BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Jenis Penelitian Metode

BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis Penelitian
Metode penelitian yang dilakukan adalah eksperimental laboratorium
untuk memperoleh data hasil. Penelitian ini dilakukan dalam beberapa
tahap yaitu pembuatan ekstrak klorofrom daun salam, uji antioksidan daun
salam dan uji antioksidan sediaan SNEDDS daun salam. Dalam penelitian
ini terdapat beberapa variabel antara lain sebagai berikut :
a. Variabel bebas dalam penelitian ini yaitu perbandingan konsentrasi
sediaan SNEDDS ekstrak klorofrom daun salam (Syzygium polyanthum
Wight Walp).
b. Variabel tergantung dalam penelitian ini yaitu persen (%) aktivitas
antioksidan dan nilai IC50.
c. Variabel kendali dalam penelitian ini yaitu metode uji aktivitas
antioksidan (DPPH), panjang gelombang, alat yang digunakan dan
tempat penelitian.
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Waktu penelitian uji aktivitas antioksidan ekstrak daun salam
(Syzygium polyanthum Wight Walp) dan sediaan SNEDDS ekstrak daun
salam (Syzygium polyanthum Wight Walp) dengan menggunakan metode
DPPH (1,1-Diphenyil-2-picrylhidrazyl) dilakukan pada bulan Maret 2016 .
Tempat penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Farmasi
Universitas Sebelas Maret untuk preparasi sampel dan Laboratorium
29 30 MIPA Terpadu FMIPA UNS untuk uji aktivitas antioksidan ekstrak daun
salam (Syzygium polyanthum Wight Walp) dan sediaan SNEDDS ekstrak
daun salam (Syzygium polyanthum Wight Walp) dengan menggunakan
metode DPPH (1,1-Diphenyil-2-picrylhidrazyl).
3.3 Alat dan Bahan
3.3.1 Alat yang digunakan
Alat yang digunakan adalah : Blender, alat timbang, bejana maserasi,
batang pengaduk, gelas ukur (Pyrex) 10 mL dan 100 mL, gelas beaker
(Pyrex) 250 mL, 500 mL dan 1000 mL, corong buchner, Waterbath,
kompor listrik, cawan porselin, erlemenyer (Pyrex) 1000 mL, chamber,
labu ukur (Pyrex) 10 mL, 50 mL dan 100 mL, seperangkat alat
spektrofotometer UV-Visibel double beam, timbangan analitik, flakon
10mL, pipet tetes, pipet volume (Pyrex) 1 mL, glasfin, mikro pipet
(Finnpipette), corong, tabung reaksi (Pyrex), dan rak tabung reaksi.
3.3.2
Bahan yang digunakan:
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : daun salam dari
daerah Klaten, klorofrom (Brataco), PEG (Brataco), tween 80 (Brataco),
fase minyak PKO (Brataco), methanol p.a (Merck), DPPH(1,1Diphenyil-2-picrylhidrazyl).
31 3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Determinasi
Determinasi daun salam (Syzygium polyanthum Wight Walp)
dilakukan di Laboratorium biologi Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret.
3.4.2 Pembuatan Serbuk Simplisia
Daun salam (Syzygium polyanthum Wight Walp) dibersihkan dan
dicuci. Daun salam (Syzygium polyanthum Wight Walp) yang sudah
bersih dikeringkan didalam oven, kemudian diserbuk dengan
menggunakan blender untuk menghaluskan simplisia.
3.4.3 Ekstraksi (Maserasi)
Daun salam (Syzygium polyanthum Wight Walp) yang sudah bersih
kemudian dikeringkan, dan diserbuk menggunakan blender. Serbuk
simplisa daun salam ditimbang sebanyak 500 gram dengan timbangan
digital. Untuk proses maserasi 500 gram serbuk simplisia daun salam
direndam dalam pelarut kloroform sebanyak 4 L. Bejana maserasi
ditutup dan didiamkan selama 5 hari. Setelah 5 hari, maserat disaring
menggunakan melalui corong kaca yang sudah dilengkapi dengan kain
flannel untuk memisahkan maserat dengan serbuk simplisia. Maserat
daun salam yang diperoleh dievaporasi menggunakan rotary
evaporator dengan suhu 55o C dan kecepatan rotary 6 hingga volume
maserat yang dievaporasi berkurang sekitar sepertiganya. Setelah itu
32 maserat yang telah dievaporasi dengan rotary evaporator dipanaskan
diatas waterbath hingga menjadi ekstrak kental.
3.4.4Pembuatan sediaan SNEDDS
Formula :
Tabel III. Formula sediaan SNEDDS
Bahan
Ekstrak daun salam
Tween 80
PEG
Minyak PKO
Konsentrasi (mL)
0,15 gr
1,6 mL
2,4 mL
1 mL
(Nurona, 2016)
Cara Pembuatan :
1.
Menyiapkan dan menimbang semua bahan yang dibutuhkan.
2.
Mencampurkan semua bahan yang sudah ditimbang kemudian di
dihomogenkan dengan magnetic stirer selama 30 menit.
3.
Kemudian disonikator selama 15 menit, dikondisikan dalam
waterbath pada suhu 45°C selama 10 menit.
4.
Setelah selesai sediaan nanoemulsi didiamkan selama 24 jam
dalam suhu ruang (Nurona, 2016).
3.4.5 Uji Antioksidan dengan peredaman warna DPPH
a. Pembuatan Larutan DPPH
Untuk pembuatan larutan DPPH yang akan digunakan sebagai
pereaksi pada sampel, diambil sebanyak 4 mg DPPH dilarutkan
menggunakan metanol p.a kedalam labu ukur 100 mL hingga tanda
batas, sehingga konsentrasi DPPH yang digunakan adalah 40 ppm.
33 b. Penentuan panjang gelombang maksimal
Penentuan panjang gelombang maksimal dilakukan dengan
memasukan 3 mL DPPH 40 ppm ke dalam kuvet kemudian diukur
absorbansinya pada rentang panjang gelombang 400-800 kemudian
dilihat nilai absorbansi tertingginya.
3.4.6 Uji kuantitatif antioksidan
a. Penyiapan larutan kontrol Vitamin C
Larutan kontrol berupa larutan Vitamin C injeksi 1000mg/mL
atau sama dengan 100.000 ppm kemuadian dilakukan pengenceran
dengan berbagai konsentrasi yaitu 1,25; 2,5; 5; 7,5; 10 ppm.
Dengan memipet larutan induk berturut turut sebanyak 62,5 µL;
125 µL; 250 µL; 375 µL dan 500 µL dimasukan pada labu ukur 5
mL dan diencerkan dengan metanol p.a hingga batas. Kemudian
diambil 2 mL masing- masing konsentrasi dimasukkan dalam
tabung reaksi dan ditambahkan 1 mL DPPH 40 ppm hingga
homogen
kemudiaan
diukur
panjang
gelombang
dengan
menggunakan spektrofotometer UV-VIS.
b. Penyiapan larutan sampel ekstrak
Dibuat larutan induk ekstrak kloroform daun salam dengan cara
melarutkan 10 mg ekstrak kental kedalam 100 mL metanol p.a
sehingga diperoleh larutan induk dengan konsentrasi 100 ppm,
kemudian dilakukan pengenceran kedalam labu ukur 10 ml dengan
variasi konsentrasi 12,5;
25; 50; 75 dan 100 ppm. Dengan
34 memipet larutan induk berturut turut sebanyak 1,25 mL; 2,5 mL; 5
mL; 7,5 mL dan 1 mL dimasukan pada labu ukur 10 mL dan
diencerkan dengan metanol p.a hingga batas.
c. Penyiapan larutan sediaan SNEDDS
Sediaan SNEDDS konsentrasi 30.000 ppm kemudian dilakukan
pengenceran kedalam labu ukur 10 mL dengan variasi konsentrasi
12,5; 25; 50; 75 dan 100 ppm. Dengan memipet larutan induk
berturut turut sebanyak 4,16µL; 8,33µL; 16,67µL; 25µL; dan
33,33µL kemudian dimasukkan pada labu ukur 10 mL dan
diencerkan dengan metanol p.a hingga batas.
d. Pengukuran serapan (absorbansi) peredaman radikal bebas DPPH
Masing-masing larutan uji (larutan sampel dan larutan kontrol)
dipipet sebanyak 2 mL ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1
mL larutan pereaksi (DPPH 40 ppm). Kemudian dikocok
dihomogen dan dibiarkan 30 menit. Kemudian diukur dan diamati
absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-VIS.
3.5 Pengumpulan dan analisis data
Data yang didapatkan berupa nilai absorbansi dari DPPH kontrol,
ekstrak, sediaan SNEDDS dan larutan vitamin C. Perhitungan daya
antioksidan atau kapasitas antiradikal bebas DPPH diukur dari
peredaman warna ungu DPPH, yang dinyatakan dengan persen (%)
peredaman yang dinyatakan dalam rumus:
35 % aktivitas antioksidan =
Keterangan:
Abs DPPH kontrol = Absorbansi DPPH sebelum direaksikan dengan
sampel.
Abs sisa DPPH
= Absorbansi DPPH setelah direaksikan dengan
sampel.
Dari harga persentase (%) peredaman yang diperoleh, selanjutnya
ditentukan nilai IC50, IC50 yaitu konsentrasi efektif yang dibutuhkan
untuk menangkap 50 % radikal DPPH.
Uji signifikasi data yang diperoleh dari hasil pengujian diuji
normalitasnya dengan uji Shapiro-Wilk, data yang terdistribusi normal
dilanjutkan dengan uji Independent T Test.
36 4
Diagram Alir Cara Kerja
a. Pembuatan ekstrak kloroform daun salam
700 gram daun salam
Disortasi dan dilakukan
penghalusan sehingga diperoleh
500 gram daun salam
Dimaserasi dengan
4000 ml kloroform selama 5x 24jam
Disaring sehingga diperoleh
filtrat
Sisa ampas
Diremaserasi dengan
1000 ml etanol 70% selama 1x 24jam
Disaring sehingga diperoleh
filtrat
Sisa ampas
Diuapkan diatas WB, sehingga diperoleh
Ekstrak kental
dilakukan
Kontrol kualitas
ekstrak
meliputi
Bau, warna, bentuk,
dan perhitungan
rendemen
Uji antioksidan
37 b. Uji kuantitatif antioksidan
(1) Pembuatan larutan DPPH
5 mg DPPH
dimasukan
Labu ukur 50ml
Ditambahkan
Metanol pa ad tanda batas
dikocok
Ad homogen
diperoleh
Larutan DPPH 100ppm
(2) Penentuan panjang gelombang maksimal
3 ml larutan DPPH 100ppm
dimasukan
Tabung reaksi
Ditambahkan
3 ml metanol
dikocok
Ad homogen
Diukur
Serapannya pada panjang gelombang 400-800 nm
dengan spektrofotometer UV-Vis
Diketahui
Panjang gelombang maksimal
38 (3) Penyiapan larutan kontrol vitamin C
0,5 ml vitamin C (100mg/ml)
Dibuat
Larutan Vitamin C 100 ppm
Dilakukan pengenceran dalam labu ukur 10 ml
dengan variasi konsentrasi larutan vitamin C
2 ppm
4 ppm
6 ppm
8 ppm
10 ppm
(4) Penyiapan larutan sampel ekstrak tunggal
10 mg ekstrak kental
Dilarutkan dalam
10 ml metanol
diperoleh
Larutan sampel 1000 ppm
Dilakukan pengenceran dalam labu ukur 10 ml
dengan variasi konsentrasi sampel
12,5
ppm
25 ppm
50 ppm
75 ppm
100 ppm
39 (5) Pengukuran serapan (absorbansi) peredaman radikal bebas
DPPH ekstrak tunggal
2 ml Masing-masing larutan uji (larutan sampel ekstrak tunggal,
larutan kontrol vitamin C
ditambahkan
1 ml larutan DPPH 100ppm
Dihomogenkan dan didiamkan
Selama 30 menit
Diukur
Absobansinya pada λ maks
(6) Pengukuran serapan (absorbansi) peredaman radikal bebas
DPPH pada kombinasi ekstrak
2 ml Masing-masing larutan uji dengan perbandingan kombinasi ¼
IC50: ¼ IC50; ¼ IC50 : ½ IC50 ; ½ IC50: ½ IC50; ½ IC50: ¼ IC50
ditambahkan
1 ml larutan DPPH 100ppm
Selama 30 menit
Absobansinya pada λ maks
40 5
No
Jadwal penelitian
Kegiatan
Bulan KeI
1
Studi Pustaka
2
Determinasi
3
Pencarian bahan
4
Ekstrasi dan
standarisasi
ekstrak
Uji daya
antioksidan
Pengolahan dan
analisis data
Penyusunan
Laporan
5
6
7
II
III
IV