6 II. METODELOGI PENELITIAN 2.1 Metode Pengumpulan Data 2.1

II. METODELOGI PENELITIAN
2.1 Metode Pengumpulan Data
2.1.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di UPT Laboratorium Biosain dan Bioteknologi
Universitas Udayana. Penelitian ini berlangsung selama 3 bulan yang dimulai dari
bulan November 2011 hingga Januari 2012.
2.2 Prosedur Penelitian
2.2.1 Penyegaran Isolat Bakteri Pediococcus acidilactici dari Stok Kultur pada
Media MRS Broth
Biakan murni isolat P. acidilactici yang diisolasi dari susu sapi Bali dari 10
strain BAL dalam vial stok biakan yang disimpan dalam gliserol pada suhu -20oC,
diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 5 mL MRS broth steril dan
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat pada
media ini ditandai dengan meningkatnya kekeruhan media MRS Broth. Tabung
reaksi yang menunjukkan hasil positif akan digunakan dalam tahap pengujian
selanjutnya.
2.2.2 Pembuatan Working Culture BAL Isolat Susu Sapi Bali
Isolat BAL yang telah disegarkan, dibuat koloni tunggal yang terpisah dengan
metode Streak for single colony pada media MRS agar. Koloni yang terpisah
diinokulasikan ke dalam 5 mL MRS Broth dan diinkubasi pada temperatur 37oC
selama 24 jam. Dari suspensi tersebut juga dibuat stok gliserol dengan menambahkan
1 mL kultur isolat ke dalam 1 mL gliserol 30% dan kemudian di simpan di dalam
freezer pada temperatur -20oC sampai waktu yang tidak terbatas. Working culture
dibuat dengan cara stab inoculation dari bakteri stock culture pada 5 mL MRS agar
dan diinkubasi pada temperatur 37 oC selama 24 – 48 jam (Hadioetomo, 1990).
6
2.2.3
Uji Konfirmasi
2.2.3.1 Uji Pewarnaan Gram
Uji pewarnaan dilakukan pada masing-masing isolat yang berumur 24 jam
dengan tujuan untuk menyakinkan bahwa bakteri yang akan dipakai adalah bakteri
yang benar dan murni. Masing-masing isolat diuji dengan menggunakan perangkat
pewarna Gram. Isolat yang dikonfirmasi mula-mula dibuat apusannya pada gelas
benda dengan cara mengambil 1 jarum ose, kemudian ditunggu hingga mengering
sambil difiksasi di atas api bunsen (kira-kira 20 cm di atas bunsen), diwarnai dengan
gentian violet selama 1,5 menit, dicuci dengan air mengalir dalam keadaan terbalik,
dikeringkan, ditetesi dengan larutan lugol dan dibiarkan kontak selama 1 menit,
dicuci dengan air mengalir, ditetesi dengan alkohol 96% dan dibiarkan selama 5
detik, dicuci dengan air mengalir, dan diwarnai dengan pewarna tandingan safranin
selama 1 menit. Sel bakteri yang telah terwarnai dicuci kembali dengan air mengalir,
dikeringkan dengan kertas hisap tanpa menggosok sediaan, dan diamati di bawah
mikroskop dengan perbesaran 100 kali. Bakteri gram positif akan tampak berwarna
ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan tampak berwarna merah dibawah
mikroskop. Kelompok BAL merupakan bakteri gram positif, sehingga akan mengikat
zat warna gentian violet dengan sangat kuat dan terlihat berwarna ungu dibawah
mikroskop (Lay, 1994).
2.2.3.2 Uji Katalase
Sebanyak dua tetes H2O2 dengan konsentrasi 10% diteteskan pada apusan
bakteri uji pada kaca objek dan diamati gelembung gas yang terbentuk. Hasil positif
ditunjukkan oleh terbentuknya gelembung gas oksigen yang dihasilkan dari degradasi
H2O2 oleh enzim katalase, sedangkan pada hasil negatif tidak diikuti oleh
terbentuknya gas (Hadioetomo, 1990; Soemarno, 2000). Bakteri Asam Laktat
memberikan hasil negatif terhadap uji ini (Sujaya et al., 2008).
7
2.2.3.3 Uji Produksi Gas dari Hasil Metabolisme Glukosa
Ke dalam suspensi isolat Bakteri Asam Laktat pada media MRS broth,
dimasukkan jarum ose panas (hot-loop). Hasil positif ditunjukkan oleh adanya
gelembung gas karbondioksida dari hasil metabolisme glukosa (Sperber and Swan,
1976). Bakteri Asam Laktat memberikan hasil negatif terhadap uji ini (Sujaya et al.,
2008).
2.3 Uji Ketahanan Bakteri Pediococcus acidilactici Terhadap pH Rendah
Biakan murni dari isolat Bakteri P. acidilactici dibuat suspensinya dengan
cara menginokulasikan 1 jarum ose Bakteri Asam Laktat ke dalam 5 mL MRS Broth
dan diinkubasi pada temperatur 37oC selama 24 jam. Kemudian, sebanyak 100 µL
suspensi BAL ini dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf yang telah berisi 900 µL
media MRS Broth yang pH 2, 3 dan 4, diinkubasi selama 3 jam dalam water bath
pada suhu 37oC, disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm selama 5 menit dan
supernatannya dibuang. Pelet bakteri pada dasar tabung selanjutnya dicuci sebanyak
dua kali dengan 300 µL larutan salin (dengan cara divortex dan disentrifugasi
kembali selama 5 menit dengan kecepatan 7000 rpm yang dilakukan sebanyak dua
kali dan supernatannya dibuang). Pelet yang dihasilkan selanjutnya disuspensikan
dalam 300 µL larutan salin dan sebanyak 50 µL suspensi ini diinokulasikan kedalam
5 mL media MRS Broth pH netral untuk selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada
suhu 370 C. Meningkatnya kekeruhan biakan pada medium MRS Broth pH netral ini
yang diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm
(OD 660 nm) menunjukkan bahwa BAL tersebut dapat bertahan pada pH rendah
(Sant’Anna dan Torres, 1998; Hyronimus et al., 2000). Untuk mendapatkan data
yang representative, maka assay ini diulang sebanyak 3 kali. Kriteria yang dipakai
untuk menilai adanya pertumbuhan (ketahanan) bakteri uji ini pada pH rendah adalah
dengan mengamati tingkat kekeruhannya pada media cair yang diukur nilai
8
absorbansinya dengan spektrofotometer. Bila nilai absorbannya (A) < 0,1 maka strain
bakteri tersebut dikatagorikan tidak tahan terhadap pH rendah (Sujaya, et al., 2008).
2.4 Uji Ketahanan Bakteri Pediococcus acidilactici Terhadap Deoksikolat
Dari working culture dibuat suspensi isolat Bakteri P. acidilactici dengan
menginokulasikan 1 jarum ose bakteri tersebut ke dalam 5 mL MRS Broth kemudian
diinkubasi selama 24 jam pada temperatur 370C. Isolat yang tumbuh tersebut divortex
terlebih dahulu, kemudian disiapkan 4 buah tabung yang berisi masin-masing 5 mL
media MRS Broth. Ke dalam masing-masing tabung ditambahkan suspensi bakteri
sebanyak 50 µL. Tabung pertama sebagai kontrol (bakteri tidak ditambahkan Natrium
Deoksikolat atau NaDC). Tabung kedua ditambahkan 10 µL
NaDC 100 mM
(konsentrasi NaDC 0,2 mM), tabung ketiga ditambahkan 20 µL NaDC 100 mM
(konsentrasi NaDC 0,4 mM), dan tabung keempat ditambahkan 30 µL NaDC 100
mM (konsentrasi NaDC 0,6 mM). Selanjutnya setiap tabung diinkubasi pada suhu
370C selama 24 jam.
Ketahanan isolat Bakteri Asam Laktat diukur berdasarkan tingkat kekeruhan
(OD 660 nm) menggunakan spektrofotometer. Penelitian ini diulang sebanyak 3 kali
(Hyronimus et al., 2000; Prangdimurti, 2001). Kriteria yang dipakai untuk menilai
adanya ketahanan bakteri uji ini pada NaDC sama dengan yang dilakukan pada uji
ketahanan terhadap pH rendah diatas.
2.5 Bioassay Resistensi Terhadap Antibiotika
Isolat diambil sebanyak 1 ose dan diinokulasi ke media MRS broth, kemudian
diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Proses penanaman isolat bakteri P.
acidilactici dilakukan dengan penyebaran isolat di atas media MRS Agar. Isolat yang
sudah diinkubasi, dihomogenkan terlebih dahulu dengan vortex, disebar sebanyak
100 µL di atas media agar yang telah disiapkan, Dibiarkan kering selama kurang
lebih 15 menit, dan setelah kering, kertas cakram yang mengandung antibiotika dan
9
kertas cakram kontrol diletakkan pada masing-masing bagian pada cawan petri.
Semua cawan selanjutnya diinkubasi 48 jam (Kirby and Bauer, 1966). Proses
inkubasi untuk isolat P. acidilactici dilakukan dengan meletakkan cawan petri ke
dalam anaerobic chamber terlebih dahulu, kemudian dimasukkan ke dalam
inkubator. Zona bening yang terbentuk menunjukkan adanya penghambatan
antibiotika terhadap pertumbuhan Bakteri Asam Laktat (BAL)
2. 6 Bentuk Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian laboratorium yang bertujuan untuk
mengetahui ketahanan Bakteri Asam Laktat yang diisolasi dari susu sapi Bali
terhadap pH rendah, deoksikolat dan beberapa jenis antibiotik yang umum dipakai
dalam mengobati masalah infeksi saluran pencernaan. Secara umum rangkaian
penelitian ini ditunjukkan pada Gambar 1.
Pembuatan Media
Penyegaran Isolat
Bakteri
Uji Konfirmasi Isolat
Bakteri Asam Laktat
Uji Pewarnaan
Gram
Uji Katalase
Uji pH Rendah
Uji Deoksikolat
Uji produksi gas dari
metabolisme glukosa
Bioassay Antibiotik
Analisis Data
Gambar 1. Skema Tahapan Penelitian
10
2.7 Analisis Data
Data yang diperoleh pada penelitian ini dianalisis secara deskriptif dan dalam
beberapa hal juga dilakukan analisis kuantitatif dengan menggunakan analisis sidik
ragam (Analysis of Variance atau ANOVA). Jika
dalam analisis ANOVA ini
diperoleh hasil yang berbeda nyata pada p < 0,05, maka uji dilanjutkan dengan
menggunakan uji jarak berganda Duncan menggunakan Software SPSS Release For
Windows versi 15.
11