Isolasi Gen Lycopene Beta Cyclase dari Daun Bit (Beta vulgaris L

Isolasi Gen Lycopene Beta Cyclase dari Daun Bit
(Beta vulgaris L.)
Yulius Dedy Irawan, Dahlia, dan Dwi Listyorini
Jurusan Biologi Universitas Negeri Malang
E-mail: [email protected]
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi gen Lycopene Beta
Cyclase (LCYB) yang mengkode enzim pensintesis beta karoten
pada daun Beta vulgaris L. menggunakan teknik Polymerase Chain
Reaction dengan primer forward (5’-TGTCGTGGTGGATCTTGTGG-3’) dan reverse (5’-ACACCTGTTGAGCGACAGAC-3’).
Sekuen yang diperoleh dianalisis menggunakan program DNA
Baser, BLAST Online, dan ClustalX. Penelitian ini belum
memperoleh sekuen gen target sehingga perlu dilakukan penelitian
ulang menggunakan primer yang lebih spesifik.
Kata Kunci: beta karoten, gen Lycopen Beta Cyclase (LCYB), Beta vulgaris L.
Karotenoid berperan sebagai prekursor biosintesis vitamin A
(Giuliano et al., 2008). Pigmen ini merupakan isoprena C40 yang berasal dari
prekursor C20 yaitu geranygeranylpirophosphat (GGPP) (Yamamizo et al.,
2009). Defisiensi vitamin A meningkatkan jumlah pengidap rabun senja (Ye et
al., 2000), sehingga memunculkan penelitian di bidang pemuliaan tanaman
penghasil provitamin A (Giuliano et al., 2008), salah satunya β-karoten (Brown,
2010). Bit merupakan salah satu tanaman yang mengandung karotenoid (Berman
et al., 2004). Rekayasa genetik berpengaruh terhadap ekspresi gen pengkode
karotenoid sehingga berdampak pada kadar pigmen karoten (Bai et al., 2011;
Giuliano et al., 2008). Pigmen karoten salah satunya adalah β-karoten yang
disintesis oleh enzim Lycopene Beta Cyclase, enzim tersebut dikode oleh gen
Lycopene Beta Cyclase (LCYB) (Cunningham et al., 1998).
Biosintesis β-karoten pada tahap pertama dikatalisasi oleh enzim
phytoena sintase (Psy) yang mengkondensasi molekul GGPP (C20) menjadi
phytoena (C40). Phytoena dikatalisasi oleh enzim phytoena desaturated menjadi
ζ-karoten yang dikatalisasi oleh enzim ζ-karoten desaturated menjadi likopen.
Likopen dikatalisasi oleh enzim lycopen beta cyclase sehingga memiliki gugus
siklik membentuk β-karoten (Marty et al., 2005). Gen LCYB pada kubis Cina
diekspresikan selama perkecambahan dan pembentukan daun (Tuan et al., 2012)
sedangkan pada daun tomat diekspresikan lebih tinggi dibandingkan pada bunga
dan buah (Galpaz et al., 2006).
METODE
Penelitian ini termasuk penelitian deskriptif eksploratif untuk mengisolasi
sekuen gen Lycopene Beta Cyclase (LCYB) dari daun bit (Beta vulgaris L.).
Isolasi DNA menggunakan DNA isolation kit (Nucleospin® II, Macherey-Nagel,
Germany), teknik PCR menggunakan sepasang primer gen LCYB yang disusun
menggunakan software Pick Primer berdasarkan daerah conserve pada
Taraxacum officinale (accession no. AB247456.1) dan Lilium lancifolium
(accession no. GU471230.1). Hasil PCR dilihat menggunakan elektroforesis pada
gel agarose 1,5% dan DNA Marker 1Kbp. Analisis data menggunakan software
BLAST, ClustalX dan Bio Edit.
HASIL DAN PEMBAHASAN
DNA total Beta vulgaris L. yang diperoleh sejumlah 245,6 ng/µL.
Amplifikasi gen target dengan teknik PCR melalui beberapa kali tahap optimasi
suhu annealing menghasilkan band tipis dengan fragmen sepanjang 200 bp
(GeneRuler 1 Kbp pada gel agarose 1,5 %). Adanya band yang tipis atau tidak
ada menunjukkan primer yang digunakan kurang spesifik (McPherson et al.,
2006; Intron Biotechnology, 2012). Hasil sekuensing DNA dengan menggunakan
primer forward dan primer reverse menghasilkan sekuen dengan error reading
(terbaca ‘N’) pada sebagian besar basa nukleotidanya. Kedua sekuen tersebut
menunjukkan hasil yang tidak spesifik (Eijkman Institute for Molecular Biology,
2012). Hasil sekuensing tersebut diperbaiki dengan software Peak Trace (Gambar
1).
Gambar 1: Hasil sekuensing DNA yang telah dioptimalkan dengan software Peak Trace;
A dengan Primer Forward;
B dengan Primer Reverse;
Kotak merah menunjukkan urutan basa yang tidak dapat dioptimalkan dengan
software Peak Trace.
Analisis menggunakan software DNA Baser tidak ditemukan
konsensusnya sehingga dilakukan konfirmasi dengan software BLAST untuk
memastikan bahwa fragmen DNA yang diisolasi merupakan sekuen gen target
(Altschul et al., 1990) berdasarkan referensi sekuen gen LCYB dari Taraxacum
officinale dan Lilium lancifolium. Hasil analisis sekuen forward menunjukkan
kecocokan dengan referensi sebesar 6% dan maximum identity 100% (Gambar 2)
sedangkan sekuen reverse menunjukkan kecocokan dengan referensi sebesar 12%
dan maximum identity 100% (Gambar 3). Sekuen dapat dikatakan identik apabila
minimal memiliki query coverage sebesar 50% (Hagelsieb, 2007; Broad Institute,
2010) dan maximum identity 25% (Grundy, 1998; Pevsner, 2009). Berdasarkan
query coverage yang rendah dari kedua sekuen tersebut, maka belum dapat
dipastikan sebagai fragmen parsial dari sekuen yang diduga gen LCYB.
Gambar 2: Pensejajaran sekuen yang diduga gen LCYB dengan BLAST Online memiliki
kecocokan dengan referensi sekuen gen LCYB Lilium lancifolium; A. Nilai query
coverage yang ditunjukkan dengan skala pita warna hitam (pada kotak merah); B.
Persentase query coverage dan maximum identity (pada kotak merah); C. Sekuen
yang memiliki kecocokan antara subjek dan query yang digunakan (pada kotak
merah).
Gambar 3: Pensejajaran sekuen yang diduga gen LCYB dengan BLAST Online memiliki
kecocokan dengan referensi sekuen gen LCYB Taraxacum officinale; A. Nilai query
coverage yang ditunjukkan dengan skala pita warna biru (pada kotak merah); B.
Persentase query coverage dan maximum identity (pada kotak merah); C. Sekuen
yang memiliki kecocokan antara subjek dan query yang digunakan (pada kotak
merah).
Primer yang digunakan dalam penelitian ini dirancang oleh software Pick
Primer dan dipilih berdasar ketentuan pembuatan primer yang baik: terdiri 18-30
panjang basa (Handoyo et al., 2000); tidak ada pengulangan basa tunggal yang
berurutan sejumlah 5 atau lebih (Priemer Biosoft, 2012); komposisi basa 50-60%
(G+C); ujung 3’ primer berupa basa G atau C, CG atau GC untuk meningkatkan
efisiensi priming; Tm antara 55-80ºC (Cooper, 2008). Fragmen yang tidak spesifik
dimungkinkan karena referensi dalam mendesain primer oleh software Pick
Primer berasal dari tumbuhan yang berbeda yaitu primer forward dari Taraxacum
officinale dan primer reverse dari Lilium lancifolium.
Fragmen yang tidak spesifik juga dapat diakibatkan oleh suhu annealing.
Penentuan suhu annealing sebesar 61ºC berdasarkan pada Tm (melting
temperature) primer yang disarankan oleh perusahaan pembuat primer. Optimasi
dengan suhu annealing mengikuti rumus {2(A+T)+4(C+G)} (Fatchiyah et al.,
2011), dihasilkan fragmen tipis yang posisinya sama dengan suhu annealing 61ºC
sehingga ketidakspesifikan sekuen bukan karena suhu annealing.
Sekuen yang diperoleh disejajarkan dengan sekuen gen referensi yang
dilaporkan di NCBI menggunakan software ClustalX untuk mengkonfirmasi
kecocokan sekuen dengan primer (Bujnicki, 2008). Sekuen yang diisolasi dengan
primer forward disejajarkan dengan sekuen gen LCYB dari Taraxacum officinale
sedangkan sekuen yang diisolasi dengan primer reverse disejajarkan dengan
sekuen gen LCYB dari Lilium lancifolium. Hasil penyejajaran kedua sekuen yang
diduga gen LCYB dengan tumbuhan referensi menunjukkan sedikit kemiripan dan
terdapat gap yang menunjukkan perbedaan panjang sekuen. Reece, (2004)
menjelaskan bahwa ketika primer tidak dapat menempel dengan baik pada DNA
template akan mengakibatkan adanya basa yang tidak terbaca dengan baik.
Berdasarkan analisis diatas diduga bahwa ketidakberhasilan memperoleh gen
target dikarenakan salah pemilihan primer berdasarkan software Pick Primer. Hal
lain yang menyebabkan ketidakberhasilan adalah jarak filogenetik dalam
pemilihan primer terlalu jauh (Gambar 2). Primer dapat ditentukan berdasarkan
sekuen gen yang sama dari organisme yang berbeda (Nicholl, 2008), namun
apabila suatu gen terdapat pada organisme yang berada pada tingkat kekerabatan
yang jauh maka homologi sekuen gen tersebut sulit ditentukan (Graur et al.,
2000). Sekuen yang dipakai sebagai primer harus homolog dengan sekuen DNA
template (Reece, 2004).
Gambar 2:
Pohon filogenetik tumbuhan referensi gen LCYB, analisis menggunakan software
MEGA 5 dengan metode Neighbour Joining berdasarkan gen RBCL;
Angka pada clade menunjukkan boostrap (jumlah pengulangan penghitungan untuk
memastikan kekerabatan);
Kotak merah menunjukkan hubungan kekerabatan yang paling dekat.
KESIMPULAN DAN SARAN
Penelitian ini belum berhasil memperoleh sekuen gen Lycopene Beta
Cyclase (LCYB) dari daun Bit (Beta vulgaris L.) karena belum ada referensi
sekuen gen LCYB dari Beta vulgaris L. Berdasarkan penelitian ini perlu dilakukan
penelitian ulang dengan rancangan primer yang lebih spesifik yaitu berasal dari
tumbuhan yang berkerabat lebih dekat dengan Beta vulgaris L. yaitu Arabidopsis
thaliana dan suhu annealing yang tepat agar dapat mengisolasi sekuen gen LCYB.
DAFTAR RUJUKAN
Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., & Lipman, D. J. 1990. Basic
Local Aligment Search Tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
Bai, C., Twyman, R. M., Farre, G., Sanahuja, G., Christou, P., Capell, T., & Zhu,
C. 2011. A golden era pro vitamin A enhancement in diverse crops. In
Vitro Cell Dev. Biol. Plant 47: 205-221.
Berman, A. F., Balick, M. J., Kronenberg, F., Ososki, A. L., Connor, B., Reiff,
M., Roble, M., Lohr, P., Brosi, B. J., & Lee, R. 2004. Treatment of
fibroids: the use of beets (Beta vulgaris) and molasses (Saccharum
officinarum) as an herbal therapy by Dominican healers in New York City.
Journal of Ethno-pharmacology 92: 337–339.
Broad Institute. 2010. Gene Finding. (Online). (http://www.fasebj.org/content/24/2/346.full, diakses tanggal 3 Mei 2013).
Brown, J. L. 2010. Supplement Facts Vitamin A. Pensylvania: Pennsylvania State
University.
Bujnicki, J. M. 2008. From Molecular Modeling to Drug Design. Dalam H. J.
Gross (Ed.), Practical Bioinformatics (hlm.35-63). Warsawa: Springer.
Cooper, S. 2008. Primer Design. (Online). (http://bioweb.uwlax.edu/
genweb/molecular/seq_anal/primer_design/primer_design.htm,
diakses
tanggal 5 April 2013).
Cunningham Jr, F. X. & Gant, E. 1998. Genes and Enzymes of Carotenoid
Biosynthesis in Plants. Plant Physiology and Plant Molecular Biology 49:
557-583.
Eijkman Institute for Molecular Biology. 2013. DNA Sequencing Service.
Jakarta: Eijkman Institute for Mo-lecular Biology.
Fatchiyah., Arumingtyas, E. L., Wi-dyarti, S. Rahayu, S. 2011. Biologi Molekular
Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Penerbit Erlangga.
Galpaz, N., Ronen, G., Khalfa, Z., Zamir, D., & Hirscberg, J. 2006. A
Chromoplast-Specific Carotenoid Biosynthesis Pathway Is Revealed by
Cloning of the Tomato white-flower Locus. The Plant Cell 18: 1947-1960.
Gardland Science. 2012. Practical Bioinformatics Chapter 3. (Online). (http://
www.garlandscience.com/res/pdf/practicalbioinformatics_ch3.pdf, diakses
3 Mei 2012).
Giuliano, G., Tavazza, R., Diretto, G., Beyer, P., & Taylor, M. A. 2008.
Metabolic engineering of carotenoid biosynthesis in plants. Cell Press 3:
0167-7799.
Graur, D. & Li, W. 2000. Fundamentals of Molecular Evolution (Second
Edition). Sunderland: Sinauer Associates, Inc.
Grundy, W. N. 1998. Family based Homology Detection via Pairwise Sequence
Detection. Proceedings of the Second Annual International Conference on
Computational Molecular Biology, Department of Computer Science and
Engineering University of California Sandiego, 22-25 March.
Hagelsieb, G. M. & Latimer, K. 2007. Choosing BLAST options for better
detection of orthologs as resiprocal best hits. Oxford University Press 24:
319-324.
Handoyo, D. & Rudiretna, A. 2000. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase
Chain Reaction (PCR) [General Principles and Implementation of
Polymerase Chain Reaction]. Universitas Surabaya. 9: 17-29.
Intron Biotechnology. 2012. I-TaqTM DNA Polymerase. Intron Biotechnology, Inc.
Marty, I., Bureau, S., Sarkissian, G., Gouble, B., Audergon, J. M., & Albagnac, G.
2005. Ethylene regulation of carotenoid accumulation and carotenogenic
gene expression in colour contrasted apricot varieties (Prunus armeniaca).
Journal of Experimental Botany 417: 1877–1886.
McPherson, M. J. & Moller, S. G. 2006. PCR (Second Edition). New York :
Taylor & Francis Group.
Nicholl, D. S. T. 2008. An Introduction to Genetic Engineering (Third
Edition). Cambridge: Cambridge University Press.
Pevsner, J. 2009. Bioinformatics and Functional Genomics (Second Edition).
New Jersey: John Wiley & Sons, Inc.
Premier Biosoft. 2012. PCR Primer Design Guidelines. (Online). (http://
www.google.co.id/search?q=PCR+Primer+Design+Guidelines&sourceid=
opera &ie=utf-8&oe=utf-8&chann el=suggest, diakses tanggal 7 April
2012).
Reece, R. J. 2004. Analysis of Genes and Genomes. West Sussex. John Wiley &
Sons, Ltd.
Tuan, P. A., Park, N. II., Park, W. T., Kim, J. K., Lee, J., Lee, S., Yang, T. J. &
Park, S. U. 2012. Carotenoids accumulation and expression of carotenogenesis genes during seedling and leaf development in Chinese
cabbage (Brassica rapa subsp. Pekinensis). Plant Omics Journal 2: 143148.
Yamamizo, C., Kishimoto, S. , & Ohmiya, A. 2009. Carotenoid composition and
carotenogenic gene expression during Ipomoea petal development.
Journal of Experimental Botany. 10: 1-11.
Ye, X., Babili, S. A., Kloti, A., Zhang, J., Lucca, P., Beyer, P., & Potrykus, I.
2000. Enginerring the Provitamin A (β-Carotene) Biosynthetic Pathway
into (Carotenoid Free) Rice Endosperm. Science 287: 303-305.