Ekonomi Isalam - lppm stkip bima

Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli
Menggunakan Metode Heat Shock
ISSN:2089-3205
Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli
Menggunakan Metode Heat Shock
Maya Ekaningtias
Abstrak: Transformasi merupakan proses memperkenalkan DNA asing ke dalam sel-sel hidup.
Umumnya, transformasi bertujuan mengekspresikan suatu gen tertentu berupa fragmen DNA di
dalam sel inang. Agar gen tersebut dapat masuk ke dalam sel inang, gen tersebut harus dibuat
menjadi DNA plasmid dengan menyisipkannya pada suatu DNA vektor. Salah satu metode
transformasi yaitu dengan heat shock (kejutan panas). Tujuan penelitian ini adalah mempelajari
proses transformasi plasmid ke dalam bakteri Escherichia coli menggunakan metode heat shock.
Bakteri E. coli strain DH5α dibuat menjadi sel kompeten dengan ditumbuhkan pada 5 ml
medium LB, suhu 37o C selama 24 jam pada shaker. Setelah diperoleh pellet yang dibutuhkan
kemudian ditambahkan TSS 2x sebanyak 1 ml, kemudian disuspensikan. Selanjutnya, suspensi
bakteri E. coli dicampur dengan DNA plasmid (pUC19) kemudian ditransformasi menggunakan
metode heat shock pada suhu 42oC selama 90 detik. Setelah itu, inokulasi 100 µl campuran
tersebut pada media seleksi (medium LB yang diberi antibiotik ampisilin), Diinkubasi semalam
pada suhu 37oC dan keesokan harinya dilakukan pengecekan hasil transformasi. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa transformasi plasmid DNA ke dalam E. coli menggunakan TSS dan
metode heat shock berhasil dilakukan. Hal ini diindikasikan dengan adanya E. coli yang mampu
tumbuh pada medium LB yang mengandung antibiotik ampisilin. Dengan adanya ampisilin
sebagai marka seleksi, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang
telah memasukkan plasmid.
Kata Kunci: Transformasi, pUC19, E. coli strain DH5α, Heat shock.
dengan segera pada suhu sekitar 42oC. Adapun
PENDAHULUAN
Transformasi
merupakan
proses
memasukkan DNA plasmid hasil konstruksi
yang telah mengandung materi asing ke dalam
sel target. Dalam proses ini, untuk sementara
dinding sel dibuat permeabel dan dapat dilalui
oleh molekul DNA kecil. Transformasi dapat
dilakukan dengan beberapa cara, antara lain
dengan heat shock dan dengan elektroporasi.
Pada metode heat shock, campuran sel dan
DNA plasmid rekombinan didinginkan dalam
metode elektroporasi menggunakan suatu alat
yang dialiri arus listrik.
Transformasi genetik merupakan salah
satu metode yang dapat dimanfaatkan untuk
mempelajari regulasi gen, identifikasi fungsi
gen, pengujian metabolisme, serta mempelajari
fisiologi dan perkembangan sebagai akibat
dari ekspresi gen tersebut. Agar gen yang
berupa fragmen DNA tersebut dapat masuk,
diperlukan
suatu
vektor
DNA
untuk
waktu yang lama, kemudian dipanaskan
7 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi
Volume 5 Nomor 2 November 2016
Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli
Menggunakan Metode Heat Shock
ISSN:2089-3205
menyisipkan gen, misalnya vektor plasmid
Supercoiling ini terjadi karena sebagian heliks
(Brown, 2006).
ganda DNA plasmid terbuka oleh kerja enzim
Vektor adalah sekuen nukleotida DNA
topoisomerase
selama
replikasi.
Bentuk
yang berperan sebagai perantara yang akan
berpilin ini hanya dapat dipertahankan jika
membawa fragmen DNA masuk ke dalam sel
kedua untai polinukleotida dalam keadaan
host dan memungkinkan terjadinya replikasi
utuh, sehingga disebut DNA sirkular yang
dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut
tertutup secara kovalen (covalently-closed-
(Lodge et.al., 2007; Wiley et.al., 2011).
circular
Beberapa jenis vektor yang dapat digunakan
polinukleotida terputus, maka heliks ganda
antara lain plasmid, phage, cosmid, Yeast
akan
Artificial Chromosomes (YAC), Bacterial
normalnya, ke bentuk alternatif plasmid yang
Artificial
disebut sirkular terbuka (open circular) (Hogg,
Chromosomes
(BAC),
dan
sebagainya. Karena perannya yang sangat
DNA).
Jika
berelaksasi
salah
kembali
satu
ke
untai
keadaan
2005).
penting dalam transformasi, vektor memiliki
Plasmid hampir selalu membawa gen
beberapa persyaratan, antara lain: memiliki
tertentu (satu atau lebih gen) dan umumnya
titik origin of replication (ORI) sebagai titik
gen tersebut mengkode sifat-sifat penting yang
awal
ditunjukkan
replikasi,
sehingga
vektor
dapat
oleh
bakteri
asal.
Plasmid
bereplikasi sendiri; mengandung gen resistensi
membawa tipe gen yang sangat bervariasi
antibiotik
fungsinya,
tertentu
sehingga
memudahkan
seperti
resistensi
endonuklease restriksi atau multicloning site
mutagen, sensitif atau resistensi bakteriofag,
(MCS) yang dapat dipotong dengan enzim
produksi enzim restriksi, produksi asam
restriksi tertentu sebagai tempat penyisipan
amino, produksi toksin, penentu virulensi,
informasi genetik (Willey et.al., 2011).
katabolisme
kemampuan
berat,
antibiotik,
proses seleksi; memiliki situs pengenalan
Plasmid merupakan DNA sirkular untai
logam
resistensi
molekul
sensitif
organik
pembentukan
terhadap
kompleks,
hubungan
ganda ekstrakromosomal pada bakteri dengan
simbiosis, dan transfer DNA antar spesies
panjang kurang dari 20 kb yang dapat
(Hogg, 2005; Brown, 2006).
bereplikasi sendiri, sehingga memungkinkan
Untuk
terdapatnya banyak kopi dalam satu sel
transformasi
(Willey et.al., 2011). Sebagian besar plasmid
plasmid, plasmid dilengkapi dengan gen
dalam sel tersusun dalam struktur molekul
penanda molekular (marker gene) tertentu saat
yang
konstruksinya.
sangat
berpilin
(supercoiled).
8 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi
mengetahui
dengan
keberhasilan
penggunaan
Penanda
vektor
molekular
Volume 5 Nomor 2 November 2016
Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli
Menggunakan Metode Heat Shock
ISSN:2089-3205
menggunakan gen yang mudah dianalisis
transformasi
ekspresinya.
Escherichia coli menggunakan metode heat
Dalam
skala
laboratorium,
penanda resistensi antibiotik sering digunakan
plasmid
ke
dalam
bakteri
shock.
sebagai suatu selectable marker (Brown, 2006;
METODE
Harisha, 2007).
Selain menggunakan antibiotik, penanda
molekuler lain yang biasa digunakan adalah
gen lac Z. Gen lac Z adalah gen yang
mengkode
enzim
menghidrolisis
β-galaktosidase
senyawa
x-gal
yang
dengan
membentuk warna biru. Bila gen lac Z disisipi
oleh gen lain, maka gen lacZ akan rusak
sehingga tidak lagi menghasilkan enzim βgalaktosidase dan tidak dapat menghidrolisis
senyawa
5-bromo-4chloro-3indolyl-β-D-
galactosidase (x-gal). Dalam hal ini, gen lacZ
merupakan lokasi untuk menyisipkan gen yang
akan ditransfer, atau sering disebut sebagai
multiple cloning site (MCS). Bakteri yang
telah berhasil ditransfer dengan plasmid (gen
lacZnya telah tersisipi) akan membentuk
koloni warna putih. Sebaliknya, bila gen
lacZnya belum tersisipi, maka koloninya akan
berwarna biru. Koloni yang berwarna putih
adalah koloni bakteri transforman, sedangkan
koloni
berwarna
transforman
atau
biru
bukan
bakteri
tidak
bertransformasi.
Seleksi dengan metode ini dikenal dengan
nama blue white colony selection (Sun et al.,
Bakteri Escherichia coli (E. coli) strain
DH5α dibuat menjadi sel kompeten dengan
ditumbuhkan pada 5 ml medium LB, suhu 37o
C selama 24 jam pada shaker. Selanjutnya
sebanyak 500 µl bakteri tersebut dikultur
kembali pada 10 ml medium LB, suhu 37o C
selama 2-3 jam pada shaker hingga mencapai
OD 0,5-0,6. Bakteri disentrifugasi dengan
kecepatan 3000 rpm, suhu 4oC selama 10
menit. Cairan dibuang dan pellet yang tersisa
ditambahkan 1 ml 2 x TSS lalu disuspensikan.
Pengambilan sebanyak 100 µl bakteri
dan ditambahkan DNA plasmid (pUC19) 2 – 3
µl lalu dicampur dengan cara suspensi.
Selanjutnya, diinkubasi ke dalam es dengan
suhu sekitar 4oC selama 45 menit. Dilakukan
heat shock pada suhu 42oC selama 90 detik.
Ditambahkan TSS 1x yang dingin sebanyak
500 µl. Inkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam
pada shaker. Inokulasi 100 µl pada media
seleksi (LB medium yang diberi antibiotik
ampicilin), diinkubasi semalam pada suhu 37o
C dan keesokan harinya dilakukan pengecekan
hasil transformasi.
2006; Harisha, 2007).
Berdasarkan hal di atas, maka tujuan
penelitian ini adalah mempelajari proses
9 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi
Volume 5 Nomor 2 November 2016
Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli
Menggunakan Metode Heat Shock
(gen resistensi ampisilin), dan sebuah fragmen
HASIL DAN PEMBAHASAN
Transformasi
ISSN:2089-3205
merupakan
salah
satu
N-terminal gen β-galaktosidase (lac Z) dari E.
langkah dalam teknologi DNA rekombinan,
coli.
yaitu rekayasa genetika untuk menghasilkan
mengeksploitasi
sifat baru dengan cara merekombinasikan gen
plasma sel bakteri inang. Enzim tersebut
tertentu dengan DNA genom. Teknik DNA
mengkatalisa hidrolisis cincin betalaktam,
rekombinan meliputi isolasi DNA, teknik
sehinggga
memotong
DNA, teknik menggbung DNA
transformasi dengan pUC19 menjadi resisten
dan teknik untuk memasukan DNA ke dalam
terhadap ampisilin. Pemilihan vektor yang
sel
akan digunakan dalam transformasi perlu
hidup.
Pada
memanfaatkan
dasarnya
penanda
enzim
tersebut
beta-laktamase
menyebabkan
bakteri
akan
ke
hasil
bakteri
yang
memperhatikan karakter vektor dengan jelas,
asing
dari
terutama sistem ekspresi dan jenis gen
Dalam
ketahanan terhadap antibiotik yang dimilikinya
transformasi gen ke dalam sel bakteri, perlu
sehingga akan memudahkan dalam proses
memperhatikan
seleksi transforman.
mampu
kemampuan
transformasi
Gen
mengambil
lingkungan
di
DNA
sekelilingnya.
beberapa
faktor,
yaitu
persiapan sel kompeten, pemilihan vektor
Hasil penelitian menunjukkan, bahwa
plasmid, metode transformasi yang digunakan,
proses transformasi yang dilakukan berhasil
serta seleksi koloni bakteri yang berhasil
memperkenalkan DNA asing dalam bentuk
ditransformasi.
plasmid pUC19 ke dalam sel inang, yaitu
Pada penelitian ini sel kompeten yang
E.coli DH5α. Hal ini dapat dilihat dari
digunakan adalah bakteri E. coli DH5α yang
terbentuknya koloni bakteri pada medium
merupakan bakteri yang sering digunakan
seleksi menggunakan ampisilin, seperti yang
dalam proses transformasi. Pemilihan E. coli
terlihat pada gambar dibawah. Bakteri yang
DH5α
kompeten
tidak tersisipi oleh plasmid pUC19 akan mati
mempertimbangkan beberapa karakter yang
dengan adanya antibiotik yang digunakan
dapat meningkatkan efisiensi transformasi.
dalam medium seleksi, sedangkan bakteri yang
Sedangkan vektor yang digunakan adalah
berhasil ditransformasi dapat bertahan hidup
pUC19. Plasmid ini mempunyai ukuran genom
dalam medium tersebut yang disebabkan
sebesar 2,69 kb, jumlah kopi sekitar 500-7000
adanya gen ampR pada plasmid pUC19 yang
dan mempunyai situs pemotongan dengan
terekspresi pada bakteri transforman.
sebagai
sel
enzim restriksi. Selain itu, plasmid pUC19
mempunyai gen penanda, yaitu satu gen ampR
10 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi
Volume 5 Nomor 2 November 2016
Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli
Menggunakan Metode Heat Shock
ISSN:2089-3205
Koloni bakteri
yang terbentuk
Gambar 1. Hasil seleksi transforman pada medium seleksi yang
mengandung antibiotik ampisilin.
Proses
transformasi
diawali
dengan
pembuatan sel kompeten. Sel Kompeten
adalah sel yang dapat menyerap DNA karena
telah mendapat perlakuan fisik maupun kimia.
merupakan sel bakteri yang telah mengalami
Proses pembuatan sel kompeten dalam
perubahan dalam hal tingkat permeabilitasnya,
penelitian ini menggunakan larutan TSS yang
sehingga bakteri tersebut dapat menyerap
mengandung ion dari MgCl. Ion tersebut akan
DNA asing dari luar sel. Tidak semua sel
menetralisir aksi tolak-menolak antara muatan
secara alami memiliki kemampuan untuk
negatif dan bagian kepala fosfolipid dengan
menyerap DNA asing. Setiap sel memiliki
muatan negatif gugus fosfat DNA (Szostkova
efisiensi
and Horakova, 1998).
yang
berbeda
dalam
menyerap
Zhang et al. (2007)
molekul DNA. Beberapa spesies yang dapat
melakukan pengujian pengaruh Mg2+ terhadap
menyerap
membran lipid
DNA
secara
efisien
adalah
bilayer
Mg2+
dan
Bacillus dan Streptococcus. Sel yang tergolong
menemukan
tidak
DNA
kerapatan membran. Berdasarkan kedua hasil
memiliki
tersebut dapat diketahui bahwa ion-ion dari
kemampuan alami menyerap DNA asing yang
MgCl2 berperan dalam mengganggu kestabilan
rendah (Tsen et al., 2002). Kemampuan sel
membran sel E.coli. selain itu TSS dingin
dalam menyerap DNA dapat ditingkatkan
dapat menyebabkan terganggunya struktur
dengan
sel
membran sel sehingga membentuk pori-pori
tersebut menjadi kompeten. Sel kompeten
yang memungkinkan membran sel dapat
efisien
dalam
adalah Escherichia
perlakuan
menyerap
coli. Sel
khusus,
ini
sehingga
bahwa
buatan,
menurunkan
dimasuki oleh DNA sirkuler.
11 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi
Volume 5 Nomor 2 November 2016
Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli
Menggunakan Metode Heat Shock
ISSN:2089-3205
yang telah
pada suhu 42o C menimbulkan gradien panas
kompeten diberi perlakuan kejut panas (heat
yang menyebabkan aliran yang mengalir ke
shock) untuk membuka pori pada dinding sel
dalam sel yang memungkinkan DNA masuk
bakteri.
ke dalam sel.
Selanjutnya, sel E. coli
Inkubasi
dengan
plasmid
akan
menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel.
Proses ini dilakukan dengan memindahkan
secara cepat sel yang tadinya diinkubasi dalam
es ke dalam suhu hangat ±42° C selama 90
detik,
jika
terlalu
lama
menyebabkan
kerusakan membran sel sehingga bakteri akan
mati. Proses ini harus dilakukan secara cepat
dan tepat waktu sehingga sel benar-benar
dalam kondisi
"terkejut". Brown (2006)
mengatakan bahwa pemanasan yang cepat
DAFTAR PUSTAKA
Brown, T.A. 2006. Gene Cloning and DNA
Analysis: An Introduction. Fifth edition.
Wiley Blackwell.
Harisha, S. 2007. Biotechnology procedures
and
experiments
handbook
(An
introduction to biotechnology). Infinity
Science Press LLC. Hingham, MA.
Canada.
Hogg, S. 2005. Essential Microbiology. John
Wiley & Sons Ltd. England.
Lodge, J., P. Lund and S. Minchin. 2007. Gene
Cloning: Principles and Applications.
Taylor & Francis Group. Birmingham.
Sun, D., Y. Zhang, Y. Mei, H. Jiang, Z. Xie,
H. Liu, X. Chen, and P. Shen. 2006.
Escherichia
coli
is
Naturally
Transformable
In
A
Novel
Transformation
System.
FEMS
Microbiology Letters. 265 (2) : 249-255.
Szostkova, M. and D. Horakova. 1998. The
Effect of Plasmid DNA Size and other
Factors on Electrotransformation of
12 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi
KESIMPULAN
Berdasarkan
dilakukan
dapat
penelitian
yang
disimpulkan
telah
bahwa
transformasi plasmid DNA ke dalam E. coli
menggunakan TSS dan metode heat shock.
berhasil dilakukan yang diindikasikan dengan
adanya E. coli yang mampu tumbuh pada
medium LB yang mengandung antibiotik
ampisilin.
Escherichia
coli
JM109.
Bioelectrochemistry and Bioenergetics.
47: 319–323.
Tsen
et
al. 2002.
Natural
Plasmid
Transformation in Escherichia coli.
Journal of Biomedical Science. 9:246252.
Willey, J.M., L.M. Sherwood and C.J.
Woolverton.
2011.
Prescott’s
Microbiology. 8ed. McGraw-Hill.
Zhang et al. 2007. Effects of Mg2+ on
Supported Bilayer Membrane on A
Glassy Carbon Electrode During
Membrane Formation. International
Journal
of
Electrochemical
Science. 2:788-796.
Volume 5 Nomor 2 November 2016