8 hasil dan pembahasan

8
Inkubasi selama 2 hari pada suhu 28o C dalam
kondisi gelap dengan kecepatan 150 rpm.
Setelah diinkubasi selama 2 hari, hasilnya
adalah terbentuknya koloni berwarna putih.
Koloni yang terbentuk kemudian diambil
dengan tusuk gigi steril dan diberi nomor lalu
dimasukkan ke dalam media agar untuk dibuat
duplikatnya dan dikulturkan dalam media LB
yang mengandung kanamisin 25 ppm dan
rifampisin 50 ppm. Selanjutnya dikocok
selama 2 malam dengan kecepatan 150 rpm
dan dilakukan isolasi DNA plasmid. Setelah
itu, dilakukan restriksi kembali dengan
menggunakan enzim NcoI dan SpeI.
Keberhasilan tahap ini dapat dilihat
berdasarkan hasil restriksi dengan enzim NcoI
dan SpeI. Tahap selanjutnya dari penelitian
ini, akan dilanjutkan oleh peneliti yang lain
dari
hasil
yang
didapatkan
akan
ditransformasikan melalui Agrobacterium ke
eksplan tanaman kelapa sawit.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemurnian Gen Kitinase Produk PCR
Strategi dalam konstruksi gen harus
mempertimbangkan dua hal yaitu urutan
nukleotida gen yang akan dikonstruksi dan
vektor ekspresi yang akan digunakan. Gen
kitinase (chi) telah diamplifikasi oleh peneliti
sebelumnya. Hasil PCR produk yang didapat
dari tahap penelitian sebelumnya, dimurnikan
terlebih dahulu untuk menghilangkan
komponen-komponen
yang
dapat
menghambat proses kloning selanjutnya. Hasil
pemurnian PCR produk gen chi ditunjukkan
pada Gambar 3. Berdasarkan hasil yang
didapat, terlihat bahwa pada sumur 2 terdapat
pita yang cukup tebal dengan ukuran yang
sesuai dengan pita marka 1500 bp. Hasil dari
gambar ini menunjukkan bahwa produk PCR
yang telah murni adalah benar gen chi yang
diinginkan.
2000 bp
1500 bp
1000 bp
M
1
M
1
2
2
Gambar 3 Pemurnian PCR produk gen chi.
(M) marker, (1&2) gen chi.
Cloning Gen Kitinase Hasil PCR pada
pGEMT-Easy
Fragmen hasil amplifikasi (PCR) yang
diverifikasi pada gel agarosa (Gambar 3),
dipotong dari gel dan dimurnikan untuk
digunakan pada tahap cloning. Cloning dibagi
menjadi tahap ligasi, transformasi ke dalam
sel kompeten, dan seleksi transforman. Vektor
cloning yang digunakan pada penelitian
adalah pGEMT-Easy dari Promega. Seperti
terlihat pada Gambar 4, plasmid yang
digunakan memiliki basa timin pada bagian
ujungnya (3’ T-overhang). Basa T dari vektor
dapat berikatan dengan fragmen gen hasil
PCR yang memiliki kelebihan basa adenin,
tanpa memerlukan tahapan restriksi terlebih
dahulu. Proses ligasi terjadi dengan adanya
bantuan enzim T4 DNA ligase, yaitu enzim
yang membentuk ikatan fosfodiester diantara
fragmen gen (insert) dan basa dari plasmid
yang digunakan. Proses tersebut dapat
dilakukan pada suhu ruang selama satu jam
atau diinkubasi pada suhu 4o C selama
semalam. Proses ligasi antara gen kitinase dan
vektor cloning dalam hal ini telah berhasil
dilakukan.
Gambar 4 Vektor klon pGEMT-Easy dan
peta restriksi yang dimiliki
(Promega 1999).
Transformasi Gen Kitinase ke Escherichia
coli (XL-1 Blue)
Produk ligasi yang telah berhasil,
kemudian ditransformasi ke dalam sel E. coli
XL1- Blue kompeten. Berdasarkan koloni
yang terbentuk pada media (Gambar 5),
menunjukkan bahwa hasil kloning gen
kitinase ke dalam pGEMT-Easy telah berhasil
dilakukan. Transformasi dilakukan dengan
pemberian kejut panas (heat shock) pada suhu
42oC selama 50 detik. Prinsip utama dari
proses tersebut adalah terjadi lonjakan suhu
dari 0oC ke 42oC terhadap sel yang telah
diberi perlakuan dengan CaCl2. Garam CaCl2
9
(B)
( B)
(A)
Gambar 5 Contoh duplikat dari koloni hasil
transformasi. (A) koloni berwarna
putih, (B) koloni berwarna biru.
akan mempengaruhi struktur dan muatan dari
membran sel. Sehingga pada saat terjadi
lonjakan suhu membran menjadi tidak selektif
terhadap molekul asing dan produk ligasi
dapat masuk ke dalam sel. Sel kemudian
dikultur dalam media tumbuh (LB + glukosa)
selama 1.5 jam untuk memperbanyak jumlah
sel. Setelah itu sel disebar pada medium
seleksi (LA + ampisilin 100 ppm + isopropil-D-thiogalaktopiranosida (IPTG) 100mM +
5-bromo-4-kloro-3-indiol- -galaktopiranosida
(X-Gal) 40 mg/L), dan diinkubasi semalaman
pada suhu 37oC.
Tahap terakhir dari proses cloning adalah
seleksi transforman. Seleksi transforman dapat
dilakukan dengan pengamatan warna koloni
putih dan biru yang tumbuh pada media
seleksi. Keberhasilan pada tahap cloning ini
dilihat dari hasil koloni yang terbentuk pada
media. Secara teoritis koloni berwarna putih
merupakan koloni yang membawa fragmen
gen sisipan (insert) dan sebaliknya koloni
berwarna biru membawa plasmid yang tidak
tersisipi oleh fragmen gen yang diinginkan.
Adanya koloni biru putih berhubungan
dengan terekspresinya enzim -galaktosidase.
Fragmen gen sisipan yang terdapat pada
plasmid akan menghambat sintesis -peptida
yang berperan sebagai aktivator terhadap kerja
enzim -galaktosidase (Reece 2004). Dalam
keadaan aktif, yaitu ketika berada pada bentuk
tetramernya, enzim –galaktosidase akan
menghidrolisis X-Gal (5– bromo–4–kloro–3–
indol–
– D – galaktopiranosida) menjadi
galaktosida dan senyawa turunan 5-bromo-4kloro indoksil yang berwarna biru. Penyisipan
fragmen DNA ke MCS (Multiple Cloning
Site) akan merusak susunan basa gen Lac Z’
sehingga ekspresi gen yang menghasilkan
enzim fungsional tidak terjadi.
Hal ini mengakibatkan koloni menjadi
berwarna putih. Pada seleksi biru putih, IPTG
berfungsi sebagai penginduksi ekspresi gen
sedangkan X-Gal berfungsi sebagai substrat.
Konfirmasi Koloni Transforman yang
Membawa Fragmen Sisipan
Hasil dari PCR DNA koloni disajikan
pada Gambar 6. Koloni positif atau koloni
yang membawa fragmen gen chi ditunjukkan
dengan terbentuknya pita berukuran sekitar
1700 bp. Apabila dicermati lebih lanjut,
terjadi penambahan ukuran sekitar 200 bp dari
fragmen asli chi yaitu 1500 bp. Penambahan
tersebut berasal dari primer universal yang
digunakan (M13). Primer universal yang
berada dalam pGEMT akan menambah
ukuran insert karena sebagian basa pGEMTEasy turut diamplifikasi pada saat proses PCR
DNA koloni. Dari gambar terlihat bahwa
koloni nomor 14 merupakan koloni positif.
Koloni yang positif, kemudian dikultur dalam
media yang telah ditambahkan antibiotik.
Selanjutnya dilakukan isolasi DNA plasmid
dari
setiap
kultur
yang
diperoleh
menggunakan High Pure Plasmid Isolation
Kit (Roche).
Hasil isolasi plasmid diverifikasi pada gel
agarosa. Kemudian, plasmid dari tiap koloni
chi dianalisis urutan basanya menggunakan
primer universal M13 F dan M13 R. Adapun
tujuan utama dari PCR DNA koloni adalah
untuk mengkonfirmasi koloni transforman
yang membawa fragmen gen sisipan
(Nurhaimi 2006) dan menghindari kesalahan
dari pengamatan warna koloni. Hasil isolasi
DNA plasmid yang positif selanjutnya
disekuensing. Sekuensing diperlukan untuk
menganalisis fragmen gen kitinase yang
berhasil diisolasi. Sekuensing dapat dilakukan
dengan menggunakan produk PCR langsung
atau melalui hasil cloning.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
Gambar 6 Hasil PCR DNA koloni chi 14.
(M) marker 1 kb plus DNA
ladder, (No 1-20) nomor koloni
yang digunakan sebagai cetakan.
10
Urutan basa yang diperoleh kemudian
dianalisis menggunakan program BLASTX.
Berdasarkan analisis BLASTX dengan
melihat parameter skor (bits) lebih dari 150
dan E value yang kurang dari 10-4, maka
tingkat homologi yang dihasilkan cukup baik
(Claveri & Notredam 2003). Semakin tinggi
skor (bits) maka tingkat homologinya semakin
baik, semakin rendah E value maka semakin
baik pula tingkat homologinya. Selain nilai
skor dan E value, tingkat homologi juga dapat
dilihat dari garis berwarna merah pada grafik
hasil BLASTX. Analisis ini diperlukan untuk
mengetahui apakah gen yang berhasil diisolasi
sesuai dengan yang diharapkan.
Hasil analisis BLASTX (Gambar 7)
menunjukkan bahwa fragmen gen kitinase.
(chi) yang diperoleh menyandi enzim
endochitinase. Chi memiliki homologi yang
tinggi dengan enzim chitinase yang lain. Hal
tersebut teramati melalui skor (bits) yang
lebih besar dari 150. Homologi chi dengan
protein lain yang bersesuaian disajikan pada
Tabel 1. Selanjutnya hasil sekuen dengan M13
F dan reverse complement M13 R disejajarkan
menggunakan pairwaise aligment (Bioedit).
Tujuan utama dari pairwaise aligment
adalah untuk mengetahui urutan basa yang
sama
(overlap)
dari
hasil
sekuen
menggunakan primer M13 F dan M13 R. Data
hasil sekuensing berupa elektroforegraf yang
menggambarkan urutan basa fragmen gen chi
berukuran 1500 bp (Lampiran 5). Ukuran
fragmen yang didapat sesuai dengan hasil
amplifikasi fragmen gen chi sebelumnya,
yaitu sekitar 1500 bp. Hasil yang didapat
merupakan gambaran bahwa proses cloning
dan sekuensing telah berhasil dilakukan.
Tabel 1 Hasil analisis BLASTX fragmen
gen chi *
Protein yang
Score
E value
bersesuaian
endochitinase
322
1e-86
[Trichoderma....
endochitinase
322
1e-86
[Hypocrea...
endochitinase
320
4e-86
[Hypocrea...
309
6e-83
endochitinase
[Trichoderma....
307
3e-82
endochitinase
[Trichoderma...
*hanya ditampilkan sebagian, secara lebih
lengkap dapat dilihat pada lampiran 6.
Restriksi Gen Kitinase dan pCambia 1303
dengan Enzim Restriksi
Hasil sekuensing yang telah didapat,
digunakan untuk memulai tahap awal dalam
konstruksi gen chi. Tahap awal untuk
mengkonstruksi gen ini adalah restriksi gen
chi dan pCambia itu sendiri. Supaya gen chi
dapat disambungkan pada vektor ekspresi
(pCambia 1303), maka terlebih dahulu
pCambia 1303 dipotong dengan enzim NcoI
dan SpeI. Hasil restriksi pCambia 1303
disajikan pada Gambar 8. Setelah dipotong
dengan enzim NcoI dan SpeI, hasil
elektroforesis pada Gambar 8 menunjukkan
pita dengan ukuran sekitar 12000 bp. Pita
dengan ukuran 12000 bp tersebut merupakan
ukuran pCambia 1303 yang berhasil dipotong
dengan enzim NcoI dan SpeI. Setelah itu,
fragmen pCambia 1303 tersebut dipotong dari
gel untuk dielusi dengan Pure Link TM Quick
Gel Extraction (Invitrogen). Hasil pemurnian
dari plasmid pCambia 1303 disajikan pada
Gambar 9. Hasil pemurnian tersebut
12000 bp
12000 bp
M
Gambar 7 Hasil analisis BLASTX fragmen
gen chi.
1
Gambar 8 Hasil elektroforesis restriksi
pCambia 1303 dengan enzim
NcoI dan SpeI (M) marker,
(1) pCambia 1303.
11
12000 bp
12000 bp
1
2
M
Gambar 9 Hasil pemurnian plasmid
pCambia 1303. (1&2)
pCambia 1303, (M)
marker.
menunjukkan bahwa pada sumur satu dan dua
terlihat adanya pita yang cukup tebal dengan
ukuran 12000 bp. Hal ini menggambarkan
bahwa pemurnian plasmid pCambia 1303
hasil restriksi telah murni.
Begitu pula sebaliknya, gen chi dipotong
dengan enzim NcoI dan SpeI dari vektor
cloning (pGEMT-Easy) untuk disambungkan
pada vektor ekspresi pCambia 1303. Hasil
elektroforesis gen chi dari pGEMT-Easy
disajikan pada Gambar 10. Setelah dipotong
dengan enzim NcoI dan SpeI, hasil
elektroforesis pada Gambar 10 menunjukkan
adanya 2 pita dengan ukuran 3000 bp dan
1500 bp. Dua pita DNA ini disebabkan
adanya dua sisi restriksi yang dikenali oleh
enzim restriksi dalam urutan nukleotida
plasmid. Pita dengan ukuran 3000 bp
merupakan ukuran dari vektor cloning
(pGEMT-Easy) sedangkan pita dengan ukuran
3000 bp
1500 bp
M 1
Gambar 10 Hasil elektroforesis restriksi gen
chi dari pGEMT-Easy. (M)
marker, (1) pGEMT-Easy
(3000 bp) dan gen chi (1500 bp).
1500 bp merupakan ukuran dari gen chi.
Dengan demikian disimpulkan bahwa gen chi
sudah terpisah sempurna dari vektor cloning
(pGEMT-Easy). Selanjutnya fragmen dari gen
chi dipotong dari gel lalu dielusi dengan Pure
Link TM Quick Gel Extraction (Invitrogen)
untuk diligasi dengan pCambia 1303.
Vektor pCambia 1303 yang digunakan
pada penelitian berfungsi sebagai vektor
ekspresi. Plasmid pCambia 1303 mempunyai
rentang yang luas sehingga bersifat stabil jika
ditransformasikan baik ke tanaman dikotil
maupun pada tanaman monokotil. Vektor ini
didasarkan pada pCambia 1301. pCambia
1303 mengandung gusA, mgfp5, dan His6
fusion. Selain itu, plasmid pCambia 1303 juga
mengandung
promotor
CaMV35S
(Cauliflower Mosaic Virus). Promotor ini
berhubungan
dengan
urutan
yang
terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid. Hal ini
memungkinkan pembuatan klon langsung ke
dalam T-DNA plasmid. Sedangkan T-DNA
sendiri merupakan untaian DNA yang akan
ditransfer ke sel tanaman. Gen gusA (betaglucuronidase) dalam plasmid pCambia 1303
yang berfungsi sebagai gen reporter untuk
memonitor proses transformasi dan introduksi
gen yang direkayasa.
Selain itu, enzim restriksi NcoI dan SpeI
yang digunakan untuk memotong gen kitinase
dan pCambia 1303 tergolong dalam enzim
endonuklease restriksi yang hanya memotong
DNA utas ganda pada sekuen tertentu yang
disebut sekuen pengenalan atau situs
pengenalan (recognition site). Enzim SpeI
berasal dari strain E. coli yang diisolasi dari
Sphaerotilus
dengan
situs
restriksi
5’A CTAGT3’. Sedangkan enzim NcoI
berasal dari strain E.coli yang diisolasi dari
Nocardia corallina dengan situs restriksi
5’C CATGG 3’.
Alasan enzim NcoI dan SpeI digunakan
pada penelitian ini karena, gen chi akan
dimasukkan ke dalam vektor ekspresi
(pCambia 1303). Untuk dapat memotong, hal
pertama yang harus dilihat adalah restriction
map dari pCambia 1303 dan pGEMT-Easy.
Enzim-enzim yang ada pada pCambia
disesuaikan terlebih dahulu dengan enzim
yang ada pada pGEMT-Easy. Pada peta
restriksi pCambia 1303, terdapat NcoI dan
SpeI tepat dibelakang promotor CaMV35S
yang mengekspresikan gen gusA dan gene
flourescent protein (gfp) (Gambar 11).
Sedangkan pada peta restriksi pGEMT-Easy
juga terdapat enzim NcoI dan SpeI (Gambar
4). Jika enzim yang akan digunakan tersebut
12
sesuai dengan terdapat pada vektor kloning
maupun vektor ekspresi maka enzim tersebut
dapat digunakan untuk memotong gen yang
diinginkan. Dalam proses restriksi ini juga
menggunakan BSA (Bouvine Serum Albumin)
yang berfungsi untuk menstabilkan enzim
pada restriksi pCambia 1303 dan gen kitinase
itu sendiri.
Gambar 12 Skema ligasi gen chi dengan
plasmid pCambia 1303.
Gambar 11 Peta restriksi pCambia 1303
dengan enzim restriksi.
Ligasi Gen Kitinase dengan pCambia 1303
Gen kitinase dan pCambia 1303 yang telah
dipotong dengan enzim NcoI dan SpeI,
kemudian diligasi. Enzim DNA ligase
berfungsi menempelkan rantai tunggal pada
ujung molekul DNA utas ganda, yang
memiliki ujung 5’ dengan gugus fosfat dan
yang memiliki ujung 3’ dengan gugus
hidroksil. Sifat komplementer hasil restriksi
dari enzim restriksi yang sama (atau enzim
berbeda yang menghasilkan ujung lancip yang
sama) sangat penting untuk menempelkan
DNA dari sumber yang berbeda. Enzim ligase
memiliki efisiensi
lebih tinggi untuk
menempelkan ikatan fosfodiester yang putus
pada pasangan ujung lancip daripada ujung
tumpul (Turner et al. 2000). Skema ligasi gen
chi dengan plasmid pCambia 1303 disajikan
pada Gambar 12.
Hasil ligasi antara pCambia 1303 dan gen
chi kemudian ditransformasi ke E. coli strain
XL1-Blue. Transformasi merupakan proses
memasukkan DNA asing biasanya plasmid, ke
dalam suatu organisme. Metode transformasi
dilakukan antara lain dengan metode fisika,
(injeksi partikel, bombardment, pulsa medan
listrik),metode kimia (melarutkan DNA dalam
larutan PEG dan penggunaan kejut panas),
atau secara biologis (menggunakan vektor E.
coli atau Agrobacterium) (Endress 1994).
Transformasi ke sel bakteri biasanya
dilakukan dengan perlakuan Ca2+ sehingga
membuat bakteri tersebut kompeten untuk
dimasuki DNA plasmid. (Turner et al. 2000).
Transformasi ke E. coli dilakukan untuk
memperbanyak jumlah DNA plasmid
rekombinan. Sel kemudian disebarkan diatas
medium LB agar yang telah ditambahkan
dengan kanamisin 25 ppm. Setelah itu
diinkubasi semalam pada suhu 37o C. Dalam
hal transformasi koloni, seleksi transforman
antara gen chi dengan pCambia 1303 melalui
warna koloni yang terbentuk berbeda dengan
seleksi transforman antara gen chi pada
pGEMT-Easy.
Warna koloni yang terbentuk pada hasil
transformasi gen chi dengan pCambia ke
dalam sel kompeten hanya menghasilkan satu
warna koloni saja, yaitu koloni berwarna putih
(Gambar 13). Setelah hasil transformasi
menghasilkan warna koloni putih yang
mengandung plasmid rekombinan, maka dari
koloni yang terbentuk tersebut diduplikat dan
dikultur untuk memperbanyak jumlah plasmid
rekombinan.
Gambar 13 Contoh transformasi koloni gen
chi dengan pCambia ke dalam
sel kompeten (XL1-Blue).
Isolasi DNA Plasmid Rekombinan
Hasil isolasi DNA plasmid dielektroforesis
pada gel agarosa sehingga menghasilkan pita-
13
pita DNA yang berbeda ukurannya dapat
terpisah. Elektroforesis DNA plasmid yang
mengandung sisipan gen chi disajikan pada
Gambar 14. Berdasarkan hasil isolasi DNA
plasmid gen chi yang ditransformasi ke dalam
sel E.coli menghasilkan satu ukuran yaitu ±
13500 bp. Ukuran ini didapat dari
penggabungan ukuran pCambia yaitu 12000
bp dan gen chi itu sendiri yang mempunyai
ukuran sekitar 1500 bp.
Tahap selanjutnya, DNA plasmid hasil
isolasi dipotong kembali dengan enzim NcoI
dan SpeI untuk memeriksa bahwa plasmid
tersebut adalah benar pCambia 1303 yang
mengandung gen chi. Hasil pemotongan DNA
kemudian dielektroforesis pada gel agarosa
dan disajikan pada Gambar 15. Hasil
pemotongan menunjukkan bahwa pita yang
terbentuk merupakan plasmid klon pCambia
1303 yang telah disisipi gen chi. Hal ini
diperlihatkan dari ukuran pita DNA berukuran
12000 bp yang merupakan ukuran rantai DNA
pCambia 1303 setelah dipotong dengan NcoI
dan SpeI dan pita DNA 1500 bp yang
merupakan ukuran dari gen chi.
13500 bp
12000 bp
M 1
Gambar 14 Hasil elektroforesis isolasi DNA
plasmid gen chi dengan pCambia
1303. (M) marker, (1) DNA
plasmid pCambia 1303 yang
mengandung gen chi.
12000 bp
12000 bp
1000 bp
1500 bp
M
1
Gambar 15 Hasil pemotongan plasmid
pCambia1303-gen chi
dengan NcoI dan SpeI.
Timbulnya beberapa pita DNA hasil isolasi
disebabkan
oleh
adanya
perbedaan
konformasi dari plasmid-plasmid tersebut.
Pergerakan fragmen DNA pada gel agarosa
proporsional terhadap logaritma berat molekul
fragmen tersebut. Plasmid yang memiliki
putaran (koil) lebih banyak memiliki bentuk
yang lebih kompak sehingga lebih mudah
melalui pori-pori dalam gel agarosa daripada
plasmid yang putarannya lebih sedikit.
Sehingga, plasmid yang memiliki putaran
lebih banyak lebih cepat jalannya di dalam gel
dibanding dengan plasmid yang memiliki
putaran lebih sedikit. Faktor penting lain yang
berpengaruh adalah kehadiran interkalator.
Interkalator yang paling terkenal adalah
etidium bromida. Etidium bromida merupakan
senyawa polisiklik aromatik bermuatan positif
yang akan berikatan dengan DNA yang
bermuatan negatif dengan menginsersikan
dirinya diantara pasangan basa (interkalasi).
Interkalasi menyebabkan DNA heliks
melonggar sekitar 26oC. Proses isolasi,
elektroforesis dan pewarnaan DNA dengan
etidium bromida juga mempengaruhi putaran
DNA heliks (Turner et al. 2000).
Isolasi DNA plasmid pada penelitian ini
menggunakan High Pure Plasmid Isolation
Kit (Roche). Isolasi DNA plasmid dengan
menggunakan kit ini, pada prinsipnya sama
dengan pemisahan plasmid berdasarkan
ukuran.
Proses
pemisahan
plasmid
berdasarkan ukurannya dimulai dengan
pembuatan ekstrak sel. Jika sel dipecah secara
perlahan pada kondisi terkendali hanya
sebagian kecil DNA kromosom yang putus,
sehingga fragmen DNA kromosom berukuran
jauh lebih besar dari ukuran plasmid dapat
dipisahkan dari plasmid dengan cara
mengendapkan DNA kromosom bersama
serpihan sel melalui sentrifugasi. Cara ini
dapat meminimalkan kerusakan DNA
kromosom dan selanjutnya dari proses
sentrifugasi akan menghasilkan larutan jernih
yang mengandung DNA yang hampir
seluruhnya berupa DNA plasmid.
Prinsip dari elektroforesis gel agarosa
yaitu dapat memisahkan DNA linear
berdasarkan perbedaan ukuran, melalui
migrasi DNA pada sebuah matriks dalam
pengaruh medan listrik karena setiap
nukleotida dalam sebuah molekul asam
nukleat membawa sebuah muatan negatif.
Elektroforesis juga bisa digunakan untuk
mendeterminasi organisasi molekul plasmid
(Turner et al. 2000). Jika gel ditempatkan
dalam tangki elektroforesis yang mengandung
larutan buffer dan tangki tersebut dialiri arus
14
listrik, maka molekul DNA yang bermuatan
negatif pada pH netral akan bergerak ke arah
positif (anode). Kecepatan migrasi DNA dapat
ditentukan oleh beberapa faktor, diantaranya
ukuran molekul DNA, konsentrasi agarosa,
konformasi DNA, voltase yang digunakan,
adanya etidium bromida di dalam gel dan
komposisi larutan buffer (Muladno 2002).
Transformasi Menggunakan Sel Kompeten
Kimia ke Agrobacterium tumefaciens Strain
AGLO
Berdasarkan hasil pemotongan pCambia
1303 dan gen chi yang diverifikasi pada
agarosa sesuai dengan yang diharapkan, maka
tahap selanjutnya adalah transformasi
pCambia 1303 yang mengandung gen chi ke
Agrobacterium
tumefaciens
dengan
menggunakan sel kompeten kimia strain
AGLO. Transformasi ini telah berhasil
dilakukan berdasarkan hasil terbentuknya
koloni yang ditunjukkan pada Gambar 16.
Transformasi gen kitinase ke dalam
Agrobacterium tumefaciens dilakukan dengan
pemberian kejut panas (heat shock).
Prinsip utama dari proses tersebut adalah
terjadi lonjakan suhu dari 0 oC ke 37 o C
terhadap sel. Sehingga pada saat terjadi
lonjakan suhu membran menjadi tidak selektif
terhadap molekul asing dan produk dapat
masuk ke dalam sel. Sel yang telah
ditransformasi selanjutnya diinkubasikan
dalam medium YEP (yeast ekstrak pepton)
dan dikocok selama 3 jam dengan kecepatan
150 rpm, pada suhu 28oC. Pengocokan ini
berfungsi memberikan kesempatan bagi sel
untuk mengekspresikan gen marka pada
plasmid. Setelah itu, sel disebarkan dalam
medium selektif yang telah ditambahkan
dengan kanamisin 25 ppm dan rifampisin 50
ppm.
Gambar 16 Contoh duplikat koloni hasil
transformasi pCambia1303
yang mengandung gen chi
melalui Agrobacterium.
Seleksi
transforman
umumnya
berdasarkan oleh adanya marka seleksi yang
diselipkan pada plasmid. Marka seleksi itu
sendiri merupakan gen yang memberi
karakteristik baru pada sel transforman yang
tidak dimiliki oleh sel bukan transforman.
Dalam transformasi melalui Agrobacterium
ini, antibiotik yang digunakan adalah
kanamisin dan rifampisin. Kedua antibiotik ini
digunakan karena plasmid pCambia 1303
membawa marka seleksi berupa gen resistensi
terhadap antibiotik kanamisin sedangkan
antibiotik rifampisin digunakan dalam
transformasi melalui Agrobacterium ini
berfungsi untuk membunuh E. coli agar
plasmid rekombinan yang terdapat di dalam E.
coli
dapat
dimasukkan
ke
dalam
Agrobacterium. Dengan demikian, sel yang
mengalami transformasi (membawa plasmid
pCambia 1303) bersifat resisten terhadap
kanamisin maupun rifampisin, sedangkan sel
yang tidak mengalami transformasi akan
sensitif terhadap kedua antibiotik tersebut.
Oleh karena itu, seleksi transforman dapat
dilakukan dengan cara menumbuhkan sel
yang ditransformasi dalam medium yang
mengandung kanamisin dan rifampisin. Sel
transforman akan mampu tumbuh dan
membentuk koloni sedangkan sel yang bukan
transforman akan mati.
Sel
perlu
waktu
cukup
untuk
menghasilkan enzim dalam jumlah yang
cukup untuk menangkal pengaruh antibiotik.
Oleh karena itu, setelah proses transformasi
sel tidak langsung ditumbuhkan ke dalam
medium selektif (mengandung antibiotika)
tetapi terlebih dahulu ditumbuhkan dalam
medium cair tanpa antibiotika dalam jangka
waktu pendek agar replikasi plasmid dan
pembentukan enzim dapat berlangsung.
Dalam transformasi melalui Agrobacterium
ini, setelah disebarkan dalam medium selektif,
plasmid pCambia yang mengandung gen chi
diinkubasi selama 2 hari dalam keadaan
kondisi gelap. Hal ini bertujuan untuk
menyamakan
kondisi
tempat
tinggal
Agrobacterium yang hidup di dalam tanah
yaitu dalam keadaan gelap. Sehingga sel
transforman dapat bertahan hidup saat
ditumbuhkan dalam medium selektif.
Koloni yang positif, kemudian dikultur
dalam media yang telah ditambahkan
antibiotik. Selanjutnya dilakukan isolasi DNA
plasmid dari setiap kultur yang diperoleh.
Hasil isolasi plasmid diverifikasi pada gel
agarosa (Gambar 14). Untuk mengkonfirmasi
kebenaran konstruksi gen chi ke pCambia
1303 melalui Agrobacterium ini, maka perlu
15
dilakukan pemotongan dengan menggunakan
enzim restriksi yang sama yaitu NcoI dan SpeI
(Gambar 15) agar dapat diketahui bahwa
plasmid pCambia 1303 yang mengandung gen
chi telah masuk ke dalam Agrobacterium.
Hasil transformasi plasmid pCambia 1303
yang mengandung gen chi selanjutnya akan
ditransfer pada tanaman kelapa sawit (kalus
sawit)
melalui
sistem
Agrobacterium
tumefaciens. Dengan demikian, konstruksi
gen chi pada vektor ekspresi (pCambia 1303)
dapat dimanfaatkan untuk menanggulangi
busuk akar pada tanaman kelapa sawit yang
disebabkan oleh Ganoderma spp. Sehingga
dengan orientasi konstruksi gen ini, gen-gen
yang akan disisipkan diharapkan dapat
diekspresikan secara terus-menerus sepanjang
hidup tanaman kelapa sawit terutama pada
bagian perakaran.
Saran
DNA rekombinan yang telah berhasil
ditransformasikan
ke
dalam
sel
Agrobacterium tumefaciens strain AGLO
sebaiknya
dilanjutkan
dengan
mengintegrasikan ke dalam sel tanaman.
Selanjutnya, untuk mengetahui efektivitas gen
kitinase
pada
Ganoderma
sebaiknya
dilakukan bioassay ditingkat E. coli.
DAFTAR PUSTAKA
Chaidamsari. 2005. Biotechnology for cocoa
pod borer resistance in cocoa
[disertasi].
Netherlands:
Plant
Research International, Wageningen
University.
Claveri
JM,
Notredame
C.
2003.
Bioinformatics for Dummies. Ed ke2. New York: Wiley Publishing.
Datta K, Nicola ZK, Baisakh N, Oliva N,
Datta K. 2000. Agrobacterium
mediated engineering for sheath
blight resistance of indica rice
cultivars from different ecosystems.
Theor Appl Genet 100: 832-839.
Gambar 17 Orientasi konstruksi gen chi
dengan pCambia 1303.
Doyle K. 1996. Promega Protocol and
Application Guide. Tird Edition.
USA: Promega Corporation. hlm. 4154.
Endress R. 1994. Plant Cell Biotechnology.
Berlin: Spriner-Verlag.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Konstruksi gen kitinase (chi) telah berhasil
disisipkan ke dalam pCambia 1303. DNA
rekombinan
yang terkonstruksi
dapat
dibuktikan dengan isolasi plasmid. Restriksi
DNA rekombinan dengan enzim NcoI dan
SpeI menghasilkan 2 pita, yaitu pita dengan
ukuran 12000 bp yang merupakan ukuran dari
pCambia 1303 dan pita dengan ukuran 1500
bp yang merupakan ukuran dari gen chi.
Transformasi DNA rekombinan ke dalam
Agrobacterium tumefaciens telah berhasil
dilakukan dengan menggunakan sel kompeten
kimia strain AGLO dengan prinsip kejut
panas (heat shock) yang dapat dilihat
keberhasilannya dari hasil restriksi dengan
enzim NcoI dan SpeI.
Jach G et al. 1995. Enhanced quantitative
resistance against fungal disease by
combinatorial expression on different
barley anti fungal proteins in
transgenic tobacco. The Plant J 8:
97-109.
Jusuf M 2001. Genetika I Struktur dan
Ekspresi Gen. Jakarta: Infomedika.
Kendrew SJ, Lawrence E. 1994. The
Encyclopedia of Molecular Biology.
Cambridge: Blackwell Science.
Lin W, Anuartha CS, Datta K, Potrykus L,
Muthukrishnan.
1995.
Genetic
engineering of rice for resistace to
sheath blight. Biotechnology 13: 686691.