G11ean_BAB II Bahan dan Metode

2
hingga Oktober 2010. Pengambilan sampel
dilakukan
di
Puskesmas
Cangkurawok,
Dramaga, Bogor. Analisis sampel feses
dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan
sampel darah di Laboratorium Fungsi Hayati
dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi,
FMIPA, Institut Pertanian Bogor.
BAHAN DAN METODE
Probandus
Probandus penderita diare yang diperoleh
selama proses sampling di Puskesmas
Cangkurawok, Dramaga, Bogor mulai tanggal
24 Februari 2010 hingga 10 Juni 2010 adalah
100 pasien penderita diare. Seluruh sampel yang
diperoleh telah melalui proses perizinan
(lampiran 1). Probandus penderita diare yang
diperoleh dikelompokkan berdasarkan tingkatan
usia, yaitu usia bayi (0-1 tahun) sebanyak 13
pasien, batita (1-3 tahun) 42 pasien, balita (3-5
tahun) 13 pasien, anak-anak (5-18 tahun) 13
pasien, dan dewasa (>18 tahun) sebanyak 19
pasien (Lampiran 2).
Metode
Pengambilan sampel
Feses
Feses diambil dengan cara usap rektum
(rectal swab) menggunakan cuttonbud steril
secara langsung pada lubang anal lalu
diinokulasikan ke dalam tabung berisi larutan
PBS (Phosphate Buffered Saline) steril dan
ditempatkan pada kondisi dingin (Adkins &
Santiago 1987).
Darah
Jari dibersihkan dengan alkohol kemudian
darah diambil pada bagian jari tengah atau
manis dengan menggunakan lancet. Darah
dimasukkan pada tabung hematokrit berheparin
(Marienfeld) dan disumbat dengan lilin pada
salah satu bagian.
Isolasi bakteri Salmonella
Sampel feses dalam larutan PBS dipipet
sebanyak 0.1 ml, kemudian disebar pada media
SSA (Salmonella Shigella Agar/Criterion) lalu
diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam.
Koloni berwarna hitam diambil sebanyak satu
lup kemudian digores kuadran pada media SSA
dan diinkubasi kembali pada suhu yang sama.
Koloni tunggal digoreskan pada media SSA
miring untuk disimpan.
Pewarnaan Gram
Sebanyak satu lup koloni hitam dioleskan
pada kaca objek yang telah ditetesi dengan
akuades. Olesan bakteri dikeringkan dengan
cara dilewatkan di atas bunsen. Olesan bakteri
diwarnai dengan pewarna crystal violet selama 1
menit lalu dibilas dengan akuades. Kemudian
dilanjutkan dengan tahap pewarnaan dengan
iodium gram selama 2 menit lalu dibilas
kembali dengan akuades. Olesan bakteri
digenangi dengan alkohol 95% kemudian
diwarnai kembali dengan safranin selama 30
detik lalu dibilas (Tortora et al. 2007). Setelah
kering, olesan bakteri diamati di bawah
mikroskop.
Identifikasi
Identifikasi dilakukan untuk mengetahui
keberadaan Salmonella menggunakan uji
biokimia mengacu pada Madigan et al. (2009),
yaitu uji MR (Methyl Red), VP (Voges
Proskauer), urease, H2S (Hidrogen Sulfida),
KCN (Kalium Sianida), indol, dan sitrat.
Uji MR dan VP
Koloni hitam dari media SSA diambil
sebanyak satu lup, kemudian diinkubasi dalam
media MR/VP (DifcoTM) pada suhu 370C selama
24 jam untuk MR dan 4 hari untuk VP. Setelah
diinkubasi, media diberi reagen methyl red
untuk MR dan α-napthol serta KOH untuk VP.
Uji Urease
Koloni hitam dari media SSA diambil
sebanyak satu lup, kemudian diinkubasi pada
media urease (DifcoTM) selama kurang lebih 4
hari.
Uji H2S
Koloni hitam dari media SSA diambil
sebanyak satu lup, kemudian digoreskan ke
media miring TSIA (Triple Sugar Iron
Agar/DifcoTM) lalu ditusuk menggunakan lup di
bagian bawah media. Inkubasi dilakukan pada
suhu 37oC selama 24 jam.
Uji KCN
Bakteri yang tumbuh pada media TSIA dari
uji H2S ditumbuhkan pada media TB (Terrifict
Broth), lalu diinkubasi selama 24 jam. Setelah
24 jam, sebanyak satu lup bakteri dipindahkan
ke media KCN lalu diinkubasi selama 24-48 jam
pada suhu 37oC.
Uji Indol
Koloni hitam pada media SSA diinkubasi
3
pada media tripton (BactoTM) pada suhu 37oC
selama 24 jam. Setelah diikubasi, media ditetesi
dengan reagen Kovac.
Uji Sitrat
Sebanyak satu lup koloni hitam pada media
SSA digores pada media simmon citrate
(Acumedia), lalu diinkubasi selama 24 jam pada
suhu 37oC.
Penghitungan nilai hematokrit
Darah dalam tabung hematokrit berheparin
disentrifugasi dengan sentrifuse (P Selecta Iso
9001) pada kecepatan 12000 rpm selama 5
menit. Nilai hematokrit dihitung dengan
membandingkan tinggi porsi sel darah merah
terhadap tinggi keseluruhan darah dalam bentuk
persen.
Penghitungan Jumlah Leukosit
Darah dikeluarkan dari tabung hematokrit
berheparin lalu dipipet dengan pipet leukosit
hingga batas 0.5. Darah diencerkan dengan
larutan Turk sampai batas skala 11 lalu dikocok
(Simmons 1976). Larutan diteteskan pada
hemasitometer kemudian dihitung butiranbutiran leukositnya.
Diferensiasi Leukosit
Perhitungan diferensiasi leukosit dilakukan
dengan metode apus/smear (Simmons 1976).
Apusan darah diwarnai dengan pewarna Giemsa
30% selama 30 menit, kemudian dihitung
masing-masing jenis leukosit/100 jenis leukosit
yang diamati.
HASIL
Hasil dari isolasi 100 sampel feses diperoleh
5 isolat membentuk koloni hitam pada media
SSA yang diduga sebagai koloni Salmonella
(Gambar 1). Pewarnaan gram dari kelima isolat
menunjukkan warna merah muda yang
menandakan bahwa kelima isolat tersebut
adalah bakteri gram negatif (Gambar 2).
Gambar 1 Koloni hitam yang diduga Salmonella
pada media SSA. Tanda panah:
koloni hitam.
Gambar 2 Warna merah muda bakteri gram
negatif setelah pewarnaan gram pada
koloni
hitam
yang
diduga
Salmonella. Tanda panah: bakteri
gram negatif.
Hasil uji biokimia pada kelima isolat koloni
hitam diperoleh 3 isolat yang teridentifikasi
Salmonella. Berdasarkan uji biokimia, sampel
feses yang teridentifikasi terdapat Salmonella
berasal pasien nomor 12, 21 dan 85 (Tabel 1).
Keberadaan Salmonella ditunjukkan dengan
hasil positif untuk uji MR, yaitu terbentuk
warna merah pada media setelah diinkubasi
selama 24 jam dan diberi indikator methyl red
(Gambar 3). Salmonella dapat menghasilkan
asam campuran (metilen glikon) yang akan
menurunkan pH media hingga 4.4, sehingga
warna media akan berubah menjadi merah
setelah diberi indikator methyl red (WHO 2003).
Uji VP menunjukkan hasil negatif untuk
keberadaan Salmonella pada media. Hasil
negatif ditunjukkan jika tidak terbentuk warna
merah pada media setelah inkubasi dan diberi
reagen α-naphtol dan KOH (Gambar 4).
Salmonella
tidak
dapat
memproduksi
acetilmethyl carbinol (acetoin) dari proses
fermentasi glukosa (Garibaldi & Bayne 1970).
Keberadaan Salmonella ditunjukkan dengan
hasil negatif untuk uji urease. Hasil yang
terlihat adalah tidak terjadi perubahan warna
menjadi merah keunguan pada semua media
yang diujikan (Gambar 5). Salmonella tidak
dapat mengubah urea menjadi amonia dan
karbondioksida di dalam media sehingga
menyebabkan kondisi media tidak berubah
menjadi basa dan indikator phenol red tidak
bekerja. Oleh karena itu media tidak berubah
menjadi merah keunguan (WHO 2003).
Berdasarkan uji H2S, diperoleh 2 isolat yang
membentuk warna hitam pada bagian dasar
media dan warna merah pada bagian lereng
media miring (isolat nomor 3 dan 4), sedangkan
3 lainnya membentuk warna kuning (isolat
nomor 1, 2, dan 5) (Gambar 6). Keberadaan
Salmonella seharusnya ditunjukkan dengan
terbentuknya warna hitam pada dasar media,
namun Salmonella yang diperoleh tidak