ISOLASI DAN KARAKTERISASI SENYAWA TERPENOID EKSTRAK

JKK, Tahun 2016, Volume 5(3), halaman 25-30
ISSN 2303-1077
ISOLASI DAN KARAKTERISASI SENYAWA TERPENOID EKSTRAK METANOL
AKAR POHON KAYU BUTA-BUTA (Excoecaria agallocha L.)
1
Fath Dwisari1*, Harlia1, Andi Hairil Alimuddin1
Progam Studi Kimia, Fakultas MIPA, UniversitasTanjungpura,
Jl. Prof. Dr. H. Hadari Nawawi 78124, Pontianak
*
email: [email protected]
ABSTRAK
Telah dilakukan isolasi senyawa terpenoid dari ekstrak metanol akar pohon kayu buta-buta
Excoecaria agallocha L. Pada penelitian ini dilakukan ekstraksi dan fraksinasi, pemisahan dan
pemurnian dengan kromatografi vakum cair dan kromatografi kolom gravitasi. Identifikasi
terpenoid dilakukan dengan kromatografi lapis tipis menggunakan reagen semprot liebermanbuchard. Analisis menggunakan spektrofotometri Fourier Transform-Infra Red terhadap isolat
menunjukkan adanya serapan gugus -OH (3456,44 dan 3410,15 cm-1), C-H alifatik (2924,09
dan 2862,36 cm -1), C=O (1712,79 cm-1), C=C aromatik (1643,35 dan 1512,19 cm-1), dan C-O
(1273,02 dan 1226,73 cm-1).
Kata kunci: Excoecaria agallocha L., Isolasi, Karakterisasi, Terpenoid
PENDAHULUAN
tanaman ini telah digunakan sebagai obat
pencahar dan aborsi, serta dalam
pengobatan maag, rematik, lepra dan
kelumpuhan. Daun dan getah dari pohon ini
telah digunakan sebagai racun ikan di
beberapa negara seperti India, Kaledonia
Baru dan Malaysia. Kulit dan kayu tanaman
ini digunakan sebagai obat untuk perut
kembung di Thailand (Poorna et al., 2011).
Beberapa penelitian pada bagian
pohon
kayu
Buta-buta
didapatkan
kandungan metabolit sekunder antara lain
alkaloid, flavonoid, steroid, saponin dan
terpenoid. Sejumlah senyawa terpenoid
telah diisolasi dari bagian kulit batang, daun
dan getahnya. Serangkaian diterpenoid,
triterpenoid derivatif juga telah diisolasi dari
beberapa bagian dari pohon E. agallocha
yang telah terbukti bioaktif terhadap
serangga dan parasit. Terpenoid dan
steroid pada bagian akar tanaman ini telah
diketahui melalui uji pendahuluan fitokimia
Namun, isolasi terpenoid dari akar pohon ini
belum dilakukan. Oleh karena itu, dalam
penelitian ini dilakukan isolasi dan
karakterisasi senyawa terpenoid dari akar
pohon
kayu
Buta-buta
dengan
menggunakan spektrofotometri
Fourier
Transform-Infra Red (FT-IR).
Wilayah
pantai
dan
pesisir
mempunyai sifat dan ciri yang unik yaitu
merupakan wilayah peralihan antara
ekosistem darat dan laut serta mengandung
kekayaan sumber daya alam yang
beranekaragam seperti ekosistem hutan
mangrove (Fahriansyah dan Yoswaty,
2012). Menurut Soemardji, et al (2002),
Indonesia dikenal sebagai salah satu
negara yang mempunyai keanekaragaman
hayati berupa tumbuhan yang banyak
digunakan
sebagai
obat
tradisional.
Beberapa bagian dari mangrove bermanfaat
sebagai obat. Ekstrak dan bahan mentah
dari mangrove telah banyak dimanfaatkan
oleh masyarakat pesisir untuk keperluan
obat-obatan alamiah.
Patil, et al (2012) menyatakan bahwa
Excoecaria
agallocha
L.,
family
Euphorbiaceae, terdistribusi secara luas di
daerah pesisir laut dan tepi-hutan bakau di
seluruh daerah tropis Afrika, Asia, dan laut
Tanaman dari genus Excoecaria terdiri
hampir 40 spesies yang terdistribusi di
seluruh daerah bakau tropis Afrika, Asia
dan Australia barat laut. Spesies yang
paling banyak dilaporkan adalah bakau
Excoecaria
agallocha
Linn.Australia.
Tanaman ini dikenal berperan penting
dalam segi ekonomis, ekologis serta
perannya dalam obat-obatan. Getah dari
25
JKK, Tahun 2016, Volume 5(3), halaman 25-30
ISSN 2303-1077
METODOLOGI PENELITIAN
Alat dan Bahan
Alat
logam Mg pada ekstrak. Tes positif bila
terjadi warna merah-jingga.
Alat-alat yang digunakan antara lain
seperangkat alat gelas, neraca analitik
Ohaus PioneerTM, seperangkat alat KKG,
KLT, KVC, pipet tetes, rotary evaporator
Heidolph
Laborota
4000
efficient,
spektrofotometer Fourier Transform-Infra
Red (FT-IR ) Prestige-21 Shimadzu.
c. Uji Saponin
Uji
saponin
dilakukan
dengan
mengocok lapisan air dalam tabung reaksi
bila terbentuk busa yang tahan selama lebih
kurang 15 menit berarti positif untuk uji
saponin.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan antara
lain asam klorida p.a, asam sulfat p.a, asam
asetat p.a, pelarut teknis : etil asetat,
metanol, n-heksana, serbuk magnesium,
pereaksi Meyer dan Wagner, pereaksi
Lieberman-Buchard, silika gel G-60 Merck,
dan plat KLT UV254.
d. Uji Terpenoid dan Uji Steroid
Uji terpenoid dan steroid dengan cara
sampel ditambahkan asetat anhidrat dan
asam sulfat pekat. Uji positif menunjukkan
golongan senyawa terpenoid dengan
terbentuknya warna merah keunguan dan
warna biru dan hijau untuk steroid.
CARA KERJA
Preparasi Sampel
Sampel akar pohon kayu Buta-buta
(E. agallocha) yang diambil dari desa
Sungai Mas, Kecamatan Sebangkau,
Kabupaten Sambas, Kalimantan Barat.
Tumbuhan Buta-buta dideterminasi di
Laboratorium Biologi FMIPA Universitas
Tanjungpura. Sampel akar kering yang
telah dibersihkan, kemudian dihaluskan.
Isolasi dan Pemurnian
Isolasi
dan
pemurnian
ekstrak
dilakukan dengan beberapa metode, yaitu
Kromatografi
Lapis
Tipis
(KLT),
Kromatografi Vakum Cair (KVC), dan
Kromatografi Kolom Gravitasi (KKG):
Kromatografi Vakum Cair (KVC)
Ekstrak dielusi menggunakan KLT
untuk menentukan eluen yang pola
pemisahannya paling baik. Fase diam yang
digunakan adalah silika gel G60 F254 dan
fasa gerak n-heksana :etil asetat (8:2) (6:4)
(4:6)(2:8);etil asetat 100%; etil asetat:
metanol (8:2)(6:4)(4:6)(2:8) ; metanol 100%.
Fraksi tersebut kemudian dipisahkan
dengan Kromatografi Vakum Cair (KVC).
Masing-masing eluen yang digunakan
adalah 100 ml. Fraksi hasil pemisahan
ditampung setiap 100 ml.
Ekstraksi dan Partisi
Ekstraksi
menggunakan
metode
maserasi. 1,1 kg akar Buta-buta direndam
menggunakan metanol selama 3x24 jam
Maserat disaring dan ditampung lalu
dikentalkan dengan rotary evaporator.
Ekstrak kental metanol yang dipartisi secara
bertahap dengan pelarut n-heksana dan etil
asetat.
Skrining Fitokimia
a. Uji Alkaloid
Ekstrak
akar
kayu
Buta-buta
diteteskan pada dua plat tetes. Satu bagian
dijadikan sebagai kontrol dan bagian kedua
ditetesi dengan pereaksi Mayer dan bagian
ketiga ditetesi dengan pereaksi Wagner.
Alkaloid dinyatakan positif apabila
pada ekstrak yang ditetesi pereaksi Mayer
berwarna putih serta pada bagian yang
ditetesi pereaksi Dragendorf berwarna
coklat kekuningan maka keduanya positif
mengandung alkaloid.
Kromatografi Kolom Gravitasi (KKG)
Sebelum
dilakukan
kromatografi
kolom, dilakukan terlebih dahulu KLT.
Tujuannya adalah untuk menentukan
senyawa
yang
positif
mengandung
terpenoid dengan menggunakan reagen
semprot Lieberman-buchard. Selanjutnya
fraksi positif terpenoid ini dielusi dengan
Kromatografi Kolom Gravitasi dengan eluen
bergradien yaitu : n-heksana:etil asetat (8:2)
(6:4)(4:6)(2:8); etil asetat 100%; etil
asetat:metanol (8:2)(6:4)(4:6)(2:8); metanol
100%. Eluat hasil pemisahan ditampung
setiap 5 ml. Eluat dianalisis menggunakan
KLT untuk melihat kesamaan pola
pemisahan untuk selanjutnya digabungkan.
b. Uji Flavonoid
Uji flavonoid dilakukan dengan cara
menambahkan asam klorida pekat dan
26
JKK, Tahun 2016, Volume 5(3), halaman 25-30
Karakterisasi
Isolat
menggunakan
Spektrofotometri Fourier Transform-Infra
Red (FT-IR)
Isolat yang diperoleh dianalisis
menggunakan spektrofotometer FT-IR.
.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sampel serbuk akar pohon kayu Butabuta (E. agallocha) sebanyak 1,1 kg yang
telah dimaserasi menghasilkan sebanyak
100,7612 gr. Sebanyak 85,2339 gr
dilarutkan kembali dalam 700 mL metanol
dan dipartisi dengan pelarut yang memiliki
tingkat kepolaran yang yaitu n-heksana dan
etil asetat.
Skrining fitokimia
Tabel 1. Hasil Skrining Fitokimia
No
Metabolit
Sekunder
Fraksi
Ekstrak
kasar
N-heksana
Etil
asetat
Metanol
1
Flavonoid
+
-
-
+
2
Alkaloid
+
+
+
+
3
Steroid
+
+
+
-
4
Terpenoid
+
-
-
+
5
Saponin
-
-
-
-
Penentuan
alkaloid
hasil
yang
didapatkan untuk penambahan reagen
mayer negatif untuk semua fraksi. Menurut
Marliana, et al (2005), hasil positif alkaloid
pada
uji
Mayer
ditandai
dengan
terbentuknya endapan putih. Diperkirakan
endapan tersebut adalah kompleks kaliumalkaloid. Pada pembuatan pereaksi Mayer,
larutan merkurium (II) klorida ditambah
kalium iodida akan bereaksi membentuk
endapan merah merkurium (II) iodida. Jika
kalium iodida yang ditambahkan berlebih
maka
akan
terbentuk
kalium
tetraiodomerkurat (II) (Svehla, 1990).
Alkaloid mengandung atom nitrogen
yang mempunyai pasangan elektron bebas
sehingga
dapat
digunakan
untuk
membentuk ikatan kovalen koordinat
dengan ion logam (McMurry, 2004). Pada
uji alkaloid dengan pereaksi Mayer
diperkirakan nitrogen pada alkaloid akan
bereaksi dengan ion logam K+ dari kalium
27
ISSN 2303-1077
tetraiodomerkurat(II) membentuk kompleks
kalium-alkaloid yang mengendap. Endapan
inilah yang tidak terbentuk pada uji yang
dilakukan pada semua fraksi, sehingga
dapat dikatakan semua fraksi negatif
terhadap alkaloid dengan pereaksi mayer.
Hasil positif alkaloid untuk semua
fraksi pada uji Wagner ditandai dengan
terbentuknya endapan coklat muda sampai
kuning. Diperkirakan endapan tersebut
adalah kalium- alkaloid. Pada pembuatan
pereaksi Wagner, iodin bereaksi dengan
ion I- dari kalium iodida menghasilkan ion I3yang berwarna coklat. Pada uji Wagner, ion
logam K+ akan membentuk ikatan kovalen
koordinat dengan nitrogen pada alkaloid
membentuk kompleks kalium-alkaloid yang
mengendap.
Uji flavonoid dilakukan dengan
penambahan serbuk Mg dan HCl pekat
pada tiap fraksi, hasil positif terhadap
flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya
warna jingga sampai merah. Hasil uji
flavonoid didapatkan negatif untuk fraksi nheksan dan fraksi etil asetat dan positif
untuk fraksi metanol dan pada ekstrak
kasar.
Uji terpenoid-steroid dilakukan dengan
dengan menggunakan pereaksi liebermanbuchard menghasilkan positif terhadap
terpenoid untuk semua fraksi. Hasil yang
didapatkan untuk fraksi n-heksan dan fraksi
etil asetat pada penambahan liebermanbuchard menghasilkan positif terhadap
steroid yang ditandai dengan terbentuknya
warna hijau pada fraksi. Penambahan
lieberman-buchard pada fraksi metanol dan
ekstrak kasar juga menghasilkan positif
terhadap terpenoid. Hal ini dapat dilihat dari
warna merah-keunguan yang terbentuk.
Pengujian saponin dilakukan dengan
diberikan perlakuan yang sama pada setiap
fraksi yaitu setiap fraksi dilarutkan dengan
setiap pelarutnya lalu dipanaskan dan
dikocok. Hasil positif ditunjukkan dengan
terbentuknya busa yang bertahan cukup
lama setlah pengocokkan selama 15 menit
(Harborne, 1987). Untuk fraksi n-heksana
terbentuk dua fasa dan terbentuk busa.
Pada fraksi etil asetat terbentuk warna
kuning susu dan sedikit berbusa sedangkan
untuk fraksi metanol adanya warna orange
susu tetapi tidak terbentuk busa. Namun,
dari keseluruhan busa yang terbentuk dari
setiap fraksi, busa hanya bertahan dalam
waktu yang sangat singkat sehingga diduga
JKK, Tahun 2016, Volume 5(3), halaman 25-30
busa yang terbentuk adalah hasil dari
pengocokkan yang dilakukan bukan karena
saponin yang terkandung
ISSN 2303-1077
terdapat pola pemisahan pada ekstrak yang
digunakan.
Pemisahan pertama dilakukan dengan
menggunakan KVC dengan diameter kolom
3 cm dan tinggi 16 cm. Kolom yang
digunakan diisi dengan silika terembankan
dengan perbandingan 5gr : 5gr dan silika
kosong dengan perbandingan 1:4 yaitu 5 gr
: 20 gr dengan tinggi silika kosong 6 cm dan
tinggi silika terembankan 1 cm, kemudian
dielusi dengan eluen yang telah didapat dari
KLT preparatif dengan volume 100 mL
setiap kali elusi dan dihasilkan 10 fraksi.
Isolasi dan Pemurnian.
Fraksi yang selanjutnya digunakan
untuk isolasi dan pemurnian adalah fraksi
metanol. Hal ini dikarenakan pada fraksi
metanol menunjukkan hasil positif terhadap
terpenoid pada uji pendahuluan fitokimia.
Proses
pemisahan
dan
pemurnian
dilakukan dengan metode kromatografi
kolom. Sebelum pemisahan dan pemurnian
dilakukan terlebih dahulu fraksi dianalisis
menggunakan KLT, analisis ini bertujuan
untuk menentukan pelarut yang akan
digunakan pada saat pemisahan dengan
KVC dan KKG.
Gambar 2. Hasil KLT hasil KVC
Fraksi yang dihasilkan kemudian di
KLT untuk melihat pola kromatogram yang
sama sehingga dapat digabungkan dan
didapatkan 4 fraksi gabungan.
Gambar 1. Hasil Kromatografi Lapis Tipis
untuk penentuan pelarut
Fraksi metanol diuji kemampuan
distribusinya menggunakan KLT untuk
mendapatkan pola pemisahan yang baik
dengan pelarut n-heksana : etil asetat dan
metanol dengan perbandingan n-heksana :
etil asetat (8:2)(6:4)(4:6)(2:8);etil asetat
100%; etil asetat : metanol (8:2) (6:4) (4:6)
(2:8); metanol 100%. Dari hasil KLT yang
dilakukan didapatkan pola pemisahan dan
didapatkan eluen yang akan digunakan
untuk
KVC
yaitu
eluen
dengan
perbandingan n-heksana : etil asetat dan
metanol dengan perbandingan n-heksana :
etil asetat (8:2) (6:4) (4:6) (2:8) ; etil asetat
100%;etil asetat:metanol (8:2) (6:4) (4:6)
(2:8); metanol 100%. Dalam hal ini eluen
dengan kandungan n-heksan 100% tidak
digunakan untuk perlakuan selanjutnya
dikarenakan pada n-heksan 100% tidak
(a)
(b)
Gambar 3. Hasil KLT fraksi gabungan, (a)
Hasil KLT setelah diterangi
lampu UV254, (b) Hasil KLT
setelah
disemprot
reagen
spesifik Lieberman-buchard.
Penentuan
senyawa
terpenoid
dilakukan dengan KLT menggunakan
reagen
semprot
Lieberman-buchard
terhadap keempat fraksi gabungan. dan
didapatkan fraksi dengan kode F 2 sebanyak
5,0023 gr kemudian dilakukan pemurnian
kembali dengan KKG dengan eluen yang
sama dengan yang digunakan untuk KVC.
Hasilnya ditampung setiap 5 mL dan
didapatkan sebanyak 88 fraksi yang
kemudian dilakukan KLT untuk melihat pola
28
JKK, Tahun 2016, Volume 5(3), halaman 25-30
ISSN 2303-1077
gelombang 3456,44 cm-1, mengindikasikan
adanya gugus hidroksil -OH, pita serapan
pada bilangan gelombang 2924,09 cm-1 menunjukkan adanya regangan C-H dari CH3,
2862,36 cm-1 diduga adalah regangan dari
C-H. Adanya gugus fungsi karbonil (C=O)
diindikasikan dengan munculnya serapan
pada daerah bilangan gelombang 1712,79
cm-1. Serapan lemah pada bilangan
gelombang 1643,35 dan 1512,19 cm-1
meng-indikasikan adanya gugus C=C
aromatik. Bilangan gelombang 1273,02 dan
1226,73 cm-1 menunjukkan adanya serapan
C-O.
pemisahan yang mempunyai kemiripan
sehingga dapat digabungkan sehingga
didapatkan 9 fraksi gabungan.
Gambar 4. Hasil KLT fraksi gabungan hasil
KKG setelah disemprot reagen
spesifik Leberman-buchard dan di
terangi lampu UV254.(eluen Nheksana : Etil Asetat ; 2:8)
Hasil yang didapatkan dari hasil KLT
didapatkan adanya pendaran saat sampel
disinari UV254. Menurut Irianti, et al (2011),
Suatu senyawa yang berpendar pada UV254
mengidentifikasikan adanya gugus karbonil,
fenolik, atau gugus lain yang mengandung
setidaknya 2 ikatan rangkap terkonjugasi.
Fraksi yang positif mengandung
terpenoid dengan noda tunggal ini
kemudian dilakukan KLT kembali dengan
eluen
yang
mempunyai
perbedaan
kepolaran untuk melihat kemurniannya.
Dalam
ini
digunakan
eluen
etil
asetat:metanol (8:2).
Gambar 6. Spektrum FT-IR
SIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang
dilakukan, karakterisasi isolat menggunakan
spektrofotometer
FT-IR
menunjukkan
adanya serapan gugus -OH (3456,44 dan
3410,15 cm-1), C-H alifatik (2924,09 dan
2862,36 cm-1), C=O (1712,79 cm-1), C-O
(1273,02 dan 1226,73 cm-1), dan C=C
aromatik (1643,35 dan 1512,19 cm -1).
DAFTAR PUSTAKA
Gambar 5. Hasil KLT dengan eluen etil
asetat:metanol (8:2)
Fahriansyah dan Yoswaty, D., 2012,
Pembangunan
Ekowisata
di
Kecamatan Tanjung Balai Asahan,
Sumatera Utara : Faktor Ekologis
Hutan Mangrove, Ilmu dan Teknologi
Kelautan Tropis, 4 (2) :346-359.
Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia :
Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan, Penerjemah: Padmawina
ta K. dan Soediro, I, Terbitan ke-2,
Penerbit ITB, Bandung.
Hasil
KLT
yang
didapatkan,
diperkirakan isolat F2,1 merupakan suatu
isolat yang relatif murni secara KLT yang
selanjutnya akan dikarakterisasi dengan
menggunakan Spektrometer FT-IR.
Analisis Spektrum Inframerah
Spektrum
FT-IR
isolat
F2,1
menunjukkan adanya pita-pita dalam
daerah serapan pada daerah bilangan
29
JKK, Tahun 2016, Volume 5(3), halaman 25-30
Irianti, T.; Puspitasari, A.; Suryani, E., 2011,
Aktivitas Penangkapan Radikal 2,2Difenil-1-Pikrilhidrazil oleh Ekstrak
Etanolik Batang Brotowali (Tinospora
crispa (L.) Miers) dan FraksiFraksinya, Majalah Obat Tradisional,
16(3), 139-146.
Marliana, D.S.; Suryanti, V. dan Suyono.,
2005, Skrining Fitokimia dan Analisis
Kromatografi Lapis Tipis Komponen
Kimia Labu Siam (Sechium edule
Jacq. Swartz) dalam Ekstrak Etanol,
Biofarmasi. 3 (1) : 26-31.
McMurry, J.; dan Fay, R.C., 2004, McMurry
Fay Chemistry, Edisi Keempat, C.A :
Pearson
Education
International,
Belmont.
Patil, R.C.; Manohar, S.M.; Katchi, V.I.;
Rao, A.J., 2012, Ethanolic Stem
Extract of Excoecaria agallocha
Induces G1 Arrest or Apoptosis in
Human Lung Cancer Cells Depending
on Their P53 Status, Taiwania. 57 (2):
89-98.
ISSN 2303-1077
Poorna, C.A.; Resmi, M.S.; Soniya, E.V.,
2012, In Vitro Antioxidant Analysis
and the DNA Damage Protective
Activity of Leaf Extract of the
Excoecaria agallocha Linn. Mangrove
Plant,
International
Journal
of
Agricultural Chemistry, 1(4) : 1-6.
Soemardji, A.A.; Endang, K.; Cucu, A.,
2002, Toksisitas Akut dan Penentuan
DL50
Oral
Ekstrak
Air
Daun
Gandarusa
(Justicia
gendarussa
Burm. F.) pada Mencit Swiss Webster,
Matematika dan Sains Journal, 7 (2) :
57-62.
Svehla, G., 1990, Buku Teks Analisis
Anorganik Kualitatif Makro dan
Semimikro, Edisi kelima. Penerjemah:
Setiono, L. dan Pudjaatmaka, A.H.,
Kalman Media Pustaka, Jakarta.
30