Efek Sitotoksik Ekstrak Daun Ketapang (Terminalia Catappa) Pada

Efek Sitotoksik Ekstrak Daun Ketapang (Terminalia Catappa)
Pada Sel Widr
Barinta Widaryanti, Nur Khikmah dan Nunung Sulistiyani
Program Studi Analis Kesehatan
Akademi Analis Kesehatan Manggala Yogyakarta
Jl. Bratajaya No. 25 Sokowaten Banguntapan Bantul
email: [email protected]
Abstrak
Kanker adalah proses pertumbuhan sel yang tidak terkontrol disertai oleh invasi ke jaringan
disekitarnya. Kemoterapi merupakan salah satu cara dalam pengendalian kanker, walaupun penemuan
dan penggunaanya memberikan hasil yang baik namun memiliki toksisitas yang tinggi. Bahan alam
dinilai memberikan prospek sebagai alternatif penghambat sel kanker, karena dianggap tidak memiliki
efek samping yang mebahayakan. Tujuan penelitan ini adalah mengetahui efek sitotoksik ekstrak daun
ketapang pada sel kanker usus besar WiDr. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan kontribusi
terhadap pengembangan terapi kanker. Daun ketapang dimaserasi menggunakan pelarut kloroform,
etil asetat dan metanol. Uji sitotoksik ketiga ekstrak daun ketapang pada sel WiDr dilakukan dengan
MTT cel viability Assay. Uji morfologi apoptosis dilakukan dengan pewarnaan ganda etidium bromida/
akridin oranye dan diamati menggunakan mikroskop fluoresen. Hasil penelitian menunjukan menunjukkan
bahwa ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol dapat menurunkan viabilitas pada
berbagai konsentrasi. Nilai IC50 ekstrak kloroform adalah 183 µg/mL, nilai IC50 ekstrak etil asetat adalah
106,9 µg/mL sedangkan ekstrak metanol adalah 102,8 µg/mL. Hasil uji apoptosis ekstrak etil asetat
mengunakan pewarna etidium bromide/akridin oranye menyebabkan apoptosis pada sel WiDr. Rendahnya
sitotoksisitas ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat dan ekstrak kloroform daun ketapang menunjukan
bahwa daun ketapang memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai agen kemoprevensi.
Kata Kunci: apoptosis, Terminalia cattapa, uji sitotoksik
Pendahuluan
Kanker merupakan proses pertumbuhan sel
yang tidak terkontrol yang diikuti oleh invasi sel
ke jaringan di sekitarnya serta penyebaran ke
bagian tubuh lain. Sifat utama sel kanker adalah
proliferasi terus menerus sehingga menyebabkan
ketidakseimbangan antara sel hidup dengan sel
mati.1 Menurut catatan WHO pada tahun 2000
hingga tahun 2010 kanker menempati urutan
kedua sebagai penyebab kematian didunia
setelah penyakit jantung. Kanker diperkirakan
akan terus mengalami peningkatan hingga akan
menempati urutan pertama pada tahun 2030. Di
negara anggota ASEAN pada tahun 2008
terdapat lebih dari 500.000 kasus kematian akibat
kanker, jenis kanker penyebab kematian adalah
kanker paru-paru, hati dan kanker usus besar. Di
Indonesia jumLah kejadian kanker usus besar
adalah 17,2/100.000 orang, kemungkinan akan
bertambah seiring dengan perubahan pola
makan dan gaya hidup. 2 Oleh karena itu,
diperlukan pencegahan dan pengobatan yang
tepat untuk meningkatkan kualitas hidup
penderita kanker.
Salah satu pengendalian kanker dilakukan
dengan kemoterapi. Pengobatan dengan cara
tersebut memberikan hasil yang bagus, namun
toksisitas dan efek sampingnya cukup tinggi, serta
biaya yang tidak murah. Bahan alam saat ini
banyak digunakan sebagai alternatif penghambat
kanker, karena dianggap tidak memiliki efek
samping yang membahayakan dan biaya
terjangkau. Bahan alami memiliki prospek sebagai
antikanker berkaitan dengan senyawa metabolit
sekunder yang secara biologis dapat memberi
pertahanan terhadap penyakit.
Tanaman ketapang (Terminalia catappa)
tumbuh di daerah tropis dan subtropis banyak
digunakan sebagai tanaman hias dan pelindung.
Daun dan batang ketapang telah banyak
Prosiding “Simposium Nasional Peluang dan Tantangan Obat Tradisional dalam Pelayanan Kesehatan Formal”
43
dilaporkan memiliki aktivitas farmakologi, karena
kandungan senyawa metabolit sekunder. Daun
ketapang mengandung senyawa alkaloid, tannin,
saponin, terpenoid dan senyawa fenolik.3 Ekstrak
air daun ketapang diketahui dapat menghambat
invasi dan metastasis pada sel A549 dan Lewis
lung carcinoma (LLC). 4 Ekstrak etanol daun
ketapang dapat menghambat metastasis human
tongue cel carcinoma SSC-4.5 Ekstrak air batang
ketapang memiliki potensi sebagai antioksidan
dan menghambat pertumbuhan sel Erlich ascites
carcinoma (EAC). 6 Menurut Morioko et al.,7
ekstrak air ketapang dapat menghambat
karsinogenesis pada tikus F344 yang diinduksi
azoxymethane. Penelitian ini dilakukan untuk
mengetahui efek sitotoksik ekstrak daun ketapang
pada sel kaner usus besar WiDr. Penelitian ini
diharapkan dapat memberikan bukti ilmiah
aktivitas antikanker ekstrak daun ketapang
sehingga dapat memberikan kontribusi pada
pengembangan penggunaan bahan alam
sebagai agen kemoprevensi.
Metode Penelitian
Pembuatan ekstrak daun ketapang
Daun ketapang yang masih berwarna hijau
diperoleh dari daerah Sokowaten Banguntapan
Bantul. Daun ketapang dikeringkan dan
dihancurkan secara manual, kemudian dimaserasi
menggunakan pelarut kloroform, etil asetat dan
metanol. Maserat dikering anginkan hingga
diperoleh massa ekstrak kental, kemudian
dikeringkan hingga diperoleh ekstrak kering
kloroform, ekstrak kering etil asetat dan ekstrak
kering metanol.
Penyiapan kultur sel WiDr
Sel kanker usus WiDr diperoleh dari koleksi
bagian parasitologi Fakultas Kedokteran UGM. Sel
dikultur menggunakan medium DMEM.
Uji Sitotoksik
Sel ditanam pada plate kultur 96 sumuran
sejumLah 1x104 sel/sumuran dengan volume medium 100 µl pada masing-masing sumuran.
Setelah inkubasi 24 jam, sel dilakukan pemberian
ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat dan ekstrak
metanol dari daun ketapang, kemudian inkubasi
kembali. Setelah 24 jam ditambahkan (3-(4,5-
44
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium
bromide (MTT) dengan konsentrasi 50 mg/mL
sebanyak 10 µl per sumuran, 4 jam kemudian
reaksi dihentikan dengan penambahan 100 mL
SDS 10% dalam HCl 0.01 N. Absorbansi dibaca
menggunakan Benchmark microplate reader
(BioRad) pada panjang gelombang 595. Viabilitas
sel dalam persen dihitung dengan persamaan:
 AbsP  AbsM  100%  ViabilitasSel
 AbsK  AbsM 
Abs P = absorbansi sel dengan perlakuan
Abs M = absorbansi media
Abs K = absorbansi sel kontrol
Nilai IC50 ditentukan dengan analisis probit
menggunakan program SPSS 17. Seluruh
percobaan dilakukan dengan 3 kali ulangan.
Uji morfologi apoptosis
Sel WiDr ditanam pada coverslip yang
diletakkan dalam kultur plate 24 sumuran
sejumLah 5000 sel/sumuran. Setelah inkubasi
selama 24 jam sel diperlakukan dengan ekstrak
kloroform, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol
pada konsentrasi 150 µg/mL, kemdian diinkubasi
kembali selama 24 jam. Sel yang mengalami
apoptosis diamati dengan penambahan 10 mL
larutan etidium bromide/akridin oranye pada
masing-masing sumuran, yang dibuat dengan
konsentrasi 50 mg/15 mg dalam 1 mL etanol.
Setelah 5 menit kemudian diamati menggunakan
mikroskop fluoresen. Sel yang hidup terlihat
berwarna hijau sedangkan sel apoptosis berwarna
oranye dan terlihat adanya fragmentasi
Hasil Dan Pembahasan
Uji sitotoksisitas dilakukan untuk mengetahui
efek perlakuan ekstrak kloroform, ekstrak etil
asetat dan ekstrak metanol pada sel kanker kolon
WiDr. Dasar yang digunakan untuk menetapkan
nilai sitotoksisitas adalah inhibition concentration
(IC50). Nilai IC50 adalah konsentrasi suatu bahan
uji yang mampu menghambat 50%
pertumbuhan sel. Sel WiDr di beri perlakuan
ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat dan ekstrak
Prosiding “Simposium Nasional Peluang dan Tantangan Obat Tradisional dalam Pelayanan Kesehatan Formal”
metanol dengan seri konsentrasi 180, 160, 140,
120, 100, 80, 60, 40 dan 20 µg/mL dengan waktu
inkubasi 24 jam. Seri kadar tersebut dipilih
berdasarkan uji pendahuluan. Hasil perlakuan sel
Gambar 1.
W iDr dengan ketiga ekstrak menunjukan
kecenderungan penurunan viabilitas sel
tergantung pada konsentrasi yang diberikan
(Gambar 1).
Pengaruh pemberian ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat dan
ekstrak metanol pada sel WiDr dengan konsentrasi 20-180 µg/
mL, dengan waktu inkubasi 24 jam.
Ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol
memberikan pengaruh sitotoksik lebih tinggi dibandingkan ekstrak metanol. Hal ini menunjukkan
bahwa senyawa metabolit pada daun ketapang
yang diduga memiliki aktivitas antikanker adalah
senyawa yang memiliki polaritas lebih tinggi.
Ekstrak air daun ketapang dari Taiwan menunjukkan potensi antimetastasis pada sel kanker
paru-paru dan kanker oral,4,5 sedangkan menurut
Behera et al.,8 ekstrak kloroform daun ketapang
dari India memiliki sitotoksisitas tinggi menggunakan Brine Shrimp assay. Perbedaan tersebut
dapat terjadi kemungkinan lokasi tanaman juga
akan mempengaruhi aktivitas antitumor senyawa
aktif yang terkandung dalam ketapang.
Sitotoksisitas direpresentasikan dalam nilai
Inhibition Concetration (IC50) yang ditentukan
berdasarkan analisa probit. Nilai IC50 dari ketiga
ekstrak disajikan pada Tabel 1 berikut:
Tabel 1.
Nilai IC50 Ekstrak kloroform, ekstrak etil
asetat dan ekstrak metanol daun
ketapang pada sel W iDr, dengan
waktu inkubasi 24 jam
Berdasarkan kriteria yang ditetapkan oleh
National Cancer Institut bahwa senyawa dikatakan
memiliki potensi sitotoksik pada konsentrasi 20
µg/mL. Ketiga ekstrak daun ketapang
menunjukan nilai IC 50 diatas kriteria yang
ditetapkan sehingga dapat dikatakan bahwa
ketiga ekstrak memiliki efek sitotoksik yang
rendah pada sel kanker WiDr.
Untuk menunjukan pengaruh pemberian
ekstrak terhadap opotosis sel WiDr dilakukan
dengan metode pewarnaan ganda dengan
Prosiding “Simposium Nasional Peluang dan Tantangan Obat Tradisional dalam Pelayanan Kesehatan Formal”
45
konsentrasi perlakuan 120 µg/mL dengan waktu
inkubasi 24 jam. Hasil pewarnaan ganda
menunjukan bahwa terjadi kematian sel
ditunjukan dengan warna oranye. Apoptosis sel
ditunjukan dengan ciri-ciri adanya membrane
Gambar 2.
Efek apoptosis ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat
dan ekstrak metanol daun ketapang pada sel WiDr.
(A) Sel kontrol, (B) sel dengan pemberian ekstrak
kloroform, (C) Sel dengan pemberian ekstrak etil
asetat dan (D) Sel dengan pemberian ekstrak
metanol. Tanda panah kuning menunjukan sel hidup
dan tanda panah merah menunjukan sel apoptosis
Sebagian besar senyawa bioaktif yang
terdapat dalam tanaman telah banyak
dikembangkan untuk agen kemoprevensi. Syarat
untuk dapat digunakan sebagai agen
kemoprevensi adalah memiliki efek sitotoksisitas
rendah serta mekanisme hambatan proliferasinya
diketahui. 10 Agen kemoprevensi seringkali
digunakan sebagai terapi kombinasi.11 Daun
ketapang menunjukan potensi sebagai agen
kemoprevensi mengingat efek sitotoksisitasnya
yang rendah dan dapat menyebabkan apoptosis
pada sel kanker WiDr. Namun demikian masih
perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk
mengetahui senyawa bioaktif yang mungkin
berperan sebagai antikanker, menguji kecepatan
proliferasi serta mekanisme hambatan proliferasi
selnya.
46
blebing, pengkerutan sel dan fragmentasi.9 Hasil
uji apoptosis secara morfologi menunjukan
bahwa ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat dan
ekstrak metanol menunjukan ciri-ciri sel apoptosis
(Gambar 2).
Kesimpulan
Ekstrak kloroform, etil asetat dan metanol
dari daun ketapang dapat menurunkan viabilitas
sel, dengan nilai toksisitas tergolong rendah
sehingga daun ketapang memiliki potensi untuk
dikembangkan sebagai agen kemoprevensi.
Ucapan Terimakasih
Penelitian ini dibiayai oleh DIPA Kopertis
wilayah V yogyakarta, Nomor: 0600/023.04.01/
14/2011, serta anggaran rutin Unit Penelitian dan
pengabdian Masyarakat Akademi Analis
Kesehatan Manggala Yogyakarta.
Prosiding “Simposium Nasional Peluang dan Tantangan Obat Tradisional dalam Pelayanan Kesehatan Formal”
Daftar Pustaka
6.
Venkatalakshmi, P, Brinda, P, Induja, K, Invitro
Anti Oxidant and Anti Tumor Studies on
Terminalia catappa Bark. International of
Pharmacy and Pharamceutical Sciences,
2014, Vol 6, Supll 1.
7.
Morioka, T, Suzui, M, Nabandith, V, Inamine,
M, Nakayama, T, Ichiba, T, Yoshimi, N. Modifying Effect of Terminalia catappa on
Azoxymethane-induced Colon Carcinogenesis in Male F344 Rats. Europian Journal of
Cancer Prevention, 2005, 14 (2): 101-105.
8.
Behera, DR, Bhatnagar, S, and Mahapatra, AK.
Cytotoxix and Radical Scavenging Potential
of Indian Almond (Terminalia catappa) Leaf
Extracts. British Biomedical Buletin, 2014,
2(1): 031-039.
Martin, .R., Targeting Apoptosis with Dietary
Bioactive Agents Exp. Biol. Med, 2006,
231:117-12.
1.
Parton, M, Dowsett, M, Smith, I. Studies of
Apoptosisis in Breast Cancer. BMJ, 2001, 322:
1528-1532.
2.
Kimman, M, Norman, R, Jan, S, Kingston, D,
Woodward, M. The Burden of Cancer in
Member Countries of the Association of
Southeast Asian Nation (ASEAN). Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 2012,
13:411-420.
3.
Muhammad, A, and Mudi, SY. Phytochemical Screening and Antimicrobial Activities of
Terminalia catappa Leaves Extracts.
Biokemistri, 2011, 23 (1): 35-39.
4.
Chu, SC, Yang, SF, Liu, SJ, Kuo, WH, Chang,
YZ, Hsieh, YS. In V itro and in vivo
Antimetastatic Effect of Terminalia catappa
L. leaves on Lung Cancer Cells.Food and
Chemical Toxicology, 2007, 45: 1194-1201.
9.
Yang, SF, Chen, MK, Hsieh, YS, Yang, JS,
Zavras, AI, Hsieh, YH, Su, SC, Kao, TY, Chen,
PN, Chu, SC. Antimetastatic effects of
Terminalia catappa L on oral cancer via
Downregulation of Metastacis-associated
Proteases., Food and Chemical Toxicology,
2010, 48:1052-1058.
11. Sporn, Michael, B, and Suh, N. Chemo-prevention of Cancer. Carcinogenesis, 2000,
21(3): 525-530.
5.
10. Greenwald, P. Cancer Chemoprevention. BMJ,
2002, 324: 714-718.
Prosiding “Simposium Nasional Peluang dan Tantangan Obat Tradisional dalam Pelayanan Kesehatan Formal”
47