pendahuluan - IPB Repository

1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kehidupan modern dewasa ini menyebabkan tingkat stress yang tinggi,
sehingga menjadi salah satu faktor pemicu berkembangnya berbagai macam
penyakit yang memerlukan penanganan khusus. Berbagai penyakit tersebut dapat
menyerang berbagai organ yang bersifat degeneratif, termasuk kelainan
reproduksi. Salah satu penyakit kelainan reproduksi yang ditakuti oleh laki-laki
adalah rendahnya produksi kadar testosteron, sehingga mengurangi kejantanan
pria. Hal ini karena kekurangan hormon testosteron di dalam tubuh jantan dapat
menghambat proses spermatogenesis (Hardy et al. 1991), sehingga menyebabkan
infertilitas.
Kegagalan reproduksi pada jantan seperti defisiensi hormonal, saat ini
umumnya diatasi dengan cara pemberian suplemen hormon testosteron sintetis,
tetapi terapi tersebut pada manusia dapat menyebabkan resiko jangka panjang
seperti menyebabkan penyakit jantung koroner, retensi cairan, kanker prostat dan
sebagainya (Gruennewald & Matsumoto 2003). Untuk itu, beberapa peneliti telah
melakukan upaya terapi lainnya dengan menggunakan sel Leydig sebagai sumber
sel penghasil hormon testosteron yang dapat ditransplantasikan ke dalam testis.
Penggunaan sel Leydig sebagai terapi alternatif penghasil hormon testosteron
membutuhkan sumber sel Leydig yang akan ditransplantasikan dalam jumlah
yang memadai. Produksi galur (cell line) sel Leydig secara in vitro diharapkan
sebagai upaya tersedianya sumber sel Leydig untuk digunakan dalam
mengembangkan terapi alternatif pada kegagalan reproduksi akibat defisiensi
hormonal.
Isolasi sel Leydig pada umumnya dilakukan menggunakan gradien Percoll,
tetapi diketahui bahwa Percoll dapat dimetabolisme oleh sel Leydig sehingga
dapat menurunkan viabilitas sel Leydig ketika dikultur. Oleh karena itu
diperlukan metoda isolasi dan purifikasi yang lebih baik. Nycodenz merupakan
gradien pemisah yang bersifat non toksik dan tidak dapat diabsorpsi oleh beberapa
jenis sel mammalia serta dapat dengan mudah dihilangkan dari sampel sel
dibandingkan dengan gradien pemisahan lain (Miller 2006).
Diketahui fungsi utama sel Leydig pada testis dewasa adalah memproduksi
testosteron yang diperlukan pada proses spermatogenesis. Pengaturan
spermatogenesis tergantung dari sistem hormon yang kompleks yang secara
langsung memerlukan testosteron. Sekresi testosteron oleh sel Leydig diatur
oleh hormon LH dari hipofisa dan merupakan bagian dari aksis hipotalamushipofisa-testis (Senger 2005, Yang et al. 2003). Sekresi testosteron tersebut tidak
hanya berdasarkan aktivitas sel Leydig pada interstitial tetapi juga berdasarkan
jumlah sel Leydig di dalam testis. Pada mamalia, fungsi sel Leydig melibatkan
dua generasi sel yaitu pertama adalah populasi sel Leydig yang berkembang
selama masa fetus. Sel Leydig pada tahap ini bertanggung jawab terhadap
maskulinisasi sistem urogenital jantan (Habert et al. 2001).
2
Progenitor sel Leydig diduga merupakan stem cell mesenkimal karena
mempunyai morfologi seperti sel yang terdapat pada jaringan ikat yang berasal
dari mesoderm embrio (Hardy et al 1991). Pada tikus, progenitor sel Leydig
mempunyai kemampuan proliferasi tinggi dan menunjukkan marker fungsi
diferensiasi (Ge et al. 2005). Disisi lain hormon LH atau hCG sangat diperlukan
untuk proliferasi dan diferensiasi sel Leydig (Saez 1994) sehingga sel Leydig
mampu memproduksi testosteron. Proliferasi sel Leydig di dalam kultur secara in
vitro memerlukan bahan bioaktif tambahan dan yang umum digunakan adalah
ITS (Insulin Transferrin Sodium Selenite) yang mengandung tiga faktor
pertumbuhan. Selain itu juga berfungsi mengurangi penggunaan serum di dalam
medium kultur.
Sel-sel yang dikultur secara in vitro mampu mensekresikan berbagai bahan
bioaktif seperti faktor pertumbuhan (growth factor) yang bermanfaat bagi
pertumbuhan sel dalam kultur. Kultur sel Leydig diduga mensekresikan berbagai
bahan bioaktif seperti peptida, faktor pertumbuhan, hormon testosteron ke
dalam medium kultur (Chemes et al. 1992, Cudicini et al. 1997, Hu et al. 1998).
Medium tersebut dapat digunakan untuk mengkultur kembali sel Leydig maupun
sel yang lain dan dikenal sebagai conditioned medium. Penggunaan conditioned
medium ditemukan dapat mengarahkan diferensiasi stem cell mesenkimal
menjadi sel tertentu (Djuwita et al. 2010), selain itu stem cell mesenkimal
sumsum tulang belakang yang ditransplantasikan ke dalam testis menyebabkan
sel tersebut berdiferensiasi menjadi sel Leydig (Yazawa et al. 2006).
Berdasarkan beberapa hal yang telah diuraikan di atas, maka perlu
dilakukan penelitian untuk mendapatkan teknik isolasi dan pemurnian sel Leydig
yang mempunyai viabilitas sel setelah kultur yang tinggi sehingga diperoleh
galur sel sebagai sumber sel Leydig, untuk mendapatkan sistem kultur sel Leydig
yang optimum, serta untuk mendapatkan sel Leydig alternatif dari stem cell
mesenkimal yang diferensiasinya diarahkan dengan menggunakan conditioned
medium kultur sel Leydig (transdiferensiasi).
Tujuan Penelitian
1. Menguji efektivitas gradien Nycodenz dalam meningkatkan
konsentrasi, kemurnian dan viabilitas sel Leydig setelah diisolasi,
dipurifikasi dan kultur in vitro.
2. Menguji pengaruh penambahan hCG dan/atau ITS ke dalam medium
DMEM terhadap proliferasi dan perkembangan sel untuk mendapatkan
kondisi optimum kultur in vitro sel Leydig hasil purifikasi dengan
gradien Nycodenz.
3. Mengidentifikasi sekresi testosteron dan protein yang terdapat dalam
conditioned medium (CM) kultur sel Leydig.
4. Memperoleh sel Leydig dari hasil kultur stem cell mesenkimal
sumsum tulang dengan CM kultur sel Leydig.
3
Manfaat Penelitian
Sel Leydig dan CM kultur sel Leydig dapat digunakan untuk aplikasi
terapi reproduksi pada manusia dan hewan terutama hewan yang terancam punah.
Kerangka Pemikiran
Penggunaan gradien Percoll banyak digunakan untuk
melakukan
purifikasi sel Leydig berdasarkan densitas sel. Percoll terdiri dari silica koloid
yang dilapisi oleh polyvinylpyrrolidone (PVP) dan merupakan medium yang
mempunyai partikel dengan diameter 15-30 nm. Keuntungan penggunaan gradien
Percoll adalah untuk memisahkan sel karena mempunyai viskositas, osmolaritas
dan toksisitas yang rendah. Namun penggunaan Percoll untuk mempurifikasi sel
Leydig ditemukan bersifat toksik terhadap sel karena adanya proses pinositosis
sehingga partikel Percoll dapat masuk ke dalam sel Leydig.
Oleh karena itu, diperlukan gradien lainnya yang digunakan untuk
mengatasi masalah toksisitas sel Leydig setelah purifikasi. Di samping itu, gradien
alternatif yang digunakan untuk purifikasi sel Leydig juga harus menghasilkan
kemurnian yang tinggi. Gradien non toksik Nycodenz yang merupakan gradien
non partikel sudah sering digunakan untuk memperoleh berbagai jenis sel.
Nycodenz atau iohexol bersifat non ionik dan non toksik serta tidak
dimetabolisme oleh sel. Lebih lanjut diketahui juga bahwa Nycodenz merupakan
larutan non partikel, sehingga mudah dihilangkan dari medium setelah digunakan
untuk memisahkan sel. Purifikasi sel dengan gradien Nycodenz dilakukan dengan
cara sentrifugasi sehingga sel dengan densitas tertentu akan berada pada
konsentrasi gradien Nycodenz tertentu. Penggunaan gradien Nycodenz untuk
mempurifikasi Leydig diharapkan dapat memperoleh tingkat kemurnian sel
Leydig yang tinggi dan setara dengan penggunaan gradien Percoll.
Kultur sel Leydig yang optimal memerlukan berbagai bahan bioaktif yang
mampu mendukung proliferasi dan perkembangan sel di dalam kultur. Produksi
hormon testosteron oleh sel Leydig diatur oleh hormon gonadotropin yaitu
hormon LH yang diperlukan oleh sel Leydig sebagai induktor untuk memproduksi
testosteron secara in vivo. Di dalam kultur in vitro, penambahan hormon hCG
yang merupakan analog dari LH digunakan untuk menginduksi sel Leydig dalam
memproduksi testosteron. Di samping hormon, diduga bahwa untuk proliferasi
sel diperlukan penambahan faktor pertumbuhan yang dapat mendukung proliferasi
sel dengan baik. Faktor pertumbuhan ITS merupakan faktor yang berperan dalam
proliferasi sel. Untuk itu kajian penambahan hCG atau ITS ke dalam medium
kultur sel Leydig secara in vitro dilakukan untuk dapat meningkatkan
konsentrasi sel serta memperoleh testosteron dan bahan bioaktif lainnya .
Sel Leydig dewasa berasal dari progenitor sel Leydig yang merupakan
stem cell mesenkimal yang terdapat di dalam testis. Untuk pembuktian lebih
4
lanjut tentang kemampuan sekreta bahan bioaktif yang dihasilkan oleh kultur sel
Leydig, maka dilakukan penelitian kemampuan conditioned medium sel Leydig
untuk mengarahkan diferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel
Leydig. Untuk mencapai hasil di atas, maka dilakukan serangkai penelitian
dalam tiga tahap, yaitu : (1) isolasi dan purifikasi sel Leydig menggunakan
gradien Nycodenz, (2) optimasi medium kultur sel Leydig serta memperoleh
conditioned medium serta galur sel Leydig dan (3) mengkultur stem cell
mesenkimal sumsum tulang dengan conditioned medium sel Leydig untuk
memperoleh sel Leydig (Gambar 1). Sebagai data tambahan juga dilakukan
analisis terhadap kandungan testosteron dan kandungan protein yang terdapat di
dalam conditioned medium sel Leydig.
5
Testis tikus
Tahap pertama
Isolasi dan purifikasi:
Nycodenz I, II dan Percoll
Kemurnian,
konsentrasi dan
viabilitas sel Leydig
Tahap kedua
Sel Leydig
Viabilitas setelah
kultur (3 hari)
Kultur in vitro dengan perlakuan:
1. DMEM+ NBCS 10%
2. DMEM + NBCS 10%+hCG 2,5 IU/ml
3. DMEM + NBCS 10%+ITS
4. DMEM + NBCS 10%+hCG +ITS
Medium Kultur
Optimum
Koleksi conditioned
medium (CM)
Pasase
Population Doubling Time (PDT)
Kemurnian, konsentrasi dan viabilitas galur sel
CML1, CML2, CML3, CML4
Tahap ketiga
ELISA, SDS PAGE, Spektrofotometer
Profil hormon testosteron dan protein CM
Isolasi tibia atau femur
tikus dewasa
Koleksi stem cell
mesenkimal sumsum
tulang
CML 4 (hCG+ITS)
Kultur in vitro:
1.DMEM+NBCS10%
2.DMEM+testosteron 10 ng/ml
3.DMEM+CML 50%
4.DMEM+CML 50%+hCG 2,5 IU/ml
Uji testosteron (ELISA)
Uji protein (spektrofotometer)
Gambar 1. Alur kegiatan penelitian
Deteksi Sel Leydig ??
Pewarnaan 3β-HSD
Morfologi