1 Isolasi dan Seleksi Bakteri Asam Laktat Penghasil Senyawa
advertisement
1 Isolasi dan Seleksi Bakteri Asam Laktat Penghasil Senyawa Antimikroba dari Lele Dumbo (Clarias gariepinus) terhadap Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri, dan Staphylococcus aureus Isolation and Selection of Lactic Acid Bacteria Producing Antimicrobial Substance from King Catfish (Clarias gariepinus) against Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri, and Staphylococcus aureus Slamet Mardiyanto Rahayu1, Ratna Setyaningsih2, Yantyati Widyastuti3 Jurusan Biologi. Fakultas MIPA. Universitas Sebelas Maret Surakarta Puslit Bioteknologi LIPI-Cibinong, Bogor Lactic acid bacteria can be found in a lot of habitats such as fermented food or drink, fruits and gastrointestinal of humans or animals. Lactic acid bacteria play an important role in the inhibition of pathogenic microorganism so they can be used for increasing the health of humans or animals. The aims of the research were (1) to get lactic acid bacteria isolates from gastrointestinal of king catfish (C.gariepinus), (2) to get lactic acid bacteria isolates that produced antimicrobial substance against A.hydrophila, E.ictaluri, and S.aureus, and (3) to identify the potencial isolates of lactic acid bacteria wich produced antimicrobial substance against A.hydrophila, E.ictaluri, and S.aureus. The experiment was carried out by collecting the samples of king catfish (C.gariepinus) from region of Depok and Parung, Bogor. Isolation of lactic acid bacteria were carried of using MRS medium containing 0.5% CaCO3. Lactic acid bacteria isolates then identified based on Gram reaction, catalase test, and cell motility test. Selection of lactic acid bacteria isolates produced antimicrobial substance against A.hydrophila, E.ictaluri, and S.aureus was carried out well-agar diffusion method. Selection of lactic acid bacteria isolates included against activity of culture, acid supernatant, and neutral supernatant. Identification for lactic acid bacteria potencial isolates was carried out followed the procedure of Gram reaction, biochemical test, and physiological test. As the results, 83 isolates of lactic acid bacteria was collected. Seven isolates, DUB2B4, DUK3B14, DUB2B6, DUB1B8, DUK3B13, PUB1B, and PUB1B3, were selected as potencial isolates. Two isolates, DUB2B4 and DUK3B14 were selected as top potencial isolates which showed the wide antimicrobial spectrum. The best activity of culture, acid supernatant, and neutral supernatant isolate DUB2B4 against A.hydrophila were 6.358 x 103 mm2/ml; 3.972 x 103 mm2/ml; and 3.454 x 10 3 mm2/ml respectively. The best activity of culture, and acid supernatant isolate DUK3B14 against A.hydrophila were 5.714 x 103 mm2/ml; and 2.967 x 103 mm2/ml respectively. The best activity of neutral supernatant isolate DUK3B14 against E.ictaluri was 2.512 x 103 mm2/ml. Primary identification shows that isolate DUB2B4 was Lactobacillus sp. and isolate DUK3B14 was Enterococcus sp. Key words: lactic acid bacteria, king catfish (C.gariepinus), producing antimicrobial substance. 1 Mahasiswa Jurusan Biologi FMIPA UNS Dosen Jurusan Biologi FMIPA UNS 3 Peneliti Puslit Bioteknologi LIPI-Cibinong, Bogor 2 2 PENDAHULUAN Ikan tidak hanya digemari oleh semua lapisan masyarakat, tetapi juga sebagai sumber protein hewani alternatif dan relatif murah. Kebutuhan ikan terus meningkat sejalan dengan meningkatnya jumlah penduduk, tingkat pendidikan dan pendapatan serta perubahan sosial budaya masyarakat (Puspowardoyo dan Djarijah, 2002). Ikan merupakan salah satu hewan air yang selalu bersentuhan dengan lingkungan perairan sehingga mudah terinfeksi patogen melalui air (Kei dkk., 2003). Pengendalian penyakit infeksi tersebut biasanya menggunakan terapi antibiotik. Namun hal tersebut dapat menimbulkan dampak negatif berupa resistensi mikroba patogen (Saparinto, 2002). Salah satu alternatif antimikroba dalam kontrol penyakit adalah bakteri probiotik (Verschuere et al., 2000). Mikroba sebagai probiotik harus memenuhi beberapa persyaratan dan yang utama adalah aman untuk dikonsumsi dan tidak bersifat patogen. Oleh karena itu, mikroba tersebut harus mampu bertahan hidup sampai pada saluran pencernaan. Kelompok bakteri asam laktat merupakan salah satu mikroba yang memenuhi persyaratan tersebut (Widyastuti dan Sofarianawati, 1999). Untuk mendapatkan manfaat yang optimum maka harus dipakai strain bakteri asam laktat yang berasal dari saluran pencernaan (Havenaar et al., 1992). Lele dumbo (C.gariepinus) merupakan salah satu komoditas perikanan yang cukup populer di masyarakat dan telah dibudidayakan secara intensif. Akan tetapi, dalam pembudidayaannya terdapat berbagai permasalahan antara lain penyakit (Wichaksana dkk., 2003). Jenis penyakit yang sering menyerang lele dumbo (C.gariepinus) adalah penyakit yang disebabkan protozoa, bakteri dan virus (Puspowardoyo dan Djarijah, 2002). A.hydrophila menyebabkan Motile Aeromonas Septicemia (MAS) atau Haemorrhagic Septicemia, Epizodic Ulcerative Syndrome (EUS), dan infectious abdominal dropsy (Noga, 1995; Hayes, 2000). E.ictaluri menyebabkan Enteric Septicemia of Catfish (ESC) yang memiliki dua bentuk patogenesis, yaitu akut dan kronis (Noga, 1995). Sedangkan S.aureus merupakan mikroflora yang dapat 3 menyebabkan infeksi pada kulit, membran mukosa dan dalam kondisi tertentu dapat menyebabkan bisul, borok serta nanah pada luka (Salle, 1961). Berdasarkan hal tersebut maka perlu diketahui adanya bakteri asam laktat yang dapat diisolasi dari saluran pencernaan lele dumbo (C.gariepinus) dan jenis bakteri asam laktat yang mampu menghasilkan senyawa antimikroba terhadap A.hydrophila, E.ictaluri dan S.aureus. Pada penelitian ini dilakukan isolasi dan seleksi bakteri asam laktat yang mampu menghasilkan senyawa antimikroba dari saluran pencernaan lele dumbo (C.gariepinus) terhadap A.hydrophila, E.ictaluri dan S.aureus. BAHAN DAN METODE Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus-Desember 2006, di Laboratorium Mikrobiologi Bidang Biologi Sel dan Jaringan, Puslit BioteknologiLIPI, Jl. Raya Bogor Km. 46, Cibinong, Kabupaten Bogor. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi sampel lele dumbo (C.gariepinus); mikroba patogen uji A.hydrophila, E.ictaluri, dan S.aureus; media MRS agar dan cair untuk isolasi dan pemeliharaan isolat bakteri asam laktat dan media Nutrient agar dan cair untuk pemeliharaan mikroba patogen uji dan seleksi isolat bakteri asam laktat melalui uji aktivitas antimikroba. Bahan kimia yang digunakan meliputi akuades, alkohol 75%, Buffer pH 4,0 dan 7,0, Dillution solution (larutan pengencer), indikator phenol red, larutan HCl 0,5 M, larutan NaOH 1 M, reagen pewarnaan Gram, reagen uji katalase (larutan H2O2 3%), dan reagen uji fermentasi karbohidrat. Pada penelitian ini, isolat bakteri asam laktat diperoleh dari saluran pencernaan lele dumbo (C.gariepinus) meliputi lambung, usus besar dan usus kecil dengan metode isolasi aerob dan anaerob dari pengenceran 10 -6 sampai 10-8 menggunakan media MRS agar yang ditambah CaCO3 0,5% dan diinkubasi pada suhu 30°C selama 24-48 jam. Isolat yang diperoleh kemudian diidentifikasi awal melalui pewarnaan Gram, uji katalase, dan uji motilitas sel. Kemudian dilakukan seleksi isolat bakteri asam laktat melalui uji aktivitas antimikrobanya (meliputi kultur, supernatan asam dan supernatan netral) terhadap A.hydrophila, E.ictaluri 4 dan S.aureus. Aktivitas penghambatan isolat bakteri asam laktat terhadap mikroba patogen uji dapat diketahui dengan adanya zona bening. Aktivitas penghambatan (mm2/ml) = (Luas zona + sumur) – (Luas sumur) Volume sampel Isolat bakteri asam laktat potensial merupakan isolat yang memiliki aktivitas antimikroba meliputi kultur, supernatan asam dan supernatan netralnya. Identifikasi bakteri asam laktat potensial meliputi: pengamatan makroskopis koloni dan mikroskopis sel; uji biokimia berupa uji fermentasi karbohidrat dan uji katalase; dan uji fisiologi berupa uji pertumbuhan pada berbagai suhu dan pH serta uji toleransi pertumbuhan pada 6,5% NaCl. Analisis data dilakukan secara deskriptif terhadap hasil seleksi isolat bakteri asam laktat yang potensial menghasilkan senyawa antimikroba terhadap A.hydrophila, E.ictaluri, dan S.aureus dan hasil identifikasi isolat bakteri asam laktat potensial. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Sampel lele dumbo (C.gariepinus) Sampel lele dumbo (C.gariepinus) diperoleh dari daerah Depok dan Parung, Bogor. Dari masing-masing tempat diambil 2 individu yang berumur sekitar 2,5 bulan dengan berat sekitar 100 gram (Gambar 1). Sesampainya di laboratorium sampel dibedah saluran pencernaannya untuk diisolasi bakteri asam laktatnya. Gambar 1. Sampel lele dumbo (C.gariepinus) Keterangan: A. dari daerah Depok B. dari daerah Parung, Bogor A B B. Isolasi Bakteri Asam Laktat Isolasi bakteri asam laktat dari saluran pencernaan lele dumbo (C.gariepinus) meliputi bagian lambung, usus besar, dan usus kecil. Isolasi bakteri asam laktat dilakukan dengan metode aerob dan anaerob (Gambar 2). Hal ini dilakukan untuk membuktikan sifat fakultatif anaerob dari bakteri asam laktat. 5 Media yang digunakan untuk isolasi bakteri asam laktat adalah MRS agar yang mengandung 0,5% CaCO3. Koloni yang diamati adalah koloni yang membentuk zona bening di sekelilingnya. Menurut Widyastuti dan Sofarianawati (1999) adanya zona bening merupakan akibat diproduksinya asam yang menetralkan CaCO3 yang terdapat pada media selama pertumbuhan bakteri asam laktat tersebut. Berdasar adanya zona bening di sekeliling koloni maka diperoleh 83 isolat yang diduga sebagai bakteri asam laktat. 1 2 A B Gambar 2. Isolat bakteri asam laktat dari saluran pencernaan lele dumbo (C.gariepinus) Keterangan: 1 A. Metode aerob B. Metode anaerob 2 1. Koloni isolat bakteri asam laktat 2. Zona bening C. Identifikasi Awal Isolat Bakteri Asam Laktat Koloni isolat bakteri asam laktat yang diperoleh diidentifikasi awal meliputi pewarnaan Gram sehingga dapat diketahui kelompok Gram suatu isolat dan bentuk selnya, uji katalase, dan uji motilitas sel. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel tebal dengan kandungan lipid yang rendah akan mengalami penyusutan akibat perlakuan dengan alkohol. Hal ini mengakibatkan ukuran pori-pori menjadi mengecil, permeabilitas berkurang dan kompleks ungu kristal-violet tidak terekstraksi dan tidak terwarnai oleh pewarna tandingan safranin. Uji katalase positif berarti bakteri memiliki enzim katalase yang dapat memecah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen. Bakteri asam laktat tidak memiliki enzim katalase sehingga selnya bereaksi negatif terhadap hidrogen peroksida. Pengujian motilitas sel dengan cara menginokulasikan isolat bakteri asam laktat pada media agar tegak dengan cara tusukan. Setelah masa inkubasi 24-48 jam, jika pertumbuhan terjadi pada jalur tusukan maka sel dinyatakan non motil (Hadioetomo, 1993). Dari 83 isolat yang telah diidentifikasi awal, semuanya memenuhi syarat atau ciri sebagai bakteri asam laktat yaitu Gram positif, katalase negatif, dan non motil. Hasil karakterisasi isolat bakteri asam laktat dapat dilihat pada Tabel 1. 6 7 D. Seleksi Isolat Bakteri Asam Laktat yang Potensial mempunyai Aktivitas Antimikroba terhadap A.hydrophila, E.ictaluri, dan S.aureus Seleksi isolat bakteri asam laktat yang mempunyai aktivitas antimikroba menggunakan metode difusi sumur. Menurut Cardici dan Citak (2005) kelebihan metode difusi sumur adalah seluruh metabolit yang dihasilkan bakteri asam laktat dapat diproduksi selama uji antimikroba. Isolat bakteri asam laktat dan mikroba patogen uji yang digunakan masing-masing sebanyak107 cfu/ml. Seleksi isolat bakteri asam laktat terhadap A.hydrophila, E.ictaluri, dan S.aureus yang dilakukan meliputi kultur, supernatan asam dan supernatan netral isolat bakteri asam laktat. Besarnya aktivitas antimikroba merupakan luas daerah penghambatan persatuan volume sampel kultur, supernatan asam, dan supernatan netral isolat bakteri asam laktat (mm2/ml). Hasil seleksi kultur, supernatan asam dan supernatan netral isolat bakteri asam laktat yang potensial mempunyai aktivitas antimikroba dapat dilihat pada Tabel 2. Kultur isolat bakteri asam laktat yang memberikan zona bening kemudian diseleksi supernatan asam dan supernatan netralnya. Penghambatan kultur isolat bakteri asam laktat terhadap mikroba patogen uji disebabkan oleh aktivitas kultur didukung oleh asam dan komponen-komponen metabolit yang dihasilkan selama fermentasi. Menurut Delgado et al. (2001) aktivitas penghambatan bakteri asam laktat terjadi oleh akumulasi metabolit primer (asam laktat, asam asetat, etanol, karbondioksida) dan produksi komponen antimikroba lain seperti hidogen peroksida, diasetil, dan bakteriosin. Penghambatan supernatan asam isolat bakteri asam laktat terhadap mikroba patogen uji terutama disebabkan oleh komponen-komponen metabolit yang dihasilkan saat fermentasi. Komponen metabolit tersebut antara lain asam organik berupa asam laktat dan asam asetat. Asam laktat merupakan metabolit utama bakteri asam laktat. Menurut Alokami et al. (2000) asam organik yang dihasilkan bakteri asam laktat menyebabkan penurunan pH dan menyebabkan sitoplasma sel menjadi asam, mengacaukan potensial transmembran dan menghambat transport substrat. Dari fermentasi juga dihasilkan etanol dan karbondioksida. Karbondioksida menyebabkan lingkungan menjadi anaerob dan akumulasi pada 8 lipida bilayer membran menyebabkan disfungsi permeabilitas membran (Yang, 2000). Etanol seperti asam organik menyebabkan penurunan pH sitoplasmik (Jordan et al., 1999). Penetralan pH pada supernatan bertujuan untuk menghilangkan atau mengurangi pengaruh senyawa-senyawa asam yang terdapat dalam supernatan tersebut. Oleh karena itu diharapkan aktivitas penghambatan yang terjadi bukan karena pengaruh senyawa asam organik, tetapi oleh senyawa antimikroba lain seperti bakteriosin. Namun masih ada kemungkinan adanya pengaruh senyawa lain yang juga memiliki sifat antimikroba yang tidak terpengaruh oleh faktor penetralan pH yaitu hidrogen peroksida, dan diasetil (Nurhasanah, 2004). Selain menghasilkan metabolit primer, bakteri asam laktat juga menghasilkan komponen antimikroba lain yaitu hidrogen peroksida, diasetil dan bakteriosin. Menurut Earnshaw (1996) dan Ouwehand (1998) hidrogen peroksida terbentuk karena adanya laktat oksidase, piruvat oksidase dan NADH oksidase. Hidrogen peroksida yang dihasilkan bakteri asam laktat dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif maupun bakteri Gram negatif. Bakteri asam laktat tidak memiliki enzim katalase sehingga terjadi akumulasi H2O2 pada media dan menyebabkan kondisi anaerob. Diasetil dihasilkan oleh bakteri asam laktat dari piruvat (Mishra and Lambert, 1996). Bakteriosin merupakan substansi protein yang bersifat bakterisidal (Nowroozi et al., 2004). Berdasar hasil seleksi maka dipilih 7 isolat bakteri asam laktat potensial yaitu DUB2B4, DUK3B14, DUK3B13, DUB1B8, DUB2B6, PUB1B dan PUB1B3. Ketujuh isolat tersebut memiliki aktivitas penghambatan yang relatif besar baik kultur, supernatan asam maupun supernatan netralnya terhadap mikroba patogen uji dibandingkan isolat-isolat yang lainnya. Senyawa antimikroba yang terkandung dalam kultur, supernatan asam, dan supernatan netral dari isolat DUB2B4 dan DUK3B14 tersebut memiliki spektrum yang luas (wide antimicrobial spectrum) karena mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif (A.hydrophila, dan E.ictaluri) maupun bakteri Gram negatif (S.aureus). 9 10 3 3 1 1 2 3 2 2 A A 1 1 2 3 2 B C 3 1 3 1 2 3 1 2 2 B A Keterangan:1. Zona bening, 2. Mikroba patogen uji, 3. Lubang sumur berisi kultur isolat DUB2B4 C B 3 1 2 Gambar 3. Penghambatan kultur isolat DUB2B4 terhadap A) A.hydrophila, B) E.ictaluri, dan C) S.aureus 1 3 C 3 1 2 3 3 2 1 2 1 A B C Gambar 4. Penghambatan supernatan asam (pH 4,55) isolat DUB2B4 terhadap A) A.hydrophila,B) E.ictaluri, dan C) S.aureus Keterangan: 1. Zona bening 2. Mikroba patogen uji 3.Lubang sumur berisi supernatan asam isolat DUB2B4 Gambar 5. Penghambatan supernatan netral (pH 7,04) isolat DUB2B4 terhadap A) A.hydrophila,B) E.ictaluri, dan C) S.aureus Keterangan: 1. Zona bening 2. Mikroba patogen uji 3. Lubang sumur berisi supernatan netral isolat DUB2B4 Gambar 6. Penghambatan kultur isolat DUK3B14 terhadap A) A.hydrophila,B) E.ictaluri, dan C) S.aureus Keterangan: 1. Zona bening 2. Mikroba patogen uji 3. Lubang sumur berisi kultur isolat DUK3B14 3 1 3 2 1 2 3 2 1 B A 1 2 3 A C 1 2 B 3 3 1 2 C Gambar 7. Penghambatan supernatan asam (pH 4,31) isolat DUK3B14 terhadap A) A.hydrophila,B) E.ictaluri, dan C) S.aureus Keterangan: 1. Zona bening 2. Mikroba patogen uji 3. Lubang sumur berisi supernatan asam isolat DUK3B14 Gambar 8. Penghambatan supernatan netral (pH 7,01) isolat DUK3B14 terhadap A) A.hydrophila,B) E.ictaluri, dan C) S.aureus Keterangan: 1. Zona bening 2. Mikroba patogen uji 3. Lubang sumur berisi supernatan netral isolat DUK3B14 11 E. Identifikasi Isolat bakteri Asam Laktat Potensial Identifikasi isolat bakteri asam laktat yang potensial mempunyai aktivitas antimikroba terhadap mikroba patogen uji mengacu pada Bergey’s Manual Determinative of Bacteriology Edisi 9 th. 1994 (Holt et al., 1994). Terdapat tujuh isolat bakteri asam laktat potensial yang dipelajari karakteristiknya yaitu DUB2B4, DUK3B14, DUB2B6, DUB1B8, DUK3B13, PUB1B, dan PUB1B3. Isolat bakteri asam laktat yang dipelajari karakteristiknya secara mendalam adalah DUB2B4 dan DUK3B14 yang merupakan isolat unggulan. Hasil identifikasi 2 isolat bakteri asam laktat unggulan dapat dilihat pada Tabel 3 dan Gambar 9. Berdasar kemampuan pertumbuhannya pada pH 2 menunjukkan bahwa ketujuh isolat bakteri asam laktat potensial tersebut berpotensi sebagai probiotik karena salah satu syarat mikroba dapat digunakan sebagai probiotik adalah mampu tumbuh pada kondisi asam. Menurut Feliatra dkk.( 2004) bahwa bakteri yang diisolasi dari saluran pencernaan (usus dan lambung) ikan dapat tumbuh dan berkembang pada media dengan pH 2 yang merupakan indikator utama bakteri probiotik. Isolat DUB2B4 (Lactobacillus sp.) dan isolat DUK3B14 (Enterococcus sp.) berpotensi sebagai probiotik ikan karena memiliki aktivitas antimikroba terhadap ketiga mikroba patogen uji (A.hydrophila, E.ictaluri, dan S.aureus) dan mampu tumbuh pada pH 2. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Suyanandana et al. (1998) terhadap ikan air tawar diperoleh 13 isolat yang termasuk genus Enterococcus dan 19 isolat yang termasuk genus Lactobacillus yang kemudian dilakukan uji antimikroba terhadap beberapa strain mikroba patogen uji seperti Escherichia coli, S.aureus, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, dan A.hydrophila. Pada penelitian tersebut diperoleh 2 isolat terpilih Enterococcus dan 1 isolat terpilih Lactobacillus yang berpotensi sebagai probiotik. 12 13 KESIMPULAN 1. Hasil isolasi bakteri asam laktat dari saluran pencernaan lele dumbo (C.gariepinus) diperoleh 83 isolat. 2. Hasil seleksi kultur menunjukkan 38 isolat bakteri asam laktat mempunyai aktivitas antimikroba. Terdapat tujuh isolat bakteri asam laktat potensial yaitu DUB2B4, DUK3B14, DUB2B6, DUB1B8, DUK3B13, PUB1B, dan PUB1B3. Isolat DUB2B4 dan DUK3B14 memiliki spektrum antimikroba yang luas (wide antimicrobial spectrum). 3. Hasil identifikasi bakteri asam laktat potensial menunjukkan bahwa semua isolat bersifat homofermentatif dan mampu tumbuh pada pH 2; 2 isolat bentuk batang (DUB2B4 dan DUB2B6) dan 5 isolat lainnya bentuk bulat. Hasil identifikasi terhadap 2 isolat unggulan menunjukkan bahwa isolat DUB2B4 adalah Lactobacillus sp. dan isolat DUK3B14 adalah Enterococcus sp. DAFTAR PUSTAKA Alokami, H.L., E. Skytta, M. Saarela, T. Mattila-Sandhlom, K. Latva-Kala, and I.M. Helander. 2000. “Lactic Acid Permeabilitizes Gram Negative Bacteria by disrupting The Outer Membrane.” Appl.Environ.Microbiol. 66(5): 2001-2005. Cardici, B.H. and S. Citak. 2005. “A Comparison of Two Methods Used for Measuring Antagonistics Activity of Lactic Acid Bacteria.” Pakistan J.of Nutr. 4(4): 237-241. Delgado, A., D. Brito, P. Fevereiro, C. Peres, and J.F. Marques. 2001. “Antimicrobial Activity of L.plantarum, Isolated From A Traditional Lactic Acid Fermentation of Table Olives.” INRA, EDP Science. 8(1): 203-215. Earnshaw, R.G. 1996. The Antimicrobial Action of Lactic Acid Bacteria: Natural Food Preservation System. In Wood, B.J.B (ed). The Lactic Acid Bacteria Vol 1 In Health and Desease. Blackie Acedemic and Proffesional. London. Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT. Gramedia. Jakarta. Haveenar, R., B.T. Brink and J.H.J. Huis In’t Veld.1992. Selection of Strain for Probiotic use. In Fuller (ed). Probiotics the Scientific Basis. Chapman and Hall. London. Hayes, J. 2000. Aeromonas hydrophila. Oregon State University: Disease of Fish Spring. http://www.hmsc.orst.edu/classes/hydrophilahayes. 23 Februari 2006. 14 Holt,J.G., N.R. Kreig; P.H.A. Saneth; J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey’s Manual of determination Bacteriology. 9th edition. Williams and Willkins. Baltimore. Jordan, S.L., J. Glover, L. Malcolm, F.M.T. Carter, I.R. Booth, and S.F. Park. 1999. “Augmentation of Killing of Escherichia coli 0157 by Combination Low pH Conditions.” Appl.Environ.Microbiol. 65(3): 13081311. Kei,Y dkk 2003. Panduan Diagnosa Penyakit Ikan. Balai Budidaya Air Tawar Jambi, Ditjen Perikanan Budidaya, DKP D dan JICA. Mishra, C. and Lambert, J. 1996. “Prodution of Anti-Microbial Substance by Probiotics.” Asia Pasific. J. Clin. Nutr. 5: 20-24. Noga, E.J. 1995. Fish Disease : Diagnosis and Treatment. The C.V Morby Company. Missouri. Nowroozi, J., M. Mirzaii, and M. Norouzi. 2004. “Study of Lactobacillus as Probiotic Bacteria.“ Iranian J.Publ.Health. 33(2): 1-7. Nurhasanah. 2004. “Produksi Bakteriosin pada Berbagai Tingkat Aerasi dan Uji Kestabilan Bakteriosin dari Bakteri Asam Laktat Galur M 6-15.” Skripsi. Program Studi Biokimia. Departemen Kimia. FMIPA. IPB. Bogor. Ouwehand, A.C. 1998. Antimicrobial Component From Lactic Acid Bacteria. In S. Salminen and A.V. Wright (ed). Lactic Acid Bacteria. Marcel Dekker, Inc. New York. Basel. Hongkong. Puspowardoyo, H., dan A.S. Djarijah, 2002. Pembenihan dan Pembesaran Lele Dumbo Hemat Air. Kanisius. Yogyakarta. Salle, B.S. 1961. Fundamental Principal of Bacteriology. 5th edition. Mc Graw Hill Book Co. Philadelphia. Saparinto, C. 2002. Budidaya Ikan dan Udang Dilarang Gunakan Antibiotik. Suara Merdeka. Sabtu ,14 September 2002. Suyanandana, P., P. Budhaka, S. Sassanarakkit, P. Saman, P. Disayaboot, Y. Cai dan Y. Benno. 1998. ”New Probiotic Lactobacilli dan Enterococi from Fish Intestine and Their Effect on Fish Production.” Proceeding of International Conference on Asian Network on Microbial Researches. Yogyakarta. 23-25 February 1998. pp. 93-104. Verschuere, L., Greet R., P. Sorgeloos, and W. Verstaete. 2000. ” Probiotic Bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture.” Microbiology and Molecular Biology Reviews. Vol 64 (4) : 655-671. Wichaksana, G.I.S, K. Winarno, A. Susilowati. 2003. ”Pengaruh Ekstrak Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap Penurunan Mortalitas Lele Dumbo (Clarias gariepinus) akibat Infeksi Aeromonas hydrophila.” Enviro. 3 (1) : 28-35. 15 Widyastuti, Y., dan E. Sofarianawati. 1999. Karakter Bakteri Asam Laktat. Enterococcus sp, yang Diisolasi dari Saluran Pencernaan Ternak. Jurnal Mikrobiologi Indonesia: 50-53. Yang, Z. 2000. Antimicrobiol Compound and Extracelluler Polysaccharides Prodices by Lactic acid Bacteria: Structures and Properties. Dept.of Food Technology. Helsinki.
