio cholerae karena pada semua lajur sampel menghasilkan pita sepanjang
302 bp (gambar 4.2).
36
302 bp
302 bp
302 bp
Gambar 6.2. Hasil elektroforesis amplifikasi gen ctxA dengan gel agarosa 2%
Hasil pembacaan elektroforesis produk amplifikasi gen crx sub unit
A menunjukkan bahwa semua sampel positif gen crx Vibrio cholerae dengan
dihasilkan pita pada semua lajur sampel pita sepanjang 375 bp (gambar 4.3).
375 bp
375 b p
375 bp
Gambar 6.3. Hasil elektroforesis amplifikasi gen ctxB dengan gel agarosa 2%
6.4. Sekuensing
Setelah
dilakukan
konfirmasi
produk
PCR
dengan
menggtrnakan
elektroforesis, selanjutnya dilakukan sekuensing untuk mengetahui urutan basa
37
nukleotida basil amplifikasi. Sekuen nukleotida dari fragmen gen ctx Vibrio
cholerae sub unit A dan sub unit
B yang telah berhasil diamplifikasi dari semua
isolat kemudian disejajarkan dan dibandingkan antar isolat yang digunakan dalam
penelitian ini, baik antara isolat penderita diare yang satu dengan penderita diare
lainnya dan juga antara isolat penderita diare yang disejajarkan dengan isolat
lingkungan. Pada sekuen nukleotida gen ctx Vibrio cholerae sub unit A
didapatkan perbedaan pada sampel dengan kode 2009.CS.09 (sampel penderita
diare) yaitu terjadi perubahan basa dari Timidin menjadi Adenosin pada posisi
basa 608 (608T>A). Sekuen nukleotida gen ctx Vibrio cholerae sub unit A dapat
dilihat pada gambar 4.4.
' '
�' " I " '"���"' • •· ;� · ·' " ' ;�: ' " ;9�"' 1 • · ·��; " I , ' ���· I" ' ���" ' 1 1 " ���" • I " ' �!�' " " · ��
;�� " I " ;�
· ·
=
"'
6"""
i:. �
t ttC.. �->CWQG�tti;-,r,;qr�:o atq >" O!i!"�°':ot::ccacc:t��:
.
�: · 9��,,.;t �ce!t: · ·;- ;Q; .�,�!.C· !• ,.:�·- ::9'-.:.\· c�!IC":��t :.,\ �t.l�et9: �:3.gc:c.,c::.qcJiCcc��c�tgt=;.tt$CQHn.it-9
1 """
::it'S.CS .01
· · . . · . . · .... .. · · · ...... . . · ·.. .. . . . . . . .. .. · · . . · .... · · . . ·
. . . . . . . . . . . . . · . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . · ..
.
.
,
.
.
. .
,
=.:!.O:
=-:;. �. o;
· · · · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · . . . .
..
.
..
=.cs.01
. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
..
.
.
. . ...
.
.
. · . .. . ..
· ... .... . ..... . . . . ... . .. . . ... .... . ... . .... .... ·· ..
=.cs.as · .. .. . . . . . . . .. . .. . . . . . . . ... . .. .. . .... . . .. ·
. . ....... ..
· .. · .. · ·
... -· .
..
..
. .. .
.. ..
.
..
. . . .. .
=.0 .06 . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .
�.cs . 01 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
· · .................................................... · . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . · . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. . . ... . . . . . . .......... . . . . . . . . · ....... .
.cs .oe
:::.:: :::: ::::::: : : :::::: :::::: : ::::.:::::::::: ::::::: : : : :: :::::: : : : : : : : : :: : :: : : : : : : : : : :: :: : : : : : :: : : : :: : : : : : : :: : : : : : :: ::: : : : : : : : : : :: :: : : : : : :: : : : :: : : : : : :
:�:g�o
�.J
, .Otl · · · · · · · ··· · · · · ·· · · · · · · ·• • • · · · · · · · · · · · · ·· · · · · · · · ·· · · · · · · · · ·· · · · · · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · • · · · · · • ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·
. . .
. .
.
. . . .
. .
..
. . .
.· . . .. . .
=.:s.011 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
... ... .. · ..... · · · .... · • ... ·
............ ...... ......... .. · ..
:=.:S.Oll · ... ..... .. · .... .. . . ..
''
'
ii � ��
..
.
•
'
' ·
���" I " ��;"
· "I"'
..........
..
.
.
......
..
..
.
......
.
.
·
I'
.
'
"
1
...
.
.
........ .
..
.....
.
.
...
..
...
•
.. . .
.
"I'"
�
. . ......
. .
.. . . . . . . . . . .
·
I
.................
. .........
.....
...
..
.. .. .
. . . . . .
...
.. . . . . . .
..
..
. . .
. . . ............
.. .
. . ... . .
..
. ..
..
....................... .
. ........
. ..
.
...
...... ..
.. .
..
..
... ..
..
.
..
. . ..
..
.
.
.
..........
.
.
..
..
.
..
.
..
..
.
..
.
. . .
....
..
..
..
.
. . . ..
.
"
:::cs.:s .011 . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . . . . . .
..... .
. .01 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
................
. . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . ..
. . . .. . . . . .. . .. . . . .. . . . .
. . . ..
..
....
......
. . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. .
. .01
1
1
::;:s :s
..::S CS
,
�.CS.O!S
•• . . . . . . . . . . . . · · · • · ... . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . ·
· •· . . . . . . . . . . . . . .. · . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
,
..
'
.
. .
.
• .... ·
· • • • • .. · .... .. . . . . . . . . . .. . ... .. ..... . .. .... .. ...... . . .. . ... .. .
·
· ..... · .... •
· .. · ..... · .. · ............. ·.. · · ·
. "" ....... ·• · · ..... · • • ... · · ·· · ........................... · ·
·
· ·
:: : : :: : ::: : : : :: : : : : : : ::: : ::::: :: : ::: .: : :::: :: : :: : : . : ::: ::: : : : : ::: :: : :: ::: :: : : :: : : : :: : :: : : :: :: : :: : : :: : :
:g:g:; ::: : :: : :: : :: : :::: : ::: : :: : : :: : : : : ::· · •::· :":::" ::· ": :::
=:!;.CS.021 · · · · · . . . . • . . · · · . . · . . · . . · ·
· · . . · · · · " • " · · . . • . . · · · · · · . . . . • . . · · · · · · . . " " · · · · · · .... · · . . · · · • " · · ' · · · · · "· · • " • · · "' • · · · " .. · · · · .. ·
::ts.CS.OH
· ...... · . . · . . · . . • · . . . . · . . · . . . . · . . · . . . . . . · . . . . . . . . · " . . . . • . . • . . . . . . . . · . . · . . · .. · " " .. . . · . . · " .. · · ".. .. • . . · . . · "· . . · · " . . · " · · · . .
:O.CS.Oll ... . . . . . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . · .... .. . . . . . ·
. . . . . . ................ .......
::s.-:S.016 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.. . .
. . . ...
. . .. . . ..
.
. .
3=5.CS.Ol7
.
. . . . ...
.
··· ... • . . . . . .......... .... ......... ····· "
• · · .. · • · .... •·•• · · ..... ................... · . . .
.=.CS.Ole · .... .. . . . .. .. . ........ ...... .. .. ... .. · .. .... .. · ·· · . . . . ·
· . .. · ' " . "" . . . . . .
.
.
. ..
.
'
.
.
.
.C5.0l9
O
.
. ..
..
.
" · · " · .... . . . . . . . . . · . . . . . . . . . . . . .. . .. . . .. . .. . .. .. . . . .. . .. .. ..
ts
�.:S.O.OlJl .
.
. , . . . . . . . . . . . . . ' . . . .. . .. . .... . . . . . . . . . ... . . . . . . . · .. . . . . . · · " . . . . . . . . . · . , , . . . · . . . . . · .. ... . . .. . .. . . . . . . . . · · . .. .. .. . . . . · " · ·
::;:;s.CS.017 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
=.CS.QI! . . . . . . . .•. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
CS.010 . . . . . . · . . . .
· . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .
•
.
..
.:.J
·'
�
_,_.
���i:r
=.:s.0
2
=.cs.al
=.:s.01
=.-:5.0l
:::z!.:S.06
.
.:::zl!'.:S.07
.::::;
::s : :
. cs .0 10
:=s.
:s.011
cs.012
:::S :S.Oll
-CS.Oil
.:s.011
:m :::S.016
:i:s.:S.017
:S.OIS
:S.0!9
:S.010
:s.021
:S.021
:S.OIJ
.
:!.Oii
:::S.Ol5
..
..
.......
.
..
........
............
....
=
=
....
....
•
......
............
. . . . . . . . . .. . .
....
........
'l''''l''"l''''l''''I'
;!l
·'70
i!O
•
.......
·
..
. . .
..
..
........
. ".
.. ..
............
.
' ' l ' " ' l ' ' ' ' l' ' ' ' I '
i9t'
�QC
..
. . • . . .. . . . . . .. ..
..................
'' l ' ' " I ' ' ' '
..
. . .. .
''''l""I'
'
..
•
..........
....
........
..
..........
...
I''"
..
'
.
''''I
'
.
.
.... .
.
•..
........
...
. . . . . .
.
•
.
.... • . .
....
..
......
.
.
.. ..
..
.. . .
..
'
.
.
..
.
.
'I
' ' 'l' ' ' 'i ' ' ' ' I ' '
.
.
· "·
.
..
...
..
.
.
...
....
..
..
..
.
........
..............
l''''I''''
''''I
..
. . . . ..
.....
.. . .
..
. .
..
.
.
...
..........
.
'''l''''l''''l''''I''
'I"
•
�!!l
!10
559
560
S70
566
S9!l
600
•
·5:0 · .;20
··
·
·· ·
���������
�����: �������:����� ��?:��&c������--���t�� · :t�� · ���� ���,--,�·.c�����- � :Q , �'. �·�q�o . . �\: · · ����:�:1 �������}�� �· �·�}: ��:��� ��q�:������·:
�
��!t
.
�
. . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . ..
.
....
.....
. .....
..
.
..
...... ............... ' ....
...
. . . . . . . . .. . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .
.. . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
.
..
. ..... . . . ... . . .... . . . . . . ..... .. . .
.. . . . . . .. . . . . . . . . . . . ..
.. ... ...
.
."
.
. .... ... . .
.. . . . . ....
" (?\
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : ::: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : ::: : : : : : : : : : : : : � . : : : ::: : : :�: : : : : : : : : :: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : . � : � : : : : : : : : : : : : : : � : : : : : : : 0
.. '
..
.'
'.' .
' ' . . ..' . .. .
' . . .. . . .
. . ' . . . . . .. .
. . . . . ..
.
.
..................
.....
....
' ..............
.....
.
.
.....
'
"
.....
......
,
..
....... . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
...
..
'
.........
.....
.'
.....
...
'
.
....
.........
...
..
'
...
. . . .. . .
'
............... '....
....
.
..
.
..
.
'
.
. . . . . . .
..
....
...............
.
..
......
....
.
.
'" ' '
' .'
' '
. . ................................................
.
''' '
'" '
' ''
'.
.. . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . .. . . . ... . . . . ' . . . . . . . . . . ...
. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ' . . . . . . . . . . . . .' . . . . . ' . . . . .
. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
'............. . .'..
.
'
.
.
.
.
"
"
'"
, .,
.......................... ........... . . ............... .....................
'
" '
'
'
.
'
. . ...... , .......... , • . . . . . . . • .. . . . . . . . . . . . . .. •
....................
.
'
.
'
..
............'.. .....
. . . . . . . . . . .. . . ' . . . . . . . . . . . . . .
....
..... ..
.... .... . ... ... .. .... .... . . . .... . ..
..
... . ... . . ..
.. ...........
.
... ... .............. . ......... ... . .. .............. ... . ..... ..... .... .... ... .. .. ..... ........
. .. . . . . . . . . . . . . . . . .
.. .. . ....... .. ..... ..
.. . . . • .
. • • ..
.. . . •
. . . . .. .
. . .. . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
,,
,
..•
. .
.
.
• • .. . . • .. . .. .. . .. . . • . . . .. .. .. .. . . .. . . . • .. . . .. . • .. • . • • . .
"
.
' . . . . . .. • • . . ' "
.
.
' '"
.
. .
' '
.
,,
,,
. . ,
. .
. .
.
.
. .
.
.
.
, . . ,. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . · . . . . . . . . . . . . .
.
, . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , .• , . . . .. • . . .. . . . .. .. .. . .. . • .. . .. . .. • . .. . .. , • .. . .. . . .
.
. . . . . . . ... . ..
.
:S.026 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. ... .. . ..
. . . . . . . . ..
... .
-·· ...................... ·- -.......... ·-··- ................. . . . . . . . .. . ...... . ...... ···-· .........
::s.021 . . .
..
.
:s .oze
--:S.01� '
. ''
.
'
'
'
'
''
.
'
.............................
.:S.OJO
"'
"' "
"
"'
' "
".
::S.031
.. .. • .. . . .. . . .
'
. . . . ..
•
.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.................. .......
... . . ... ..... ... . . . .. ...
...
........
...........
..
...
.
.
,
. .
....
. . . . . . . .
.......
..............
...
.
..
.
...
.
. . .............
......
..
.................
.. .. .
.
. .
.. .
....................
...... .. ... ... ... .... ... .
.. ..
....•
..... ...
. ..
.........
.. • .
....................
. .
. . ........ .
...
..
.
. .. . . .
........ '..
.
" ..... " "...'
.....
.
............. .............
' . . .. . ... "
. " . . . . . ". � ' " " . . . .
.......
.
. . .
.....
.
.
................
..
. . .
'.
..
.......
. . . . .
......
... .
.
..
.........
..
'.
....
...................
. ... .....
..
......
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.............................
. . . . . .
..
. . .... ... . ..
.
.
. ..
..
... .. . .... . .. ..
.
..
..
..
.
...
.
.
. . . . ..
.
..............................
...
.... .
. . . . . .. .
.
Gambar 6.4. Pensejajaran nukleotida gen crx sub unit A dari semua isolat sampel
. . . . . . ..
38
Pensejajaran antar isolat dimaksudkan untuk menyesuaikan penomoran urutan
basa nukleotida dan asam amino isolat yang digunakan sebagai sampel dalam
penelitian ini. Pensejajaran dilakukan antara isolat penderita diare yang satu
dengan isolat penderita diare lainnya, juga antara isolat lingkungan yang satu
dengan isolat lingkungan lainnya. Perubahan sekuen nukleotida pada gen ctx sub
unit A pada sampel dengan kode 2009.CS.09 juga mengakibatkan te�jadinya
perubahan pada sekuen asam amino dari Tirosin menjadi Aspargin (Y203N)
seperti yang terlihat pada gambar 4.5.
"..:.J , .
•
R!,...,
!,r
:l:E
=
=
-5
�
1�
:=!;.G.O
l
:SS.CS.01
'=5.:!.Q)
!:.S. .:Z.C4
1 , , , ,
' ' ' 1 1 . , 1 . 1
110
I
• •
120
, , 1 , , . '
I ' . , ,
130
1 , . , , 1
• •
140
.
,
.,
. , , . 1 , • • • 1 , , , , 1 , , , ' I ' ' . • 1 , , , , 1 , . , , 1 . ,
150
';T � \..'R;fl!Lo \ V.::
'"L·� 1 :;;; L.R;·
,.tt�L V - ·.
�T IL�i··•'i:.""i'; Y l \
.VI::r :;::_�.·:·nP:,v:i:1�.:L
.
- - . - -· .
. - - - - · . . . . - .
- . - . . •
• .
- .
.
..--.
• - - . . . . . .
.....-..•
. . . - . . . . . · ·
- - . . . • . . -
.
.
160
).i.·1-'dl t\ E.:,:E\'.. . . . . .. . .
170
..
1.
.
t::
1&0
. .· _ I
'
• .
J:•".'
1 , , . , 1 . , . 1 1 , , ,
190
'/! l•!:. :..:;R;JR
1 1 1 , ,
200
;JH..11'.H
=::;. :;.::
:.::. .:S.,j�
..=;.::.cj
�-�-Ce
::;;;.�.c;
. . .o
.=.cs.0ll
.::G . CS .012
=.:s.01c
:::c; . cs.011
=.cs.011
::S.:S.01!
�.:S.01£
:=i;.::S.017
=.:s.011
=s.�.c:s
.
-=:.; .:..:.G
�C
::25.CS.O?I
::E.CS.Oll
.:::tS
.::S.Oll
,.::_cs.02�
.:S.CS.Oll
::::S
.CS.OlE
..::s
.::s . 2
00
�.::S.021
_,. ::s.ou
.::S.OlC
.-;::!;.::S.Oll
Gambar 6.5. Pensejajaran asam amino gen ctx sub unit A dari semua isolat sampel
Pensejajaran sekuen nukleotida hasil sekuensing gen ctx Vibrio cho/erae
sub unit B antara isolat yang satu dengan lainnya apabila dibandingkan dengan
sekuen referensi gen ctx Vibrio cholerae sub unit B dari gene bank menunjukkan
bahwa semua sampel dari penderita diare dan sampel dari lingkungan mengalami
mutasi substitusi pada posisi basa 997 yang mengalami substitusi dari Timidin
mel'\jadi Citosin (997T>C) dan pada posisi basa I 085 yang mengalami substitusi
Timidin menjadi Citosin ( I 085T>C). Sekuen nuleotida gen ctx Vibrio cholerae
sub unit B dapat dilihat pada gambar 4.6.
39
..=J
• ••• 1••• · ,
, , , • . • •1 . , . , ,
=.,,.....,.
..,, · ..,
m
• · , .••·1 · • • 1 •••
5��
• • , • • • •1 · · · · 1 • • • •
;;:
m
s"
•·.,.••
540
•
�;
"
9!:
" ••
..
•
•
·
•
,._
;<(
.'
�.
'
I
·
tc·
. .
(
e.9ccuit9c�c���11tctcctcidnt;tt.!Cti;�rt:.r:cr�.�=�q:���ct�?1:cr,c�c��1:.::t.,:ec9t�d.at;•
..
. ..
. . . . . . . . . . . . . c.. .
.
.
..
. .
. . .. . . ..
.
.(
. ..
..
..
.
.
. . .
(
.
........................................... .............................. .
.
&Lq.atu.e.ntMae::::.tQ9tqc.1..t':'.t it.1ic�9r.':�t::�te.:� c.:c
� P.ie ter
:::5..::S.01
.... ..•. ... . ...•..•. .
....... . ..
-::S.0
2
:::5.03
--= ::s.o�
::s .os
. .... .
.
- .
.. . .
.
. . . ... . . . . . . . . . • .
. ...
. .
..
. .
.. .
..
...
....
...
. . . . . . . c. . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.... .
.
. .. .
. .
...
.................
, ............................ . .. ......................................
............. . . . . . . . .
..
..
.
. . .
... ................................... . . . . . . .......
.
.. . . .
.. .
.. .
.
..
.
. .. . .
. .
.
.
.
.
...
.
iJ
.
.
.. . .
0£
-:::1.
r"llt. .C!.()'7
.-.C.116
� .OS
::S.010
::S.011
:::5.012
=-:s.Oll
::s.011
::s.ou;
-..:.01!
:
..
... ... .
llllll'tl''''Jllllllllll•tlljlltlll
twi
mi
.....
.
.
.
....... . . . .
........... . . .
(. . . . . . . . .
...
.
...
.. . . .... . . .. .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .
.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . .. . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . ,.. . . . . . . ...
.................
. . .. ..
. . .. .. ....
.
............
......
.. ...... . . . . . ...
.
.
. . . . . . . . . . . ........
(. .
...
.
.( . .
. (.
.(.. .
.
.. ....
..
...
....
.....
.. .. .
. . . . . . . . .......................... .
···- . . . . .... .... .. .. . . .. . . .. . . .
..
.
.
- - - · · . . .......................
·
....
. . .... .
.................. ........ .............. (. . . . . . . . . . . . . . . . .
.
.
.. . . . . .. . . . . . . . .
" " " . . . . ... . . ..
...
.....
......
.
.
. ..
... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
.
...
.
.
.. ...
.
.
.
..
.
.
..
.
.
.
?'.OO
u
:?r
mi
U411
1m
m�
mi
1!80
mo
!!«'
1211
?m
im
11(1)
12S9
·
•·
·
:::::.-:i:tc:.:.�;h:�c:
o
.:.·:::s.�::� .:�'!Ct:.· :r::·.:!...�� ::::· :.::-.
.:.,:o�:t:t.!��cca��:
.
�a'•!.•.rA" :::1::-:·"•· ��..:::
:
::.:: :;::c!
'.totttt �::�c:,:c.:r�'!!'.· �'!
'l"''l'"'l'"'l''"l'"'l''''lflHjl•I 1 1 1 • 1 1 " ' ' 1 ' " ' ( ' ' ' ' 1 ' " ' 1 " " 1 ' ' " 1 "
mo
=:;;;-:::.
;c:�
•tr to:-4...ot��:l�t,rn:·"!.;1�:,:c�3::e.::c�
�.i::!
�.w
....03
"°'.C>i
-ZS.CO
.
.
- .... .. ..
.. . . .......... . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . .
...
. ..
......
.. ...
...... .
. . . . . . . . ..... ... .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . ......... . . .. . . .. . . .......... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .....
.... .. ...........
. ....
.. ..... .. . . . . . . .
. . . . . . . . . . . .. . . . . . ... . ... . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . ........ ..... ...... . ........... .... (. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . ....
.. . . . . . . . . . . . . . .. ...... . . . ., .
... .... . ... .... .......... . . . . . . . . . . . ................ . . . . . . . . . . . . . . . ....... ........ . . . . . . . . . . . ' ................ ' ... c. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ' ' . . . . . . . . ... . . ' ... . . . . . . ,. , . . . ..
... .... . . . ' . . . . . ......... ' . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . . . ' .. .. . ... c. . . . . . . . . • ' . . . . . , . '' . . . . ' .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .. .
. . . . . . . . . . ... . . . ... . ... . . . . . . . . .... . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.. . . . . . . . . . . . . . .
. . .. . . . . . . . . . . . . . (. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ·- . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .
.................................... ............... ............ ......... .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .[. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...
..... . . . . . . . . . ... . . . . . . . ... . . . . . . .. . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . ... . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .(. . . . . . . . . . . . . . ... . . .. . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .. . . .. . . . ... .
. .. . . . . . .. . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .(. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. .. . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. .. (. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . c. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . ' . . . . . . . '' . . . . . . . . . . .. ' . . . . . . ... . . . . . ... . ... . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . " . . . . . . - . - - - . . . . . . . . . . . ..
.......................
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . c . . . . . . . . . ... . . . . . . .. . . ... . .
. . . . . . . . . . .. .. . . . . . .. . . . .. . . . . .
..... . . . . . . . . . . . . ... . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . .(. . . . . . . . . . . . . ... . .. . . . ... . .
. ... . . . .
..
. . . . . . . .. . . . . . .. . . .. . .... . . . . . . . . . . . .. . . . . ....... . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . .
.. . . . . . . . . . .
. .. . . ...... . ... . . . .(. . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . .. .
...
. ...... ..................c. ..... . . . . . . . . . .... . . . . . .. . ... .
.. ..
. . . . . .. . .
. ..
. . . .. ...... ... . .......
..... .
..... ............ ........
.. . . . . . . . . . . . . . . . .
........ . . . . . .
. ..... . . ..... c. ....... . . . .. ... . . . . .. . .. - . . . . . . . ... .... .. . . . ..... ..
.
. . . ..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
..
.
:=.;3.0ll
.....
........ . ........ . .. .. .. . .... .... . . . . .. . . . . . .
. . . .. . ... . . . .. . .... . . ... . . ... . ... . ....... . . .. . . ... . . ... ...
. ....
.
"I " '
leSt
. ....
. . .....
. .. . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ............................ c....................... ..
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , ............... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . t. . . .
.,
. . . . . . . . ... . .
.. ....
. . . . . ..
' l "" I " ' l ' " ' t
. . . ..... .. .. . . .... . . .. . ..
. . ..
..........
I
...
,:,::.:�-.:·.: �:o;::• �. C'.,�, ·.i;i;: , 1�i;.!Q!.q1:;;.:�t.:!l
- .. ... . .....- . .. . ...... . . .. .
.. .. . . . .. .... .. .. . ..... . .. . . ..
. . . . .. . . . . .
.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . .. .. . . . . . . . .c . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . .. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . .. . . . .(. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .
. .. .. . . . . . . .. . . . ... . . .. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .. . . .. . . . .. . . . .. . .
. . . . . . . . . . . . ... . . .. (. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ............ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
�
""'.03 0
'
'1
' •
·
·
.,.,�� .
�.r:.-
.
........(.. . ... . . ... . •..••. ..• ...
••
.
..
... .
........(. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....... . . . ...... . . . . . . . . . .
... . . . . .c...... . . . . . .... ........ .. . . . . . . . ..
. ..
..
.. . . ...
.....
. . . . . . . .C• • • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
, ......
. . . .... • • • • • • . . . . . . .. ... . . . . •
.
.:
.
1 1 1 1 1 1 • 1 1 1 1 1 1 11p11111n11•llll1tllJll 1 1 1 1 1 t o l f l " l ' " ' l ' ' " f "
- . . . .• . . . . . ..
....
..
...
.. . . . . ... .
.
.
. .......
.. . . . . . . .
. . .. ,
.. .
..
..
.
"'
.. . . . . .
. ....
.. _
. . . .. .. . . . . . . . . .
.
... ..
..
. . . • . . . .. .
. ....... .
.
.. . . . . .... •
·•·•···•
.
- . . . . . . . ... ... . . .
.
. ... . ..
..
.. .
.
.
. . .. ,
.. ... . ..
......... •
... . . ,
".
. . . . . . . . (. . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . .
. . . . . .. . . . . . . . ' . . . . . . . . . . .. . . . .
........ (. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
... ..... . . . ' ...
' ' ' ' ' ' ' , (, , , , , , , , , ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' " ' ' ' ' ' ' ' ' • ' ' ' ' ' ' ' ! I O • O o o ' ''
''''' ••'
·•·O · • • • • , . , ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' I
O • I O o • • O • ' •·•·•·•·•l•I • • l • • o • o • • • O • ' ' ' ' ' ''' '
( . . . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . "" . . . . . . . . . . . . .
.. . . ... . ... .. . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . . . .
. . . . . . . .C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . ' ' .. c. . . . . . . . . . . ' . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . ' . . . . ' . . . . . . . . . . . . . " . . . . . . . . . . . . ' . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . ' . . . . . . . . . . . ' . . " . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ' - . . . . . . . . . . . . " . . . . . . . .
. . . . . . . .(. . . . " . . . . . . .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . •.. . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . ... . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . " ' . . . . . . . . . . . . . . .
.... ' . . .(. . . " . . . . . . . . . . . . . . . . . . ' . . . . ' . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . ... . . ' ... . . . . . . . ' . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . - '
........ (. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . .
.... . . . . c. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ................ ......... ' . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... ..... . .... . . .. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . . . . . " . . . . . . . . . .
. . . . • . . .c. . .. . . . . . .... . .. . .. • •. ... . .. ...... .. .... . . .... . . . .. . ... . ... .. .. • .. . ... . . .. .. .. . .. ... . ... . . .... . . .. . .. . . . .... . . . .. . . . ..... .... . . . . · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·
........c. . .... . .. .............................. . . . . . . . . . . . . ....... ... . . . . .
.... . ..
. .. ... . . ... . . . . . . . . .... . . . . . . . . . . ... . ...... . . . . . ... ..... . . . .. . . . .. ... .. . . .. . . . .. .
. . . ... . . . . . . . . ... ..... .. ... .......... ... . ....... . ... . ... . . .. . . . ... . .....
................................................ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....... .. .... . .
.
.
........
.
.
.
.
..
.
.
..
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.. .
..
.
.
.
. 017 ........( . .
. . .
.
.
(
O IS
. C... . . . ..... . .... . . .... .. ........... . .. . . . .. . . ........ . .... . ... ... .... . .... .. . .... . . .. .. ..... . ... . ... ...... .. ... .. . . .. .. . . ... . . ... . . ..... .. ... .. .. . . .... .. . ... . . . . . .. .. . . ..
. . ..
.. .
..
.
.
. .
. .
.
.
::s.czc ........ (
--:!.OJ� ........ (
.
.
. .
..
.
. . .
.
. . . . ..
.
. .
.. .. . . . .
.
.
.
. .
.
.. .
=..::5 ..Q22 ........ ( . .
.02
)
......
=...:s
�'.12 4 . . c........................................................... . . . . . . . . . . . ............................................. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.. . .
.
.
.
" .. .
"
. ...
-..:S- 02 5 .. ' . . .c . . .
..=.:s-'!2 £ .... . .(. . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
. " ..
.
.
.
..
.
. . c. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . .. .. . .. . . .. . . .. . . .
. .. . . . .
.
..
.
.
.
. .
.. ...
.
=..:oz;
:-s.
c. . .
..
....
,
...
.
-.me . . .
' . . . c. . .
. .. .
.
. . . . .. . . . .
.
.
.
.
..
... ..
..:...:S.. 029
.::a..::5
�.lllE
•
•••••.•• . ..... ..... . . ... .. . ... .. ... . . . .... ..... . . ... ..... . ... . . ... . ... ... . ... . ........... . . .. .. ..... . ... . .... .. . .. . ....... . . . ... . . .. . . ..... . ..... . ....... .. ...... ..... . . .. . . . .... . . .
....
...
... . . . . . . . .. . . .. .
.. . ... . ...
... . . . .. . . . . . . . . ... .
....
...
........ .. ..
....
...
. ..... ...
...... . .
. ..... ... .. . . .
. . . . . .. . . . ..
...........................
...
.....
.....
. . . . ..
..
...
. .....
. .. .
...
.
... . ....
......
. ....
..... .. . . .. .
. .......
..
. . ..
.
. . . . ..
.
... . ....................... .. . ... . . . . . . . .
. .
.
.
. . .. . . ... .. .. .. .. ... . .... . . ... . . . . . . . . .. . . . .. . . . . .
.
.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
... . . . . .. . . . . . . ...
.. . ...
...
. . . .. . ... . . . . . . . . . . . . . . .
. . . ..
. . ..
' . (. . . . . . . . . . . . . ' . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ' . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . ' . . . . . . . •
.
.. . . ..
.
....
..::L:::s -OlD
;:5., 0]\
..
....
' .
. ...
..
...
........
0 11 t l • t
....
..
.
. . . " . ' . . . . ' . " . ' . . . . . . . . . . . '" . . . ' . . . . . . . ." . . . . . • ' . . . '" . • . . ' . . ' ' . . .
.... .
....
'.... '
...
..
. . . . . . . . . . . . . ' ' . . . . . . ...
,
.,
.....
...
......... .
...
....
....... ....... .......... ..
.. ...
...
.. ..
.....
,
. ..
... .........
..' .... '
. . . . ... . . . . . . . ... . . .. .
..
....
...
,
....
. ... ' .. . .
... . ...,.....
.
.
. ' . ' . . . ' ' . . ' ' . . . . '. . . . . . . . . . . . .
.....
. . . .....
. . . . ....
. . . 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
'' . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ' . . ' . .
C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . .
'
.'
.. ' '...' ... ..
' ..
... .....
.... .
. ..
...
... ... ...
.
.
"'..''
...... ... . . ....'
. ...... . .....
.......... .... ....... . ... ..... . .... ... .
' ' ' .. . ' . . . . . . . . . . . . . . ' . . . . . . . . . . ' ' . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ' , , . . . '
.
. . ..
...
....
.. ' '..
..
.
,. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .· . . . . . . . . .". . . . . . . . . . . . . . . . ",.. , ...., .............................,. ,............ ·
r f l t tl t o l • '' ' ' ' ' ' ' •• l l• • 1 • • • • • l • • • • • • • • 1 • • • •• •t • • • > l l • • • • • • • 0 0 0 0 1 • 1 1 • 1 1 1 • 1 1 0 1 ; 1 1 ' ' · ' ' ' ' · · l l • • l • • i • • • • • • • • 'f ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '
• O • • O • • • • o • • • • • • • • • • • • • •• •• , , , , , , , , , , , , , . , , , , ,
Gambar 6.6. Pensejaj aran nukleotida gen ctx sub unit B dari semua isolat sampel
Mutasi substitusi pada posisi basa 997 yang mengalami substitusi dari Timidin
menjadi Citosin (997T>C) dan pada posisi basa 1085 yang mengalami substitusi
Timid in menjadi Cito sin ( 1085T>C) mengakibatkan perubahan asam amino pada
posisi 333 yang mengalami perubahan dari Tirosin menjadi Histidin (Y333H) dan
pada posisi 362 yang juga mengalami perubahan asam amino Isoleusin menjadi
Treonin (I362T). Sekuen asam amino gen ctx Vibrio cho/erae sub unit B dapat
dilihat pada gambar 4.7.
.
. ..... . . . . .
40
�----;i: 1 ' ' ' ���· ' ' I ' ' '��� ' ' ' I ' ' ' ;�� · ' ' I ' ' ';��· ' ' I ' ' ' ���' ' ' I ' ' ' ��� ' ' ' I ' ' ' ;�� • ' · I ' ' •��� · • ' I ' ' ' ���• ' ' I ' • · ;�� ' · ' I · · ��� · • • I • • • ��� • • · I · · •
116961 �l•r ;HU:LY.f•jVfil\ILLSSJ.'f;,;,:,, ,�;ITDi.(i.EYlifiiQ IrTWDKl fSYTESLJ.�KR l:ff!.! IH
T lk-.'.l1-.:VEVP�S<)HlDS·�Kl:l lEl<nf:D'.'i.R!-�".lH ...;:-.:o:"·:VJJ,;11tirni. 1i.!.lSXI:<
2009.CS.Ol
1009.CS.01
1009.CS.Ol
1005 .CS.DI
2009.CS.OS
��� :�;:�;
-
12�.CS .09
1ZOl'?.CS.lle
2oos.cs.01;
l���:�:�:i
12CD9. CS.0!3
1CD9.CS.O!l
jltl9.CS.01S
·?�09.�S.016
·tJO�.C5.0li
l20os.cs.010
12ou; ..:s.a1s
;2cGs . cs.020
i���: �� :�;�
111o�s.cs.01;
1009.CS.021
ZOO>. :s.025
'lOiS.:S.OIE
zoos.cs.on
'1C09.C
S.02f
W99.CS.015
::�. :s.o;�
•. . . . . . . . . . . . . . . . .
'
.. , , . , . . . , . . . . . . . .
.. .. . . . .. . . . . . . . .
, , . . ..
, .... ... .
• . ......
:: : : : · :
. . .. . .
.. .. ..
.. . . ..
:::::
.. : : : : :
...... ....
. . .....
.
. .. .•
•
;;
. . . . . . . . . . . . . . . . . . H. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . , . . . . . . . . . . . Ii . . . , , , , , . . . . . . . . . . . . . . . . . .
• . . . . . . . . . , , , , , , . . , , , , ,
. . . . . . . . . . . . . . . . . .R . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
, . .. . .. . . . . . . . . . . . . . . . .
• . . . . . . . . . . . . . . . . . H . . . . , • . . . . . . . . .. . . .
. . • .
. ............ .
• . . . . . . . .x. . . . . . . .
..... ... . ....
. . . . . . . . :�::
. .
:· . : : : : : : . :
.
: : : : 1.
. . . . . . . . . .:i . . . .
. . . . . . . . . . . f.. . . . .
. . . . . . . . . . . . . . K. . . . .
.
.
...
. . .. . .. . .
.
.... ..
. . . . . . .. . .
.. . . . . .
.. , .
. .. .. .. . .
.. .
,
. . : : . : :: : : : .
. .
...
..
.. . . .
..
.. .
.
..
.
... .. . . .
.
.
. . . .
.
. .
...............
. ... . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . �. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.. ..
.
. . ..
...
: : : : : : :: : : : : : : : : :�: : : : : : ::: : : : : : : : : : : : : : : : : · :�: : : : : : : : : : : . : : : . : : : . : . : : : :
.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ;;. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . :. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , ".'. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.. ... . .....
. . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P.• • . • . • , . . . . . . . . • • • . . • • . . • . . . . . . . • .
. . . . • . • . . . . . . . . . . . . . . . • . • . • . . . . . . . . . . . r. . . . . . .. . . . . . . . . . . . .
•
.
. . • . . . • . . . . . . . . . . . . . . . • . • . • . • • . . . • . . • . tt . • . • . • • . . • . • . . .
. . . . . . . . . . . . .. . .
. ' • . . . . . . • . . . . ' . ' . • . ' . • ' • . . . . . • . . . . . . •�. . ' • • . • . . • . ' . . • • • . . • . • . • . . . 7. . ' ' . ' . . . • . . . . . • ' . ' . . • • . • . ' .
.....
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .H . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . .
.. .. . " ..........
. . • • • . . . . . , , . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . , . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . , . . . . .
. . • • • • . • . . . • . . ' i ' . • • - . ' - • . • . • • • . . - ' . •�. • • . • • • • • • ' . . . . . . . . . . . . . .
. .. - ... ' . . . . " . • • • • ' . • . ' . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . f.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ;
. . . . .. ... ..............
• . . • • • " . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ,H. . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . .:. . . . •
• .. . . . . . . . .. . ..
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . " " " . . . . . " " . " . ff, . . . . . " . . . . " " - . . " . . " . . : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . �. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
'
.
.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
............. .... , ,,..
................
.
.
.
.
.
.
.
... . . . . .
....
.....
.
• ..
. .
.
.
...
. . .
. .
.. .
.. . . . . . .. . . .
. .
. .. . • ..
.... .
.
. ..
..
...
.
·-
• .
..
. .
. . . ..... ....
..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Perbandingan Gen ct.x Vibrio cholerae Antara lsolat Uji dengan
Referensi dari Genebank
Selain dilakukan pensejajaran sekuen nukleotida dan sekuen asam ammo
antar isolat yang diuji dalarn penelitian ini, sekuen nukleotida dari fragmen gen
ctx Vibrio cho!erae hasil penelitian ini juga disejajarkan dan dibandingkan dengan
fragrnen gen ctx Vibrio cholerae yang telah berhasil diidentifikasi dari beberapa
tempat di dunia terutama di Asia Tenggara. Sekuen nukleotida dari gen c1x l'ibrio
cholerae yang diuji dalam penelitian ini dan dari bebcrapa tempat di Asia
Tenggara di bandingkan dengan sekuen lengkap gen crx Vibr;o
cholerae
yang
diarnbil dari GeneBank dengan ascension number 030053 sebagai referensi yang
mempunyai
panjang
sebesar
persamaan fragmen gen ctx
1369 bp. Hasil analisis menunjukkan adanya
Vibrio cho!erae antara isolat yang diuji dalam
penelitian ini maupun fragmen gen ctx Vibrio cholerae
dari beberapa tempat di
Asia Tenggara. Pensejaj aran dilakukan dengan menggunakan software pogram
BioEdit versi
7.0.5.0 dan Mega 4 versi 4.0.2.8.
.
..
Garn bar 6. 7. Pensejaj aran asam amino gen ctx sub unit B dari semua isolat sampel
6.5.
.
. • '
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .H. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.....
.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .H. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
.... . . .. . . . . . . . . -.
. . . . . . . . . . . . . . . .s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . - . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . 3 . . . . • . . . . . . . . . . . • . • . . .
. . . . . . . . . . . . .,.. . . . . . . . . . . . . . . . . , . . .
.
.
.
.
.
41
�'.6961
·
c
I'
� gj mm �m�u��1m�
' ' '( ' " ' 1 " " 1 " " 1
lUJ
Retem>Ce
01 strain VC14 IHatavs1a)
�� g; :�;:i� �g��o:�11�:��1
"l""I
320
"'l ''. " " "l "''I ' '
l3G
HJ
··;:s.' ;-•; ;
'Lt.:'
S;.i.t!Hi<(!!ThLC!L;""f.irn:;-i.'.itl.Jf>�rE,'.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . o. . . . . . . . . . . . .
Saudtl
l'iC
i·,·c 01 Starin Vl)l Clndia)
01 strain ClRSlOI (Banaladosh)
11' 111'
l60
' I'
l10
01/1111!''
'11
"I"'
l&l
JSll
I''
'l""I"'
JO
�
l " ' 'I'"
i!O
. K;Ir.•. :nm; .;:;.;1.T;; ·o'.•1;:;; KW!PJ!f.�TLF.I
�"'L:!AKl
.' J:IG.C'fill.lll(Tf'·· 'L:l..J:
.
. ...
. . . . . . . .
i. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
: : : :: : : :: : : : : :: : : : : : : ::: : : : : :: t: :: : :: : : : : >:::: : : :: : : :-:t: ::: : : : : : : : ::: :: : :: : : :::: :: : ::: : :: :: ::: : :: : :: : : :: ::
:. : : :
: : : . : : ::
.
12009.CS.01
2009.CS.OZ
i���UH�
.
::::.:. :::::L:::
:· · ·:::::
· • · - · · - ·· · · · ··f.
··
. . . . . . . . .. . . .
.
.. .
..
..
..
... . .. ....
.... .
..
.
... .
�..
... .
.o. .
..
...
. . ... . . . . . . . . . . . . , . . �.. . . . .
· · . . ........
l2oos.cs.os
2009 . cs. 06
,zoo9. cs.01
2Cll9.CS.Oe
2oo:i-. :s.o�
lC09.CS.CIO
:zou> .cs.011
1100;.cs.oiz
:2oos.cs. 01J
l50
·
: : : : ::
... ... .
,
.
....
· ...
:': :
. . . :: . .
: :
,, . . . . . . . . .
,.. . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
, . . . . ..
.. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .
.........
·
: : : : : : : : : : : : : : : . : . ·: · . . .
:
:
: :
. ... ...
. .
...
....
. . ..
"
"'
:
.:: ::.::: ::: J : ::: : ·:: : : : : : : : : : : : : :: : :: : : ·:: : : : : : :: : : : : : : . :: :: ·
'
...
..
�:-. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . .
.
: :
,,_,,,,
.
.. . .
.
: . : r : . : : : . . . : : : : . : : : : ::::::. ::-: . : : � : - : : : : : : : : : : . : : : : : : : : : : � . : : : : : : : � . : : . . . . . . .
• "
' . . ::. ' • • " " " ' • ' ' ' • o I • " • ' " • "I' ' • • • • • " I • • ' ' • ' ' " ' ' o ' " • ' • ' o ' ' • •" • • ' o • " ' ' '
·
. . . . . . . . . . . . : : : : : : : : : : . : : :µ::::::::.:::::::::: · :::�::�::-:::::: :::::::::�:::::::::: : : : : : : : : : . . : ..
. . . . . .. . . . ;_... .. . .. . . . . ... . . . - .. ·!··· · · . . . . . . . . . . . . . . .. . . . - . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . .. .::. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . '.;.," ' ' ' ' . . . · · · · · . . . . . . · · - . · · · · - · · . . '
. . . . . . . . . . . . , ,;. . , . . . . . . . .
. . . . .. . . . . . . .
. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.. . ...... ... . .
..
·
. . . ' . . . . . . : � ' : : : : : : : : : : : : : : : :�: : :: : :: : : :: : : � : : : : :: : : : : :: : : + : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : . : : : : � : : : : : : . :
. . . . . . . . ··-�·· .... . . ... . . . . . . . . . . . - - ·I· ..... . . . . ................. . . . . . . . - . . - . . .
·
·
·
: . : . : . :. : : : : : : .. : . : . : : : : : : : : : . : ·:r:�:::::;::::.�:::: :::::: :+:�::::::::::::::: : : : : : : : : : : '. : : : : : : : : : : : : : : : : ::::: : : : : :
;�ggutg:�
•
� 009 . C S . 01 6
oo;.cs.011
009 . cs. 018
039.CS.019
20)9.cs.020
lioo,.cs.oz1
!2009 .C!.OZZ
IZ009.CS.023
12009.CS.02i
1
'2 0
n
3.CS.02 S
009.CS.026
• " '
' '•• ''•I
'
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ;. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ' . . . . " .1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . ' ' . . ' . ' ' . . . . . . . ' . . . . . ' .. ' . . ' .� . . ' . ' . ' . . . . . . ' .. ' ' . . . . . . . ' . ·�· ' . ' ' . . . . . ' . . . . . ' . . . . . . . ' . . . . . ' . . . . . . ' ' . . . . . ' . . . . '
009 .CS.OZ?
009.CS.OZ6
003.CS.019
2 C09 .CS. OJO
-·· ......... ..
:�J;..:!.�3:
,.
. . .. . ., ,. . . . .
. ..
Gambar 6.8. Pensejajaran asam amino sub unit B dari isolat yang digunakan
dalam penelitian dengan beberapa strain di beberapa tempat
VII. PEMBAHASAJ\
Pada penelitian ini berhasil diidentifikasi isolat
isolasi KLB diare di Bogor tahun
Vibrio cholera e hasil
_
2009. Hasil uj i aglutinasi dengan menggunakan
antiserum polivalen Vibrio cholerae menunjukkan bahwa semua isolat
.
KLB diare
di bogor tahun 2009 yang digunakan dalam penelitian ini termasuk
cholerae serogrup
Vibrio
0 1 , sedangkan hasil uji aglutinasi dengan menggunakan
antiserum monovalen Vibrio cholerae menunjukkan bahwa semua isolat tennasuk
serotipe Ogawa.
Bakteri
Vibrio
cho/erae
dibedakan
menjadi
beberapa
serogroup
berdasarkan antigen 0-nya. Meskipun terdapat lebih dari 200 macam serogroup.
namun terdapat dua serogroup yang dianggap
sangat patogen dan menjadi
penyebab kejadian wabah kolera di dunia yaitu serogroup 0 I dan
0 1 39. Pada
umumnya Vibrio cholerae yang diisolasi di Indonesia merupakan serogroup
dan serotipe Ogawa.
0l
40
Hasil penelitian ini sesuai dengan beberapa hasil penelitian sebelumnya
yang
dilakukan
di
Indonesia yang
hasilnya menunjukkan
Vibrio
cholerae
42
serogrup 0 I
serotipc Ogawa. Pada tahun 2007 Marlina dan kawan-kawan
melak:ukan isolasi dan identifikasi terhadap keberadaan Vibrio cholerae dari
sampel yang diambil dari beberapa rumah sakit di Padang. Dari sampel yang
berhasil diidentifikasi didapatkan hasil bah\\'·a semua
Vibrio cholerae yang
diisolasi merupakan Vibrio cholerae serogroup 0 1 serotipe Ogawa.43 Penelitian
lain yang telah dilakukan oleh Dadik Rahardjo dan kavvan-kawan pada tahun 2009
terhadap Vibrio cholerae yang berhasil diisolasi dari beberapa tempat di Su rabaya
juga menghasilkan data balnva dari sampel yang diisolasi dari semua Vibrio
cholerae yang berhasil diisolasi merupakan scrogroup 0 1 dan serotipe Ogawa.44
Hasil survey pada tahun
1993
sampai
1999 yang dilakukan
oleh Cyrus
S imanjuntak bersama timnya juga didapatkan data bahwa dari seluruh Vibrio
cholerae yang berhasil diisolasi sebanyak 98.81 % rnerupakan Vibrio cholerae
serogroup 0 1 .46.48
Berdasarkan data yang ada di Badan Kesehatan Dunia (WHO). pada
pandemi kolera pertama yang dimulai pada tahun 1 8 1 7 di wilayah Asia. dan
pandemi berikutnya disebabkan oleh serogroup 0 1 biotipe klasik. Pandemi kolera
ketujuh pada tahun 1 9 6 1 juga d isebabkan oleh Vibrio cholerae serogroup 0 1
·
biotipe El Tor berasal dari Indonesia dan kemudian menyebar dengan ccpat di
sebagian besar daratan Asia. Pada tahun 1 9 70, biotipe Elter berhasil diisolasi di
wilayah Afrika Barat, dan sekarang biotipe Eltor telah menjadi endemik di panyak
negara di Afrika. Pada tahun 1 9 9 1 berhasil diisolasi <!Ii Peru yang sebelumnya
tidak pernah ditemukan selama hampir I 00 tabun, dan dari Peru kemudian
menyebar ke seluruh negara Amerika Latin. Dalam beberapa tabun terakbir kolera
di Amerika Latin telah dapat dikendalikan. Vibrio cho!erae serogroup 0 I kini
mendominasi d i beberapa bagian Afrika dan Asia. Vibrio cholerae 0 l merupakan
penyebab kolera asiatik atau kolera epidemik. Pada awalnya hanya
Vibrio
cholerae 0 I yang dianggap memproduksi enterotoksin yang menyebabkan kolera
endemik dan epidemik namun belakangan Vibrio cholerae 0 1 39 juga diketahui
memproduksi enterotoksin dalam jumlah yang besar seperti pada yang terdapat
Vibrio cholerae 0 1 .
Vibrio cholerae serogroup 0 1 39, ditemukan
sebagai
penyebab wabah kolera di India dan Bangladesh pada tahun 1992 dan sejak itu
kemudian menyebar ke negara lain di wilayah Asia Tenggara.40
43
Pemeriksaan Vibrio cholerae dengan menggunakan polymerase chain
reaction (PCR) dan konfirmasi dengan elektroforesis didapatkan hasil bahwa
semua isolat Vibrio cholerae positif mengandung gen ctx Vibrio cholerae . Gen ctx
Vibrio cholerae merupakan gen yang terdapat pada Vibrio cho/erae patogen yang
berperan dalam menghasilkan toksin kolera (CT). Gen ctx Vibrio cholerae ini
hanya terdapat pada Vibrio cholerae sehingga untuk mengidentifikasi bakteri ini
bisa hanya dengan melihat gen spesifik yang dimilikinya tersebut menggunakan
metoda biomolekuler Polymerase Chain Reaction (PCR). Tidak semua bakteri
Vibrio cholerae mempunyai gen ctx
Vibrio cholerae, hanya bakteri
Vibrio
cholerae yang patogen mempunyai gen ini. dan selama ini hanya terdapat dua
jenis Vibrio cholerae yang patogen dar) .menyebabkan terjadinya wabah kolera di
banyak negara yaitu Vibrio cholerae serogroup 0 I dan Vibrio cholerae serogroup
0139. Deteksi gen
en:
dengan PCR dilakukan untuk mengkonfirmasi keberadaan
gen ctx pada setiap sampel sebelum dilakukan sekuensing. Berdasarkan hasil
identifikasi, semua isolat yang digunakan dalam penelitian ini merupakan isolat
Vibrio cholerae 0 I serotipe Ogawa sehingga dari hasil pemeriksaan metoda
.
biomolekuler Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat dideteksi keberadaan gen
ctx Vibrio cholerae pada semua sampel.
Pensejajaran sekuen nukleotida gen ctx Vibrio cholerae sub unit A antara
isolat penderita diare yang satu dengan lainnya menunjukkan hasil 1 00% identik.
Pada sekuen nukleotida gen ctx Vibrio cholerae sul:t unit A terdapat mutasi
tunggal hanya pada sampe! dengan kode 2009.CS.09 yaitu pada posisi basa ke
608 yang mengalami perubahan basa Timin menjadi Adenin (608T>A) yang
mengakibatkan terjadinya perubahan asam amino dari Tirosin menjadi Aspargin
(T203I). Pada penelitian ini tidak bisa ditarik kesimpulan mengenai efek dari
perubahan asam amino gen ctx tersebut terhadap kondisi penderita diare karena
tidak tersedia data klinis penderita diare. Pensejajaran sekuen nukleotida gen clx
Vibrio cholerae
sub unit B isolat penderita diare satu dengan yang Iain
menunjukkan hasil I 00% identik. Meskipun jika disejajarkan dengan fragmen gen
ctx Vibrio cholerae sub unit B dari genbank terdapat mutasi substitusi pada basa
997 yang mengalami substitusi dari Timidin menjadi Citosin (997T>C) dan pada
basa I 085 yang mengalami substitusi dari Timidin menjadi Citosin ( I 085T>C),
44
namun sekuen nukleotida gen c!x Vibrio cho/erae sub unit B pada penderjta diare
yang disejajarkan dengan sekuen nukleotida isolat lingkungan menunjukkan
100% identik.
Perbandingan
sekuen
nukleotida yang identik
antara
semua
isolat
penderita diare kemungkinan dikarenakan sumber infeksi Vibrio cholerae berasal
dari spesies yang sama dan berasal dari lokasi yang sama atau berdekatan.
Pensejajaran antara isolat dari penderita diare rnenunjukkan hasil 1 00% identik
karena tidak terdapat perbedaan antara satu dengan lainnya. Perbandingan sekuen
nukleotida yang identik dikarenakan surnber infeksi Vibrio cholerae didapatkan
dari lingkungan. Lingkungan dapat menjadi sumber infeksi Vibrio cholerae.
Beberapa faktor yang dapat dilihat sebagai kemungkinan te1jadi penularan adalah
lingkungan yang tidak bersih dan tercemar o!eh bakteri Vibrio cholerae. Dari
lingkungan yang tercemar kemudian mencemari sumber air yang digunakan untuk
minum dan juga air untuk penanganan makanan. Sumber air yang telah tercemar
bakteri Vibrio cholerae kemudian dikonsumsi oleh manusia sehingga bakteri
Vibrio cholerae akan mengi_nfeksi manusia .
.
Lingkungan sangat berperan sebagai sumber infeksi
cholerae. Infeksi kolera sangat
erat
bakteri
Vibrio
hubungannya dengan keadaan higiene dan
sanitasi lingkungan, terutama yang berkaitan dengan persediaan air untuk rumah
tangga dan cara pembuangan kotoran yang tidak baik. Penyebaran sumber infeksi
kolera dapat berupa tinja dan muntahan penderita yang mengandung bakteri
f/ibrio cholerae:
50
Analisis sekuen nukleotida gen ctx Vihrio choleroe suh unit 8 dari sampel
yang digunakan dalam penelitian menghasilkan gen ctx Vibrio cholerae Vibrio
cholerae dengan sekuen nukleotida yang identik dengan sekuen nukleotida pada
gen ctx Vibrio cholerae sub unit B serogroup 0 1 biotipe El Tor. Sekuen asam
amino yang ditunjukkan dari semua sampel yang digunakan dalam penelitian ini
identik dengan delapan perwakilan serogroup 0 I biotipe El Tor yang selaras
dengan sekuen gen ctx Vibrio cholerae sub unit B strain referensi N 16961 yang
te1masuk biotipe El Tor. Sekuen asam amino dari semua sampel yang digunakan
dalam penelitian ini menjadi identik dengan sekuen asam amino dari gen ctx
45
Vibrio cholerae strain referensi N l 696 1 , dengan histidin pada pos1s1 333 dan
treonin pada posisi 362."13
Beberapa stu<li perbandingan sekuen mer1unjukkan homologi sekuen gen
ctx Vibrio cholerae antara berbagai serogrup Vibrio cho!erae. Kumar et al. (2009)
mendokumentasikan varian gen ctx Vibrio cholerae baru dari Vibrio cholerae 0 I
biotipe El Tor yang diisolasi dari Orissa (India). Studi ini menyoroti mutasi baru
(H20N) pada gen
ctx
Vibrio cholerae sub unit B dan adanya perubahan gen ctx
Vibrio cholerae sub unit B dalam biotipe
El Tor dari isolat klinis. Sebuah studi
oieh Ansaruzzaman (2004) melaporkan substitusi H l 8Y dan T47I pada gen ctx
Vibrio cholerae sub unit B biotipe El Tor dan sekuen ini mirip dengan sekuen gen
ctx Vibrio cholerae sub unit B dari biotipe Klasik. Sebelumnya, sebuah penelitian
menunjukkan munculnya strain baru El Tor dengan modifikasi gen ctx Vibrio
chulerae biotipe Klasik. Dengan demikian, sekuen untuk gen c1x / 'ibrio cholerae
sub unit A dan sub unit B mewakili beragam serogroup yang diisolasi pada
berbagai periode waktu dari berbagai sumber dan lokasi yang tersedia di GenBank
dibuat untuk berbagai penelitian. Beberapa studi telah menunjukkan efek mutasi
yang diarahkan pada gen clx Vibrio cholerae sub unit A serta pada sub unit B
pada 0 1 wild type. Te1jadinya situs mutan dilaporkan menyebabkan penurunan
atau kerugian pada toksisitas seperti yang terjadi pada gen ctx Vibrio cholerae sub
unit A (R7K, R l l K, I 16A. R25G, E29H, S68Y +V72Y, E l 1 2Q, F223D) dan pada
sub unit B (R350. H57 A. L77D. 1740, T780). Dengan demikian, peran situs
mutan mengarah pada hilangnya toksisitas seperti pada 0 l wild type. Oleh karena
itu.] penting untuk mengevaluasi pengaruh mutasi yang disebabkan oleh tekanan
seleksi alam di antara serogroup.
�9
Sekuen nukleotida dan asam amino hasil peneiitian ini identik dengan
sekuen nukleotida dari beberapa tempat di Asia, sepe11i identik dengan sekuen
nukleotida dari hasil penelitian yang dilakukan oleh Balakrish dan kawan-kawan.
Balakrish dan kawan-kawan pada tahun 2005 melakukan penelitian terhadap
isolat yang berada di Pusat Penelitian dan Kesehatan Dhaka Bangiades. Isolat­
isolat tersebut dilakukan pemeriksaan sekuensing untuk mengetahui sekuen
nukleotida dan asam amino gen clx terutama sub unit B. Sekuen nukleotida dari
46
isolat yang diteliti kemudian disejajarkan dan di bandingkan dengan sekuen
lengkap gen ctx Vibrio cholerae yang diambil dari GeneBank sebagai referensi.
Pengaruh mutasi pada pembentukan toksin kolera secara fungsional (ABS
hetero-heksamer) sangat penting. Laporan gambaran munculnya serogroup baru
dengan mutasi yang te1jadi pada gen crx Vibrio cholerae sub unit A dan sub unit
B telah tersedia. Mutasi pada gen ctx Vibrio cholerae sub unit A dan sub unit B
mempunyai peran terhadap perakitan struktur AB5 toksin kolera. Beberapa mutasi
(kutub non-polar atau \Vakil) sebagian besar non-identik (menyebabkan perubahan
sifat fisik dan kimia) di alarn dan memiliki efek potensial terhadap interaksi
protein-protein dari sub unit gen crx
Vibrio cholerae yang mempengaruhi
pembentukan struktur ABS. Signifikansi terhadap peningkatan kompleks protein
rekombinan gen ctx Vibrio cholerae analog umuk desain vaksin terhadap multi
serogroup.
49
VIII. KESIMPULAN DAN SARAN
8.1.
Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan :
l . Semua isolat Vibrio
holera KLB diare di Bogor tahun 2009 merupakan
c
Vibrio cho/erae serogrup 01 serotipe Ogawa .
2.
Hasil amplifikasi terhadap gen
cr.x
.
V ibrio chol:!rae sub A dan sub unit B
menunjukkan bahwa semua isolat penderita diare dan isolat lingkungan
KLB diare di Bogar tahun 2009 mengandung gen crx Vibrio cholerae.
3. Hasil sekuesing terhadap seluruh isolat menunjukkan bahwa :
-
Pada gen ctx Vibrio cho!erae sub unit A menunj ukkan terdapat mutasi
tunggal pada sampel dengan kode 2009.CS.09 pada posisi basa ke 608
yaitu terjadi perubahan basa Timin menjadi Adenin (608T>A).
-
Pada gen ctx
Vibrio cholerae sub unit B menunjukkan terdapat
substitusi pada basa 997 yang mengalami
substitusi dari
menjadi citosin (997T>C) dan
l 085
pada basa
substitusi dari timidin menjadi citosin ( 1 08ST>C).
c
timidin
yang mengalami
47
4. Sekuen nukleotida gen crx Vibrio cholerae sub unit A dan sub unit B
identi k antar isolat penderita diare.
5. Sekuen nukleotida gen ctx Vibrio cholerae su b unit A dan sub unit B dari
isolat penderita diare identik den gan isolat dari l i ngkun gan.
8.2. Saran
Berdasarkan hasil penel i tian ini, maka perl u dilakukan penelitian Ianjutan
untuk penyempurnaan penelitian ini. Be berapa saran ya ng dapat di gunakan
untuk penel i ti an lanjutan antara lain perlu dilakukan:
I . Penelitian seca ra mendalam untuk identi fi kas i dan karakterisasi gen ctx
Vibrio
cholerae
yang
dapat mewakili
populasi
Vibrio
cholerae
di
Indonesia untuk menge tahu i pola khas mutasi gen ctx Vibrio cholerae asal
Indonesia yang dapat mengarah pada perubahan patogcn itas
1 "ibrio
cholerae.
2. Penelitian untuk melihat hubungan mutasi yang terjadi pada ctxAB dengan
tingkat keparahan diare kolera.
3 . Penelitian lebih lanjut dengan menggunakan gen ctx Vibrio cholerae
secara utuh agar dapat memastikan posisi mutasi yang terjadi secara
keseluruhan.
4. Penelitian untuk identifikasi biotipe Vibrio cholerae untuk m engetahui
epidemiologi kolera di Indonesia.
-
"'='"""
.,
,
tl�!f
n
m
•
• ll
llj
.,
I-�
-
tJl .lillllif iE
r:i
:iF='!E
1
iii
-�
f l ��
I
.
I.
�:to :
-- �
...
�
=
� ll l
I
1
ii I
-
48
DAFTAR PUSTA KA
I.
Soemarsono H. Kolera: dalam Buku Ajar Ilmu Pe nyaki t Dalam. Jakarta:
Balai Penerbit FKUI, 1996. p. 443.
2.
Pelczar J.M. Dasar - Dasar Mikrobiologi. Jakarta: U niversitas Indonesia,
2005.
3.
Simanjuntak CH, Larasati V/, A1joso S, Putri M, Lesmana M, A
Cholera in Indonesia in 1 993 - 1 999 .200 1 : 65(6): 788-97.
Buhari
4.
Pusat Komunikasi Publik Direktur Jenderal Pemberantasan Penyakit dan
Penyehatan Lingkungan Departemen Kesehatan RI. Jakarta. 2008
5.
Direktur Jenderal Pemberantasan Pen yakit dan Penyehatan Lingkungan
Departemen Kesehatan RI. Laporan Hasil Jnvestigasi KLB Diare di
Kabupaten Nabire dan Kabupaten Paniai. 2008.
6.
Suharyono. Diare Akut. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indones ia
1 99 1 .
7.
Lesmana M.
.4 23.
et al.
,
Vibrio & Campylobacter.
Jakarta: Universitas Trisakti, 2003. p
-
8.
Jawetz, Melnick, Adelberg. Mikrobiologi Kedokteran. B uk u Kedokteran
EGC. Jakarta; 2005.p.274 - 6.
9.
Chaudhuri K, Chatte1:jee SN. Cholerae Toxin. Ge rmany: Springer; 2009.
1 0. Rocka Polka. Pewamaan Gram Vibrio cholerae. 20 1 1 (Cited 20 1 1 Apr 1 1 ).
Availablefrom:http://panji 1 1 02.blogspot.com/2009/ 1 1/pewarnaan-gram.html.
2 1 April 2 0 1 2 .
Vibrio cholerae Predator ilnteraction and
Virulence. Sweden: Department of Molecular Biology Umea U n i versity ;
1 1 . Lindmark Barbra. Modulators of
2009.
1 2. Kaper JB, Morris JG, Levine MM. Cholera. Clinical Microbiology Reviews.
Clin. Microbial. Rev. 1995; &(I ):48.
1 3 . Ganguly NK, K au r T . Mechan ism of action o f cholera toxin
Indian J Med Res. 1996; 104(1): 28-37.
&
other toxins.
14. R.-G. Zhang, D. L . Scott, M . L. Westbrook, S. Nance, B . D. Spangler, G. G .
Shipley and E . M . Westbrook. The Three-Dimensional Crystal Structure of
Cholera Toxin. Journal of Molecular Biology. 1 992; 2 5 1 ( 1 ) : 563-573.
49
1 5 . Zhang RG, Westbrook ML, Westbrook EM, Scott DL, Onvinowski Z e t a l . A
crystal structure of cholera toxin B subunit pentamer: choleragenoid. J Mo!
Biol. 1995; 2 5 1 (3): 550-62.
1 6. Merritt EA, Sarfaty S, Akker FV, Hoir CL, Martial JA, Ho! GJ. Crystal
structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GMI
pentasaccharide. Protein Science. 1994; 3(2): 166-75.
1 7. Galen JE, Ketley JM, Fasano A, Richardson SH, Wasserman SS, Kaper JB.
Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin. Infect
I mmun. 1992; 60(2): 406-15.
1 8. Salama NN, Eddington ND, Fasano A. Tight junction modulation and its
relationship to drng delivery. Adv Drug Del iv Rev. 2006; 58( 1 ) : 1 5-28.
19. Anderson JM, Balda MS, Fanning AS. The structure and regulation of tight
junctions. CurrOpin Cell Biol. 1993; 5(5): 772-8.
··
20. Fasano A. Cellular microbiology: can we learn cell physiolog_y from
microorganisms? Am J Physiol. 1999; 276(4): 765-76.
2 1 . Uzzau S, Lu R, Wang W, Fiore C, Fasano A. Purification and preliminary
characterization of the zonula occludens toxin receptor from human (CaCo2)
an 9 murine (IEC6) intestinal cell lines. FEMS Microbiol Lett. 200 L 194( 1 ):
1-5.
22. Trucksis M, Galen JE, Michalski J, Fasano A, Kaper JB. Accessory cholera
enterotoxin (Ace), the third toxin of a Vibrio cholerae virulence cassette.
Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90( 1 1 ) : 5267-7 1 .
23. Trucksis M, Co1m TL, Wassennan SS, Sears CL. Vibrio cholerae ACE
stimulates Ca(2+)-dependent CJ(-)/HC0(3)(-) secretion in T84 cells in vitro.
Am J Physiol Cell Physiol. 2000; 279(3): 567-77.
24. Zitzer A, Zitzer 0, Bhakdi S, Palmer M. Oligomerization of Vibrio cho/erae
cytolysin yields a pentameric pore and has a dual specificity for cholesterol
and sphingolipids in the target membrane. J Biol Chem. 1 999; 274(3): 13 7580.
25. Zitzer A, Wassenaar TM, Walev I, Bhakdi S. Potent membrane­
permeabilizing and cytocidal action of Vibrio cholerae cytolysin on human
intestinal cells. Infect Immun 1997; 65(4): 1 293-98.
26. Lally ET, Hill RB, Kieba IR, Korostoff J. The interaction between RTX
toxins and target cells. Trends Microbial. 1999; 7(9): 356-6 1 .
50
27. Welch RA. RTX toxin structure and function: A story of numerous anomalies
and few analogies in toxin biology. Curr Top Microbial Immunol. 200 l ;
257(1 ) : 85-1 1 1 .
28. Fullner KJ, Mekalanos JJ. In vivo covalent cross-linking of cellular actin by
the Vibrio cholerae RTX toxin. Embo J. 200 1 ; 19(20): 5 3 1 5-23.
29. Steele-Mo1timer 0, Knodler LA, Finlay BB. Poisons, ruffles and rockets:
Bacterial pathogens and the host cell cytoskeleton. Traffic. 2000; l (2): 1 0718.
30. Pollard TD, Borisy GG. Cellular motility driven by assembly and
disassembly of actin filaments. Cell. 2003; 1 12(4): 453-65.
3 1 . Cryz SJ. Jr.. Kaper .I. Tacket C. Nataro J. Levine MM. Vibrio cho/erae
CVD1 03-HgR live oral anenuated vaccine: Construction, safety,
immunogenicity, excretion and non-target effects. Dev Biol Stand. 1 995.
84( 1 ) : 237-44.
32. Tikoo A, Singh DY, Shukla BN, Sanyal SC. Development of an improved
synthetic medium for a better production of the new cholera toxin and its
immunological relationship with the toxin produced by Vibrio cholerae 0 1 39
strains. FEMS Immunol Med Microbial. 1 996; 1 4(2 -3): 67-72 .
33. Nishibuchi M, Fasano A; Russell RG, Kaper JB. Enterotoxigenicity of Vibrio
parahaemolyticus with and without genes encoding thermostable direct
hemolysin. Infect Immun. 1 992; 60(9): 3539-45.
34. Nishibuchi M, Kaper JB. Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio
parahaemolyticus: ·A virulence gene acquired by a marine bacterium. Infect
Immun. 1995; 63(6): 2093-99.
35. Terai A, Baba K. Shirai H. Yoshida 0. Takeda Y, Nishibuchi M. Evidence
for insertion sequence-mediated spread of the thermostable direct hemolysin
gene among Vibrio species. J Bacterial. 1991 ; 1 73 ( 1 6): 5036-46.
36. Hoge CW, Sethabutr 0, Bodhidatta L, Echeverria P, Robertson DC, Mo1Tis
JG Jr. Use of a synthetic oligonucleotide probe to detect strains of non­
serovar 0 I Vibrio cholerae carrying the gene for heat-stable enterotoxin
(NAG-ST). J Clin Microbial. 1 990; 28(6): 1 473-76.
37. Takeda T, Peina Y, Ogawa A, Dohi S, Abe H, Nair GB, Pal SC. Detection of
heat-stable enterotoxin in a cholera toxin gene-positive strain of Vibrio
cholerae 0 1 . FEMS Microbial Lett. 1 99 1 ; 64( ! ) : 23-27.
38. Walia K, Ghosh S, Singh H, Nair GB, Ghosh A et al. Purification and
characterization of novel toxin produced by Vibrio cholerae 0 l . Infect
Immun. 1999; 67(10): 5 2 1 5-22.
·=,
•
•
™'
™
_
-=------==-- -1
=
--
-
-
-
-
51
39.
Bhattacharyya S. Shant J. Ganguly NK. Majurndar S. Ghosh S. A potential
epidemic factor from the bacteria, V ibrio c/10/erae W07. C u rr Microbiol.
2008; 56(1): 98-103.
40. World Health Organization. Cholera: global surveillance summary, 2008.
2009; 84(3 1 ): 309-24.
4 1 . Marlina, Almasdy D. Aufa I. Deteksi Gen ctx pada Bakteri Vibrio c ho l erae
Isolat Limbah Cair Rumah Sakit dan Uji Resistensinya Terhadap Beberapa
Antibiotik. Kumpulan Abstrak Penelitian Fakultas Farmasi Universitas
Andalas. 2007; l ( l ) : 1 -7.
42. Nishibori T, Cores G, Rahardj o D, Wasito EB, Tsmoedijanto, et al.
Phenotypic and Genotypic Characterization of V ibrio cholerae Clinically
Isolated in Surabaya. Indonesia. J Infect Dis. 20 1 1 : 64( 1 ) : 7 - 1 2 .
43. Davy VB, Horvath C, Marc JS. Vibrio cholerae: Cholera toxin. The
International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2007: 39( 1 0 ) : 1 77 1 -5.
44. Lesmana M. Perkembangan mutakhir infeksi kolera .
2004: 23(3): 1 0 1 -9.
.I Kedoktera n Trisakti.
45. Balakrish N, Firdausi Q, Holmgren J, Svennerholm AM, Ashrafus S. et al.
Cholera Due to Altered El Tor Strains of Vibrio cholerae 01 in Ban!:!Iadesh. J
Clinical M i crobiology. 2006; 44( 14): 4 2 1 1-3.
.
�
46. Simanjuntak CH, Larasati
W, Arjoso W, Putri M, Lesmana M, et al. Cholera
in Indonesia in 1 993-1 999. Am. J. Trop . Med. Hyg. 200 1 ; 65(6): 788-97.
47. Lesmana M . Vibrio cholerae 0 1 , Viable but No nc u lt ura b l e . J Kedokter
Trisakti. 2002; 2 1 (3 ) : 1 1 1 -7.
�8. Agtini MD. Soehamo R, Lesmana L, Punjabi :\H. Simanjuncak C H . et al.
The burden of diarrhoea, shigellosis. and cholera in North Jakarta. Indonesia:
findings from 24 months surveillance. BMC Infectious Diseases. 2005; 5( I ) :
89.
49. Shamini S , Ravichandran M, Sinnott JT, Somboonwit C, Sidhu HS, et al.
Structural inferences for Cholera toxin mutations in Vibrio cholerae.
Biomedicals Informatics, 201 1 ; 6(1 ) : 1 -9.
50. Peterson KM. Ex press i on of Vibrio cholerae Virulence Genes i11 Response to
Environn1ental Signals. Curr. Issues Intest. Microbial. 2002; 3( 1 ) : 29-38.
52
Lampiran l . Lokasi pengambilan sampel pada saat KLB diare di Bogor
� �-�,�...
"
'.
..
,
·
"'
:.
;
�
,,.-r
,
/
'
I
I
" I
I
/1
..
..� ....
(diambil dari laporan hasil pemeriksaan sampel K L B diare di Bogor tahu 2009 di
Laboratoriurn Bakteriologi Badan Litbangkes.
-
53
Lampiran 2 . Hasil isolasi Vibrio cholerae pada KLB d iare tahun 2009
No.
A.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
A.
1.
2.
3.
Daerah pengambilan Jumlah
Sampel Penderita Diare
S ukagal ih
Sukamanah
Sukakarya
Neglasari
Megamendung
Kopo
Pesanggrahan
Cilember
Sinargalih
Sampel Lingkungan
Cipayung
Kopo
Sukamanah
Total
Jumlah Positif Vibrio cholerae
3
8
13
2
6
11
4
2
2
2
1
2
2
I
1
1
1
1
1
2
5
1
l
3
45
31
54
Lampiran 3 . Sumber
asal sampel yang menghasilkan kultur positif
cholerae
NO
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
I -l
15
16
17
18
19
. 20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
Kode SamEel
2009.CS.0 1
2 009 CS 02
.
.
2009.CS.03
2009.CS.04
2 009.CS 0 5
.
2009.CS.06
2009.CS.07
2 009 . C S. 0 8
2009.CS.09
2009.CS.0 1 0
2009.CS.01 l
2009.CS. 0 1 2
2 009 . C S . 0 13
2009.CS.O 1-l
2009.CS.O 1 5
2009.CS.O 1 6
2009.CS.O 1 7
2009.CS.O 1 8
2009.CS.O 1 9
2009.CS.020
2009.CS.02 l
2009.CS.022
2009.CS.023
2009.CS.024
2009 C S. 025
2009.CS.026
.
2009.CS.027
2009.CS.028
2009.CS.029
2009.CS.030
2009.CS.03 I
Asal SamEel
ASAL
Penderita diare
Sukagalih
Penderita diare
Sukagalih
Penderita diare
Sukamanah
Penderita diare
Sukamanah
Penderita diare
Sukamanah
Penderita diare
Sukamanah
Penderita diare
Penderita diare
Sukamanah
Sukamanah
Penderita diare
Sukakarya
Penderita diare
Sukakarya
Penderita diare
Sukakarya
Penderita diare
Penderita diare
Sukakarya
Penderita diare
Penderita diare
Sukakarya
Sukakarya
Penderita diare
Sukakarya
Penderita diare
Sukakarya
Penderita diare
Sukakarya
Penderita diare
Penderita diare
Sukakarya
Penderita diare
Neglasari
Penderita diare
Penderita diare
Megamendung
Penderita diare
Pesangrahan
Penderita diare
Penderita diare
Cilember
S inargalih
Sungai
Cipayung
Sukakarya
Neglasari
Kopo
Sumur
Kopo
Sungai
Mangunjaya
Sumur
Mangunjaya
TemEa�an
Mangunjaya
Vibrio
55
PERSETUJUAN ATASAN YANG BERWENANG
Menyetujui,
Kepala Bidang Biomedis
.Jakarta, J anuari 20 13
Ketua Pelaksana
dr. Roselinda. M.Epid .
drh. Khariri. M.Biomed.
N I P . 1 9 820222 2008 1 2 1 0 04
NIP. 1 9 5 8 0 70 1 1 9870 1 2 0 0 1
DISETUJUI,
Ketua
Panitia Pembina Ilmiah
Dr. drg. Magdarina Destri A. MSc.
NIP. 1 9 520427 198 1 0 7 2001
�
�
-t-,,.I HIJCJ�
KEMENTERIAN KESEHATAN RI
SADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATA N
PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESE HATAN
tlan Percetakan Negara No. 23 Jakarta 1 0560
Telepon (021) 42881758, 42881763, 42881 762, 428817·
(021) 42881754
'..Dtak Pos 1226 Jakarta 10012
Fax
Lampiran 1
Keputusan Kepala Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar
Kesehatan
HK.03.0511111750/2012
Nornor
:
Tanggal
6 Februari 20 1 2
SUS.U NAN TIM PELAKSANA PENELITIAN TAHUN 2012
PERBANDINGAN KARAKTERISTIK GEN CTX ISOLAT Vibrio Cholerae .
PENOERITA DIARE DAN ISOLAT LINGKUNGAN PADA PAOA KLB BOGOR
1.
drh. Khariri
Peneliti Non Fungsional/Ketua Pelaksana
2.
Fauzul Muna, S.Si
Pene!iti Non Fungsional
3.
Kartika Dewi Puspa, S.Si
Pembantu Peneliti
4.
Metatiwati, AMAK
Pembantu Peneliti
5.
Yudi Hartoyo
Sekretariat Penelitian
17
Ii
I
Fi
�
�
�
....
"1 H\lc;,
KEMENTERIAN KESEHATAN RI
SADAN PEN ELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN
PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN
..zn Percetakan Negara No. 23
&k Pos 1226 Jakarta 10012
Jakarta 10560
Telepon (021) 428817 58, 42881763, 42881762, 42881
(021) 42881754
Fax
Lampiran 2
o
Keputusan Kepala Pusat Biomedis dan
Oasar Kesehatan
Nomor
HK.03.05/1111750/2012
6 Februari 2012
Tanggal
JUDUL PENELITIAN
Teknologi
PERBANOINGAN KARAKTERISTIK GEN CTX ISOLAT Vibrio Cholerae
PENDE RITA DIARE DAN ISOLAT LINGKUNGAN PADA PADA KLB
BOGOR
JUMLAH HONOR TIM PELAKSANA PENELITIAN TAHUN 2012
=Rp
30.000
Jumlah honor yang diterima per-jam , per­
minggu sebesar
= Rp
20.000
Jumlah honor yang diterima setiap bulan
=Rp
300.000
1.
Peneliti Non Fungsional
Jumlah honor yang diterima per-jam, per­
minggu sebesar
2.
Pembantu E'eneliti
3.
Sekretariat Penelitian
sebesar
18
KEMENTERIAN KESEHATAN
BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN
Jalan Percetakan Negara No. 29 Jakarta 10560 Kotak Pos 1226
Telepon: (021 ) 4261088 Faksimile: (021) 4243933
E-mail: sesban@litbang .depkes.go.id, Website: http://www.litbang.depkes.go.id
PERSETUJUAN ETIK (ETHICAL APPROVAL )
Nomor :
KE.01.� /EC/ '1°� /2012
Yang bertanda tangan di bawah ini, Ketua Komisi Etik Penelitian Kesehatan Sadan Litbang
.
Kesehatan, setela,h dilaksanakan pemba hasan dan penilaian, dengan ini memutuskan
protokol penelitian yang berjvdul :
"Karakterisasi Gen CTX /so/at Vibrio cholerae dari Penderita dan
Sumber Air Minum KLB Diare di Bogor tahun 2009 "
yang mengikutsertakan manusia sebagai subyek penelitian, dengan Ketua Pelaksana I
Peneliti Utama :
drh. Khariri
dapat disetujui pelaksanaannya. Persetujuan ini berlaku sejak tangga! ditetapkan sampai
dengan batas waktu pelaksanaan penelitian seperti tertera dalam protokol
.
Pada akhir penelitian, laporan pelaksanaan penelitian harus diserahkan kepada KEPK­
BPPK. Jika
ada
perubahan protokol
dan
I
at
au perpanjangan
penelitian, harus mengajukan
kembali permohonan kajian etik penelitian (amandemen protokol).
Jakarta,
V
Mei 2012