AMILASE DARI BAKTERI LAUT Vibrio sp

21
Bab III
Metodologi Penelitian
III.1 Alat
Peralatan gelas yang digunakan terdiri dari labu erlenmeyer, gelas kimia, gelas
ukur, cawan petri, tabung reaksi, batang pengaduk, dan spreader (batang L).
Peralatan non-gelas yang digunakan terdiri dari batang ose, spatula, mikropipet
(Soccorex) berukuran 0-50 μl, 50-200 μl; mikropipet (Eppendorf, Germany)
dengan ukuran 1-10 μl, 100-1000 μl; dan tip mikropipet berukuran 10μl, 200 μl,
1000 μl, yang digunakan untuk mengambil reagen dan sampel dalam skala kecil
dan tabung mikrosentrifuga berukuran 0,5 mL dan 1,5 mL, yang digunakan untuk
wadah sampel dalam skala kecil.
Autoclave (All American, Wiconsin) digunakan untuk mensterilkan media dan
peralatan yang digunakan, oven (Memmert) digunakan untuk pengeringan
peralatan gelas dan plastik, Freezer model 8831 (Caravell, Denmark) suhu -20°C
dan model 3671 (Forma Scientific Inc., USA, Caravell, Denmark) suhu -20°C
digunakan untuk menyimpan sampel, enzim, dan reagen-reagen. Laminar flow
(Oliphant LTD, Australia) digunakan untuk pekerjaan yang memerlukan kondisi
steril, misalnya meremajakan bakteri dan pembuatan media. Inkubator goyang
(Lab line dan Thermolyne ROSI 1000) digunakan untuk menumbuhkan bakteri
pada media cair.
Vortex (Vortex-2 Genie) digunakan untuk menghomogenkan campuran.
Spektrofotometer (Smart SpecTM3000 Biorad) digunakan untuk pengukuran
optical density. pH meter Thermo Orion (model 710) digunakan untuk mengukur
pH larutan. Termometer digunakan untuk mengukur suhu. Timbangan digital
model 682B (Mettler Toledo, Switzerland) digunakan untuk pengukuran massa
bahan-bahan kimia.
22
Sentrifuga model JA2-21 (Biofuge) dengan kecepatan 0-12.500 rpm dan
sentrifuga Beckman model J2-HS digunakan untuk memanen sel, memisahkan
supernatan dan sel atau debris sel, dan untuk mengendapkan DNA. Peralatan
elektroforesis (Biorad) digunakan untuk memisahkan fragmen DNA. Lampu
WL/UV (Cole Parmer Instrument, France) digunakan untuk visualisasi hasil
elektroforesis. Mesin PCR (BioRad Gene Cycler) digunakan untuk memperoleh
fragmen cDNA. Kamera digital Canon Power Shot A460 digunakan untuk
dokumentasi.
III.2 Bahan
Bakteri yang digunakan dalam penelitian adalah bakteri laut galur lokal SFNB3
yang diperoleh dari Dr. Ocky Karnaradjasa, Universitas Diponegoro, Semarang.
Plasmid yang digunakan adalah pUC19 dan Escherichia coli TOP10F’
(F’{proAB, lacIq, lacZ∆M15, Tn10(TetR)}mcrA, ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC),
d80lacZ∆M15, ∆lacX74, deoR, recA1, λ-araD139, ∆(ara-leu)7697, galU, galK,
rpsL(Str-R), endAJ, nupG}) digunakan sebagai sel inang untuk memperbanyak
DNA plasmid yang diperoleh dari Laboratorium Biokimia, Program Studi Kimia,
ITB.
Gambar III.1 Peta restriksi plasmid pUC19.
23
Zat-zat kimia yang digunakan dalam penelitian adalah pepton, ekstrak ragi, bakto
agar, pati, bakto tripton, NaCl, EDTA (Asam Etilendiamintetraasetat), lisozim,
etanol, RNase, isopropanol, aquabides (ddH2O), agarosa, buffer TAE (Tris-Base,
asam asetat glasial, EDTA, akuades), etidium bromida, loading buffer (sukrosa,
bromfenol biru, Tris-HCl, EDTA), bufer fosfat (Na2HPO4 dan NaH2PO4),
ampisilin (100 mg/mL), alkalin fosfatase, CaCl2 0,1 M, NaOH, KI/I2, dcycloserine, IPTG (Isopropiltiogalaktosida), X-Gal, T4 DNA Ligase, DNA λ,
GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder, Taq polimerase, Taq bufer, dNTP, primer 16S
rRNA (BactF1 dan UniB), Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega),
QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), GFXTM PCR DNA and Gel Band
Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech). Enzim restriksi yang digunakan
adalah HindIII dan EcoRI.
III.3
Metode
III.3.1 Peremajaan kultur dan pertumbuhan bakteri laut galur lokal SFNB3
Peremajaan kultur bakteri dilakukan dengan menumbuhkan kultur pada media
padat marine yang terdiri dari 0,05% ekstrak ragi, 0,25% pepton, 2% bakto agar
dan air laut, dengan menggunakan ose secara aseptik. Media padat yang telah
diinokulasi bakteri laut galur lokal SFNB3 kemudian diinkubasi pada suhu 30°C
selama dua hari, dan selanjutnya disimpan pada suhu 4°C. Hasil pertumbuhan
bakteri ini dapat digunakan untuk memperoleh DNA kromosom.
III.3.2 Isolasi DNA kromosom bakteri laut galur lokal SFNB3 dengan
metode Wizard® Genomic DNA Purification Kit
Isolasi DNA kromosom dilakukan dengan menggunakan metode Wizard®
Genomic DNA Purification Kit. Koloni tunggal bakteri laut galur lokal SFNB3
diinokulasi ke dalam 5 mL media marine cair dan diinkubasi pada suhu 30°C
selama 16-18 jam dengan kecepatan 150 rpm. Kemudian kultur sel dituangkan ke
dalam tabung mikrosentrifuga 1,5 mL dan disentrifugasi dengan kecepatan 12500
24
x g selama dua menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensi dengan 600
µL Nuclei Lysis Solution, kemudian diinkubasi pada suhu 80°C selama lima
menit. Campuran didinginkan pada suhu ruang, lalu ditambah 3 µL RNase
solution untuk mendegradasi RNA, dan dihomogenkan dengan membolak-balikan
(inversi) tabung. Campuran diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 30 menit,
lalu didinginkan pada suhu ruang, dan ditambahkan 200 µL Protein Precipitation
Solution. Untuk menghomogenkan campuran, digunakan vortex dengan kecepatan
tinggi selama 20 detik. Kemudian dilakukan inkubasi di dalam es selama lima
menit dan campuran disentrifugasi dengan kecepatan 12500 x g selama tiga menit.
Pelet sel dibuang dan supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifuga
1,5 mL baru yang berisi 600 µL isopropanol, campuran dihomogenkan dengan
membolak-balikan tabung, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12500 x g
selama dua menit. Supernatan dibuang dan pelet DNA ditambah dengan 600 µL
etanol 70% untuk pencucian. Sentrifugasi dilakukan untuk mendapatkan DNA,
dengan kecepatan 12500 x g selama dua menit. DNA yang telah diperoleh
dikeringkan pada suhu ruang selama 15 menit, kemudian ditambahkan 100 µL
DNA Rehydration Solution untuk mengelusi DNA dan diinkubasi pada suhu 65°C
selama satu jam.
III.3.3 Identifikasi bakteri laut galur lokal SFNB3 dengan sekuensing gen
16S rRNA
Untuk mengidentifikasi spesies bakteri laut galur lokal SFNB3 yang digunakan
dalam penelitian, dilakukan amplifikasi gen 16S rRNA bakteri laut galur lokal
SFNB3 dengan proses PCR. Kondisi reaksi PCR untuk 16S rRNA adalah
denaturasi awal dengan suhu 94°C selama dua menit, siklus amplifikasi sebanyak
30 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 94°C selama satu menit;
annealing pada suhu 48°C selama satu menit; dan elongation pada suhu 72°C
selama 1 menit, Post-elongation pada suhu 72°C selama 10 menit, dan
penyimpanan hasil PCR dilakukan pada suhu 4°C untuk mempertahankan agar
sampel PCR tetap dingin sebelum dilanjutkan ke tahap berikutnya. Campuran
25
reaksi PCR terdiri atas DNA kromosom bakteri laut galur lokal SFNB3 sebagai
templat, dNTP, enzim Taq Polimerase, bufer enzim Taq polimerase, ddH2O,
primer UniB1 dan BactF1. Primer yang digunakan untuk 16S rRNA yaitu UniB1
(reverse primer): 5’-GGTTAC(G/C)TTGTTACGACTT-3’ dan BactF1 (forward
primer): 5’-AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3’.
III.3.4 Pemotongan DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 secara parsial dengan
enzim restriksi EcoRI
DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 yang telah diisolasi, dipotong secara parsial
dengan enzim restriksi EcoRI untuk memperoleh fragmen DNA dengan ukuran
tertentu. Pemotongan DNA kromosom secara parsial dilakukan dengan beberapa
tahapan, yaitu pemotongan DNA kromosom dengan variasi aktivitas unit enzim
restriksi, variasi waktu inkubasi, dan perbandingan waktu inkubasi. Untuk variasi
aktivitas unit enzim restriksi digunakan 1,525 µg DNA kromosom yang dipotong
masing-masing dengan 2,5 U, 5 U, dan 10 U enzim restriksi EcoRI dalam volume
total campuran 20 µL dan diinkubasi pada 37°C, selama satu malam. Untuk
variasi waktu inkubasi digunakan 1,525 µg DNA kromosom yang dipotong
dengan 2,5 U enzim restriksi EcoRI dalam volume total campuran 20 µL.
Campuran diinkubasi dengan waktu yang berbeda, yaitu selama 1 jam, 2 jam, 3
jam, 4 jam, 5 jam, dan 6 jam pada 37°C. Untuk perbandingan waktu inkubasi
digunakan 3,05 µg dan 4,026 µg DNA kromosom yang dipotong dengan 5 U
enzim restriksi EcoRI, secara berturut-turut diinkubasi selama 3 jam dan satu
malam, dalam volume total campuran 25 µL dan 20 µL.
Untuk pemotongan fragmen DNA dengan ukuran tertentu digunakan 6,1 µg DNA
kromosom yang dipotong dengan 10 U enzim restriksi EcoR1 dalam volume total
campuran 50 µL. Campuran kemudian diinkubasi pada 37°C selama 3 jam.
Hasil pemotongan DNA kromosom secara parsial dengan enzim restriksi EcoRI
dianalisis dengan gel agarosa 1% b/v, dengan tegangan 80 V selama 45 menit,
kemudian divisualisasi dengan sinar UV dekat.
26
III.3.5 Pemurnian DNA dengan GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification
Kit
Fragmen DNA dengan ukuran sekitar 4,5-6 kb dipotong dengan pisau steril,
kemudian ditimbang. Potongan fragmen DNA pada gel agarosa kemudian
diekstraksi dan dimurnikan dengan GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification
Kit.
Setiap 10 mg gel ditambah dengan 10 µL bufer 1 (capture buffer) untuk
mendenaturasi protein dan melarutkan gel, kemudian diinkubasi pada 60°C
sampai gel larut. Campuran kemudian ditransfer ke dalam kolom GFX lalu
diinkubasi pada suhu ruang selama satu menit dan disentrifugasi selama satu
menit dengan kecepatan 12500 x g.
DNA yang terdapat pada kolom GFX dicuci dengan menggunakan 500 µL bufer 2
(wash buffer) dan dikeringkan melalui sentrifugasi selama 1 menit dengan
kecepatan 12500 x g. Kolom GFX yang terdapat DNA di dalamnya, dipindahkan
pada tabung mikrosentrifuga 1,5 mL yang baru, kemudian ditambah 50 µL ddH2O
untuk mengelusi DNA dan diinkubasi pada suhu ruang selama satu menit. Untuk
mendapatkan larutan DNA murni, dilakukan sentrifugasi selama satu menit
dengan kecepatan 12500 x g. Selanjutnya DNA hasil pemurnian dianalisis melalui
elektroforesis gel agarosa 1% pada tegangan 80 Volt.
III.3.6 Elektroforesis gel agarosa
DNA yang akan dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa dicampur dengan
loading buffer (6x larutan stok, 400 g/L sukrosa, 2,5 g/L bromfenol biru dalam 0,6
mL larutan 10 mM Tris-HCl pH 8 dan 1 mM EDTA). Elektroforesis dilakukan
menggunakan TAE 1x (Tris asetat 40 mM, EDTA 1 mM) sebagai running buffer,
dengan tegangan 80 Volt. Penanda yang digunakan adalah DNA λ yang dipotong
dengan enzim restriksi HindIII. Pita DNA diamati menggunakan sinar UV dengan
panjang gelombang 302 nm, selanjutnya gel didokumentasikan dengan kamera
digital.
27
III.3.7 Isolasi DNA plasmid pUC19 dengan metode QIAprep Spin Miniprep
Kit
Kultur sel transforman dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifuga 1,5 mL dan
disentrifugasi dengan kecepatan 12500 x g selama satu menit. Supernatan dibuang
dan pelet sel diresuspensi dengan 250 µL bufer P1, kemudian ditambahkan 250
µL bufer P2 dan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung sebanyak empat
sampai enam kali. Bufer N3 sebanyak 350 µL ditambahkan ke dalam campuran
dan dihomogenkan kembali dengan membolak-balik tabung, lalu dilakukan
sentrifugasi dengan kecepatan 12500 x g selama 10 menit.
Pelet sel yang berwarna putih dibuang dan supernatan dipindahkan ke dalam
kolom QIAprep dengan dekantasi atau dipipet lalu disentrifugasi dengan
kecepatan 12500 x g selama satu menit. Supernatan dibuang dan pelet sel
ditambahkan 0,5 mL bufer PB untuk pencucian kolom kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 12500 x g selama satu menit. Supernatan dibuang dan pelet
DNA dalam kolom dicuci kembali dengan 0,75 mL bufer PE lalu disentrifugasi
dengan kecepatan 12500 x g selama satu menit. Untuk menghilangkan sisa bufer,
dilakukan sentrifugasi kembali dengan kecepatan 12500 x g selama satu menit.
Kolom QIAprep Spin Miniprep Kit yang berisi DNA plasmid pUC19 ditempatkan
pada tabung mikrosentrifuga 1,5 mL kemudian ditambahkan 50 µL air steril
(ddH2O steril), didiamkan selama satu menit, dan disentrifugasi dengan kecepatan
12500 x g selama satu menit untuk memperoleh larutan DNA plasmid.
Larutan DNA plasmid pUC19 dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1%
pada tegangan 80 Volt.
III.3.8 Pemotongan DNA plasmid pUC19 dengan enzim restriksi EcoRI dan
defosforilasi
DNA plasmid pUC19 hasil isolasi QIAprep Spin Miniprep Kit sebanyak 0,1 µg,
dipotong dengan enzim restriksi EcoRI, dengan aktivitas 5 unit pada suhu 37°C
28
selama enam jam. Hasil pemotongan dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa
1% pada tegangan 80 V.
Defosforilasi dilakukan terhadap DNA plasmid pUC19 yang telah dipotong oleh
EcoRI dengan 1 U enzim alkalin fosfatase. Campuran DNA plasmid pUC19 dan
alkalin fosfatase ditambah bufer enzim alkaline fosfatase 1/10 kali volume dan
dihomogenkan lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Enzim
diinaktifkan dengan cara inkubasi pada 65°C selama 10 menit.
Untuk memurnikan DNA plasmid linier yang telah didefosforilasi maka dilakukan
proses pemurnian dengan GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit
seperti pada pemurnian fragmen DNA Sub Bab III.3.5.
DNA plasmid pUC19 hasil pemurnian kemudian dianalisis dengan elektroforesis
gel agarosa 1% pada tegangan 80 volt.
III.3.9 Ligasi
Ligasi dilakukan dalam volume total campuran 20 µL. Campuran untuk reaksi
ligasi mengandung 1 U T4 DNA ligase, 2 µL bufer 10x T4 DNA ligase, 50 ng
DNA plasmid pUC19, dan 111,111 ng fragmen DNA dengan ukuran ~ 4,5-6 kb.
Campuran dihomogenkan kemudian diinkubasi pada suhu 4°C selama 16-18 jam
untuk memperoleh hasil yang optimum.
III.3.10 Pembuatan sel E. coli Top10F’ kompeten
Pembuatan sel E. coli Top10F’ kompeten dilakukan menurut metode Cohen
(Sambrook et al., 1989). Koloni tunggal E. coli Top10F’ ditumbuhkan dalam 5
mL media Luria Bertani cair yang ditambah dengan 5 mg tetrasiklin pada suhu
37°C, dengan pengocokan 150 rpm selama 16-18 jam. Kultur sel sebanyak 200
μL diinokulasi ke dalam 20 mL media Luria Bertani cair yang telah ditambahkan
dengan 45 mg/mL tetrasiklin, dan diinkubasi pada 37°C dengan pengocokan 150
29
rpm hingga diperoleh OD600 ≈ 0,4 (± 3 jam). Selanjutnya kultur sel diinkubasi di
dalam es selama 20 menit, setelah itu dipindahkan ke dalam tabung sentrifuga 50
mL dan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm pada suhu 4°C selama 10
menit. Supernatan dibuang dan pelet sel dicuci dengan 5 mL larutan CaCl2 0,1 M
segar, lalu diinkubasi kembali di dalam es selama 5 menit dan disentrifugasi
dengan kecepatan 4000 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit. Supernatan dibuang
dan pelet diresuspensi dengan 300 μL larutan CaCl2 0,1 M segar, kemudian
dipindahkan ke dalam tabung mikrosentirfuga 1,5 mL, masing-masing 100 µL.
Sel kompeten didinginkan dalam es dan kemudian disimpan pada suhu 4°C.
III.3.11 Transformasi E. coli Top10F’ dengan DNA plasmid rekombinan
Transformasi E. coli Top10F’ dengan DNA plasmid rekombinan dilakukan
menurut metode Cohen (Sambrook et al., 1989). DNA plasmid rekombinan
sebanyak 2,5 µL ditambahkan ke dalam 100 μL sel E. coli Top10F’ kompeten
dan dibiarkan di dalam es selama 30 menit. Selanjutnya dilakukan heat shock
pada 42°C selama 90 detik dan diinkubasi di dalam es selama 2 menit. Campuran
ditambahkan 900 μL media LB cair, kemudian ditumbuhkan dengan pengocokan
150 rpm pada suhu 37°C selama 3 jam.
Kultur sel hasil transformasi sebanyak 250 µL ditumbuhkan kembali pada media
padat LB yang mengandung ampisilin (100 mg/mL), 0,5 mM IPTG dan 80
μg/mL X-Gal untuk mengisolasi DNA plasmid rekombinan, dengan cara
disebarkan menggunakan batang L dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 16-18
jam.
Koloni putih yang tumbuh diremajakan kembali pada media padat LBA dan
media padat LBA ditambah 1% pati. Selanjutnya dilakukan penapisan seperti
yang akan dijelaskan pada Sub Bab III.3.12.
Transforman
yang
diduga
mengandung gen α-amilase ditumbuhkan pada 5 mL LB cair yang mengandung
ampisilin (100 mg/mL) dan diinkubasi kembali pada suhu 37°C dengan
30
pengocokan 150 rpm selama 16-18 jam, kemudian dilakukan isolasi DNA
plasmid rekombinan dengan metode QIAprep Spin Miniprep Kit.
III.3.12 Penapisan (Screening)
Bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3 ditumbuhkan pada media padat marine
yang terdiri dari 0,05% ekstrak ragi, 0,25% pepton, 2% bakto agar, air laut, dan
1% pati secara aseptik lalu diinkubasi pada suhu 30°C selama dua hari.
Selanjutnya penapisan (screening) dilakukan dengan penambahan larutan 0,5%
KI/0,15% I2 ke atas permukaan media padat marine yang telah ditumbuhi bakteri
tersebut. Terbentuknya daerah bening (halo zone) mengindikasikan adanya
aktivitas α-amilase yang dapat menghidrolisis pati sehingga kompleks antara pati
dan iodin tidak terbentuk. Jika tidak ada aktivitas α-amilase akan terdapat daerah
gelap karena pati membentuk komplek dengan iodin.
Untuk penapisan sel transforman, diperlukan D-sikloserin sebelum diberi
penambahan 0,5% KI/0,15% I2. Transforman ditumbuhkan pada media luria
bertani yang terdiri dari 1% bakto tripton, 1% NaCl, 0,5% ekstrak ragi, 2% bakto
agar, dan 1% pati serta penambahan ampisilin (100mg/mL) secara aseptik, lalu
diinkubasi pada suhu 37°C selama satu malam. Sebanyak 3 mg/5 mL D-sikloserin
dituangkan ke atas permukaan tumbuhnya transforman, kemudian diinkubasi pada
37°C selama 5 jam (Cha et al., 1993). D-sikloserin akan menghambat biosintesis
dinding sel E. coli sehingga α-amilase dapat disekresikan dan pati dapat
dihidrolisis. Selanjutnya dilakukan penambahan 0,5% KI/0,15% I2.
III.3.13 Isolasi plasmid rekombinan yang membawa gen α-amilase dengan
metode QIAprep Spin Miniprep Kit
Koloni putih dari hasil transformasi yang diduga membawa gen α-amilase
ditumbuhkan pada 5 mL media cair LB yang mengandung ampisilin (100 mg/mL)
pada suhu 37°C dengan pengocokan 150 rpm selama 16-18 jam. Kemudian
31
dilakukan isolasi DNA plasmid rekombinan dengan metode QIAprep Spin
Miniprep Kit seperti yang telah dijelaskan sebelumnya pada Sub Bab III.3.7.
III.3.14 Pemotongan plasmid rekombinan yang membawa gen α-amilase
dengan enzim restriksi EcoRI
DNA plasmid rekombinan yang membawa gen α-amilase hasil isolasi QIAprep
Spin Miniprep Kit sebanyak 250 ng dipotong dengan 5U enzim restriksi EcoRI
dalam volum total campuran 20 μL. Selanjutnya campuran diinkubasi pada suhu
37°C selama 16-18 jam. Hasil pemotongan DNA plasmid rekombinan dengan
enzim restriksi kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 0,8% (b/v)
untuk mengetahui ukuran fragmen DNA sisipan.
III.3.15 Analisis urutan nukleotida
Urutan nukleotida fragmen DNA sisipan ditentukan dengan metode dideoxy
Sanger menggunakan dye terminator (Macrogen, Korea). Untuk menentukan
urutan nukleotida hasil amplifikasi gen 16S rRNA digunakan primer untuk 16s
rRNA yaitu UniB1 (reverse primer): 5’-GGTTAC(G/C)TTGTTACGACTT-3’
dan BactF1 (forward primer): 5’-AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3’.
Untuk menentukan urutan nukleotida fragmen DNA sisipan digunakan primer
universal
pUC19,
yaitu
5’(GTAAAACGACGGCCAGT)3’),
5’(AACAGCTATGACCATG)3’).
M13F-pUC
dan
M13R-pUC
Analisis
kesamaan
(forward
(reverse
urutan
primer:
primer:
nukleotida
dilakukan dengan menggunakan metode blastn yang berasal dari program BLAST
pada situs NCBI. Selanjutnya dapat dilakukan penjajaran dengan menggunakan
program Clustal-X dan GeneDoc.