plagiat merupakan tindakan tidak terpuji plagiat

PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
EFEK ANTIKANKER EKSTRAK ETANOLIK DAUN LAVENDER
(Lavandula officinalis Chaix) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA
T47D MELALUI PENEKANAN EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-α
Skripsi
!Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Disusun Oleh :
Winda Sekarjati
NIM : 118114126
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2014
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
EFEK ANTIKANKER EKSTRAK ETANOLIK DAUN LAVENDER
(Lavandula officinalis Chaix) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA
T47D MELALUI PENEKANAN EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-α
Skripsi
!Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Disusun Oleh :
Winda Sekarjati
NIM : 118114126
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2014
i
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
Penotufua Peubinlohg
EFBK ANTII(AIIIKER EIGTNAK ETANOLn( DAT'N LAYtrNDER
(Levudtrk affihalb
,
T47D
efr)
TDRflADAP SEL KANKER PAY[ ITARA
MEI,ALII PENEKANAI{ EISPRE$I RESEPTORESTROGEN-A
--
,lttt"
'
Skipsl /ang diaj'rken oleh
Winda
S*a{ati
NIM: ll8114126
Tel&dis€trqiui oleh:
Pembimbing Lltama
(Agustim Sairawati, M. Sc, Apt.)
Tanggal30 Jmuari 2015
u
:
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
Pengesahan Skripsi Berjudul
EFEK AI\TIKAI{KER EKSTRAK ETA}IOLIK DAUN LAVEITDER
(Lavandula offrcinalis Chaix) TERIIADAP SEL KAFTKER PAYUDARA
T47D MELALTII PEITEKANAI\I EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN.A
Oleh:
Winda Sekarjati
NIM:
118114126
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farrnasi
Universitas Sanata Dharrra
Pada tanggal: 10 Maret
2015
'
''''
'. '.
a.
Mengetafoui,
Fahlttas Faanasi
_
:.,1
Universitas Sdata Dharma
( Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt.)
Panitia Penguji Skripsi
Tanda Tangan
1.
Agustina Setiawati, M.Sc., Apt.
2.
Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt.
3.
Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc.
ut
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
HALAMAN PERSEMBAHAN
“Sebab Aku ini mengetahui rancangan –
rancangan apa yang ada pada-Ku mengenai
kamu demikianlah firman TUHAN, yaitu
rancangan damai sejahtera dan bukan
rancangan kecelakaan, untuk memberi
kepdamu hari depan yang pebuh harapan.”
(Yeremia 29:11)
“Diberkatilah orang yang mengandalkan
TUHAN, yang menaruh harapannya pada
TUHAN”
(Yeremia 17:7)
!
Karya!ini!kepersembahkan!kepada:!
Tuhan!dan!Juru!Selamat!saya,!Tuhan!Yesus!Kristus!
Bapak!saya!Sudarto!dan!!
Mama!saya!Tatik!Retnowulan!
Kakak!saya!Datia!Kurnia!Witri!serta!
Adikku!Pandu!Yogaswara
iv
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
PERIYYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang telah saya
tulis ini, tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang sudah
disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, seperti layaknya karya ilmiah.
Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah
tersebut, saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundangundangan yang berlaku.
Yogyakana" 30 Januari 2105
Penulis
dueA(Winda Sekarjati)
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
LEMBAR PER}I YATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan dibawah ini, saya mahasiswi Universitas Sanata Dharma.
Nama :Winda Sekarjati
NIM
.118114126
Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan
Universitas Sanata Dharma, Yogyakart 4 kary a ilmiah saya yang berj udul
:
EFEK ANTIKANIMR EKSTRAK ETANOLIK DAUN LAYENDER
(Lavandula olftcinalis Chaix) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA
T47D MELALUI PENEKANAN EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-a
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
hak kepada
Perpustakaan Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta untuk
menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk
pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di
internet dan media lain untuk kepentingan akademis tanpaperlu meminta ijin dari
saya maupun memberikan royalti kepada saya selamatetap mencantumkan nama
saya sebagai penulis.
Demikian pernyataan inisaya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Yada tanggal : 30
lanuai 2015
Yang menyatakan
(Winda Sekarjati)
vl
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan Yesus Kristus atas kasih dan berkat-Nya yang
begitu melimpah, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul
“Efek Antikanker Ekstrak Etanolik Daun Lavender (Lavandula Officinalis Chaix)
terhadap Sel Kanker Payudara T47D melalui Penekanan Ekspresi Reseptor
Estrogen-α” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu
persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) program studi
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Penulis menyadari bahwa dalam pelaksanaan dan penyusunan skripsi ini
tidak lepas dari bantuan dan campur tangan dari berbagai pihak. Oleh karena itu,
pada kesempatan yang indah ini penulis hendak mengucapkan terima kasih
kepada:
1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
2. Ibu Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing dan dosen
penguji skripsi ini serta selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi,
atas segala bimbingan, bantuan, dukungan, kesabaran, dan motivasi
selama penyusunan skripsi tidak lupa atas segala izin yang telah diberikan
untuk dapat menggunakan semua fasilitas laboratorium untuk kepentingan
skripsi ini.
3. Bapak Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt. selaku dosen penguji skripsi
dan telah memberikan saran kepada penulis.
vii
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
4. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. selaku Dosen penguji skripsi
dan telah memberikan saran kepada penulis.
5. Seluruh Dosen dan Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma atas ilmu , arahan, dan bimbingan yang telah dibagikan.
6. Ibu Rumbi dan Ibu Juju selaku teknisi Laboratorium Parasitologi, Fakultas
Kedokteran Umum UGM atas bimbingan dan bantuan selama melakukan
berbagai perlakuan sel kanker di laboratorium tersebut.
7. Keluarga tercinta, Bapak Sudarto, Ibu Tatik Retnowulan, Pandu
Yogaswara dan Datia Kurnia Witri atas segala doa yang tak henti
diucapkan, dukungan, semangat, dan bantuan agar penulis dapat
menyelesaikan studi dengan tepat waktu dan menjadi kebanggan keluarga.
8. Teman- teman tim skripsi “Pasti Sukses!” : Clara Dewi Anggraeni dan
Andung Panjalu Vidityo yang telah memberikan bantuan, semangat dan
tekad untuk dapat mengenakan toga bersama di hari wisuda nanti.
9. Sahabat-sahabat tercinta Vincentius Henry, Albertus Juannino, Theresia
Dian, Skolastika Ferranda, dan Gregoria Novalia atas segala dukungan dan
semangat yang telah diberikan.
10. Teman-teman FST B 2011, FSM C 2011, dan seluruh teman- teman
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta angkatan 2011
atas kebersamaannya.
11. Rekan-rekan kerja part time di PT. Aseli Dagadu Djokdja terkhusus
GARDA DEPAN#49 (m49netics) atas persahabatan yang telah terjalin
viii
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
serta dukungan, doa dan motivasi untuk setiap anggotanya agar dapat
menyelesaikan studi dengan tepat waktu.
12. Teman-teman Pemuda GKJ Brayat Kinasih Yogyakarta atas motivasi
yang selalu diberikan.
13. Sahabat tercinta Thorifah Zatu Sabila dan Karisa Indraswari atas
persahabatan yang telah terjalin sejak duduk di bangku Taman Kanakkanak hingga saat ini.
14. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu oleh penulis yang
telah membantu selama proses penyusunan skripsi ini berlangsung.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi
ini, sehingga membutuhkan saran dan kritik yang membangun untuk perubahan
yang lebih baik. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca.
Yogyakarta, 23 Februari 2015
Penulis
ix
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL .....................................................................................
i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................
ii
HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................
iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ....................................................................
iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................
v
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ..........................................
vi
PRAKATA .....................................................................................................
vii
DAFTAR ISI ..................................................................................................
x
DAFTAR TABEL ..........................................................................................
xiii
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................
xiv
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................
xv
INTISARI ......................................................................................................
xvi
ABSTRACT .....................................................................................................
xvii
BAB I. PENDAHULUAN ...........................................................................
1
A. Latar Belakang ......................................................................................
1
1. Rumusan Masalah ..........................................................................
4
2. Keaslian Penelitian..........................................................................
4
3. Manfaat Penelitian ..........................................................................
4
B. Tujuan Penelitian ..................................................................................
5
1. Tujuan Umum .................................................................................
5
2. Tujuan Khusus ................................................................................
5
x
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ..........................................................
6
A. Lavender (Lavandula officinalis Chaix) ................................................
6
1. Taksonomi .....................................................................................
6
2. Morfologi ........................................................................................
7
3. Kandungan kimia ............................................................................
8
4. Khasiat dan kegunaan......................................................................
8
B. Kanker Payudara ....................................................................................
9
C. Sel Kanker T47D ...................................................................................
12
D. Apoptosis ...............................................................................................
13
E. Uji Sitotoksik dengan Metode MTT ......................................................
14
F. Uji Apoptosis menggunakan Annexin V Fluos .....................................
15
G. Uji Ekspresi Sel dengan Metode Imunositokimia .................................
16
H. Landasan Teori ......................................................................................
17
I. Hipotesis ................................................................................................
18
BAB III. METODE PENELITIAN...............................................................
19
A. Jenis dan Rancangan Penelitian .............................................................
19
B. Variabel dan Definisi Operasional ........................................................
19
1. Variabel Penelitian .........................................................................
19
2. Definisi Operasional .......................................................................
20
C. Bahan Penelitian ....................................................................................
21
D. Alat Penelitian .......................................................................................
22
E. Tata Cara Penelitian ...............................................................................
22
1. Pengumpulan Tanaman ...................................................................
22
xi
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
2. Determinasi Tanaman ......................................................................
22
3. Sortasi Basah ...................................................................................
22
4. Pencucian .........................................................................................
23
5. Pembuatan serbuk daun lavender kering .........................................
23
6. Pembuatan ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix ........................
23
7. Pembuatan larutan uji ......................................................................
23
8. Uji sitotoksik ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix.....................
24
9. Uji apoptosis Annexin V Fluos........................................................
26
10. Imunositokimia ................................................................................
38
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .....................................................
31
A. Penyiapan ekstrak .................................................................................
31
B. Uji sitotoksik ekstrak dengan metode MTT ..........................................
32
C. Uji apoptosis ekstrak dengan metode Annexin V Fluos ........................
38
D. Uji ekspresi ERα menggunakan metode imunositokimia .....................
41
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................
47
A. Kesimpulan ............................................................................................
47
B. Saran ......................................................................................................
47
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................
48
LAMPIRAN ...................................................................................................
53
BIOGRAFI PENULIS ...................................................................................
61
xii
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I
Viabilitas sel T47D dengan perlakuan ekstrak ........................
35
Tabel II
Viabilitas sel T47D dengan perlakuan tamoxifen ....................
36
Tabel III
Persentase sel T47D pada uji Annexin V Fluos ......................
39
Tabel IV
Perhitungan ekspresi ERα pada kontrol sel .............................
43
Tabel V
Perhitungan ekspresi ERα ekstrak ...........................................
44
!
!
!
xiii
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
.
Halaman
Gambar 1.
Lavandula officinalis Chaix.....................................................
7
Gambar 2.
Struktur senyawa dalam lavender............................................
8
Gambar 3.
Anatomi kelenjar payudara manusia........................................
9
Gambar 4.
Jalur signaling ERα..................................................................
11
Gambar 5.
Sel T47D..................................................................................
12
Gambar 6.
Anatomi sel nekrosis dan apoptosis.........................................
13
Gambar 7.
Struktur MTT...........................................................................
15
Gambar 8.
Bentuk kristal formazan pada metode MTT............................
33
Gambar 9.
Morfologi sel T47D.................................................................
37
Gambar 10. Hasil pembacaan flowcytometer .............................................
39
Gambar 11. Morfologi ekspresi sel T47D pada uji imunositokimia ..........
42
!
!
!
!
!
!
xiv
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
DAFTAR LAMPIRAN
.
Halaman
Lampiran 1.
Surat keterangan hasil determinasi daun lavender ...............
54
Lampiran 2.
Perhitungan seri kadar ekstrak dan tamoxifen ......................
55
Lampiran 3.
Viabilitas sel T47D dengan pemberian ekstrak ....................
56
Lampiran 4.
Viabilitas sel T47D dengan pemberian tamoxifen ...............
57
Lampiran 5.
Analisis IC50 ekstrak menggunakan program R ..................
58
Lampiran 6.
Analisis IC50 tamoxifen menggunakan program R ..............
59
Lampiran 7.
Pengamatan tiga lapang pandang imunositokimia ...............
60
xv
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
INTISARI
Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker dengan tingkat
prevalensi yang cukup tinggi di Indonesia setelah kanker leher rahim. Selama ini
penatalaksanaan kanker payudara dilakukan dengan serangkaian pengobatan
meliputi pembedahan, kemoterapi, radiasi, hormonal dan terapi imunologik.
Terdapat beberapa kelemahan dari pengobatan tersebut antara lain menimbulkan
rasa mual dan muntah, pendarahan serta dapat meningkatkan resiko kanker
endometrium (pada wanita menopause). Oleh karena itu, penting untuk dilakukan
penemuan obat antikanker yang selektif.
Penelitian ini mengeksplorasi efek antikanker ekstrak etanol daun lavender
(Lavandula officinalis Chaix.) terhadap sel kanker payudara T47D. Model sel
kanker payudara yang digunakan adalah sel T47D yang mampu mengekspresikan
reseptor estrogen alfa (ERα). Uji sitotoksisitas dianalisis menggunakan metode 3[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dilanjutkan
dengan uji induksi apoptosis dengan metode Annexin V Fluos. Mekanisme
molekuler terhadap ERα dianalisis secara semi-kuantitatif menggunakan metode
imunositokimia.
Ekstrak etanol daun lavender (L. officinalis Chaix) menunjukkan efek
sitotosik pada nilai IC50 232 µg/mL yang dihitung secara statistik menggunakan
program R serta mampu menginduksi sel kanker payudara T47D melalui
mekanisme apoptosis dengan menekan ekspresi protein ERα.
Kata kunci: Ekstrak etanol, Lavandula officinalis Chaix., kanker payudara,
T47D.
xvi
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
ABSTRACT
Breast cancer is the second highest incidence after cervical cancer in
Indonesia. Management of breast cancer is conducted by a series of treatment
include surgery, chemotherapy, radiation, hormonal, and immunological therapy.
But, there are several side effects caused by the treatment, for example, nausea
and vomiting, bleeding, and may increase the risk of endometrial cancer (for
menopausal woman). Furthermore, it is important to discover a selective
anticancer drug.
This study explored the effect of ethanol extract of Lavandula officinalis
Chaix leaves against T47D breast cancer cell line. Breast cancer cell model used
T47D, an overexpressing estrogen receptor alpha (ERα). Cytotoxicity assay were
analyzed using 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide
(MTT) then induction of apoptosis using Annexin V Fluos method. Molecular
mechanism on ERα was analyzed using a semi-quantitative methode,
immunocytochemistry.
Ethanol extract of Lavandula officinalis Chaix leaves showed cytotoxic
effect with IC50 value 232 µg/mL which calculated using statistical R program and
was able to induce T47D breast cancer cells through mechanism of apoptosis by
inhibition the expression of ERα.
Keyword: Ethanolic extract, Lavandula officinalis Chaix, breast cancer, T47D.
xvii
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kanker merupakan salah satu penyakit tidak menular yang menjadi
masalah kesehatan utama baik di dunia maupun di Indonesia. Menurut data WHO
tahun 2013, angka kejadian kanker meningkat dari 12,7 juta kasus pada tahun
2008 menjadi 14,1 juta kasus pada tahun 2012. Di Indonesia, prevalensi penyakit
kanker juga cukup tinggi, berdasarkan data Riset Kesehatan Dasar (RISKESDAS)
tahun 2013, prevalensi kanker di Indonesia adalah 1,4 per 1000 penduduk atau
sekitar 330.000 orang. Jenis kanker yang menduduki posisi dengan angka
kejadian tertinggi pada wanita adalah kanker leher rahim (serviks) dan kanker
payudara. Menurut estimasi Globocan, International Agency for Reasearch on
Cancer (IARC) tahun 2012, angka kejadian kanker payudara sebesar 40 per
100.000 wanita, sedangkan kanker leher rahim sebesar 17 per 100.000 wanita
(Kementrian Kesehatan Republik Indonesia, 2014). Berdasarkan data di atas,
maka penelitian terkait kanker payudara sangat menarik untuk dikembangkan.
Kanker payudara sendiri memiliki berbagai macam sub tipe secara
molekuler, Karolina dkk. (2010) menggolongkan menjadi empat macam yaitu:
luminal (luminal A dan luminal B), HER2, basal-like, dan normal breast.
Mengacu pada penelitian yang telah dilakukan oleh Pilar dkk. (2010), kanker
payudara luminal A merupakan sub tipe yang paling umum terjadi, yaitu sekitar
50- 60% dari total kejadian kanker payudara. Salah satu karakteristik molekuler
1
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
2
dari kanker payudara luminal A adalah adanya ekspresi gen yang diaktifkan oleh
faktor transkripsi estrogen. Over ekspresi produksi reseptor akibat stimulasi
estrogen dapat mengakibatkan proliferasi sel yang tidak terkontrol. Salah satu
jenis reseptor yang bertanggung jawab atas kejadian kanker payudara adalah
reseptor estrogen alfa (ERα). Informasi terkait regulasi ekspresi reseptor ERα
memberikan kontribusi positif terhadap penelitian mengenai kanker payudara
(Hayashi, dkk., 2003).
Mekanisme terjadinya kanker payudara yang cukup kompleks juga
berpengaruh pada berbagai macam pengobatan yang diberikan bagi para penderita
kanker payudara, beberapa diantaranya melalui operasi pengangkatan payudara,
terapi radiasi, dan terapi hormonal (National Cancer Institute, 2013). Tidak sedikit
pula efek samping yang ditimbulkan dari berbagai jalur pengobatan tersebut,
kelemahan dari pengobatan kanker payudara adalah munculnya efek samping
yang secara umum dapat berupa mual dan muntah, timbulnya rasa nyeri dan sakit,
pendarahan, dan lain sebagainya. Berdasarkan keterangan diatas, maka perlu
adanya penelitian untuk menemukan suatu senyawa yang memiliki target aksi
lebih spesifik pada sel kanker payudara sehingga tidak menimbulkan berbagai
efek samping.
Daun Lavandula officinalis Chaix (Sinonim Lavandula angustifolia
Mill.; Lavandula vera DC) dipilih karena mengandung berbagai komponen
senyawa kimia, antara lain adalah linalil asetat, linalol, kampor, limone, dan lain
sebagainya, namun yang terbesar diantara semua adalah kandungan monoterpen
yaitu sebesar 60-65% (European Medicines Agency, 2011). Chu dan Kamper,
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
3
(2001) melaporkan bahwa salah satu hasil metabolit monoterpen memiliki
aktivitas dalam melawan sel kanker payudara pada uji klinik fase I yang pernah
dilakukan. Berdasarkan penelitian diatas, maka dapat disimpulkan bahwa ekstrak
daun
L.officinalis
Chaix
potensial
untuk
dikembangkan
sebagai
agen
kemopreventif pada kanker payudara.
Penelitian ini didesain untuk eksplorasi aktivitas antikanker dan
kemampuan ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix dalam menginduksi apoptosis
sel kanker payudara T47D. Mekanisme molekuler antikanker dianalisis melalui
ekspresi ERα dengan metode imunositokimia.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
1.
4
Rumusan Masalah
Apakah ekstrak etanol daun lavender mempunyai kemampuan sitotoksik,
induksi apoptosis, dan menekan ekspresi ERα terhadap sel kanker payudara T47D
serta berapa nilai IC50 ekstrak tersebut?
2.
Keaslian Penelitian
Penelitian dengan menggunakan ekstrak etanol Lavandula officinalis
Chaix yang pernah dilakukan adalah Neuroprotective effect of pretreatment with
Lavandula officinalis ethanolic extract on blood-brain barrier permeability in a
rat stroke model (Rabiei dan Rafieian, 2014), dalam penelitian tersebut ekstrak
etanol digunakan untuk pengobatan stroke. Terdapat pula penelitian lain
menggunakan ekstrak lavender sebagai anti-mikroba yang dikombinasikan
dengan minyak aroma terapi lain, judul penelitian tersebut adalah The In Vitro
Antimicrobial Activity of Lavandula angustifolia Essential Oil in Combination
with Other Aroma Therapeutic Oils (Rapper, dkk., 2013).
Sejauh studi pustaka yang dilakukan oleh peneliti, penelitian tentang uji
efektifitas antikanker ekstrak etanol daun lavender (Lavandula officinalis Chaix)
dengan metode MTT dan imunositokimia pada sel kanker payudara T47D belum
pernah dilakukan.
3.
a.
Manfaat Penelitian
Manfaat Teoretis.
Penelitian ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan
khususnya ilmu kefarmasian mengenai informasi
!
terkait ekstrak etanol daun
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
5
lavender (Lavandula officinalis Chaix) sehingga dapat pula menjadi sumber acuan
yang dapat digunakan untuk penelitian selanjutnya.
b.
Manfaat Praktis.
Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan secara ilmiah khasiat dari
ekstrak etanol daun lavender (Lavandula officinalis Chaix) yang berpengaruh
pada apoptosis sel kanker payudara T47D dan mendeteksi ekspresi sel protein
kanker payudara.
B. Tujuan Penelitian
1. Tujuan Umum
Mengetahui aktivitas antikanker ekstrak etanol daun lavender terhadap
sel kanker payudara T47D.
2. Tujuan Khusus
Mengetahui efek ekstrak etanol daun lavender terkait kemampuan
sitotoksik, induksi apoptosis pada sel kanker payudara T47D serta penekanan
ekspresi
!
ERα
dengan
nilai
IC50
ekstrak
tersebut.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
!
A. Lavender (Lavandula officinalis Chaix)
1.
Taksonomi
Berdasarkan sistem taksonomi, tanaman lavender dikenal dengan nama
ilmiah Lavandula officinalis Chaix. Adapun klasifikasi tanaman tersebut adalah
sebagai berikut :
Kingdom
: Plantae
Subkingdom
: Tracheobionta
Superdivision
: Spermatophyta
Division
: Magnoliophyta
Class
: Magnoliopsida
Subclass
: Asteridae
Ordo
: Lamiales
Family
: Lamiaceae
Genus
: Lavandula L.
Species
: Lavandula officinalis Chaix
(United States Departement of Agriculture)
Lavender merupakan tanaman yang dapat tumbuh dengan baik di tempat
kering dengan sinar matahari penuh disertai perlindungan angin (Prusinowska,
2014). Tanaman ini berasal dari wilayah Mediterania Utara, kemudian
dibudidayakan di daerah Eropa bagian selatan, Bulgaria, Federasi Rusia, Amerika
6
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
7
Serikat dan bekas Yugoslavia. Lavender berasal dari bahasa latin yang diambil
dari kata “Lavo” atau “Lavare” yang berarti sarana untuk mencuci atau
membersihkan (Prusinowska, 2014). Lavender merupakan nama dalam bahasa
Indonesia maupun bahasa Inggris (WHO, 2007).
2. Morfologi
Gambar 1. Lavandula officinalis Chaix (United States Departement of Agriculture)
Lavandula officinalis Chaix merupakan sinonim dari Lavandula
angustifolia Mill. Pada sebagian besar buku referensi lama menyebutkan bahwa
Lavandula officinalis Chaix sebagai nama spesies, namun menurut peraturan
internasional nomenklatur botani, Lavandula angustifolia Mill. Merupakan nama
spesies yang resmi. Lavender merupakan tanaman yang termasuk dalam anggota
keluarga Lamiaceae serta memiliki genus yang terdiri dari 25-35 sub-spesies dan
memberikan morfologi yang beragam. Tanaman ini ditemukan dalam bentuk
semak aromatik setinggi 1-2 meter, memiliki cabang berwarna abu sampai coklat
tua. Bunga lavender berwarna ungu tua hingga biru tua dengan tinggi 25-35 cm.
Jumlah bunga dalam satu batang mencapai 6-10 buah. Daun mengelompok pada
bagian tunas daun, memiliki jarak yang cukup lebar pada tunas yang berbunga,
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
8
tangkai daun sangat pendek, bentuk tangkai daun linier-lanset higga linier dengan
panjang 17 mm, lebar 2 mm (WHO, 2007).
3.
Kandungan kimia
(A)
(B)
(C)
(D)
Gambar 2. Struktur senyawa yang terkandung dalam lavender (A) Linalool; (B) Linalil
asetat; (C) Kumarin; (D) Asam ursolat (PubChem, 2015).
Lavender mengandung banyak konstituen kimia, namun kandungan yang
terbesar merupakan minyak esensial, beberapa diantaranya yang memiliki
konsentrasi tertinggi adalah linalool yang tergolong dalam monoterpen alkohol
dan linalil asetat yang tergolong monoterpen ester. Senyawa kimia lain yang
terdapat di dalamnya adalah asam ursolat, monoterpen keton (kumarin), dan lain
sebagainya (European Medicines Agency, 2011).
4. Khasiat dan kegunaan
L. officinalis Chaix diketahui memiliki aktivitas antioksidan yang baik
dan komponen kimia yang berperan adalah komponen fenolik, kandungan minyak
esensial didalamnya juga memiliki aktivitas antioksidan yang kuat dalam
melawan lipid peroksidasi sistem model asam linoleat. Senyawa perilil alkohol
(POH) golongan monoterpen didalam L. officinalis Chaix dapat digunakan
sebagai agen kemopreventif dalam kanker payudara, kolon, dan pankreas
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
9
(Bardon, dkk., 2002). Pada penelitian Lim (2014), menyebutkan bahwa tikus yang
diberi makan p-limonene (salah satu golongan monoterpen) sebanyak 10.000 ppm
dapat mereduksi 72% tumor payudara dibandingkan dengan kontrol pada 18
minggu perlakuan.
Khasiat lain yang terkandung dalam L. officinalis Chaix adalah sebagai
antimikrobia, antikonvulsan dan memiliki efek sedatif, serta berperan sebagai
senyawa anti-inflamasi. Pada uji klinik diketahui bahwa minyak esensial L.
officinalis Chaix dapat digunakan untuk aromaterapi pada penderita insomnia
(WHO, 2007).
B. Kanker Payudara dan Reseptor Estrogen- α (ERα)
Gambar 3. Anatomi kelenjar payudara manusia (PubMed Health, 2014).
Kelenjar payudara manusia terdiri dari duktus dan lobus, dibentuk dari
sel-sel epitel yang dikekelingi sel-sel mioepitel serta sel lain yang tergolong dalam
jaringan ikat seperti fibroblast, sel endotel, serabut saraf dan adiposa. Kanker
payudara adalah tumor ganas yang berasal dari kelenjar payudara, termasuk
saluran kelenjar air susu dan jaringan penunjangnya. Tumor pada payudara
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
10
bermula dari sel epitelial, sehingga sebagian besar kanker payudara dikelompokan
sebagai karsinoma (keganasan tumor epitelial) (Hondermarck, 2003).
Terjadinya kanker payudara dibagi kedalam 4 tahapan utama didasarkan
pada hasil pengujian tumor dan benjolan kelenjar getah bening selama operasi dan
tes lain, tahapan tersebut adalah :
a)
Tahap 0 (karsinoma in situ) : Merupakan tahapan non-invasif yaitu
dimana sel abnormal ditemukan di dalam kelenjar payudara. Sel abnormal ini
cenderung tidak menyebar menuju jaringan lain didalam payudara.
b)
Tahap 1 : Tahap 1 terdiri dari 1A dan 1B. Pada tahap 1A
ditemukan tumor yang berukuran 2 cm atau lebih kecil dan tidak menyebar di
jaringan yang lain. Pada tahap 1B terdapat sekelompok kecil sel kanker dengan
ukuran 0,2 mm namun tidak lebih dari 2 mm ditemukan di kelenjar getah bening.
c)
Tahap 2 : Ukuran tumor menjadi lebih besar, yaitu sekitar 2–5 cm,
sel kanker ditemukan pada kelenjar getah bening aksilaris atau didekat tulang
dada.
d)
Tahap 3 : Ukuran tumor lebih besar dari 5 cm, sel kanker sudah
mulai menyebar pada kelenjar getah bening aksilaris. Sekelompok kecil sel
kanker berukan lebih besar dari 0,2 mm.
e)
Tahap 4 : Kanker sudah mulai menyebar pada bagian tubuh lain,
terutama pada bagian tulang, paru- paru, hati atau otak.
(National Cancer Institue, 2013).
Faktor yang dapat meningkatkan resiko kanker payudara pada individu
tertentu, meliputi riwayat keluarga yang memiliki kanker payudara, usia, tidak
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
11
memiliki anak, kehamilan pertama pada usia di atas 30 tahun, periode menstruasi
yang lebih lama (menstruasi pertama lebih awal atau menopause lebih lambat),
faktor hormonal (baik estrogen maupun androgen) (Hondermarck, 2003).
Gambar 4. Jalur signaling ERα (Compston, 2001).
Salah satu faktor yang dapat mempengaruhi proses metastasis kanker
payudara karena adanya aktivasi atau overekspresi beberapa protein, yaitu ERα,
ekspresi berlebih pada ERα sering ditemukan pada tahapan awal terjadinya kanker
payudara (Hayashi, dkk., 2003).
ERα
merupakan faktor transkripsi ligand-
dependent yang memodulasi transkripsi gen melalui proses perekrutan menuju
kromatin gen sasaran. Proses signaling pada reseptor ERα membantu dalam
memahami terjadinya kanker payudara, tahapan signaling ERα memberikan
kontribusi pada perubahan epigenik, epigenik merupakan modifikasi DNA yang
tidak merubah urutan gen, namun dapat berdampak pada ekspresi gen dan dapat
diwariskan. Sinyal ERα berpotensi untuk mengaktifkan sinyal ekstranuklear yang
berfungsi untuk mengaktifkan beberapa kaskade kinase yang secara langsung
dapat memodifikasi ekor histon atau secara tidak langsung dapat mempengaruhi
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
12
fungsi dari histon yang memodifikasi enzim. Deregulasi ERα melalui sinyal
epigenik memiliki implikasi pada perkembangan kanker payudara (Mann, dkk.,
2011).
C. Sel Kanker T47D
Gambar 5. Sel T47D (Koleksi pribadi).
T47D merupakan sel kanker payudara yang aktivitasnya bergantung dari
jumlah hormon dalam tubuh manusia, sel ini secara luas digunakan sebagai model
eksperimental studi kanker payudara. T47D dapat dipakai pada uji in vitro (dalam
sel kultur) maupun in vivo (tumor xenograf pada tikus), fungsi protein dan tingkat
efikasi daya hambat sel. Sel ini awalnya berasal dari sisi metastasis efikasi pleura
dan memberikan ekspresi pada reseptor estrogen (Adjo dan Lin, 2012).
Sel kanker payudara T47D mengekpresikan reseptor estrogen nukleus,
yang diperlukan bagi sel untuk mengaktifkan gen penting tertentu
dalam
pertumbuhan dan replikasi. Estrogen termasuk dalam hormon seks yang terdiri
dari estradiol, estriol, dan estrone. Hormon-hormon ini mampu menembus
membran sel sehingga dapat berdifusi langsung ke nukleus. Sekali estrogen dapat
masuk ke dalam nukleus, maka dapat terjadi ikatan antara substrat dan reseptor
estrogen membentuk reseptor dimer. Sisi aktif reseptor kemudian berikatan
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
13
dengan sisi spesifik pada DNA yang dapat menaikkan atau menurunkan ekspresi
gen tergantung pada peran faktor transkripsi sisi aktif (Neumann dan Rossi,
2012).
D.
Apoptosis
Gambar 6. Anatomi (A) sel nekrosis (B) dan (C) sel apoptosis
(Johnson dkk., 2002).
Apoptosis merupakan kematian sel yang terprogram dan sekaligus
suatu komponen yang normal pada perkembangan dan pemeliharaan kesehatan
pada organisme. Pada apoptosis, sel yang mati merupakan respon terhadap
berbagai stimulus, sel ini dikontrol dan diregulasi, sel yang mati difagosit oleh
makrofag (Lumongga, 2008). Kejadian apoptosis ditandai dengan adanya
perubahan morfologi, termasuk penyusutan sel, membran bleebing, kondensasi
kromatin, fragmentasi DNA, dan pembentukan badan apoptosis (Handayani,
2012).
Apoptosis berbeda dengan nekrosis, pada nekrosis terjadi kematian sel
tidak terkontrol, sel yang mati pada nekrosis dapat membesar dan kemudian
hancur serta lisis pada satu daerah yang merupakan respon terhadap inflamasi.
Kelainan pada kontrol kematian sel dapat memberikan kontribusi pada berbagai
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
14
penyakit, termasuk kanker, autoimun dan penyakit degeneratif. Sinyal apoptosis
terjadi melalui berbagai jalur independen yang dimulai dengan memicu peristiwa
dalam sel maupun dari luar sel, misalnya dengan ligasi kematian reseptor. Seluruh
jalur signaling apoptosis bertemu pada suatu mesin kerusakan sel yang diaktifkan
oleh famili protease sistein (caspase) yang membelah pada residu aspartat.
Pembongkaran sel dicapai dengan cara proteolisis dari konstituen vital sel,
degradasi DNA, dan fagositosis oleh sel tetangga (Strasser, dkk., 2000).
E. Uji Sitotoksik dengan Metode 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl
tetrazolium bromide (MTT)
Uji 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide
(MTT) merupakan uji viabilitas sel yang dikembangkan untuk format 96 sumuran.
Metode ini diawali dengan mempersiapkan substrat MTT dalam larutan fisiologis
kemudian ditambahkan pada sel yang telah dikulturkan dan diinkubasi selama 14 jam. Jumlah formazan (berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup) diukur
pada panjang gelombang 570 nm dengan menggunakan spektrofotometer. Sel
yang hidup dan memetabolisme aktif mengkonversi MTT menjadi formazan yang
berwarna ungu pada absorbansi maksimum 570 nm. Ketika sel tersebut mati,
maka sel itu kehilangan kemampuan dalam mengkonversi MTT menjadi sebuah
formasan, sehingga adanya perubahan warna berfungsi hanya sebagai penanda
jumlah sel yang masih hidup. Jumlah sinyal yang dihasilkan bergantung dari
konsentrasi MTT, masa inkubasi, jumlah sel yang hidup dan aktivitas
metabolisme (Terry, dkk., 2013).
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
15
Gambar 7. Struktur MTT dan formasan yang terbentuk
(Terry, dkk., 2013).
F. Uji Apoptosis menggunakan Annexin V Fluos
Annexin V Fluos merupakan suatu metode uji yang digunakan untuk
menghitung jumlah sel yang telah mengalami apoptosis. Hal ini didasarkan pada
sel-sel normal di alam bersifat hidrofobik dan memiliki membran fosfolipid yang
terdistribusi di dalam dan di bagian luar lapisan membran. Pada bagian luar lipid
bilayer mengandung fosfatidilkolin dan sfingomielin sedangkan pada bagian
dalam terdapat fosfatidilserin, ketika terjadi apoptosis pada sel tersebut, bagian
membran menjadi terganggu atau rusak, sehingga mengakibatkan fosfatidilserin
keluar menuju bagian luar. Annexin V Fluos yang memiliki afinitas kuat terhadap
fosfatidilserin sehingga dapat terdeteksi jumlah sel yang mengalami apoptosis.
Sedangkan untuk sel- sel yang mengalami kerusakan DNA berikatan dengan
reagen propidium iodin dan dapat memberikan data jumlah sel yang mengalami
nekrosis (Istvan, dkk., 1995).
Alat yang digunakan untuk mendeteksi hasil Annexin V Fluos adalah
flow cytometer. Flow cytometer merupakan alat yang canggih untuk mendeteksi
suatu fenotip dan karakteristik dari sel berdasarkan fluoresensi cahaya yang
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
16
diapancarkan oleh sel itu sendiri. Adanya fluroresensi ini kemungkinan berkaitan
dengan pewarnaan atau adanya konjugasi pada antibodi spesifik pada permukaan
sel atau pada komponen intraseluler. Flow cytometer dapat mengidentifikasi
berbagai macam jenis sel pada populasi sel yang heterogen, hal ini dapat dicapai
dengan adanya Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) didalam flow
cytometer, perangkat ini mampu mengidentifikasi lebih dari dua warna floresensi
(Macey, 2007).
G.
Uji Ekspresi Sel dengan Imunositokimia
Metode imunositokimia memanfaatkan suatu antibodi spesifik yang
dapat berikatan dengan protein atau antigen didalam sel dan membran di bawah
mikroskop (Richard, 2010). Ada dua jenis metode imunositokimia, yaitu metode
langsung dan metode tidak langsung. Pada metode langsung, antibodi yang
mengikat fluoresen atau zat warna langsung berikatan dengan antigen pada sel.
Sedangkan pada metode tidak langsung, antigen diikatkan pada antibodi primer
secara langsung, kemudian ditambahkan antibodi sekunder yang mengikat enzim
seperti peroksidase, alkali fosfatase, atau glukosa oksidase. Antibodi sekunder
akan berikatan dengan antibodi primer. Selanjutnya ditambahkan substrat
kromogen yang diubah oleh enzim sehingga terjadi pembentukan warna (pigmen)
yang mampu memberikan warna pada sel (Richard, 2011).
Pada metode imunositokimia dibutuhkan suatu kontrol yang terdiri dari
antibodi primer, antibodi sekunder, dan kontrol label. Antibodi primer digunakan
untuk mengetahui spesifisitas ikatan antibodi primer tehadap antigen, antibodi
sekunder digunakan untuk menunjukkan ikatan label yang spesifik pada antibodi
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
17
primer, sedangkan kontrol label merupakan hasil dari proses pelabelan selama
proses imunositokimia dan menunjukkan bahwa label yang digunakan tidak
bersifat endogen/bereaksi dengan produk (Richard, 2011).
H. Landasan Teori
Kanker payudara memiliki hubungan erat dengan hormon estrogen yang
terdapat pada wanita. Salah satu penyebab terjadinya kanker payudara adalah
aktivasi atau overekspresi protein, yaitu reseptor estrogen alfa (ERα). ERα
berikatan dengan estrogen membentuk kompleks reseptor aktif dan dapat
mempengaruhi transkripsi gen yang mengatur proliferasi sel, adanya overekspresi
pada ERα menimbulkan terjadinya proliferasi sel yang abnormal dan memicu
terjadinya kanker.
Beberapa macam jenis terapi yang pernah diberikan bagi penderita
kanker payudara antara lain adalah terapi hormonal, terapi radiasi, operasi
pengangkatan payudara, dan kemoterapi. Kekurangan dari berbagai terapi tersebut
yaitu munculnya iritasi pada kulit payudara, lymphedema, rasa mual, muntah,
diare dan sakit kepala, sehingga diperlukan adanya penelitian suatu senyawa yang
mampu membunuh sel kanker payudara secara selektif dan meminimalkan
munculnya efek samping. Selama ini telah dilakukan berbagai macam penelitian
terkait senyawa alam yang memiliki aktivitas antikanker pada kelenjar payudara.
Menurut Lim (2014), L. officinalis Chaix merupakan tanaman yang
memiliki kandungan monoterpen cukup tinggi dan senyawa ini mempunyai
aktivitas antikanker. Potensi ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix dalam
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
18
menghambat viabilitas sel diujikan pada sel kanker payudara T47D yang mampu
mengekspresikan ERα. Kemampuan senyawa dalam menginduksi apoptosis diuji
menggunakan Annexin V Fluos. Jalur kematian apoptosis dipilih karena tidak
membawa pengaruh pada sel sekitarnya dan memberikan terapi yang lebih
selektif. Pengamatan molekuler sel dalam menekan ekspresi ERα dilakukan
dengan metode semi-kuantitatif melalui imunositokimia. Tamoxifen dapat
digunakan sebagai obat pembanding dalam penelitian ini karena obat ini tergolong
dalam terapi hormonal yang telah terbukti mampu menghambat ikatan antara
estrogen dengan sel-sel kanker ER-positif
I. Hipotesis
Adanya pengaruh ekstrak etanol daun lavender (Lavandula officinalis
Chaix) terhadap viabilitas sel T47D yang diuji menggunakan metode 3-[4,5dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium (MTT) dan mampu menginduksi
apoptosis sel serta menekan ekspresi ERα melalui uji imunositokimia.
!
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
BAB III
METODE PENELITIAN
A.
Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang berjudul “Efek Antikanker Ekstrak Etanolik Daun
Lavender (Lavandula Officinalis Chaix) terhadap Sel Kanker Payudara T47D
melalui
Penekanan
Ekspresi
Reseptor
Estrogen-α”
termasuk
penelitian
eksperimental murni dengan menggunakan rancangan penelitian acak lengkap
pola searah. Penelitian ini termasuk jenis ekperimental karena terdapat perlakuan
terhadap subyek uji. Rancangan penelitian acak lengkap pola searah karena
penelitian ini memiliki satu faktor dengan banyak level.
B.
1.
Variabel dan Definisi Operasional
Variabel Penelitian
a. Variabel utama
1) Variabel bebas
: tujuh peringkat konsentrasi ekstrak etanol daun
lavender yaitu (1585, 1150, 1000, 300, 178, 100, 10) µg/mL.
2) Variabel tergantung
: viabilitas sel, persentase sel apoptosis, level
ekspresi protein ERα.
b. Variabel Pengacau
1) Variabel pengacau terkendali
Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi sel uji, yaitu sel
kanker payudara T47D. Bahan uji yang digunakan berupa daun Lavandula officinalis
19
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
20
Chaix yang didistribusikan oleh Dipokusumo Farm (Rasamala A4, Semarang Kota
50189, Jawa Tengah, Indonesia) berasal dari kebun di Malang, Jawa Timur dipanen
pada bulan Juni 2014, serta lama pengeringan daun L. Officinalis Chaix.
2) Variabel pengacau tak terkendali
Usia tanaman, cuaca, kontaminasi lingkungan, kondisi lingkungan, dan waktu
inkubasi.
2.
Definisi Operasional
a. Ekstrak etanol daun Lavandula officinalis Chaix adalah larutan kental hasil
ekstraksi total daun lavender yang diperoleh dengan cara mengekstraksi.
b.
Uji MTT adalah metode yang digunakan untuk mengetahui jumlah sel yang
masih hidup setelah pemberian ekstrak etanol daun Lavandula officinalis
Chaix.
c. Konsentrasi IC50 adalah konsentrasi sampel yang mampu mematikan sel
sebanyak 50% dari total sel.
d. Apoptosis sel yang teramati adalah sel hidup berfluoresensi hijau terang, sel
yang mengalami nekrosis berwarna oranye merata seperti sel normal, sel yang
mengandung ERα berwarna coklat dan sel yang tidak mengandung ERα
berwarna biru.
e. Imunositokimia adalah metode yang digunakan untuk mengetahui adanya
ekspresi suatu protein spesifik di dalam sel.
f. Level ekspresi ERα populasi atau persentase sel yang berwarna coklat baik
pada sitoplasma dan atau nukleus dalam tiga lapang pandang.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
C.
1.
21
Bahan Penelitian
Bahan utama
a. Daun lavender (Lavandula officinalis Chaix) diperoleh dari distributor
Dipokusumo Farm (Rasmala A4, Semarang Kota) yang dipanen pada bulan
Juni 2014
b. Breast Cancer Cell Line T47D diperoleh dari Laboratorium Parasitologi
Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
2.
Bahan kimia
Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 70% (CV. Labora), PBS
(Phospate Buffer Saline), MK (Media Kultur) yang berisi Dulbeco’s Modified
Eagle Media (DMEM) dan Roswell Park Memorial Institute (RPMI), Dimethyl
Sulfoxide (DMSO), Reagen MTT 5mg/mL (50 mg MTT dan 10 mL PBS), Sodium
Dodecyl Sulfate (SDS) 10% dalam 0,1N HCl (larutan stopper), Fetal Bovine
Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), penisilin- streptomisin 1% (v/v) (Gibco), tripsin
EDTA 0,25%, fungizone 0,5% (Gibco), reagen Annexin V Fluos (Roche),
Propidium Iodine (Pi), reagen Imunositokimia yang terdiri dari metanol, larutan
hidrogen peroksida, Novostain universal detection kit, antibodi monoklonal
primer ERα (Thermo Fisher Scientific Pierce), biotinylated universal secondary
antibodi (Lab Vision), etilen, xylol, dan hematoxylin (Dako). Bahan untuk kontrol
positif adalah tablet tamoxifen 10 mg (Nolvadex), akuades, Streptavidin berupa
Horse Radish Peroxidase (HRP), 3, 3’ – diaminobinzidine (DAB), etanol absolut
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
D.
22
Alat Penelitian
Treated tissue culture dish diameter 10 cm, 96 well-plate, 24 well-plate,
6 well-plate, cover slip, sentrifuge tube, object-glass, conical tube, eppendorf,
inkubator CO2, Laminar air flow cabinet, mikropipet, yellow-tip, blue-tip, pinset,
autoklaf, hemositometer, ELISA reader, kamera digital, mikroskop cahaya, rotary
evaporator, mikroskop inverter, neraca digital.
E.
1.
Tata Cara Penelitian
Pengumpulan tanaman
Tanaman Lavender officinalis Chaix dibeli dari perkebunan Dipokusumo
Farm (Rasamala A4, Semarang Kota 50189, Jawa Tengah, Indonesia) dipanen
pada bulan Juni 2014. Bagian tanaman yang digunakan hanya bagian daun dan
dipilih daun segar dengan ciri berwarna hijau, mengeluarkan aroma lavender,
bentuk masih utuh dan sedikit lengket karena kandungan minyak atsiri.
2.
Determinasi tanaman
Daun lavender yang telah diperoleh dari perkebunan Dipokusumo Farm
dilakukan determinasi atau identifikasi tanaman sesuai dengan Lampiran 1.
3. Sortasi basah
Daun lavender dipisahkan dari bunga, batang dan akarnya serta
pengotor lain seperti tanah yang menempel pada permukaan daun.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
23
4. Pencucian
Pencucian daun lavender dilakukan dengan menggunakan air mengalir
sebanyak tiga kali, pencucian dilakukan dengan hati–hati supaya daun lavender
tetap dalam kondisi utuh.
5. Pembuatan serbuk daun lavender kering
Daun lavender yang telah dicuci bersih dilakukan pengeringan suhu
rendah dengan cara dimasukkan ke dalam lemari pendingin pada suhu 5-100C
selama 14 hari, daun yang telah kering tersebut kemudian dibuat dalam bentuk
serbuk dengan cara diblender hingga hancur dan diperoleh serbuk halus simplisia.
6. Pembuatan ekstrak etanol daun Lavandula officinalis Chaix
Sebanyak 10 gram serbuk simplisia dilarutkan dengan 50 mL etanol
70% dalam erlenmeyer, kemudian dilakukan pengadukan dan dilanjutkan dengan
maserasi selama 48 jam dengan kecepatan 150 rpm. Hasil maserasi yang
diperoleh selanjutnya disaring dan diambil bagian cairan, kemudian dilakukan
rotary evaporator pada suhu 800C selama 5 menit dilanjutkan dengan pemekatan
dengan menggunakan waterbath selama 4,5 jam pada suhu yang sama, yaitu 800C
hingga diperoleh hasil ektraksi dengan konsistensi kental berwarna hijau pekat.
Hasil ekstraksi yang diperoleh ditimbang, ditempatkan dalam flakon, dan
disimpan pada suhu ruang (Hajhashemi, dkk., 2003).
7. Pembuatan larutan uji
a. Sampel ( ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix)
Ekstrak kental ditimbang sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan kedalam
100 µl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel adalah 100.000
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
24
µg/ mL. Selanjutnya dibuat delapan seri kadar pengenceran yaitu 1585 µg/mL;
1150 µg/mL; 1000 µg/mL; 562 µg/mL; 300 µg/mL; 178 µg/mL; 100 µg/mL; dan
10 µg/mL.
b. Kontrol positif (Tablet tamoxifen)
Larutan kontrol positif menggunakan tamoxifen dari 20 tablet Nolvadex
yang tiap tabletnya mengandung 20 mg tamoxifen, ditimbang kemudian digerus
hingga homogen. Sebanyak 10 mg dilarutkan dalam DMSO 100 µL, didapatkan
larutan stok kontrol dengan konsentrasi 100.000 µg/ mL. Selanjutnya dibuat tujuh
seri kadar pengenceran yaitu 1585 µg/mL; 1150 µg/mL; 1000 µg/mL; 300 µg/mL;
178 µg/mL; 100 µg/mL; dan 10 µg/mL (Setiawati, dkk., 2009).
8. Uji Sitotoksik ekstrak etanol daun Lavender pada sel T47D
a. Perlakuan sel T47D
Sel T47D yang telah diinkubasi selama 24 jam dikeluarkan dari
inkubator dan dipindahkan menuju LAF (Laminar Air Flow), seluruh kegiatan uji
sitotoksik dilakukan didalam LAF yang sebelumnya telah diberi penyinaran UV
(Ultra Violet). Selanjutnya, seluruh media didalam well-plate dibuang dan
ditiriskan, lalu segera dipipet 100 µL sampel dari setiap seri kadar dan
dimasukkan kedalam lubang well-plate, dilakukan replikasi sebanyak tiga kali.
Didalam satu well-plate yang berisi 96 lubang diisi oleh sampel, kontrol sel,
kontrol positif (tablet tamoxifen). Selanjutnya, sel diinkubasi selama 24 jam
didalam inkubator dan setelah inkubasi dilakukan pengamatan pada sel yang telah
diberi perlakuan sampel dibawah mikroskop inverter, tidak semua lubang diamati,
hanya diambil beberapa lubang yaitu pada konsentrasi tertinggi, tengah dan
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
25
terendah, bentuk sel diamati dan diambil gambar dengan menggunakan kamera
digital.
b. Metode MTT
Seluruh reagen MTT dipersiapkan dengan cara mencampur 1 mL MTT
dengan 10 mL MK kedalam conical tube, digojog secara perlahan karena sangat
mudah berbuih. Selanjutnya, media yang terdapat pada sel T47D perlakuan
dibuang dengan membalikan plate 1800 diatas tempat pembuangan dengan jarak
10 cm kemudian tekan plate secara perlahan diatas tisu untuk meniriskan sisa
cairan. Larutan PBS dimasukkan sebanyak 100 µL kedalam semua sumuran yang
telah berisi sel untuk mencuci sisa media yang masih bercampur dengan sel,
kemudian buang PBS dengan cara membalik plate seperti perlakuan diatas.
Ditambahkan reagen MTT yang telah dipersiapkan sebelumnya sebanyak 100 µL
ke setiap sumuran, termasuk kontrol media, dilakukan inkubasi selama empat jam
didalam inkubator CO2. Setelah itu, diamti kondisi sel dan formazan yang
terbentuk dibawah mikroskop inverted, jika formasan telah terbentuk,
ditambahkan 100 µL SDS 10% dalam 0,1N HCl. Plate dibungkus menggunakan
alumunium foil dan diinkubasi pada tempat gelap selama semalam pada suhu
kamar.
(American Type Culture Collection, 2011).
c. ELISA Reader
ELISA reader dihidupkan dan ditunggu hingga proses regressing selesai.
Pembungkus plate dan tutup plate dibuka kemudian plate dimasukkan kedalam
ELISA reader, absorbansi yang diperoleh dibaca pada λ= 595 nm, ditekan tombol
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
26
start. ELISA reader dimatikan, kertas hasil pembacaan menggunakan ELISA
reader di fotocopy dan ditempel pada logbook. Data yang diperoleh diolah untuk
mendapatkan nilai IC50 dengan membuat grafik absorbansi versus konsentrasi
menggunakan program Microsoft Excell serta dilanjutkan dengan program R.
Persentase sel yang hidup dihitung dengan rumus:
(!"#$%&'"#(!!"#$%&'%(!!!"#$!%&"'!!"#$%"&!!"#$%)
Persentase sel hidup = (!"#$%"&'#(!!"#$%"&!!"#!!"#$%"&'#(!!"#$%"&!!"#$%) X 100%
(Doyle dan Griffiths, 2000).
9. Uji apoptosis Annexin V Fluos
a. Perlakuan sel
Penanaman sel T47D dilakukan pada 6 well-plate, tiap sumuran diisi
dengan 2 mL. Jumlah sel sekitar lima ratus ribu hingga satu juta sel. Diinkubasi
selama 24 jam didalam inkubator CO2. Selanjutnya, plate sel yang telah
diinkubasi diambil dan dimasukkan dalam LAF, seluruh media dalam sumuran
disedot menggunakan micropipet dan dibuang. Selanjutnya dicuci PBS sebanyak
satu kali, PBS disedot kembali menggunakan micropipet. Sampel pada
konsentrasi IC50 dimasukkan dalam well-plate sebanyak 2 mL. Kemudian
diinkubasi selama 24 jam.
b. Pra Perlakuan Annexin V Fluos
Well-plate yang telah diinkubasi dengan sampel diambil dan disiapkan
conical tube untuk memindahkan media yang ada pada well-plate kedalam
conical tube.sesuai dengan jenis masing- masing sampel yang ada, termasuk
kontrol sel. Well-plate yang telah kosong dicuci menggunakan PBS sebanyak 1
mL. Kemudian, PBS ditarik kembali menggunakan micropipet dan dimasukkan
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
27
ke dalam conical tube yang sesuai dengan tiap sampel. Selanjutnya, dimasukkan
tripsin kedalam well-plate sebanyak 200 µL, diinkubasi selama 3 menit, dan
diamati menggunakan mikroskop hingga terlihat bentuk bulat transparan yang
menunjukkan sel T47D. Ditambahkan MK sebanyak 1 mL kedalam plate, lalu
disedot kembali dan ditampung pada conical tube. Dilakukan sentrifuge pada
conical tube selama 4 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan yang
terbentuk dibuang kemudian ditambahkan PBS dingin sebanyak 1 mL. Dilakukan
resuspensi dan 1 mL cairan di dalam conical tube dipindahkan kedalam eppendorf
1 mL. Eppendorf disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm.
c. Pembuatan reagen Annexin V Fluos
Eppendorf dibungkus dengan alumunium foil, diambil 550 mL buffer
dan dimasukkan dalam eppendorf, ditambahkan reagen Annexin V Fluos 10 µL
lalu di vortex dan ditambahkan reagen Pi 10 µL, di vortex kembali. (Setiap 100
µL larutan uji digunakan 2 µL reagen Annexin V Fluos dan 2 µL reagen Pi).
d. Perlakuan sampel dengan reagen Annexin V Fluos
Supernatan pada sampel dibuang dan disisakan endapan yang terbentuk,
ditambahkan 100 µL reagen Annexin V Fluos yang telah dibuat kedalam endapan
sampel. Dilakukan inkubasi selama 10 menit dalam ruang gelap (laci).
Ditambahkan buffer 300 µL didalam eppendorf kemudian dilakukan analisis.
(Roche, 2008).
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
28
10. Imunositokimia
a. Perhitungan sel
Sel yang berada di dalam cawan petri diberi MK hingga memenuhi
permukaan cawan. MK diambil dan dimasukkan dalam conical tube. Cairan sel
diambil sedikit dan dituang diatas kaca preparat untuk menghitung jumlah sel.
Kaca preparat diletakan diatas Haemositometer (alat penghitung sel), kemudian
diamati menggunakan mikroskop inverter perbesaran 10 kali dan dilakukan
penghitungan dengan bantuan counter. Sel sudah sesuai dengan kriteria apabila
jumLahnya antara minimal 50.000- 100.000 sel, jika hasil perhitungan sel sudah
sesuai maka dilanjutkan dengan preparasi sel tersebut. Dimasukka 5 mL MK
kedalam conical tube yang baru dan ditambahkan 1,25 mL sel dari conical tube
awal kedalam conical tube yang berisi 5 mL MK.
b. Subkultur sel
Cover slip dimasukkan ke dalam well plate sesuai dengan jumlah sampel
dan kontrol yang digunakan. Campuran MK dan sel yang ada di conical tube
dimasukkan pada 24 well-plate yang telah diisi coverslip sebanyak 1 mL. Inkubasi
dilakukan selama 24 jam didalam inkubator CO2.
c. Perlakuan
MK yang ada di dalam well plate disedot kemudian diisi dengan sampel
sebanyak 1 mL. Di dalam well plate juga diberi kontrol sel, kontrol positif, dan
kontrol negatif.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
29
d. Perlakuan imunositokimia
Coverslip dipindahkan diatas kaca preparat dengan bantuan pinset dan
jarum agar tidak merusak sel dan peletakan coverslip juga harus tepat, tidak boleh
terbalik. Pada ujung kaca preparat diberi label yang dilapisi dengan selotip agar
tidak lepas atau sobek saat diberi perlakuan. Kaca preparat dipindahkan pada
tempat kayu untuk memudahkan memberi reagen imunositokimia. Mula–mula
dilakukan pencucian dengan PBS sebanyak dua kali dengan cara menggenangi
coverslip yang ada diatas kaca preparat dengan PBS yang diambil menggunakan
micropipet (asal tergenang). PBS ditarik atau disedot kembali dengan
menggunakan micropipet yang berbeda, hal ini dilakukan dengan hati- hati agar
coverslip tidak terjatuh. Lalu dilakukan fiksasi metanol selama 10 menit, fiksasi
metanol juga dilakukan dengan cara yang sama dengan pencucian PBS yaitu
dengan menggenangi coverslip dengan metanol dan menarik kembali setelah 10
menit. Selanjutnya, dilakukan pencucian PBS dua kali dan akuades dua kali, lalu
dibuat campuran H2O2 : H2O = 1:9, campuran diambil sebanyak 100 µL untuk
diteteskan diatas coverslip, didiamkan selama 10 menit kemudian ditarik/disedot
kembali menggunakan micropipet yang berbeda. Kemudian, preparat dicuci PBS
sebanyak dua kali. Larutan bloking ditambahkan 100 µL, didiamkan 10 menit dan
kembali disedot. Antibodi primer ditambahkan sebanyak 50 µL dan didiamkan
selama satu jam, antibodi primer dan diratakan dipermukaan coverslip, seluruh
coverslip diberi antibodi primer kecuali kontrol negatif. Cairan disedot kemudian
dibuang. PBS ditambahkan untuk pencucian. Antibodi sekunder universal
ditambahkan sebanyak 100 µL dan didiamkan selama 20 menit, cairan disedot dan
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
30
kemudian dibuang. Streptavidin (HRP) ditambahkan sebanyak 100 µL, didiamkan
selama 10 menit, cairan disedot kemudian dibuang. Proses pencucian PBS
dilakukan sebanyak dua kali. Sebanyak 100 µL DAB ditambahkan dan didiamkan
selama 2 menit. Akuades ditambahkan untuk mencuci sebanyak dua kali, disedot
kemudian dibuang. Perwarna hematoxilin ditambahkan sebanyak 100 µL dan
didiamkan selama 5 menit, kembali dicuci akuades dua kali hingga bersih dan
warna biru dari pewarna hilang. Etanol absolut ditambahkan dengan cara
menggenangi preparat dan langsung ditarik kembali kemudian digenangi xylol
dan kembali langsung ditarik. Coverslip yang ada di atas preparat dikeringkan
selama beberapa menit. Setelah kering, coverslip ditempel diatas object glass
dengan cara memberikan setetes etilen dan diaratakan di atas coverslip. Preparat
imunositokimia dapat diamati menggunakan mikroskop cahaya.
(Javois, 1999).
!
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanol daun
L. officinalis Chaix terhadap viabilitas sel kanker payudara T47D dengan melihat
aktivitas ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix dalam menekan ekspresi ERα
serta untuk mengetahui IC50 ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix yang
berpengaruh pada apoptosis sel kanker payudara T47D. Persentase viabilitas sel
diketahui dari uji in vitro menggunakan MTT assay, deteksi apoptosis dilakukan
dengan metode Annexin V Fluos dan dilanjutkan dengan uji imunositokimia
untuk melihat ekspresi antigen spesifik pada sel terhadap estrogen-α secara
molekuler. Tamoxifen digunakan sebagai kontrol positif karena tamoxifen telah
diketahui dapat dipergunakan sebagai obat dalam terapi hormonal bagi penderita
kanker payudara.
A. Penyiapan Ekstrak
Penelitian ini menggunakan sampel berupa tanaman yaitu daun L.
officinalis Chaix. Determinasi daun L. officinalis Chaix pada penelitian ini
bertujuan untuk membuktikan bahwa tanaman yang diguakan dalam penelitian ini
memang benar tanaman yang dimaksud, yaitu L. officinalis Chaix. Bagian
tanaman yang digunakan untuk determinasi merupakan bagian daun, hasil
determinasi dibuktikan dengan adanya surat keterangan yang dikeluarkan
langsung oleh unit determinasi di Laboratorium Biologi Farmasi. Hasil
31
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
32
determinasi menyatakan bahwa daun yang digunakan merupakan daun L.
officinalis Chaix (Lampiran 1).
Tahap selanjutnya dilakukan proses ekstraksi menggunakan metode
maserasi dengan pelarut etanol 70% dan diharapkan seluruh kandungan zat aktif
di dalam daun L. officinalis Chaix dapat tersari. Maserasi merupakan cara
ekstraksi yang sederhana, yaitu dengan merendam serbuk simplisia dalam cairan
penyari, pada percobaan ini dilakukan maserasi selama 48 jam agar diperoleh
rendemen ekstraksi dengan kadar yang tinggi. Prinsip maserasi adalah masuknya
cairan penyari kedalam rongga sel yang mengandung zat aktif, sehingga terjadi
perbedaan konsentrasi antara zat terlarut didalam sel dengan yang diluar sel maka
larutan didalam sel didesak keluar dan hal ini terjadi berulang kali hingga terjadi
keseimbangan konsentrasi antara larutan yang ada di dalam dan di luar sel. Hasil
maserasi disaring untuk memisahkan bagian padat yang mengendap dengan
bagian cairan, bagian cairan dilakukan pemekatan dengan bantuan rotary
evaporator untuk menguapkan larutan penyari (etanol 70%) sehingga diperoleh
hasil ekstraksi yang pekat, evaporasi dilakukan selama 5 menit karena jumlah
cairan hasil ekstraksi sedikit, sehingga hanya memerlukan waktu singkat untuk
menguapkan. Pemekatan dilanjutkan kembali menggunakan waterbath untuk
menguapkan sisa–sisa etanol 70% yang masih ada.
B.
Uji sitotoksik ekstrak daun L.officinalis Chaix pada sel kanker
payudara T47D dengan metode MTT
Uji sitotoksik bertujuan untuk mengetahui potensi ketoksikan suatu
senyawa dengan parameter penurunan viabilitas sel. Metode MTT merupakan
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
33
metode kolorimetrik berdasarkan pada perubahan garam tetrazolium [3-(4,5-dimet
iltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromide] (MTT) menjadi formazan dalam
mitokondria yang aktif pada sel hidup. MTT diabsorbsi oleh sel hidup dan
dipecah oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium yang termasuk dalam respirasi
mitokondria, sehingga aktif menjadi bentuk formazan (Doyle dan Griffiths, 2000).
Intensitas warna ungu dan jumlah kristal formazan yang terbentuk proporsional
dengan viabilitas sel. Kemudian absorbansi dapat diukur menggunakan ELISA
reader, hasil pembacaan ELISA terdapat pada Lampiran 3 dan 4.
!
Gambar 8. Kristal formazan (A) kontrol sel; (B) perlakuan ekstrak etanol daun L.officinalis
Chaix
Ilustrasi gambar di atas merupakan contoh kristal formazan yang
terbentuk pada kontrol sel dan perlakuan ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix.
Intensitas warna ungu dan jumlah kristal formazan yang terbentuk proporsional
dengan jumlah sel yang hidup, pada kontrol sel terbentuk kristal formazan lebih
banyak daripada perlakuan, hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun
L.officinalis Chaix mampu menghambat sel kanker payudara T47D. Namun perlu
gambaran terkait sensitivitas ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix terhadap sel
kanker payudara T47D sehingga dapat diperoleh suatu evaluasi mengenai
kekuatan sitotoksik ekstrak dan pengaruhnya terhadap viabilitas sel T47D.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
34
Sensitivitas ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix terhadap sel kanker
payudara T47D diukur melalui nilai IC50, nilai IC50 menunjukkan konsentrasi
ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix yang mampu mematikan setengah dari
populasi sel T47D yang ada. Pada penelitian ini diperoleh nilai IC50 232,86 µg/mL
yang dihitung secara statistik menggunakan program R, program R merupakan
software statistik seperti halnya SPSS untuk analisis regresi namun memiliki
kemampuan yang lebih baik dalam mengolah dan menganalis data, hal ini seperti
yang dikemukakan oleh Darinus (2002). Hasil IC50 menunjukkan bahwa ekstrak
etanol daun L. Officinalis Chaix memiliki sifat sitotoksik yang cukup lemah
dibandingkan dengan nilai IC50 tamoxifen yaitu 13,98 µg/mL. Menurut
Kamuhabwa (2000), suatu ekstrak dikatakan memiliki efek sitotoksik terhadap sel
kanker payudara apabila memiliki nilai IC50 ≤ 100 µg/mL, namun ekstrak etanol
daun L. officinalis Chaix tetap memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai
antikanker karena dalam penelitian Machana (2011) menyebutkan bahwa ekstrak
dikatakan tidak aktif sebagai antikanker apabila memiliki nilai IC50 > 500 µg/mL.
Nilai IC50 yang kurang sensitif diduga karena kompleksitas senyawa yang
terkandung didalam ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix.
Pengaruh ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix terhadap viabilitas sel
kanker payudara T47D dapat diketahui dari suatu kurva sigmoid yang
menunjukkan hubungan persentase viabilitas sel versus log konsentrasi ekstrak
etanol daun L.officinalis Chaix kemudian dibandingkan dengan kurva viabilitas
sel dari tamoxifen. Berikut merupakan hasil pengukuran viabilitas sel kanker
payudara T47D dengan perlakuan ekstrak etanol daun lavender.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
35
Tabel I. Viabilitas sel kanker payudara T47D dengan perlakuan ekstak etanol daun
lavender.
Konsentrasi
% Viabilitas Sel
(µg/mL)
V1
V2
V3
1585
1,428
3,973
1,089
1150
2,446
3,125
1,937
1000
-0,269
-0,608
-0,438
300
3,973
7,196
12,965
178
98,982 108,483 111,198
100
111,876 119,171 117,984
10
92,874 115,100 114,421
x,ˉ ± SD
2,163 ± 1,576
2,502 ± 0,596
-0,438 ± 0,170
8,045 ± 4,,556
106,22 ± 6,414
116,344 ± 3,914
107,465 ± 12,640
Dari hasil yang disajikan diatas, maka dapat diketahui bahwa pemberian
ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix berpengaruh pada viabilitas sel kanker
payudara T47D, semakin meningkat konsentrasi ekstrak maka viabilitas sel
semakin menurun. Salah satu kandungan senyawa alam yang mampu
mempengaruhi viabilitas sel kanker payudara T47D adalah monoterpen.
Monoterpen merupakan senyawa alam yang terkandung dalam L. officinalis Chaix
dengan kadar tertinggi, senyawa ini memegang peranan penting sebagai agen
kemopreventif dan memiliki aktivitas terapi pada tikus yang terinduksi sel kanker
payudara T47D, hal ini dipaparkan oleh Satomi dkk. (1999) pada penellitiannya.
Monoterpen juga mampu menghambat pertumbuhan sel kanker serta menginduksi
apoptosis. Data yang diperoleh dibandingkan dengan perlakuan tamoxifen.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
36
Tabel II. Viabilitas sel kanker payudara T47D dengan perlakuan tamoxifen.
Konsentrasi
% Viabilitas Sel
(µM)
V1
V2
V3
1000
4,233
5,163
4,698
100
1,910
2,375
2,530
10
107,537 106,763
102,891
1
105,834 100,568
92,514
0,1
103,210 105,524
104,440
0,01
88,952 100,258
93,908
x,ˉ ± SD
4,698 ± 0,465
2,272 ± 0,322
105,731 ± 2,489
99,639 ± 6,708
104,388 ± 1,162
94,373 ± 5,667
Data tamoxifen menunjukkan hasil yang sama, yaitu bahwa semakin
tinggi konsentrasi tamoxifen, persentase viabilitas sel kanker payudara T47D
mengalami penurunan. Tamoxifen tergolong dalam terapi hormonal yang
digunakan pada pasien penderita kanker payudara, mekanisme aksi tamoxifen
diketahui dapat melalui dua aksi, yaitu 1) melakukan kompetisi dengan 17βestradiol (E2) pada lokasi reseptor untuk memblok peran promosi E2 pada kanker
payudara; dan 2) dengan mengikat DNA setelah aktivasi metabolik (Yu dan
Bender, 2001). Tamoxifen merupakan senyawa yang memiliki aktivitas
antiestrogen dan menjadi inhibitor kompetitif bagi estrogen yang berikatan pada
reseptornya (Osborne, 1998). Apabila tamoxifen berikatan dengan ERα maka
ligand-activated transcription factor yang melakukan regulasi transkripsi pada
nukleus berikatan dengan Estrogen Response Element (ERE) dan mempengaruhi
aktivitas protein coregulator sehingga proliferasi dari estrogen dapat dihambat
(Deroo dan Korach, 2006)
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
37
Gambar 9. Morfologi sel T47D (A) kontrol sel ; (B) ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix
1585 µg/mL; (C) ekstrak lavender 300 µg/mL; (D) ekstrak lavender 10 µg/mL; (E) tamoxifen
(sel hidup:
;sel mati:
)
Morfologi sel kanker payudara T47D diamati dibawah mikroskop
inverter dan memberikan gambaran bahwa sel yang mati memiliki warna lebih
gelap dan berbentuk bulat, hal ini terjadi karena sel kehilangan sitoplasma akibat
rusaknya membran sel, sehingga sel tidak dapat meneruskan cahaya dari
mikroskop. Sedangkan untuk sel yang masih hidup ditunjukkan dengan bentuk
yang lebih lonjong dan warna terang.
Perubahan morfologi sel perlu dianalisis lebih lanjut untuk mengetahui
kemampuan ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix dalam menginduksi
apoptosis sel kanker payudara T47D pada konsentrasi IC50.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
C.
38
Uji Apoptosis Ekstrak Etanol Daun L. Officinalis Chaix dengan
Metode Annexin V Fluos
Metode Annexin V Fluos digunakan dalam penelitian ini untuk
mengetahui jalur kematian sel akibat pemberian ekstrak etanol daun L. Officinalis
Chaix. Metode ini dipilih karena dapat memberikan hasil kuantitatif yang cepat
untuk mengetahui jumlah sel yang mengalami apoptosi melalui flow cytometer
dan dapat membedakan sel yang mengalami nekrosis maupun sel yang mengalami
apoptosis menggunakan reagen Annexin V Fluos dan Propidium Iodin (Pi).
Mekanisme kematian sel dapat dibagi menjadi dua yaitu melalui mekanisme
apoptosis dan nekrosis, proses kematian sel melalui mekanisme apoptosis penting
digunakan sebagai indikasi selektifitas ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix
sebagai agen kemopreventif. Mekanisme kematian sel dapat dilihat dari
persentase total sel di setiap kuadran dengan menggunakan metode Annexin V
Fluos. Hasil Annexin V Fluos kemudian dianalisis menggunakan alat bernama
FACSCalibur (Gambar 10)
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
Gambar 10. Hasil pembacaan flow cytometer: (A) Kontrol sel; (B) Ekstrak etanol daun
L.officinalis Chaix; (C) Tamoxifen
Tabel III. Persentase jumlah sel kanker payudara T47D pada setiap kuadran
Kuadran I
(Sel hidup)
Kuadran II
(Early
apoptosis)
Kuadran III
(Late
apoptosis)
Kuadran IV
(Nekrosis)
!
Kontrol sel
Ekstrak etanol
daun L.officinalis
Chaix
Tamoxifen
91,85%
5,51%
4,55%
6,24%
25,27%
65,61%
1,75%
52,83%
27,62%
0,21%
16,62%
2,38%
39
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
40
Pada kuadran satu dengan warna hijau (Gambar 10) menunjukkan
jumlah sel yang hidup, kuadran dua dengan warna kuning menunjukkan jumlah
sel yang mengalami apoptosis tahap awal/early apoptosis, kuadran tiga dengan
warna merah muda memberikan gambaran mengenai jumlah sel yang telah
mengalami apoptosis, sedangkan untuk kuadran empat menunjukkan total sel
yang mengalami nekrosis. Sistem pembagian kuadran mengacu pada penelitian
Nurzijah dkk. (2012).
Gambaran hasil flow cytometer mengindikasikan bahwa kematian sel
kanker payudara T47D yang disebabkan karena pemberian ekstrak etanol daun L.
Officinalis Chaix mengarah pada mekanisme apoptosis, karena sebanyak 25, 27%
dari total sel menempati kuadran dua yang menandakan telah terjadi tahapan
apoptosis awal, sedangkan sel yang mengalami late apoptosis sebanyak 52,83%
dari total sel, sehingga total sel yang mengalami apoptosis adalah sebesar 78,10%
dari total sel. Jalur pemacuan apoptosis oleh ekstrak etanol daun L. Officinalis
Chaix diprediksikan melalui jalur intrinsik karena dalam penelitian yang
dilakukan oleh Liston dkk. (2013), monoterpen dapat mempengaruhi interaksi
interseluler dalam menginduksi sel kanker. Pada jalur intrinsik, protein caspase 3
memiliki peran aktif dalam memecah berbagai substrat, diantaranya enzim DNA
untuk mengaktifkan caspase yang lain yang memberikan amplifikasi terhadap
kerusakan seluler, adanya kerusakan seluler meningkatkan ekspresi dari protein
p53 yang menyebabkan terjadinya apoptosis.
Kedua perlakuan baik tamoxifen maupun ekstrak etanol daun L.
Officinalis Chaix menunjukkan bahwa pada konsentrasi IC50 yang digunakan, sel
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
41
yang mati melebihi 50%, hal ini dapat diakibatkan karena waktu inkubasi sel yang
melebihi 24 jam, sehingga banyak sel yang telah mengalami kematian sebelum
dilakukan uji Annexin V Fluos.
Setelah dilakukan uji Annexin V Fluos terhadap ekstrak etanol daun L.
Officinalis Chaix, analisis efek antikanker dilanjutkan menggunakan metode
imunositokimia untuk mengetahui interaksi molekuler ekstrak etanol daun L.
Officinalis Chaix terhadap ERα.
D.
Uji Ekspresi ERα menggunakan Metode Imunositokimia
Metode imunositokimia digunakan untuk mengetahui adanya ekspresi
suatu protein spesifik dengan menggunakan antibodi spesifik yang berikatan
dengan protein, pada penelitian ini antibodi primer yang digunakan adalah
estrogen alfa. Antibodi ini berikatan dengan reseptor ERα yang ada di sel kanker
payudara T47D sehingga sel tersebut dapat mengekspresikan reseptor estrogen
dengan memberikan warna coklat ketika diberi pewarna DAB dari reagen
imunositokimia.
Pada penelitian ini digunakan metode imunositokimia indirect (tidak
langsung) yang dapat memberikan hasil lebih sensitif karena antibodi primer
dikenali oleh antibodi sekunder yang berikatan kovalen dengan marker (sebagai
penanda) sehingga membuatnya mudah terdeteksi (Albert, dkk., 1994).
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
42
Gambar 11. Morfologi ekspresi estrogen sel T47D (A) Kontrol sel dengan pemberian
antibodi; (B) Kontrol sel tanpa antibodi; (C) perlakuan ekstrak etanol daun L. Officinalis
Chaix pada IC50; (D) perlakuan tamoxifen
(mengekspresikan ERα:
; tidak mengekspresikan ERα:
)
Berdasarkan pengamatan, kontrol sel dengan pemberian antibodi
memiliki sel dengan warna sitoplasma coklat (bagian pinggir), warna coklat pada
sel terjadi karena pewarna DAB yang bereaksi dengan H2O2 dari HRP, sehingga
menimbulkan warna coklat, sedangkan HRP berikatan pada antibodi primer dan
antibodi sekunder yang aktif bekerja pada ERα. Sedangkan pada pengamatan sel
dengan pemberian ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix memberikan warna
biru atau ungu pada sel, hal ini dikarenakan ekstrak etanol daun L. officinalis
Chaix menghambat ikatan antibodi primer (estrogen alfa) dengan ERα pada sel
T47D, sehingga ERα tidak diekspresikan dan pewarna Mayer yang memberikan
warna ungu pada sel. Selanjutnya distribusi ekspresi ERα dapat diketahui dan
dihitung menggunakan metode scoring system. Metode ini memberikan gambaran
terkait level ekspresi ERα dengan menghitung jumlah sel T47D yang
mengekspresikan ERα dari tiga lapang pandang yang berbeda saat dilakukan
pengamatan di bawah mikroskop (Vang, dkk., 2006). Mekanisme perhitungan sel
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
43
dilakukan secara blind dengan tiga orang pengamat independen untuk
menghindari subyektivitas. Proses perhitungan dibandingkan dengan kontrol sel
dengan antibodi dan tanpa antibodi sehingga perbedaan warna antara sel yang
mengekspresikan ERα dan tidak dapat nampak dengan jelas.
Tabel IV. Perhitungan ekspresi ERα pada kontrol sel dengan dan tanpa antibodi (metode
scoring system) menurut Vang dkk. (2006)
Level ekspresi ERα
Pengamat Kontrol sel dengan antibodi
Kontrol sel tanpa antibodi
L1
L2
L3
L1
L2
L3
1
175
101
177
0
0
0
2
175
101
177
0
0
0
3
175
101
177
0
0
0
Total sel
%
175
101
177
514
365
193
100%
100%
100%
0%
0%
0%
Level
4+
4+
4+
0
0
0
!
Data perhitungan kontrol sel tanpa antibodi menunjukkan bahwa ERα
tidak diekspresikan karena ERα pada sel T47D tidak berikatan dengan estrogen
alfa sehingga pewarna Mayer berikatan dengan ERα dan memberikan warna biru
atau ungu pada sitoplasma sel T47D. Sedangkan pada kontrol sel dengan antibodi
memberikan level ekspresi ERα bernilai 4+, hal ini menunjukkan bahwa antibodi
primer yang diberikan pada sel T47D dapat berikatan seluruhnya, sehingga ERα
diekspresikan sepenuhnya.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
44
Tabel V. Perhitungan ekspresi ERα pada perlakuan dengan ekstrak etanol daun L.
Officinalis Chaix dan tamoxifen (metode scoring system) menurut Vang dkk. (2006).
Level ekspresi ERα
Ekstrak etanol daun
Pengamat
Tamoxifen
L.officinalis Chaix
L1
L2
L3
L1
L2
L3
1
0
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
0
Total sel
%
165
115
121
56
80
63
0%
0%
0%
0%
0%
0%
Level
0
0
0
0
0
0
metode
scoring
Hasil
tabel
perhitungan
menggunakan
system
menunjukkan bahwa level ekspresi ERα pada sel T47D dengan pemberian ekstrak
etanol daun L. officinalis Chaix adalah 0 (nol), hal ini mengindikasikan bahwa
seluruh ERα telah diduduki oleh senyawa yang terkandung pada ekstrak etanol
daun L. officinalis Chaix dan menandakan bahwa kematian sel tergolong dalam
ER-dependent dimana kematian sel dikendalikan oleh ERα. Hal yang sama juga
terjadi pada pemberian tamoxifen terhadap sel kanker payudara T47D, skala level
ekspresi yang ditimbulkan akibat pemberian tamoxifen adalah 0 (nol), karena
tamoxifen berperan sebagai inhibitor kompetitif bagi estrogen alfa yang berikatan
dengan ERα, sehingga tamoxifen dapat menghambat ekspresi ERα termasuk
faktor pertumbuhan dan faktor angiogenik yang disekresikan oleh sel kanker dan
mempengaruhi proses pertumbuhan sel kanker, hal ini dinyatakan dalam
penelitian yang dilakukan oleh Osborne (1998).
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
45
Pengujian ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix pada sel kanker
payudara T47D memberikan hasil bahwa ekstrak tersebut telah mampu menekan
ekspresi ERα dengan mekanisme kematian sel apoptosis. Senyawa yang berperan
langsung dalam mekanisme tersebut dapat diketahui dengan melakukan sebuah
pengujian lebih lanjut untuk mengkonfirmasi kandungan-kandungan yang
terdapat dalam ekstrak etanol daun L.Officinalis Chaix. Salah satu penelitian yang
pernah dilakukan oleh Nevein dkk. (2014) menunjukkan bahwa kandungan
tertinggi dalam L. Officinalis Chaix adalah monoterpen dan penelitian lain yang
serupa pernah dilakukan oleh Saadatian dkk. (2013) yang menganalisis
kandungan senyawa dalam ekstrak etanol 70% L. Officinalis Chaix menggunakan
Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC-MS), namun senyawa yang
teridentifikasi senyawa volatil, sehingga perlu adanya metode analisis lain seperti
menggunakan
High
Performance
Liquid
Chromatography
(HPLC)
dan
kromatografi lapis tipis (KLT).
Menurut penelitian yang dilakukan oleh Crowell (1997), monoterpen
memiliki aktivitas kemopreventif pada kanker payudara dengan menghambat
proses karsinogenesis pada fase inisiasi maupun promosi atau progesi. Fase
inisiasi merupakan tahapan awal dalam proses karsinogenesis, senyawa inisiator
tidak reaktif terhadap DNA, namun diubah melalui enzim pemetabolime obat
didalam tubuh yang dapat menyebabkan mutasi DNA (Devi, 1989). Apabila
proses karsinogenesis pada proses inisiasi dapat dihambat, maka perubahan
genetik DNA yang permanen akibat ikatan irreversible senyawa inisiator dapat
dicegah dan DNA dapat menghasilkan kode genetik yang sesuai.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
46
Selain itu, monoterpen juga memiliki aktivitas molekuler yang berpotensi
untuk mendasari index terapetik yang positif, pada penelitian Gould (1997)
dikatakan bahwa monoterpen mampu menghambat isoprenilasi small G protein,
isoprenilasi protein memegang peranan penting dalam fungsionalisasi protein
yang mampu memacu terjadinya kanker (McTaggart, 2006). Penghambatan ini
dapat mengubah sinyal transduksi dan mengakibatkan ekspresi gen yang berubah,
hasil dari ekspresi gen yang baru telah diidentifikasi mampu menurunkan regresi
dari karsinoma kelenjar payudara.
!
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A.
Kesimpulan
Ekstrak etanol daun lavender mempunyai efek sitotoksik pada sel kanker
payudara T47D serta menginduksi apoptosis dengan nilai IC50 sebesar 232,86
µg/mL dan mampu menekan ekspresi protein ERα.
B. Saran
1.
Perlu dilakukan proses pengujian lebih lanjut untuk mengetahui senyawasenyawa yang terkandung di dalam ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix.
2.
Potensi ketoksikan dari ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix perlu
ditingkatkan dengan mengujikannya pada model sel kanker payudara lain.
3.
Penelitian
dilanjutkan
dengan
membuat
suatu
formulasi
sediaan
menggunakan ekstrak etanol daun Lavandula officinalis Chaix sebagai obat
kemopreventif.
47
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
48
DAFTAR PUSTAKA
A
Adjo, J., dan Lin, S., 2012, Comparison of Functional Proteomic Analyses of
Human Breast Cancer Cell Lines T47D and MCF7, Plos One, 7(2), 1-4.
Alberts, B. dkk.. 1994. Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing, New
York, 186-188.
American Type Culture Collection, 2011, MTT Cell Proliferation Assay,
University Boulevard, www.atcc.org, diakses tanggal 20 Februari 2015.
Bardon, S., Picard, K., dan Martel, P., 2002, Monoterpene Inhibit Cell Growth,
Cell Cycle Progession, and Cyclin D1 Gene Expression in Human Breast
Cancer Cell Lines, Nutrition and Cancer, 32(1), 1-7.
Chu, C., dan Kemper, K., 2001, Lavender Longwood Herbal Task Force,
http://www.mcp.edu/herbal/, diakses tanggal 12 Desember 2014.
Compston, J., 2001, Sex Steroids and Bone, APS, 81(1), 429.
Crowell, P., 1997, Monoterpenes in Breast Cancer Chemopreventive, Breast
Cancer Research anf Treatment, 46, 191- 197.
Deroo, B., dan Korach, K., 2006, Estrogen Receptors and Human Disease, JCI,
116 (3).
Darinus, O., 2002, Aplikasi software R dalam analisis regressi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.
Devi, U., 1989, Basics of Carcinogenesis, Health Administrator, 17 (1), 16- 24.
Doyle, A., dan Griffiths J.B., 2000, Cell and Tissue Culture: Laboratory
Procedures in Biotechnology, John Willey & Sons LTD, New York, 62- 64.
European Medicines Agency, 2011, Assessment report on Lavandula angustifolia
Mill., aetheroleum and Lavandula angustifolia Mill., flos, HMPC,16d(1).
Gould, M., 1997, Cancer Chemoprevention and Therapy by Monoterpenes,
Enviromental Health Perspectives, 105 (4), 977- 979.
Hajhashemi, V., Ghannadi, A., dan Sharif, B., 2003, Anti-inflammatory and
analgesic properties of the leaf extracts and essential oil of Lavandula
angustifolia Mill., Journal of Ethnopharmacology, 89(2003), pp. 67- 71.
Handayani, S., 2012, Selaginella Active Fractions Induce Apoptosis On T47d
Breast Cancer Cell, Indonesian J. Pharm., 23(1), 48-50.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
49
Hayashi dkk., 2003, The Expression and Function of Estrogen Receptor α and β in
Human Breast Cancer and its Clinical Application, Endocrine- Realted
Cancer, 10, 193- 202.
Hondermarck, H., 2003, Breast Cancer : When Proteomics Challenges Biological
Complexity, Molecular and Proteomics, 2, 281- 291.
Istvan, V., Haanen, C., Nakken, H., dan Reutelingsperger, C., 1995, A novel assay
for apoptosis Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on
early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V, Journal of
Immunological Methods, 1, 184.
!
Javois, L., 1999, Immunocytochemical Methods and Protocol 2nd Ed., Humana
Press, USA, 3-10.
Johnson, A., dkk., 2002, Molecular Biology of the Cell. 4th edition, Garland
Science, New York, 335.
Kamuhabwa, A., Nshimo, C., dan de Witte P., 2000, Cytotoxicity of some
medicinal plant extracts used in Tanzanian traditional medicine, J.
Ethnopharmacol, 70(2), 143- 149.
!
Karolina, H., dkk., 2010,! RMolecular subtypes of breast cancer are associated
with characteristic DNA methylation patterns, CBR, 12, 1- 16.
Kementrian Kesehatan Republik Indonesia, 2014, Hilangkan Mitos tentang
Kanker,
http://www.depkes.go.id/article/print/201407070001/hilangkanmitos-tentang-kanker.html, diakses tanggal 10 Mei 2014.
Lim, T., 2014, Lavandula angustifolia, Edible Medicinal and Non Medicinal
Plant, 8, 165-167.
Liston, B., dkk., 2003, Perillyl Alcohol as Chemopreventive Agent in NNitrosomethylbenzylamine-induced Rat Esophageal Tumorigenesis,
American Association for Cancer Research, 2399-2403.
Lumongga, F., 2008, Apoptosis, Departemen Patologi Anatomi Fakultas
Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan, 2-4.
Macey, M., 2007, Flow cytometry: Principles and Applications, Springer Science
& Business Media, Totowa, pp. 1-2.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
50
Machana, S., Weerapreeyakul, N., Barusrux, S., Nonpunya, A., Sripanidkulchai,
B., Thitimetharoch, T., 2011, Cytotoxic and apoptotic effects of six herbal
plants against the human hepatocarcinoma (HepG2) cell line, Chin
Med.,6(1), 1-8.
McTaggart, S., 2006, Isoprenylated Protein, Cell. Mol. Life. Sci, 63, 255- 267.
Mann, M., Cortez, V., and Vadlamudi, K., 2011, Epigenetics of Estrogen
Receptor Signaling: Role in Hormonal Cancer Progression and Therapy,
Cancers, 3, 1691- 1699.
National
Cancer
Institue,
2013,
Breast
Cancer
Treatment,
http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/breast/Patient/page1.
Diakses tanggal 1 juli 2014.
Neumann, B., dan Rossi, M., 2012, Effects of Exemestane on Two-Dimensional
and Three-Dimensional T47D Breast Cancer Cell Cultures, University of
New Haven Summer Undergraduate Research Fellowship 2012, 1-4.
Nevein, M., Gamil, M., dan Nagi, F., 2014, Phytochemical Studies and In Vivo
Antioxidant Activity of Two Lavandula Species (Lamiaceae) Against
Streptozotocin Induced Oxidative Stress in Albino Rats, JBPR, 4(3), 30-40.
Hurzijah, I., Putri, D., Rivanti, E., dan Meiyanto, E., 2012, Secang (Caesalpinia
sappan L.) Heartwood Ethanolic Extract Shows Activity as Doxorubicin
Co-chemotherapeutic Agent by Apoptosis Induction on T47D Breast Cancer
Cells, ISCC, 3(2), 377-384.
Osborne, K., 1998, Tamoxifen in the Treatment of Breast Cancer, The New
England Journal of Medicine, 339(22), 1609-1912.
Pilar,E., Bosch, A., Perez-Fidalgo, J., dan Lluch, A., 2012, Molecular biology in
breast cancer: Intrinsic subtypes and signaling pathways, J.CTRV, 38(2012),
698- 707.
Prusinowska, R., 2014, Composition, biological properties and therapeutic
effects of lavender (Lavandula angustifolia L.). A review, Hepo., 60 (2), 5662.
Pubchem,
2015,
Open
Chemistry
Database,
NIH,
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Linalool#section=Top, diakses
tanggal 19 Februari 2015.
Pubchem,
2015,
Open
Chemistry
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/8294,
Februari 2015.
!
Database,
NIH,
diakses tanggal 19
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
Pubchem,
2015,
Open
Chemistry
Database,
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/323#section=Top,
tanggal 19 Februari 2015.
Pubchem,
2015,
Open
Chemistry
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/64945,
Februari 2015.
51
NIH,
diakses
Database,
NIH,
diakses tanggal 19
PubMed
Health,
2014,
Breast
Cancer
Treatment,
PDQ,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/PMH0032825/, diakses tanggal
19 Februari 2015.
Rabiei, Z., dan Rafieian, M., 2014, Neuroprotective effect of pretreatment with
Lavandula officinalis ethanolic extract on blood- brain barrier permeability
in a rat stroke model, Asian Pac. J. Trop. Med,7 (1), 421- 426.
Rapper, S., Kamatou, G., Viljoen, A., dan Vuuren S., 2013, The In Vitro
Antimicrobial Activity of Lavandula angustifolia Essential Oil in
Combination with Other Aroma Therapeutic Oils, Evidence-Baed
Complementary and Alternative Medicine, 2013, 1- 10.
Richard, W., 2010, Immunocytochemistry: A Pratical Guide for Biomedical
Research, Springer, 1-2.
Richard, W., 2011, Control for Immunocytochemistry: An Update, JHC, 59(1), 612.
Roche, 2008, Apoptosis, Cytotoxicity, and Cell Proliferation, 4th edition, Roche
Diagnostic GmbH, German, pp. 38- 41.
Saadatian, M., Aghaei M., Farahpour, M., dan Balouchi, Z., 2013, Chemical
composition of Lavender (Lavandula Officinalis L.) Extraction Extracted by
Two Solvent Concentration, Glob. J. Med. Plant Res., 1(2), 214- 217.
Satomi, Y., Miyamoto,S., dan Gould, M., 1999, Induction of AP-1 activity by
Perillyl Alcohol in Breast Cancer Cells, Carcinogenesis, 20(10).
Setiawati, A., Riswanto, F., Yuliani, S., dan Istyastono, E., 2014, Anticancer
Activity of Mangosteen Pericarp Dry Extract Against MCF-7 Breast Cancer
Cell Line through Estrogen Receptor –α, Indonesian J. Pharm., 25 (3), 119124.
Strasser, A., O’ Connor, L., and Dixit, V., 2000, Apoptosis Signaling, Annurev.
Biochem., 69 (1), 217- 245.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
52
Terry, L., dkk., 2013, Cell Viability Assays, Eli Lilly & Company and the
National Center for Advancing Translational Sciences, San Fransisco.
Unites States Department of Agriculture, 2012, Lavandula officinalis Chaix,
Natural
Resources
Conservation
Service,
http://plants.usda.gov/core/profile?symbol=LAAN81. Diakses tanggal 10
Mei 2014.
Vang, R., dkk., 2006, Immunohistochemistry for estrogen and progesterone
receptors in the distinction of primary and metastatic mucinous tumors in
the ovary: an analysis of 124 cases, MPG, 19, 99-102.
World Health Organization, 2007, WHO Monograph on Selected Medicinal
Plants, volume 3, WHO Press, Geneva, 219- 225.
Yu, F., dan Bender W., 2001, The Mechanism of Tamoxifen in Breast Cancer
Prevention, Breast Cancer Reasearch, 3(1), 22.
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
LAMPIRAN
!
53
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
54
Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi sampel daun L. officinalis
Chaix
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
55
Lampiran 2. Perhitungan seri kadar ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix
dan tamoxifen
a. Ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix
10 mg + 100 µL DMSO = 100.000 µg/mL
Intermediet (int): 2000 µg/mL= 30 µL bulk + 1470 µL MK
C1 (1585 µg/mL)
= 396 µL (int) + 104 µL MK
C2 (1150 µg/mL)
= 288 µL (int) + 212 µL MK
C3 (1000 µg/mL)
= 250 µL (int) + 250 µL MK
C4 (300 µg/mL)
= 75 µL (int) + 425 µL MK
C5 (178 µg/mL)
= 45 µL (int) + 455 µL MK
C6 (100 µg/mL)
= 50 µL C3
+ 450 µL MK
C7 (10 µg/mL)
= 50 µL C7
+ 450 µL MK
b. Tamoxifen (2000 µM)
C1 (315 µg/mL)
= 79 µL bulk + 421 µL MK
C2 (175 µg/mL)
= 44 µL bulk + 456 µL MK
C3 (100 µg/mL)
= 25 µL bulk + 475 µL MK
C4 (60 µg/mL)
= 15 µL bulk + 485 µL MK
C5 (35 µg/mL)
= 9 µL bulk + 491 µL MK
C6 (20 µg/mL)
= 5 µL bulk + 445 µL MK
C7 (10 µg/mL)
= 50 µL C7
+ 450 µL MK
C8 (1 µg/mL)
= 50 µL C7
+ 450 µL MK
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
56
Lampiran 3. Tabel viabilitas sel T47D dengan pemberian ekstrak etanol
daun L. officinalis Chaix.
NO KONSENTRASI LOG+KONSENTRASI
1
2
3
5
6
7
8
1585
1150
1000
300
178
100
10
A1
0,105
0,111
0,095
0,12
0,68
0,756
0,644
V1
1,428
2,446
,0,269
3,973
98,982
111,876
92,874
!
3,200
3,061
3
2,477
2,250
2
1
ABSORBANSI
A2
A3
rata(rata
0,12
0,103
0,109
0,115
0,108
0,111
0,093
0,094
0,094
0,139
0,173
0,144
0,736
0,752
0,723
0,799
0,792
0,782
0,775
0,771
0,730
%)VIABILITAS)SEL
V2
V3
RATA(RATA)
3,973
1,089
2,163
3,125
1,937
2,502
,0,608
,0,438
,0,438
7,196
12,965
8,045
108,483
111,198
106,221
119,171
117,984
116,344
115,100
114,421
107,465
SD
1,576
0,596
0,170
4,556
6,414
3,914
12,640
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
Lampiran 4. Tabel viabilitas sel T47D dengan pemberian tamoxifen.
NO KONSENTRASI LOG*KONSENTRASI
1
2
3
4
5
6
1000
100
10
1
0,1
0,01
A1
0,122
0,107
0,789
0,778
0,761
0,669
V1
4,233
1,910
107,537
105,834
103,201
88,952
!
3
2
1
0
&1
&2
ABSORBANSI
A2
A3
rata(rata
0,128
0,125
0,125
0,11
0,111
0,109
0,784
0,759
0,777
0,744
0,692
0,738
0,776
0,769
0,769
0,742
0,701
0,704
%)VIABILITAS)SEL
V2
V3
RATA(RATA)
5,163
4,698
4,698
2,375
2,530
2,272
106,763
102,891
105,731
100,568
92,514
99,639
105,524
104,440
104,388
100,258
93,908
94,373
SD
0,465
0,322
2,489
6,708
1,162
5,667
57
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
Lampiran 5. Hasil analisis IC50 ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix
menggunakan program R.
!
58
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
Lampiran 6. Hasil analisis IC50 tamoxifen menggunakan program R.
!
59
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
60
Lampiran 7. Pengamatan tiga lapang pandang sel T47D dalam perhitungan
imunositokimia
A. Perlakuan esktrak etanol daun L. officinalis Chaix.
B. Perlakuan tamoxifen
C. Kontrol sel dengan pemberian antibodi
D. Kontrol sel tanpa antibodi
!
PLAGIAT
PLAGIATMERUPAKAN
MERUPAKANTINDAKAN
TINDAKANTIDAK
TIDAKTERPUJI
TERPUJI
61
BIOGRAFI PENULIS
Winda Sekarjati. Penulis lahir pada tanggal 28 Agustus
1992 di Yogyakarta dan merupakan anak kedua dari tiga
bersaudara, memiliki kakak bernama Datia Kurniawitri
dan adik bernama Pandu Yogaswara. Penulis lahir dari
pasangan suami- istri Sudarto dan Tatik Retno Wulan
dan telah menempuh pendidikan di SD Lempuyang
Wangi pada tahun 1999 sampai tahun 2005, SMP Negeri
5 Yogyakarta pada tahun 2005 sampai dengan tahun 2008, SMA Negeri 8
Yogyakarta pada tahun 2008 sampai dengan tahun 2011, dan melanjutkan
pendidikan di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma pada tahun 2011
sampai dengan tahun 2015. Selama menjadi mahasiswa, penulis mengikuti
beberapa kegiatan dan kepanitiaan, yaitu Program Kreativitas Mahasiswa bidang
Pengabdian Masyarakat lolos didanai DIKTI (2013), Inisiasi Fakultas Farmasi
yaitu TITRASI (Tiga Hari Temu Akrab Farmasi ) selama tiga tahun berturut- turut
(2012-2014) menjabat sebagai anggota seksi acara, koordinator seksi acara dan
steering committee (SC), Pelatihan Pengembangan Kepribadian Mahasiswa
(PPKM I) sebgai Co- Facilitator (2013), serta pernah mengambil pekerjaan part
time (paruh waktu) di PT. DAGADU ASELI DJOKDJA sebagai Gardep (2014).
!