(dgat1) pada sapi limpo (limousin–peranakan ongole)

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2010
ANALISIS VARIASI GEN DIACYLGLYSEROL
ACYLTRANSFERASE 1 (DGAT1) PADA SAPI LIMPO
(LIMOUSIN–PERANAKAN ONGOLE) MENGGUNAKAN
TEKNIK PCR-RFLP
(Genetic Variation of Diacylglycerol Acyltransferase 1 (DGAT1) Gene of
Limpo Cattle by PCR-RFLP Method)
SRI RAHAYU1, A. PURWANTO1, A. SUSILO2, M.S. DJATI1 dan SUYADI2
1
Jurusan Biologi, FMIPA Universitas Brawijaya, Jl. Veteran Dinoyo, Malang
2
Fakultas Peternakan Universitas Brawijaya, Jl. Veteran Dinoyo, Malang
ABSTRACT
The aim of this research was to determine polymorphism of DGAT1 gene. The blood sample was taken
from ten LIMPO cattle at animal slaughter house Krian, Sidoarjo. Genomic DNA was isolated by salting out
method. A PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism) procedure
was developed to determine polymorphism of DGAT1 gene. The PCR product were digested with HaeIII
enzyme. The Result of the amplification was a specific single band with fragment size 220 bp. Restriction
with HaeIII enzyme resulted four haplotypes. Haplotype 1 were cut into one fragment (220 bp), haplotype 2
were cut into two fragments (100 and 30 bp), haplotype 3 were cut into three fragments (220, 190 and 30 bp)
and haplotype 4 were cut into four fragments (220, 190, 100 and 30 bp). It was concluded that there were
polymorphism of DGAT1 gene of LIMPO cattle.
Key Words: DGAT1 Gene, LIMPO Cattle, Marbling, PCR-RFLP, Polymorphism
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya variasi gen DGAT1. Sampel darah sebagai sumber
DNA dikoleksi dari vena jugularis dengan menggunakan tabung venoject yang mengandung bahan
antikoagulan, EDTA sebanyak 5 – 6 ml setiap ekor sapi. DNA diisolasi dari sel limfosit menurut metoda
standar. Untuk mengetahui keberhasilan isolasi DNA dilakukan pengamatan secara kuantitatif dengan
menggunakan spektrofotometer dan pengamatan secara kualitatif dengan menggunakan elektroforesis agarosa
1 %. Amplifikasi dengan PCR menghasilkan satu pita DNA yang mempunyai ukuran 220 bp. PCR-RFLP
dengan enzim HaeIII menghasilkan empat haplotip (pola potongan pita DNA), yaitu haplotip 1 dengan satu
fragmen (220 bp), haplotip 2 dengan dua fragmen (100 dan 30 bp), haplotip 3 dengan tiga fragmen (220, 190
dan 30 bp), dan haplotip 4 dengan empat fragmen (220, 190, 100 dan 30 bp). Berdasarkan hasil penelitian
dapat disimpulkan bahwa terdapat polimorfisme gen DGAT1 pada sapi LIMPO.
Kata Kunci: Gen DGAT1, Marbling, PCR-RFLP, Polimorfisme, Sapi LIMPO
PENDAHULUAN
Pada tahun 2008, produksi daging nasional
baru mencapai 66% (380.059 ton) dan
kekurangannya dicukupi melalui impor (34%).
Pasokan impor daging diprediksikan semakin
meningkat dan mencapai 70% pada tahun
2020. Hal ini, memperlihatkan bahwa terdapat
kecenderungan
semakin
meningkatnya
kebutuhan akan daging sapi potong.
Peningkatan jumlah kebutuhan daging tersebut
harus diimbangi dengan peningkatan kualitas
daging. Kualitas daging dapat dipengaruhi oleh
beberapa faktor baik sebelum atau setelah
pemotongan. Salah satu faktor yang dapat
digunakan untuk karakterisasi kualitas daging
adalah marbling. Marbling merupakan
komposisi lemak yang ada dalam otot
intramuskular. Adanya kandungan marbling
yang cukup pada daging dapat meningkatkan
25
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2010
kualitas dari daging tersebut. Jumlah marbling
dapat berbeda di antara jenis kelamin jantan
dan betina. Misalnya, pada umur yang sama,
sapi jantan memiliki lebih banyak kandungan
marbling daripada sapi betina. Daging yang
mengandung sedikit marbling akan tampak
kering dan mempunyai rasa yang kurang baik,
namun marbling yang terlalu banyak akan
membatasi palatibilitas dan menimbulkan cita
rasa yang tidak disuka (SOEPARNO, 1998).
Marbling, yang dikontrol oleh beberapa
gen (poligen), merupakan sifat komersial pada
usaha peternakan. Pengujian karakteristik
marbling dapat dilakukan dengan mengunakan
marka genetik yang dapat berupa polimorf
dalam gen-gen marbling. Penelitian yang
dilakukan oleh THALLER et al. (2003) serta
CASAS et al. (2005) menunjukkan terdapatnya
pengaruh
polimorfisme
pada
gen
Diacylglycerol acyltransferase1 (DGAT1)
terhadap tingkat marbling pada daging sapi.
Gen DGAT1 merupakan gen yang mengkode
enzim DGAT1. Secara genetis, trigliserida
yang merupakan komposisi utama penyusun
marbling, tidak hanya dipengaruhi oleh
keberadaan gen DGAT1. Gen-gen lain yang
dapat mempengaruhi deposisi trigliserida,
antara lain adalah gen GPAT (glycerol-3phosphate acyltransferase), AGPAT (1-Acylglycerol-3-phosphate acyltransferase), PPH-1
(phosphatidate phosphohydrolase 1), MGAT
(monoacylglycerol
acyltransferase)
dan
DGAT2 (diacylglycerol acyltransferase 2).
Gen-gen tersebut merupakan gen-gen yang
mengkode enzim (selain DGAT1) yang
berperan dalam sintesis trigliserida (STONE et
al., 2004).
Enzim ini berperan dalam katalisis akhir dari
sintesis trigliserida yang merupakan senyawa
lemak utama penyusun marbling. Enzim ini
mengkatalisis tahap akhir dari sintesis
triacyglycerol melalui asilasi acyl-CoAdependent dari sn-1,2-diacylglycerol dan
tingkat aktivitas DGAT memiliki pengaruh
dalam kuantitas deposisi triacylglycerol dalam
pembentukan jaringan lemak. Substitusi nonkonservatif dari dua pasangan basa pada ekson
8 yang mengakibatkan perubahan lisin menjadi
alanin di posisi asam amino 232 (K232A) pada
DGAT1 berhubungan dengan perubahan
kandungan lipid pada otot semitendinosus
26
pada.sapi (THALLER et al., 2003; FARESE et al.,
1998 dan GRISART et al., 2004; RIPOLI et al.,
2006). Gen yang berhubungan dengan
penyandian (encoding) marbling adalah gen
DGAT1
(diacylglycerol
acyltransferase)
(CASAS et al., 2005). Penelitian dari THALLER
et
al.
(2003)
mendapatkan
adanya
polimorfisme lisin / alanin pada DGAT 1 dari
marbling yang diambil dari musculus
semitendinosus dan musculus longissimus
dorsi. Menurut MOORE et al. (2003) bahwa
deposisi marbling tergantung pada alel yang
mengkode alanin dan lisin pada posisi basa 232
dari gen DGAT1. Keberadaan alel yang
mengkode lisin (K) terbukti berkaitan dengan
meningkatnya deposisi marbling daripada
keberadaan alel pengkode alanin (A) yang
berhubungan dengan menurunnya deposisi
marbling. Menurut GRISART et al. (2004)
bahwa adanya polimorfisme dari gen DGAT1
pada sapi Black-and-White Holstein-Friesian
terjadi karena adanya mutasi pada daerah nonkonservasi K232A yang menyebabkan variasi
pada deposisi marbling. Polimorfisme suatu
gen dapat diketahui dengan menggunakan
metode PCR-RFLP.
Berdasarkan hal tersebut di atas, maka
analisis polimorfisme ini perlu dilakukan untuk
melihat adanya variasi gen DGAT1 dan
hubungannya terhadap variasi kualitas
marbling pada sapi LIMPO. Sapi LIMPO
merupakan tipe sapi pedaging yang secara
genetik memiliki tingkat pertumbuhan dan
produksi daging yang baik. Selain itu, sapi
LIMPO mempunyai daya tahan terhadap
temperatur
panas
yang
lebih
tinggi
dibandingkan dengan sapi lokal (ARYOGI et al.,
2005). Variasi kualitas marbling sapi LIMPO
di Jawa Timur telah diketahui dari penelitian
yang dilakukan oleh SUSILO et al. (2007), yang
mengelompokkan menjadi dua, yaitu kualitas
dengan kandungan marbling yang sangat tipis
dan tipis. Hasil dari analisis polimorfisme ini
diharapkan
dapat
mengetahui
adanya
polimorfisme dari gen DGAT1 sehingga dapat
memberikan informasi tentang data genetis
khususnya pada sapi LIMPO di Indonesia.
Selain itu, hasil analisis ini juga diharapkan
dapat digunakan sebagai langkah awal untuk
pembuatan marker gen DGAT1 yang dapat
digunakan untuk seleksi genetis secara dini.
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2010
HASIL DAN PEMBAHASAN
MATERI DAN METODE
Sampel darah sapi LIMPO didapatkan dari
Rumah Pemotongan Hewan (RPH) Krian,
Sidoarjo. Sebanyak 10 sampel darah sapi
LIMPO akan dianalisis gen DGAT1-nya.
Sampel darah tersebut diambil dari sapi
LIMPO yang telah diketahui tingkat
marblingnya
berdasarkan
penelitian
sebelumnya, yaitu grade 1 (kualitas 1) dengan
kandungan marbling sangat tipis dan grade 2
(kualitas 2) dengan kandungan marbling yang
tipis (SUSILO et al., 2007). Sampel-sampel
tersebut dikelompokkan dalam kualitas 1
(sampel 1 – 5) dan kualitas 2 (sampel 6 – 10).
PCR-RFLP
DNA diisolasi dari sel limfosit darah.
Amplifikasi gen marbling sapi LIMPO
dilakukan melalui metode PCR. Primer yang
digunakan dalam penelitian ini adalah primer
DGAT6829. Primer forward DGAT6829F 5'CTACCGGGACGTCAACCTC-3', sedangkan
primer
reverse
DGAT6829R
5'GGTTGTCGGGGTAGCTCA-3' Pemotongan
hasil amplifikasi gen DGAT1 dilakukan
melalui metode RFLP dengan menggunakan
enzim restriksi HaeIII. Data yang diperoleh
dianalisis secara deskriptif, yaitu dengan
melakukan pengamatan profil pita DNA hasil
PCR-RFLP masing-masing sampel pada gel
hasil elektroforesis. Selanjutnya dari profil pita
DNA hasil PCR-RFLP dianalisis apakah
terdapat hubungan antara variasi marbling
dengan variasi pola potong pita DNA.
M 1
3000
2
3
Amplifikasi gen DGAT1
Hasil
Amplifikasi
gen
DGAT1
menghasilkan satu pita berukuran 220 bp
(Gambar 1). Munculnya satu pita ini
menunjukkan bahwa primer DNA yang
digunakan pada penelitian ini adalah spesifik
untuk sapi LIMPO untuk DGAT1. Hasil
pemotongan oleh enzim HaeIII pada hasil
amplifikasi gen DGAT1 menghasilkan pita
potongan DNA seperti yang tersaji pada
Gambar 2.
Variasi gen DGAT1 dapat dilihat dari hasil
pola potong pita DNA dengan enzim restriksi.
Enzim HaeIII merupakan enzim yang
mengenali sisi pemotongan pada sekuen
GG*CC dengan tipe pemotongan blunt end,
yaitu tipe pemotongan yang menghasilkan
sekuen dengan ujung yang tumpul karena
pemotongannya bersifat simetris (BECKER et
al., 2000). Hasil pemotongan oleh enzim
HaeIII menghasilkan pola potongan pita DNA
seperti yang dapat dilihat pada Gambar 2 dan
Tabel 1.
Pola potongan pita DNA berdasarkan
Gambar 2 dapat dikelompokkan dalam 4 pola
potongan (haplotip), yaitu haplotip 1 dengan
satu fragmen (220 bp), haplotip 2 dengan dua
fragmen (100 dan 30 bp), haplotip 3 dengan
tiga fragmen (220, 190 dan 30 bp), dan
haplotip 4 dengan empat fragmen (220, 190,
100 dan 30 bp). Adanya variasi pola potongan
pita DNA tersebut menunjukkan adanya variasi
dalam gen DGAT1.
4
5
6
7
8
9
10
bp
bp
500 bp
1000
220
200
bp
bp
Gambar 1. Hasil amplifikasi gen DGAT1; M: DNA ladder 1 - 10: Fragmen DNA hasil PCR
27
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2010
M
U
1
2
3
4
5
M
6
7
8
9
10
3000 bp
1000 bp
500 bp
200 bp
Gambar 2. Fotograf gel agarosa memperlihatkan adanya variasi DNA pada 220 bp fragmen
gen DGAT1 yang dideteksi dengan menggunakan enzim restriksi HaeIII.
M: DNA ladder, U: uncut (fragmen DNA hasil PCR yang tidak dipotong enzim
restriksi), 1 - 10: band yang terpotong oleh enzim restriksi
Persentase kemunculan antara haplotip 1
sampai 4 menunjukkan adanya perbedaan,
haplotip 3 mempunyai persentase kemunculan
paling tinggi dibandingkan dengan kemunculan
haplotip 1, 2 dan 4 baik pada kualitas marbling
1 maupun marbling 2 (Tabel 2 dan 3).
Variasi haplotip yang didapatkan pada
penelitian ini ternyata tidak terdapat hubungan
dengan kualitas marbling dari sampel yang
digunakan. Sementara itu THALLER et al.
(2003) menemukan adanya polimorfisme gen
DGAT1 pada sapi German Holstein yang
memiliki kandungan marbling tinggi dengan
kandungan marbling rendah. Variasi yang
terjadi pada gen DGAT1 sapi LIMPO ini dapat
terjadi karena adanya perubahan susunan basa
dalam DNA dari gen DGAT1 tersebut.
Tabel 1. Data hasil PCR-RFLP gen DGAT1 pada sapi LIMPO
Ukuran fragmen
Sampel
Pola potongan
220
190
100
30
1
Haplotip 1
*
−
−
−
2
Haplotip 3
*
*
−
*
3
Haplotip 2
−
−
*
*
4
Haplotip 4
*
*
*
*
5
Haplotip 3
*
*
−
*
6
Haplotip 2
−
−
*
*
7
Haplotip 3
*
*
−
*
8
Haplotip 3
*
*
−
*
9
Haplotip 3
*
*
−
*
10
Haplotip 3
*
*
−
*
28
DNA (bp)
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2010
Tabel 2. Persentase pola potongan (haplotip) DNA hasil PCR-RFLP gen DGAT1 pada sapi LIMPO
No
Pola potongan
Jumlah
Persentase (%)
1
Haplotip 1
1
10
2
Haplotip 2
2
20
3
Haplotip 3
6
60
4
Haplotip 4
1
10
Tabel 3. Persentase pola potongan (haplotip) DNA hasil PCR-RFLP gen DGAT1 pada sapi LIMPO
berdasarkan kualitas marbling
No
Kualitas
Marbling
Pola potongan
Jumlah
Persentase (%)
1
Grade 1
Haplotip 1
1
20
Haplotip 2
1
20
Haplotip 3
2
40
Haplotip 4
1
20
2
Grade 2
Haplotip 1
0
0
Haplotip 2
1
20
Haplotip 3
4
80
Haplotip 4
0
0
Menurut GRISART et al. (2004) menyatakan
bahwa adanya polimorfisme dari gen DGAT1
pada sapi Black-and-White Holstein-Friesian
terjadi karena adanya mutasi pada daerah nonkonservasi K232A yang menyebabkan variasi
pada deposisi marbling. SORENSEN et al.
(2006), mendapatkan bahwa aktifitas enzim
DGAT pada longisimus Dosri dari Bos Taurus
sangat terkait dengan genotip dari gen DGAT1.
Polimorfisme yang terdapat pada gen dapat
dipengaruhi oleh tinggi rendahnya perkawinan
acak, migrasi, dan seleksi di dalam populasi
sapi tersebut. MOORE et al. (2003)
menyebutkan bahwa deposisi marbling
tergantung pada alel yang mengkode alanin
dan lisin pada posisi basa 232 dari gen DGAT1.
Keberadaan alel yang mengkode lisin (K)
terbukti berkaitan dengan meningkatnya
deposisi marbling daripada keberadaan alel
pengkode alanin (A) yang berhubungan dengan
menurunnya deposisi marbling. Sementara itu,
THALLER et al. (2003) mengungkapkan bahwa
SNP (single nucleotide polymorphism) pada
daerah non-konservasi K232A gen DGAT1
menunjukkan pengaruh yang signifikan
terhadap peningkatan deposisi lemak dengan
adanya alel pengkode lisin pada daerah
tersebut. Sedangkan WINTER et al. (2002)
mengungkapkan bahwa terdapat hubungan
antara variasi gen DGAT1 dengan variasi pada
marbling yang disebabkan oleh subtitusi
K232A. ANTON et al. (2008) mendapatkan
bahwa polimorfisme pada gen DGAT 1
berhubungan dengan produksi ari susu pada
sapi Hungary.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat
diambil kesimpulan bahwa:
1.
2.
3.
Terdapat 4 haplotip gen DGAT1 pada sapi
LIMPO berdasar analisis dengan metode
PCR-RFLP menggunakan enzim HaeIII.
Haploitip 3 mempunyai persentase
kemunculan paling tinggi dibandingkan
dengan haplotip 1,2 dan 4, baik pada sapi
dengan kualitas marbling 1 maupun
kualitas marbling 2.
Tidak terdapat hubungan antara pola
potongan pita DNA hasil PCR-RFLP yang
menggunakan enzim HaeIII dengan
kualitas marbling.
29
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2010
DAFTAR PUSTAKA
ANTON, ISTVÁN, K. KOVÁCS, L. FÉSÜS, J. VÁRHEGYI,
L. LEHEL, Z. HAJDA, J. P. POLGÁR, F. SZABÓ
and A. ZSOLNAI . 2008. Effect of DGAT1 and
TG gene polymorphisms on intramuscular fat
and on milk production traits in different cattle
breeds in Hungary.
ARYOGI, S. UMADI dan W.H. ARDJOSUBROTO. 2005.
Performans sapi silangan Peranakan Ongole di
Dataran Rendah (Studi Kasus di Kecamatan
Kota Anyar Kabupaten Probolinggo Jawa
Timur). http://peternakan.litbang.deptan.go.id/
publikasi/semnas/pro05-12.pdf. (3 Januari
2008).
RIPOLI M.V, P. CORVA and G. GIOVAMBATTISTA.
2006. Analysis of a polymorphism in the
DGAT1 gene in 14 cattle breeds through
PCR-SSCP methods. R V S 80(issue 3):
287 – 290.
SOEPARNO. 1998. Ilmu dan Teknologi Daging.
UGM Press, Yogyakarta.
SORENSEN, B., C. KÜHN, F. TEUSCHER, F.
SCHNEIDER, R. WESELAKE and J. WEGNER.
2006. Diacylglycerol acyltransferase (DGAT)
activity in relation to muscle fat content and
DGAT1 genotype in two different breeds of
Bos taurus (short communication). Arch.
Tierz., Dummerstorf 49 (4): 351 – 356
BECKER, W.M dan L.J. KLEINSONTH. 2000. The
World of The Cell fourth edition. The
Benjamins Cummings Publishing Company,
New York.
STONE, S.J., H. MYERS, B.E. BROWN, S.M. WATKINS,
K.R. FEINGOLD, P.M. ELIAS and R.V. FARESE
JR. 2004. Lipopenia and skin barrier
abnormalities in DGAT2- deficient mice. J.
Biol. Chem. 279: 11767 – 11776.
CASAS, E., S.N. WHITE, D.G. RILEY, T.P.L. SMITH,
R.A. BRENNEMAN, T.A. OLSON, D.D.
JOHNSON, S.W. COLEMAN, G.L. BENNETT and
C.C. CHASE JR. 2005. Assessment of single
nucleotide polymorphisms in genes residing
on chromosomes 14 and 29 for association
with carcass composition traits tn Bos Indicus
cattle. J. Anim. Sci. 83: 13 – 19.
SUSILO, A., SUYADI dan S. RAHAYU. 2007.
Pengembangan Teknik Seleksi Peningkatan
Kualitas Daging Sapi Menggunakan Gen
Kandidat Pengatur Marbling dan Meat
Tenderness Pada Kromosom 14 dan 29.
Laporan Penelitian Riset Terapan Program
Insentif Tahun 2007. Kementrian Negara Riset
dan Teknologi Republik Indonesia, Jakarta.
FARESE, R.V., M.D.S. CASES., H. MYERS dan E.
SANDE. 1998. Breakthrough In Understanding
The Biology Of Fat-Ucsf/Gladstone Scientists
Discover
Gene
For
Key
Enzyme.
http://pub.ucsf.edu/newsservices/releases/2004
011310/. (5 Maret 2008).
THALLER, G., C. KUHN, A. WINTER, G. EWALD, O.
BELLMANN, J. WEGNER, H. ZUHLKE and R.
FRIES, 2003. DGAT1, a new positional and
functional candidate gene for intramuscular fat
deposition in cattle. Animal Genetics 34(5):
354 – 357.
GRISART, B., F. FARNIR, L. KARIM, N. CAMBISANO,
J.J. KIM, A. KVASZ, M. MNI, P. SIMON, J. M.
FRERE, W. COPPIETERS and M. GEORGES. 2004.
Genetic and functional confirmation of the
casuality of the DGAT1 K232A quantitive
trait nucleotide in affecting milk yield and
composition. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101:
2398 – 2403.
WINTER, A., W. KRAMER, F.A.O. WERNER, S.
KOLLERS, S. KATA, G. DURSTEWITZ, J.
BUITKAMP, J. E. WOMACK, G. THALLER and R.
FRIES. 2002. Association of a Lysine232/Alanine Polymorphism In Bovine Gene
Encoding
Acyl-CoA:
Diacylglycerol
Acyltransferase (DGAT1) with variation at a
quantitative trait locus for milk fat content.
Proc. of the National Academy of Science of
the Unite States of America 99: 9300 – 9305.
MOORE, S. S., C. LI, J. BASARAB, W.M. SNELLING, J.
KNEELAND, B. MURDOCH, C. HANSEN and B.
BENKEL. 2003. Fine mapping of quantitative
trait loci and assessment of positional
candidate genes for backfat on bovine
chromosome 14 in a commercial line of Bos
Taurus. J. Anim. Sci. 2003. 81: 1919 – 1925.
30