SKRINING DAN UJI AKTIVITAS LIPOLITIK

SKRINING DAN UJI AKTIVITAS LIPOLITIK MIKROBA
HIDROKARBONOKLASTIK
Elga Renjana, Dr. Ni’matuzahroh, dan Dr Sri Sumarsih, M.Si.
Prodi S-1 Biologi, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi,
Universitas Airlangga, Surabaya
ABSTRACT
This study aimed to screen and test the lipolytic activity of
hydrocarbonoclastic microbial from collection of Microbiology Laboratory of
FST Airlangga University. Screening of hydrocarbonoclastic microbial was
performed using rhodamine-B agar which contained cooking oil 1%. Microbes
which had lipolytic activity were marked with orange flourescent zone around the
colony. Hydrocarbonoclastic microbial which had the highest lipolytic activity
index was Actinobacillus sp. The lipase enzyme of Actinobacillus sp. was
produced in Bushnell Haas liquid medium which added cooking oil 1%. Lipolytic
activity of Actinobacillus sp. was measured using a spectrophotometer UV –vis (λ
= 410 nm) with p-nitrophenyl palmitat as substrat on phosphat buffer pH 7.0, 37
ºC. Lipolytic activity from crude lipase enzyme extract of Actinobacillus sp. was
1,36 U/ml at 24 hours incubation time. Characterization of the enzyme was done
by determining the optimum pH and temperature at optimum incubation time.
Maximum lipolytic activity of Actinobacillus sp. was 1,55 U/ml at pH 7.0, 60 ºC.
Keywords: lipolytic activity, Actinobacillus sp., rhodamine-B agar
suatu
PENDAHULUAN
Enzim
merupakan
molekul
biopolimer protein yang tersusun dari
serangkaian
asam
amino
dalam
komposisi dan susunan rantai yang
teratur dan tetap. Enzim berfungsi
sebagai
biokimia
terhadap
aktivator
dan
dalam
bersifat
substrat,
mempermudah
proses
reaksi
rantai
(Syamsudin
kompleks
dkk.,
2008).
tertentu
Lipase
merupakan enzim yang dapat larut
dalam
air
dan
secara
alami
mengkatalis hidrolisis ikatan ester
dalam substrat lipid yang tidak larut
air (Miller et al., 2010).
spesifik
Saat ini aktivitas pengeboran
sehingga
minyak bumi di Indonesia dan
pemutusan
penggunaan derivat-derivatnya mulai
mengalami peningkatan. Peningkatan
suatu senyawa berupa enzim lipase.
aktivitas
Aktivitas
tersebut
mengakibatkan
mikroba
dalam
kenaikan tingkat pencemaran tanah
mendegradasi
oleh hidrokarbon karena kandungan
menggunakan lipase disebut aktivitas
senyawa hidrokarbon dalam minyak
lipolitik.
bumi sangatlah besar. Menurut Via
(2009),
kandungan
hidrokarbon
Laboratorium
Mikrobiologi
senyawa
Departemen Biologi FST Universitas
hidrokarbon murni dalam minyak
Airlangga memiliki koleksi 11 isolat
bumi sebesar 90-99%. Salah satu
mikroba
upaya pemulihan lahan tercemar
potensial yang berhasil diisolasi oleh
minyak yang saat ini sudah mulai
Ni’matuzahroh dkk. (2009). Namun
dikembangkan di Indonesia adalah
selama ini belum dilakukan skrining
bioremediasi (Ni’matuzahroh dkk.,
kemampuan lipolitik dari mikroba
2009).
merupakan
hidrokarbonoklastik tersebut. Oleh
menghilangkan
karena itu, perlu dilakukan skrining
pengaruh kontaminan (zat pencemar)
dan uji aktivitas lipolitik mikroba
dengan
menggunakan
hidrokarbonoklastik, sehingga dapat
mikroorganisme, sehingga substansi
menjadi sumber alternatif dalam
kontaminan
perolehan enzim lipase yang dapat
Bioremediasi
upaya
untuk
tersebut
berkurang
(Arsyad dan Rustiadi, 2008).
Mikroba
digunakan
hidrokarbonoklastik
merupakan mikroba yang mampu
mendegradasi
keperluan
hidrokarbon
untuk
metabolisme
dan
perkembangbiakannya.
Senyawa
hidrokarbon dalam minyak bumi
merupakan
mikroba
sumber
hidrokarbonoklastik
karbon
bagi
hidrokarbonoklastik
untuk
mendegradasi
hidrokarbon pada lahan tercemar
minyak.
METODE PENELITIAN
a. Bahan penelitian
Bahan yang digunakan sebagai
sumber mikroba merupakan koleksi
mikroba
hidrokarbonoklastik
(Nugroho, 2006). Pada mekanisme
Laboratorium
degadrasi
Departemen Biologi FST Universitas
tersebut,
hidrokarbonoklastik
mikroba
menghasilkan
Airlangga
yang
Mikrobiologi
diisolasi
oleh
Ni’matuzahroh dkk. (2009), yaitu
20 ml medium Bushnell Haas cair,
Candida
Pseudomonas
0,6 ml (3%) minyak goreng dan 0,04
aeruginosa, P. putida hasil isolasi
ml rhodamin-B 0,1% dalam H2O.
dari Depo PERTAMINA Surabaya,
Selanjutnya
Acinetobacter
hidrokarbonoklastik
famata,
faecalis
tipe
II,
mikroba
diinokulasi
Actinobacillus sp., C. parapsilopsis,
sebagai spot kecil ke medium uji dan
P. cepacea, P. flourescens-25, P.
diinkubasi pada suhu 37 ºC selama
pseudomallei,
Rhodotorulla
48 jam. Aktivitas lipolitik ditandai
isolasi
dengan munculnya zona pendaran
mucilaginosa
hasil
dari
pengeboran minyak Desa Wonocolo,
berwarna
Bojonegoro, dan Bacillus subtilis
sekitar koloni mikroba di bawah
3Kp hasil isolasi dari perairan Kali
sinar UV pada λ = 312 nm.
Donan
Cilacap,
Jawa
Tengah.
Bahan-bahan yang digunakan untuk
pembuatan media dan uji adalah
Nutrient Agar
Dextrose
(NA),
Agar
(SDA),
Sabouraud
Nutrient
Broth (NB), minyak goreng, powder
oranye
kemerahan
di
2. Uji aktivitas enzim terhadap pnitrofenil palmitat
Penentuan aktivitas enzim lipase
dilakukan dengan metode PereiraMeirelles
et
al.
(1997)
dalam
Sumarsih (2005) yang dimodifikasi.
agar, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3,
Aktivitas enzim ditentukan dengan
MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, FeCl3,
metode
NaCl, p-nitrofenil palmitat (p-NPP),
rhodamin-B, buffer fosfat pH 5.0,
6.0, 7.0, 8.0, alkohol 70%, air
fisiologis, spiritus, dan akuades.
spektrofotometrik
dengan
substrat p-nitrofenil palmitat (pNPP). Pada tabung Eppendorf yang
diisi 700 µl larutan p-NPP 0,503 mM
dalam
buffer
fosfat
Kemudian
1. Skrining
mikroba
hidrokarbonoklastik penghasil
lipase
supernatan yang mengandung enzim
Skrining
dengan
mikroba
pembuatan
dilakukan
medium
uji
(rhodamin-B agar) dengan komposisi
ekstraseluler.
300
7.0.
b. Prosedur penelitian
lipase
ditambahkan
pH
µl
Campuran
diinkubasi dalam waterbath
pada
suhu 37º C selama 30 menit. Setelah
diinkubasi, campuran ditambahkan
100 µl larutan Na2CO3 0,2 M. p-
nitrofenol yang terbentuk ditandai
bahwa
dengan warna kuning, kemudian
aktivitas lipolitik dimana ditandai
diukur dengan spektrofotometer UV-
dengan pendaran berwarna oranye di
Vis pada λ = 410 nm.
sekitar koloni mikroba. Kesebelas
c. Karakterisasi enzim lipase
Karakterisasi
dilakukan
enzim
dengan
semua
spesies
memiliki
spesies tersebut adalah Acinetobacter
faecalis tipe II, Actinobacillus sp.,
lipase
Bacillus
memproduksi
famata,
subtilis
3Kp,
C.
Candida
parapsilopsis,
enzim lipase pada inkubasi optimal
Pseudomonas
aeruginosa,
P.
yang
cepacea,
flourescens-25,
P.
selanjutnya
dilakukan
P.
penentuan aktivitas lipolitik pada
pseudomallei,
suhu dan pH optimal enzim lipase
Rhodotorulla mucilaginosa. Adanya
tersebut.
aktivitas
Penentuan
pH
optimal
P.
putida,
lipolitik
dan
dikarenakan
aktivitas enzim lipase dilakukan
mikroba menghasilkan enzim lipase
dengan melarutkan substrat p-NPP
yang
pada buffer fosfat dengan variasi pH
menghidrolisis
5.0, 6.0, 7.0, dan 8.0. Sedangkan
minyak goreng menjadi gliserol dan
penentuan suhu optimal aktivitas
asam lemak. Pendaran berwarna
enzim lipase dilakukan pada pH
oranye yang ada di sekitar koloni
optimal dengan variasi suhu inkubasi
mikroba
hidrokarbonoklastik
,yakni 30, 40, 50, 60, dan 70 ºC.
terbentuk
karena
digunakan
untuk
trigliserida
dalam
terjadi
pembentukan dimer kompleks antara
HASIL DAN PEMBAHASAN
a. Aktivitas Lipolitik Mikroba
Hidrokarbonoklastik Koleksi
Laboratorium
Mikrobiologi
FST Universitas Airlangga
rhodamin-B dengan asam lemak dan
monogliserida
atau
digliserida
(Wirawan, 2009).
koleksi
b. Indeks Aktivitas Lipolitik
Mikroba Hidrokarbonoklatik
Koleksi
Laboratorium
Mikrobiologi FST Universitas
Airlangga
FST
Hasil penelitian menunjukkan
Universitas Airlangga menunjukkan
bahwa bakteri Actinobacillus sp.
Hasil skrining aktivitas lipolitik
pada
11
spesies
mikroba
hidrokarbonoklastik
Laboratorium
Mikrobiologi
memiliki indeks aktivitas lipolitik
pendaran yang dihasilkan. Hasil
tertinggi di antara spesies mikroba
analisis statistik juga menunjukkan
hidrokarbonoklastik lainnya dengan
bahwa
nilai 3,50 (Gambar 1). Tingginya
bakteri Actinobacillus sp. mayoritas
indeks
berbeda
aktivitas
lipolitik
Actinobacillus
aktivitas
nyata
dengan
lipolitik
mikroba
dikarenakan
lainnya (Tabel 1). Dengan demikian,
diameter zona pendarannya paling
Actinobacillus sp. dipilih sebagai
besar.
isolat
Hal
sp.
bakteri
indeks
ini
sesuai
dengan
uji
yang
akan
pernyataan Hou and Johnston (1992)
kemampuan
bahwa bakteri penghasil lipase yang
dan dikarakterisasi enzim lipase yang
baik dapat dilihat dari kekuatan
dihasilkan.
pendaran
dan
diameter
aktivitas
diukur
lipolitiknya
zona
3,50
1,39
0,88
0,15
1,29
1,62 1,75
0,23 0,33 0,16 0,22
Gambar 1. Indeks aktivitas lipolitik mikroba hidrokarbonoklastik koleksi
Laboratorium Mikrobiologi FST Universitas Airlangga
Tabel 1. Indeks aktivitas lipolitik mikroba hidrokarbonoklastik dan uji statistiknya
No
Spesies Mikroba
1
2
3
4
5
Acinetobacter faecalis tipe II
Actinobacillus sp.
Bacillus subtilis 3Kp
Candida famata
C. parapsilopsis
Indeks Aktivitas Lipolitik
pada Ulangan ke1
2
3
0,08
0,18
0,18
3,31
3,67
3,51
0,25
0,22
0,23
0,51
0,24
0,25
0,22
0,07
0,16
Rata-rata
0,15a ± 0,06
3,50b ± 0,18
0,23ac ± 0,02
0,33a ± 0,15
0,08a ± 0,08
6
7
8
9
10
11
Pseudomonas aeruginosa
P. cepacea
P. flourescens-25
P. pseudomallei
P. putida
Rhodotorulla mucilaginosa
0,31
1,51
1,15
1,47
1,28
2,56
c. Kemampuan
Bakteri
Actinobacillus
sp.
dalam
Menghasilkan Lipase
Berdasarkan
hasil
penelitian
(Gambar 2) bahwa aktivitas lipolitik
mulai mengalami peningkatan pada
jam ke-4 sampai jam ke-24 dimana
bakteri
berada
pada
fase
log
(eksponensial). Namun pada jam ke28
sampai
lipolitik
sehingga
jam
ke-40
mengalami
aktivitas
penurunan,
mengakibatkan
pertumbuhan bakteri melambat atau
memasuki fase stasioner. Naiknya
aktivitas enzim antara jam ke-4
sampai jam ke-24 dan menurunnya
aktivitas enzim antara jam ke-28
sampai jam ke-48 disebabkan adanya
perbedaan waktu yang dibutuhkan
enzim dan peningkatan jumlah enzim
yang bereaksi dengan substrat.
0,22
1,22
0,83
1,10
1,86
0,56
0,22a ± 0,09
1,39d ± 0,15
0,88ad ± 0,24
1,29cd ± 0,19
0,62ad ± 0,30
1,73ad ± 1,50
0,14
1,43
0,67
1,30
1,71
2,13
Selain itu, menurunnya aktivitas
enzim juga disebabkan berkurangnya
jumlah substrat atau jumlah produk
enzim
menghambat
kompleks
pembentukan
enzim
substrat
(Hasnunidah dan Sumardi, 2009).
Menurut Wirawan (2009), penurunan
aktivitas
lipolitik
diduga
karena
adanya hambatan dari metabolit yang
dikeluarkan bersamaan dengan lipase
oleh bakteri pada media produksinya.
Berdasarkan hasil penelitian dapat
diketahui bahwa waktu inkubasi
optimal
yang diperlukan bakteri
Actinobacillus
sp.
dalam
memproduksi enzim lipase adalah
pada jam ke-24. Aktivitas lipolitik
pada waktu inkubasi optimal adalah
sebesar 1,36 U/ml.
1,25
Aktivitas lipase (U/ml)
16,00
1,36
11,50
1,00
12,11
13,55
1,15
9,83
0,97
0,75
13,34
13,21
13,08 13,04
1,09
13,14
1,09
1,09
0,96
14,00
13,27
13,07
13,01
12,00
1,07
10,00
0,97
0,89
0,93
8,00
8,01
6,00
0,58
0,50
0,45
4,00
0,25
2,00
0,00
0,00
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
Log jumlah sel bakteri (CFU/ml)
1,50
52
Waktu inkubasi (jam)
aktivitas enzim
kurva pertumbuhan bakteri
Gambar 2. Pertumbuhan dan aktivitas lipolitik bakteri Actinobacillus sp.
pada media Busnell Haas + minyak goreng 1%
d. Karakterisasi Enzim Lipase
Bakteri Actnobacillus sp.
residu asam amino (Sofia, 2000
Berdasarkan Gambar 3 diketahui
2009). Di samping itu, tiap enzim
dalam Hasnunidah dan Sumardi,
bahwa pada pH 5.0 hingga 7.0
memiliki
aktivitas
berbeda-beda,
lipolitik
mengalami
struktur
molekul
dimana
ada
yang
yang
peningkatan. Akan tetapi, aktivitas
memiliki rantai samping basa, netral,
lipolitik mengalami penurunan pada
atau
pH 8.0. Penurunan aktivitas lipolitik
mengakibatkan suatu enzim secara
ini dikarenakan enzim mengalami
keseluruhan dapat bermuatan positif
denaturasi atau struktur sekunder dan
atau negatif pada pH tertentu (Dewi,
tersiernya berubah. Perubahan nilai
2009). Dengan demikian diketahui
pH akan menyebabkan struktur dan
bahwa pH optimal aktivitas lipolitik
aktivitas
dari bakteri Actinobacillus sp. adalah
enzim
berubah
dan
mengakibatkan perubahan muatan
asam.
pada pH 7.0.
Hal
tersebut
Aktivitas lipase (U/ml)
1,50
1,19
1,25
0,99
1,09
1,00
0,91
0,75
4
5
6
7
8
9
pH
Aktivitas lipase (U/ml)
Gambar 3. Aktivitas lipolitik bakteri Actinobacillus sp. pada berbagai
pH dengan suhu 37º C
2,00
1,75
1,55
1,50
1,46
1,12
1,25
1,00
1,16
1,06
0,75
20
30
40
50
60
70
80
Suhu (ºC)
Gambar 4. Aktivitas lipolitik bakteri Actinobacillus sp. pada berbagai suhu dalam
kondisi pH optimal (pH 7.0)
Berdasarkan Gambar 4 diketahui
optimal lipase untuk mengkatalisis
pada suhu 30º hingga 60º C terjadi
reaksi adalah antara 20º – 60º C. Dari
peningkatkan
lipolitik.
hasil penelitian aktivitas lipolitik
Namun pada suhu 70º C terjadi
bakteri Actinobacillus sp. pada pH
penurunan aktivitas lipolitik karena
dan suhu optimal adalah sebesar 1,55
enzim mengalami denaturasi protein.
U/ml.
aktivitas
Dengan demikian diketahui bahwa
Aktivitas
lipolitik
bakteri
suhu optimal aktivitas lipolitik dari
Actinobacillus sp. ini lebih besar bila
bakteri Actinobacillus sp. adalah
dibandingkan dengan hasil penelitian
pada suhu 60º C. Hasil ini didukung
Liu et al. (2006) yang menggunakan
oleh Reetz et al. (2006) yang
isolat uji Aeromonas sp. dengan
menyatakan bahwa kisaran suhu
aktivitas lipolitik sebesar 0,70 U/ml.
Selain itu, nilai aktivitas lipolitik
bahwa
bakteri Actinobacillus sp. juga lebih
hidrokarbonoklastik
besar bila dibandingkan dengan hasil
Laboratorium
penelitian Guzman et al. (2008) yang
Universitas Airlangga yang memiliki
menggunakan isolat uji
aktivitas
Bacillus
spesies
mikroba
koleksi
Mikrobiologi
lipolitik
FST
adalah
pumilus dengan aktivitas lipolitik
Acinetobacter
sebesar
Actinobacillus sp., Bacillus subtilis
0,079
aktivitas
U/ml.
Tingginya
lipolitik
Actinobacillus
sp.
bakteri
menunjukkan
3Kp,
faecalis
Candida
tipe
famata,
parapsilopsis,
II,
C.
Pseudomonas
bahwa bakteri ini berpotensi dalam
aeruginosa, P. putida, P. cepacea,
menghasilkan
Di
P. flourescens-25, P. pseudomallei,
samping itu, enzim lipase bakteri
Rhodotorulla mucilaginosa dimana
Actinobacillus sp. optimal pada suhu
mikroba
60º C. Oleh karena itu, enzim lipase
aktivitas lipolitik tertinggi adalah
ini dapat diaplikasikan untuk industri
Actinobacillus sp. Actinobacillus sp.
yang melakukan proses produksi
memiliki kemampuan menghasilkan
pada suhu tinggi, seperti industri
enzim lipase sebesar 1,36 U/ml pada
makanan dan kosmetik.
waktu inkubasi optimal 24 jam.
enzim
lipase.
yang
Karakteristik
KESIMPULAN
Berdasarkan
pembahasan
dapat
memiliki
enzim
lipase
indeks
dari
Actinobacillus sp. adalah memiliki
dan
optimal pada suhu 60 ºC dan pH 7.0
disimpulkan
dengan aktivitas lipolitik sebesar
hasil
1,55 U/ml.
DAFTAR PUSTAKA
Arsyad, S. dan Rustiadi, E. 2008.
Penyelamatan Tanah, Air,
dan Lingkungan. Edisi
Pertama. Crestpent Press dan
Yayasan Obor Indonesia.
Dewi, G.D.F. 2009. Isolasi dan
Karakterisasi
Ekstrak
Kasar Enzim Laktase dari
Fungi Pelapuk. Skripsi.
Departemen
Kimia,
FSAINTEK,
Universitas
Airlangga.
Guzman, M.N., Vargas, V.A.,
Antezana, H., and Svoboda,
M. 2008. Lipolytic Enzyme
Production
by
Halophilic/Halotolerant
Microorganisms
Isolated
from
Laguna
Verde,
Bolivia. J. Revista Boliviana
De Quimica, 25.
Nugroho, A. 2006. Bioremediasi
Hidrokarbon Minyak Bumi.
Yogyakarta: Graha Ilmu.
Hasnunidah, N. dan Sumardi. 2009.
Isolasi
Bacillus
sp.
Penghasil
Lipase
dari
Saluran Pencernaan Ayam
Kampung. Jurusan Biologi.
FMIPA. Unila.
Reetz, M.T., Carballeira, J.D., Vogel,
A.
2006.
Iterative
Saturation Mutagenesis on
the Basis of B Factors as a
Strategy for Increasing
Protein
Thermostability.
Angew. Chem. Int. Ed., 45,
7745-7751.
Hou, C.T. and Johnston, T.M. 1992.
Screening
of
Lipase
Activities with Culture
from The Agricultural
Research
Culture
Collection. J. Am. Oil. Chem.
Soc., 69, 1088-1097.
Liu, C.H., Chen, W.M., and Chang,
J.S. 2006. Methods for
Rapid
Screening
and
Isolation
of
Bacteria
Producing Acidic Lipase:
Feasibility Studies and
Novel
Activity
Assay
Protocols.
J.
Microb
Biotechnol., 23, 633-640.
Miller, F.P., Vandome, A.F., and
McBrewster, J. 2010. Lipase.
Alphascript Publishing. USA.
Sumarsih, S. 2005. Skrining Bakteri
Penghasil
Lipase
Termostabil dari Reaktor
pada
Pabrik
Minyak
Goreng. Laporan Penelitian
Dipa Penerimaan Bukan
Pajak Tahun Anggaran 2005.
FMIPA.
Universitas
Airlangga.
Syamsudin, Sri Purwanti, dan Andri
Taufick R. 2008. Efektivitas
Enzim
dalam
Sistem
Lumpur
Aktif
pada
Pengolahan Air Limbah
Pulp dan Kertas. Berita
Selulosa Vol. 43 (2), hal 8392.
Via.
Ni’matuzahroh, Supriyanto, A.,
Affandi, M. dan Fatimah.
2009. Bioremediasi Tanah
Tercemar
Minyak
Menggunakan Konsorsium
Mikroba. Laporan Hibah
Penelitian Strategis Nasional
Tahun
Anggaran
2009.
Universitas Airlangga.
2009.
Minyak
Bumi.
http://kimiakoloid.com/blog/?
cat=13. Diakses tanggal 18
Januari 2011.
Wirawan, B. 2009. Potensi Bakteri
Endofit Tanaman Obat
sebagai Penghasil Senyawa
Antihiperlipidemia melalui
Aktivitas Lipase. Skripsi.
Departemen Biologi. FMIPA.
IPB. Bogor.