25 BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Latar dan Waktu

BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1
Latar dan Waktu Penelitian
Tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian daun dari
tanaman binahong (A. cordifolia) yang diperoleh dari Desa Toima Kecamatan
Kabupaten Luwuk dan sekitarnya.Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia,
Jurusan Pendidikan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Negeri Gorontalo (UNG) selama ± 6 bulan, mulai dari bulan Agustus
2013-Januari 2014.
3.2
Pendekatan dan Jenis Penelitian
Pendekatan dan jenis penelitian yang digunakan adalah jenis penelitian
eksperimental yang dilakukan di Laboratorium melalui metode penelitian
kualitatif dan kuantitatif. Metode kualitatif digunakan untuk menguji ada tidaknya
senyawa aktif flavonoid, alkaloid, steroid, terpenoid dan saponin pada ekstrak
daun binahong.Metode kuantitatif digunakan untukuji toksisitas ekstrak daun
binahong terhadap larva udang Artemia salina Leach dengan menggunakan
metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
3.3
Alat dan Bahan yang Digunakan
3.3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat untuk
ekstraksi maserasi dan uji fitokimia: Timbangan analitik, blender, seperangkat alat
gelas, pipet mikro, pengaduk kaca, aluminium foil, statif, klem, lampu dan
aerator.
25
3.3.2 Bahan Tanaman
Tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian daun dari
tanaman binahong yang diperoleh dari Desa Toima Kecamatan Bunta Kabupaten
Luwuk dan sekitarnya.Daun binahong dibersihkan, dicuci lalu dikeringkan dengan
cara diangin-anginkan dan terhindar dari cahaya matahari secara langsung.
3.3.3 Bahan Kimia
Bahan kimia yang digunakan terdiri dari akuades, metanol, n-heksan, etil
asetat, pereaksi Hager, Dragendrof, Mayer, Wagner, asam asetat glacial, HCl
pekat, serbuk Mg, NaOH, H2SO4 pekat,
kloroform, dietil eter, kloroform
amonikal.
3.4
Tahap-tahap Penelitian
3.4.1 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Baku
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun Binahong. Daun
binahong sebanyak 6,4 kg dicuci bersih dan ditiriskan, kemudian dikeringkan
dengan cara diangin-anginkan dan tidak terkena sinar matahari secara langsung
dengan suhu di ruangan 35°-37°C, kemudian dihaluskan menggunakan blender
sampai terbentuk serbukdan dihitung rendemen dengan menggunakan rumus
sebagai berikut :
Rendemen =
Bobot Contoh (g)
x 100 %
Bobot Total (g)
26
3.4.2
Ekstraksi dan Fraksinasi
Sebanyak 250 gram serbuk daun binahong dimaserasi dengan menggunakan
pelarut metanol selama 4 x 24 jam, di mana setiap 24 jam ekstrak disaring dan
residunya dimaserasi kembali dengan menggunakan metanol yang baru. Proses
maserasi dibantu dengan pengadukan sesekali agar proses ekstraksi berlangsung
dengan maksimal. Filtrat metanol hasil maserasi seluruhnya digabungkan kemudian
dievaporasi dengan menggunakan alat penguap vakum pada suhu 30-40oC sehingga
diperoleh ekstrak kental metanol.
Tahap selanjutnya, Ekstrak kental metanol disuspensi dengan campuran
metanol-air (1:2).Selanjutnya dipartisi dengan pelarut n-heksan 4 x 200 ml sehingga
diperoleh fraksi n-heksan dan fraksi air. Fraksi n-heksan dievaporasi pada suhu 3040oC dan menghasilkan ekstrak kental n-heksan. Fraksi air dipartisi kembali dengan
pelarut etil asetat 4 x 200 ml sehingga diperoleh fraksi etil asetat dan fraksi air.Hasil
partisi dievaporasi pada suhu 30-40oC sehingga diperoleh ekstrak kental etil asetat
dan air.Kemudian dihitung rendemen saat hasil ekstraksi dan rendemen masingmasing fraksi dilanjutkan dengan uji fitokimia dan uji toksisitas.
3.4.3
Uji Fitokimia
Hasil maserasi dan partisi dari tiap-tiap ekstrak diuji fitokimia untuk melihat
kandungan senyawa aktif yang terdapat di dalamnya yang meliputi uji flavonoid, uji
alkaloid, uji steroid, terpenoid dan saponin.
25
3.4.3.1 Uji Flavonoid
Ekstrak kental dari berbagai ekstrak diambil sebanyak 0,1 g dilarutkan dalam
10 ml metanol kemudian dibagi ke dalam 4 tabung reaksi. Tabung pertama digunakan
sebagai tabung kontrol, tabung ke dua, ke tiga dan ke empat berturut-turut
ditambahkan NaOH, H2SO4 pekat dan serbuk Mg-HCl pekat.Warna pada masingmasing tabung dibandingkan dengan tabung kontrol, jika terjadi perubahan warna
dari tabung kontrol maka positif mengandung flavonoid.Terbentuknya warna merah,
kuning atau jingga menunjukan adanya flavonoid.
3.4.3.2 Uji Alkaloid
Ekstrak kental dari berbagai ekstrak sebanyak 0,1 g dilarutkan dengan 10 ml
kloroform amoniakal dan hasilnya di bagi ke dalam dua tabung reaksi. Tabung
pertama diuji dengan pereaksi Hager, tabung kedua ditambahkan dengan 5 ml asam
sulfat (H2SO4) 2 N. Bagian asam dipisahkan ke dalam 3 buah tabung reaksi
kemudian masing-masing diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu pereaksi
Dragendorff, pereaksi Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila
dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan cokelat
dengan pereaksi Wagner dan endapan merah hingga jingga dengan pereaksi
Dragendrof.
3.4.3.3Uji Saponin
Uji saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Ekstrak dari
berbagai pelarut sebanyak 0,1 g dilarutkan dengan alkohol kemudian perlahan-lahan
ditetesi dengan dengan akuades panas sebanyak 10 tetes. Tabung reaksi dikocok
26
sehingga terbentuk busa.Busa yang stabil selama 15 menit dan tidak hilang saat
penambahan HCl menunjukan adanya saponin.
3.4.3.4 Uji Terpenoid dan Steroid
Ekstrak binahong sebanyak 2 ml ditambahkan asam asetat anhidrat
kemudianditambahkan 2 ml asamsulfat pekat. Adanya steroid ditandai dengan
perubahan warna dari violet menjadi biru atau hijau.Uji terpenoid dilakukan dengan
mencampur 5 ml ekstrak dengan 2 ml kloroform.Kemudian tambahkan dengan hatihati 3 ml asam sulfat pekat.Terbentuknya warna coklat kemerahan pada permukaan
dalam larutan, menunjukkan adanya terpenoid.
3.4.4
Identifikasi Gugus Fungsi Senyawa dalam Ekstrak Daun Binahong
Gugus fungsi senyawa dalam ekstrak daun binahong diidentifikasi dengan
menggunakan spektrofotometer inframerah.
3.4.5
Uji Toksisitas Terhadap Artemia salina Leach (Metode BSLT)
Telur Artemia salina Leach sebanyak 2 gram dimasukkan dalam 400 ml air
laut
yang telah diaerasi dandiberi penerangan dengan cahaya lampu. Telurakan
menetas dalam waktu 24-48 jam dan disiapkan untuk digunakan sebagai target uji
toksisitas.
Perlakuan uji toksisitas dilakukan sebanyak 2 kali pengulangan pada masingmasingekstrak sampel. Botol vial (wadah uji) disiapkan untuk pengujian. Ekstrak
metanol, n-heksan dan etil asetat, ditimbang dan dilarutkan dalam air laut untuk
membuat larutan stok dengan konsentrasi 2.000 ppm. Dari larutan stok tersebut
kemudian dilakukan pengenceran larutan sesuaidengan konsentrasi yang diinginkan,
27
yaitu 1000, 500, 200, 100, dan 50 ppm.10 ekor larva udang dimasukkan dalam vial
yang berisi 5 ml larutan uji.Kontrol dibuat dengan memasukkan 10 ekor larva udang
dalam 5 ml air laut tanpa penambahan larutan uji. Pengamatan dilakukan selama 24
jam dengan selang waktu 8 jam terhadap jumlah kematian larva udang.
Analisis data dilakukan untuk mencari LC50 dengan menggunakan analisis
probit, dimana hubungan nilai logaritma konsentrasi bahan toksik uji dan nilai probit
dari persentase mortalitas hewan uji merupakan fungsi linear y = a + bx. Nilai LC50
diperoleh dari anti log m, dimana m merupakan logaritma konsentrasi bahan toksik
pada y = 5, yaitu nilai Probit 50% hewan uji, sehingga persamaan regresi menjadi :
m =
5−
Dengan nilai a dan b diperoleh berdasarkan persamaan sebagai berikut :
= 1/ (∑ − ∑ )
b=
( ∑ − (∑ ∑ )
( ∑X ) − (∑X)
Keerangan
:
Y
:
Nilai Probit Mortalitas
X
:
Logaritma konsentrasi bahan uji
n
:
Banyaknya perlakuan
a
:
Konstanta
b
:
Slope/ kemiringan
m
:
Nilai x pada y = 5
LC50
:
Anti log m
(Rand dan Petrocelli, 1985 dalam Hendri dkk, 2010).
28
1.5
Teknik Analisis Data
Analisis data yang dilakukan untuk mencari LC50 adalah analisis probit
dengan menggunakan program MC excel, dimana hubungan nilai logaritma
konsentrasi bahan toksik uji dan nilai probit dari persentase mortalitas hewan uji
merupakan fungsi linear y = a + bx.
29