BAB IV Hasil dan Pembahasan Hasil yang diperoleh dari tahapan

BAB IV
Hasil dan Pembahasan
Hasil yang diperoleh dari tahapan penelitian akan dijelaskan pada bab ini. Dimulai
dengan amplifikasi gen katG, penentuan urutan nukleotida (sequencing), dan
diakhiri dengan analisis in silico.
IV.1 Amplifikasi gen katG M. tuberculosis galur alami H37Rv dan isolat L5
MDR-TB
Hasil amplifikasi gen katG M. tuberculosis H37Rv dan isolat L5 MDR-TB dapat
dilihat dari visualisasi hasil elektroforesis gel agarosa pada gambar IV.1, M.
tuberculosis H37Rv ditunjukkan sebagai kontrol wild type.
1
2
3
4
1417 pb
517 pb
397 pb
0,43 kb
214 pb
75 pb
Gambar IV.1 Elektroforesis agarosa M.tuberculosis H37RV dan isolat L5 MDRTB. Tampak pada gambar lajur 1 adalah penanda (marker) DNA puC19/HinfI,
lajur 2 M.tuberculosis galur alami H37Rv, lajur 3 isolat L5 MDR-TB, dan lajur 4
adalah kontrol negatif. Pada gambar tampak kedua pita sampel berukuran 0,43 kb.
Elektroforesis gel agarosa M. tuberculosis galur alami H37Rv dan isolat L5
MDR-TB memperlihatkan perkiraan hasil pita DNA berukuran 0,43 kb. Letak pita
tersebut berada pada posisi antara pita kedua dan ketiga pita penanda (marker)
pUC19/HinfI dengan ukuran 0,512 kb dan 0,397 kb. Ukuran fragmen DNA yang
diperoleh sesuai dengan perkiraan panjang fragmen yang menggunakan primer
KF dan KR pada program Editseq, DNA*STAR. Posisi fragmen DNA kedua
sampel dalam gen katG diperlihatkan pada gambar IV.2.
738
5’
1172
3’
KF
2,359 kb
KR
3’
5’
5’
3’
3’
5’
0,43 kb
Gambar IV.2 Posisi fragmen PCR pada gen katG M. tuberculosis. Pada gambar
terlihat posisi fragmen DNA dimulai dari urutan nukleotida ke 738 hingga 1172
pada gen katG. Jumlah basa dalam fragmen DNA adalah 430 pb.
IV.2 Hasil penentuan urutan nukleotida
Data urutan nukleotida yang diperoleh berupa elektroforegram dalam bentuk file
abi. Masing-masing basa nukleotida gen katG kedua sampel ditunjukkan oleh
warna yang berbeda, yaitu warna hijau untuk basa adenin (A), warna biru untuk
sitosin (C), warna hitam untuk guanin (G) dan warna merah untuk timin (T).
Elektroforegram dapat dilihat pada gambar IV.3.
Gambar IV.3 Elektroforegram hasil sequencing isolat L5 MDR-TB. Elektroforegram
isolat L5 MDR-TB memperlihatkan puncak basa penyusun fragmen DNA. Basa timin
berwarna merah, adenin berwarna hijau, sitosin berwarna biru, dan guanin berwarna
hitam.
Selain dalam bentuk elektroforegram, didapatkan pula hasil sequencing dalam
bentuk teks. Data teks urutan nukleotida fragmen DNA isolat L5 MDR-TB
ditunjukkan pada gambar IV.4.
AGGCGAGGGA CCGGAATCCA TGGCCGCGGC GGTCGACATT 40
CGCGAGACGT TTCGGCGCAT GGCCATGAAC GACGTCGAAA 80
CAGCGGCGCT GATCGTCGGC GGTCACACTT TCGGTAAGAC 120
TACATGGCGC CGGCCCGGCC GATCTGGTCG GCCCCGAACC 160
CGAGGCTGCT CCGCTGGAGC AGATGGGCTT GGGCTGGAAG 200
AGCTCGTATG GCACCGGAAC CGGTAAGGAC GCGATCACCA 240
GCGGCATCGA GGTCGTATGG ACGAACACCC CGACGAAATG 280
GGACAACAGT TTCCTCGAGA TCCTGTACGG CTACGAGTGG 320
GAGCTGACGA AGAGCCCTGC TGGCGCTTGG CAATACACCG 360
CCAAGGACGG CGCCGGTGCC GGCACCATCC CGGACCCGTT 400
ATGAACTTGG GC
412
Gambar IV.4. Data teks urutan nukleotida isolat L5 MDR-TB. Data teks ini
memperlihatkan urutan nukleotida isolat L5 MDR-TB dalam bentuk teks,
nukleotida yang dapat dibaca berjumlah 412 pb.
Hasil sequencing isolat L5 MDR-TB dalam bentuk teks menunjukkan nukleotida
yang dapat di baca berjumlah 412 pasang basa (pb) dari 430 pb dan nukleotida
yang dapat di baca pada M. tuberculosis H37Rv berjumlah 356 pb dari 430 pb.
Urutan nukleotida M. tuberculosis H37Rv dapat dilihat pada lampiran. Pada
penelitian sebelumnya telah dilaporkan bahwa mutasi gen katG G944T yang
merubah residu asam amino Ser315Thr merupakan mutasi yang paling sering
terjadi (Mokrousov et al., 2002), namun pada penelitian ini mutasi tersebut tidak
ditemukan.
944
M. tuberculosis H37Rv
944
Isolat L5 MDR-TB
Gambar IV.5 Eletroforegram nukleotida posisi 944. Grafik ini menunjukkan tidak
ada mutasi pada posisi basa 944, penelitian sebelumnya melaporkan posisi ini
merupakan posisi yang paling banyak mengalami mutasi.
IV.3 Analisis homologi
Analisis homologi gen katG antara M. tuberculosis galur alami H37Rv dan isolat
L5 MDR-TB dimulai dengan memasukkan urutan nukleotida kedua sampel dalam
bentuk abi file ke dalam program SeqmanTM versi 4.0.0. Setelah disejajarkan
program akan secara otomatis memberi tanda adanya mutasi, pada pensejajaran
antara dua sampel diatas dapat terlihat adanya perbedaan basa pada posisi yang
sama, yaitu C pada M. tuberculosis galur alami H37Rv dan T pada isolat L5
MDR-TB. Hal ini menandakan adanya mutasi subsitusi C menjadi T. Posisi
nukleotida yang mengalami mutasi dapat diketahui dengan memasukkan urutan
nukleotida lengkap gen katG M. tuberculosis galur alami H37Rv yang berasal dari
GenBank,
pensejajaran ini berhasil menunjukkan posisi nukleotida yang
mengalami mutasi, yaitu posisi 825.
M. tuberculosis
H37Rv
Isolat L5
MDR-TB
Gambar IV.6 Elektroforegram fragmen DNA gen katG M. tuberculosis H37Rv
dan Isolat L5 MDR-TB. Pada grafik terlihat adanya mutasi C825T pada isolat L5
MDR-TB, analisis menggunakan program Seqman, DNA*STAR.
825
Gen katG
H37Rv
L5
Gambar IV.7 Posisi nukleotida 825 isolat L5 MDR-TB yang mengalami mutasi
C825T. Pada gambar ini terlihat posisi nukleotida yang mengalami mutasi berada
pada urutan ke 825. selain itu, ditunjukkan pula perbedaan warna pada nukleotida
yang mengalami mutasi.
Untuk melihat adanya perubahan asam amino akibat mutasi C825T, maka
dilakukan pensejajaran antara nukleotida M. tuberculosis H37Rv, isolat L5 MDRTB dan open reading frame (ORF) gen katG yang diperoleh dari GeneBank. Hasil
pensejajaran dapat dilihat pada gambar IV.6.
Gen katG
796
266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281
atc gtc ggc ggt cac act ttc ggt aag acc aca tgg cgc cgg ccc ggc
Ile Val Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Thr Thr Trp Arg Arg Pro Gly
I V G G H T F G K T T W R R P G
M. tuberculosis H37Rv
796
266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281
atc gtc ggc ggt cac act ttc ggt aag acc aca tgg cgc cgg ccc ggc
Ile Val Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Thr Thr Trp Arg Arg Pro Gly
I V G G H T F G K T T W R R P G
Isolat L5 MDR-TB :
796
266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281
atc gtc ggc ggt cac act ttc ggt aag act aca tgg cgc cgg ccc ggc
Ile Val Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Thr Thr Trp Arg Arg Pro Gly
I V G G H T F G K T T W R R P G
Gambar IV.8 Posisi dan jenis asam amino yang dikode oleh kodon 275. Terlihat
pada gambar asam amino yang mengalami mutasi adalah Thr275.
Gambar diatas menunjukkan bahwa mutasi pada nukleotida 825 terletak pada
kodon 275 basa ketiga, ACC menjadi ACT. Perubahan basa ini tidak merubah
asam amino 275, treonin. Tidak adanya perubahan residu asam amino 275 maka
dapat dipastikan
mutasi tersebut bukan merupakan penyebab sifat resisten
terhadap INH.
Pada penelitian sebelumnya isolat L5 MDR-TB telah diamplifikasi menggunakan
metode PCR multipleks katG315, primer yang digunakan adalah dua primer luar
KF dan KR serta satu primer dalam K315, daerah gen katG yang diamplifikasi
berada pada urutan 738 hingga 1172. Hasil amplifikasi isolat tersebut
menghasilkan dua pita berukuran 0,29 dan 0,43 kb, yang berarti isolat L5 tidak
mengalami mutasi S315T, namun dari hasil PCR multipleks tidak ditentukan
urutan nukleotidanya, sehingga mutasi pada isolat L5 belum diketahui. Pada
penelitian ini, untuk mengamplifikasi gen katG digunakan dua primer luar yang
dipakai pada PCR multipleks. Berdasarkan penentuan urutan nukleotida dan
setelah dilakukan analisis homologi, ditemukan mutasi C825T pada isolat L5
MDR-TB, tetapi tidak merubah residu asam amino T275. Sehingga dapat
dikatakan mutasi yang menyebabkan sifat resisten antibiotik diduga berada diluar
fragmen yang dianalisa, mengingat primer KF dan KR mengamplifikasi daerah
gen katG sepanjang 0,43 kb sedangkan jumlah urutan nukleotida lengkap gen
katG 2,3 kb, maka diperlukan penelitian lanjutan yang mengamplifikasi daerah
diluar fragmen yang telah diamplifikasi.
1 kb
2,3 kb
T275
S315
0,43 kb
Gambar IV.9 Fragmen amplifikasi DNA pada gen katG M. tuberculosis Gambar
ini menujukkan letak fragmen DNA yang diamplifikasi, letak residu asam amino
yang mengalami mutasi (merah) dan letak Ser315 yang tidak mengalami mutasi
(hijau).
IV.4 Model struktur protein katalase peroksidase
Protein katalase peroksidase M. tuberculosis telah berhasil dikristalkan dan
ditentukan struktur tiga dimensinya (Bertrand et al., 2004). Struktur tiga dimensi
dari enzim ini meperlihatkan bahwa enzim tersebut adalah homodimer dengan
masing-masing monomer berukuran 80 kDa.
Data struktur protein dapat dilihat pada www.pdb.org dengan nama ISJ2. Posisi
residu asam amino T275 berada dekat dengan sisi pengikatan substrat INH, sisi
pengikatan substrat tersebut berada di domain N.
Gambar IV.10 Struktur tiga dimensi enzim KatG M. tuberculosis (pdb kode
ISJ2). Gambar diatas menunjukkan bahwa enzim KatG merupakan homodimer.
Perbedaan warna menunjukkan masing-masing monomer.
Mutasi C825T pada isolat L5 MDR-TB tidak menyebabkan perubahan struktur
pada posisi 275 enzim KatG, tidak berubahnya struktur maka fungsi enzim
tersebut tidak mengalami perubahan. Informasi tersebut menjelaskan bahwa
penyebab resistensi berada di daerah lain pada struktur KatG. Selain itu, mutasi
diduga berada pada protein target INH yaitu InhA.
Gambar IV.11 Posisi asam amino Thr275 pada model tiga dimensi enzim KatG
M. tuberculosis. Warna merah tua menunjukkan atom O, warna merah muda
menunjukkan atom C dan biru atom H. Interaksi polar dengan residu lain, air dan
ligan heme ditunjukkan sebagai garis putus-putus beserta jarak antar keduanya.