Repository FMIPA 1 OPTIMASI SUHU ANNEALING PRIMER

OPTIMASI SUHU ANNEALING PRIMER UNTUK
AMPLIFIKASI DNA GEN LINAMARASE
Fitri Ramsela1, Dewi Indriyani Roslim 2, Herman2
1
Mahasiswa Program Studi S1 Biologi
2
Dosen Genetika Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau
Kampus Binawidya Pekanbaru, 28293, Indonesia
[email protected]
ABSTRACT
The difference between bitter and not bitter cassava based on the linamarase gene is
scientifically unknown. In order to know this difference, the scientific information is
necessary and can be conducted by isolation of total DNA and DNA amplification.
DNA amplification was done using two primer pairs (LK and LP) with different
annealing temperature (Ta). The average melting temperature (Tm) of LK and LP
primers were 52,3oC and 53,1oC, respectively. Ta values was determined by reducing
3°C or 5°C of Tm value. This study aimed to determine the annealing temperature of
the linamarase primer used in PCR. In this study, annealing temperature optimization
was carried out at 49,3oC and 47,3oC for LK primers and 50,1oC and 48,1oC for LP
primers. The template DNA used was total DNA from cassava (Manihot esculenta
Crantz.) genotype menggalo. The annealing temperature optimization of LK primer
produced a thick band with smear at both temperature (49,3oC and 47,3oC), while for
LP primer produced thick band without smear at 50,1oC, and with smear at 48,1oC.
Therefore, the primer used for amplification of linamarase gene was LP primer with
the annealing temperature was 50,1oC.
Keywords: annealing temperature, cassava, linamarase primary, PCR optimation
ABSTRAK
Perbedaan ubi kayu pahit dan tidak pahit berdasarkan gen linamarase pada ubi kayu
secara ilmiah belum diketahui. Untuk mengetahui perbedaan tersebut maka
diperlukan informasi ilmiah secara genetik, dengan dilakukan isolasi DNA total dan
amplifikasi DNA. Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan dua pasang
primer (LK dan LP) dengan suhu annealing (Ta) yang berbeda. Primer LK dan LP
memiliki nilai rata-rata melting temperature (Tm) 52,3oC dan 53,1oC secara berturutturut. Nilai Ta ditentukan dengan menurunkan nilai Tm sebesar 3 oC atau 5oC.
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan suhu annealing dari primer linamarase
yang akan digunakan dalam PCR. Pada penelitian ini, optimasi suhu annealing
Repository FMIPA
1
dilakukan pada suhu 49,3oC dan 47,3oC untuk pasangan primer LK dan 50,1oC dan
48,1oC untuk pasangan primer LP. DNA cetakan yang digunakan adalah DNA total
dari ubi kayu (Manihot esculenta Crantz.) genotipe menggalo. Optimasi suhu
annealing menghasilkan pita yang tebal dan smear untuk primer LK sedangkan
untuk primer LP menghasilkan pita yang tebal dan tidak smear pada suhu annealing
50,1oC. Oleh karena itu, primer yang digunakan untuk amplifikasi gen linamarase
adalah primer LP dengan suhu annealing 50,1oC.
Kata kunci: optimasi PCR, primer linamarase, suhu annealing, ubi kayu
PENDAHULUAN
Karakterisasi ubi kayu umunya
berdasarkan morfologi dan biokimia
yaitu rasa pahit dan tidak pahit pada
umbi. Ubi kayu memiliki kandungan
glukosida sianogenik yang berbeda
antar genotipe (Bokanga 2001)
Perbedaan ubi kayu pahit dan tidak
pahit ini diduga berasal dari perbedaan
sekuen DNA yang berkonstribusi
dalam pembentukan asam sianida.
Enzim linamarase terlibat dalam
hidrolisis
senyawa
glukosida
sianogenik seperti linamarin dan enzim
linamarase disandikan oleh gen lin
(Santana et al. 2002 ).
Pada tanaman ubi kayu, enzim
linamarase terletak di dinding sel
tanaman. Untuk mendapatkan data
yang akurat tentang
perbedaan
kandungan glukosida sianogenik maka
dilakukan penelitian secara genetik.
Langkah awal yang telah dilakukan
adalah isolasi DNA gen linamarase
pada ubi kayu, kemudian dilanjutkan
dengan
amplifikasi
DNA
gen
linamarase sehingga dapat digunakan
untuk langkah berikutnya. Untuk
mendapatkan pita PCR yang tebal
maka perlu dilakukan optimasi suhu
Repository FMIPA
annealing pada primer yang akan
digunakan. Primer didesain dari sekuen
DNA gen linamarase pada ubi kayu
yang
terdapat
di
geenbank
(EC.3.2.1.21), yang mengamplifikasi
daerah promotor dan sinyal peptida.
Suhu annealing (Ta) adalah
suhu untuk penempelan primer pada
DNA cetakan. Primer yang didesain
terdiri dari 2 pasang yaitu LK dan LP
dengan nilai melting temperature (Tm)
yang berbeda-beda. Pasangan primer
LK memiliki sekuen sebagai berikut
(F) 5'-CAT TGG GATACTCCT CAA
GC-3 dan (R) 5'-GGAGAGAGGTTC
AAA CCA A-3' dengan Tm sebesar
52,3oC. Primer LP memiliki sekuen
sebagai berikut (F) 5'-CAT TGC ACG
ATG AAG CAT TG-3' dan (R) 5'-CCC
AAA CAC TAG CTCCTC TA-3'
dengan Tm 53,1o C.
Melting temperature (Tm) akan
menjadi dasar dalam menentukan suhu
annealing. Suhu annealing yang terlalu
tinggi akan menyebabkan terlepasnya
primer yang sudah menempel pada
DNA cetakan sehingga produk PCR
tidak akan terbentuk, sebaliknya suhu
annealing yang terlalu rendah akan
menyebabkan terjadinya penempelan
primer yang tidak spesifik pada DNA
21
cetakan. Besarnya suhu annealing
dapat ditentukan berdasarkan nilai Tm
dari primer yang akan digunakan
(Asy’ari et al. 2005). Optimasi PCR
pada penelitian ini bertujuan untuk
menentukan primer linamarase yang
akan digunakan untuk amplifikasi gen
linamarase dengan suhu annealing
yang sesuai.
METODE PENELITIAN
a. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada
penelitian adalah tisu, tabung mikro 0,2
ml, 1,5 ml, rak tabung mikro, pipet
mikro berbagai ukuran, tip mikro untuk
pipet mikro, microfilm, vortek, mesin
PCR, perangkat elektroforesis, dan UV
transilluminator.
Bahan yang digunakan pada
penelitian ini adalah DNA total ubi
kayu (Manihot esculenta Crantz.)
genotipe menggalo, pasangan primer
LK dan LP, dan campuran PCR
(komposisi: 1x buffer PCR; 0,1 mM
dNTP, 0,2 µM Primer F, 0,2 µM
Primer R, 1 unit Taq DNA polymerase,
dan dH2O). Bahan untuk elektroforesis
adalah 1 x TBE, etidium bromida,
loading dye, 1,2 % gel agarose, 1 kb
DNA ladder (ThermoScientific), dan
akuabidestilata steril (dH2O).
b. Prosedur Kerja
Optimasi suhu annealing (Ta)
dilakukan dengan PCR menggunakan
dua pasang primer pada dua Ta (Tabel
1).
Repository FMIPA
Tabel 1. Suhu annealing (Ta)
Primer
LK
Tm
52,3 oC
LP
53,1oC
Ta
49,3 oC
47,3 oC
50,1 oC
48,1 oC
Keterangan: Tm: rata-rata suhu primer,
Ta: suhu annealing.
Suhu annealing primer LK dan
LP dihitung dengan dua gradien yaitu
3oC dan 5oC dibawah Tm. Suhu
annealing berdasarkan melting Tm
dapat dilihat pada tabel 1. Komponen
PCR terdiri dari buffer PCR, dNTP,
primer forward dan reverse, dH2O, dan
Taq polymerase.
Program PCR meliputi pra-PCR
pada suhu 94oC selama 5 menit, diikuti
35 siklus dengan tiga tahapan yaitu
denaturasi dengan suhu 94oC selama 1
menit, annealing selama 1 menit (Tabel
1), elongasi selama 1 menit 30 detik,
dengan suhu 72oC, dan pasca PCR
pada suhu 72oC selama 10 menit. Hasil
PCR
dielektroforesis
untuk
menentukan
keberhasilan
proses
optimasi PCR.
c. Elektroforesis Hasil PCR
Molekul DNA hasil PCR
dimigrasikan pada gel agarose 1,2%
dalam larutan 1x TBE dengan
menggunakan mesin Fison Mode FEC
306, Large Horizontal Gel System.
Setelah itu diwarnai dengan 4 µl
etidium bromida, lalu divisualisasikan
dengan bantuan UV Transilluminator
(λ= 300 nm).
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pita DNA hasil optimasi suhu
annealing untuk primer LK dan LP
dapat dilihat pada gambar 1.
Gambar 1. Hasil
Keterangan: (L) 1 kb
primer LK 47,3oC,
49,3oC, (3) primer
primer LP 50,1 oC.
optimasi PCR.
DNA ladder, (1)
(2) primer LK
LP 48,1oC, (4)
Ampifikasi
menggunakan
primer LK mendapatkan pita yang
tebal dan smear pada kedua suhu
annealing 47,3 oC dan 49,3oC. Primer
LP menghasilkan pita yang tebal, utuh,
dan tidak smear pada kedua suhu
annealing yang digunakan. Namun
suhu annealing 50,1oC pada primer LP
menghasilkan pita yang tebal dan tidak
smear dibandingkan suhu annealing
48,1oC. Hal ini sesuai dengan
penelitian optimasi PCR yang pernah
dilakukan pada primer gen lain bahwa
suhu annealing yang digunakan
biasanya 5oC lebih rendah dari nilai Tm
(Asy’ari et al. 2005). Oleh karena
untuk amplifikasi DNA gen linamarase
sebaiknya menggunakan primer LP
pada suhu annaealing 50,1oC.
Repository FMIPA
Suhu annealing (Ta) yang
optimum
sangat
menentukan
keberhasilan PCR. Ta dengan suhu
yang tinggi dapat menghambat
hibidisasi template sehingga produk
PCR yang dihasilkan lebih sedikit
(Astriani et al. 2014). Hal ini sesuai
dengan hasil optimasi PCR primer LP
yang menunjukkan bahwa pita PCR
pada suhu 50,1oC tebal dan tidak smear
dibandingkan 48,1°C. Apabila suhu
annealing terlalu rendah dari pada suhu
optimum
maka
menyebabkan
terjadinya false primining dan apabila
suhu annealing terlalu tinggi maka
primer tidak dapat menempel pada
DNA cetakan sehingga proses PCR
tidak berhasil.
Keberhasilan PCR dipengaruhi
oleh penggunaan pasangan primer yang
sesuai dan suhu annealing yang
mendukung. Oleh karena itu optimasi
suhu annealing merupakan salah satu
kriteria penting untuk menetukan
keberhasilan PCR.
KESIMPULAN
Amplifikasi
DNA
gen
linamarase sebaiknya menggunakan
primer LP pada suhu annealing 50,1oC.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima
kasih kepada DIKTI yang telah
mendanai penelitian ini melalui Hibah
Penelitian Fundamental tahun kedua
2015 atas nama Dr. Dewi Indriyani
Roslim, M.Si.
4
DAFTAR PUSTAKA
Asy’ari M, Noer AS. 2005. Optimasi
konsentrasi MgCl2 dan suhu
annealing
pada
proses
amplifikasi
multifragmens
mtDNA dengan metode PCR.
JKSA VIII(1):24-28.
Bokanga, M. 2001. Cassava: Postharvest
bio
deterioration
[bibliografi].
Nigeria:
International Institut of Tropical
Agriculture (IITA), Ibadan.
Santana MA, Vasquez V, Matehus J,
Aldao RR. 2002. Linamarase
expression in cassava cultivars
with roots of low-and high
cyanide content. Plant Physiol
129: 1686-1694.
Astriani PL, Ratnayani K, Yowani SC.
2014.
Optimasi
Suhu
Annealing dan Amplifikasi 0,3
Kb Gen RpoBdi Hulu dari
RRDR
Pada
Isolat
P16
Mycobacterium Tuberculosis
Multidrug Resistant di Bali
Dengan Metode Polymerase
Chain Reaction. Cakra Kimia
2:2.
Repository FMIPA
5