kpr-jun2005

Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005
Firman Sebayang
AMOBILISASI ENZIM PENISILIN ASILASE DARI E. coli B1O4 DENGAN POLIAKRILAMIDA Firman Sebayang Departemen Kimia FMIPA USU Medan
Abstrak
Penisilin asilase adalah merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis benzil penisilin menjadi asam
6-amino penisilanat (6-APA) dan asam fenil asetat. Isolasi enzim penisilin asilase menggunakan bakteri. E.coli
B1O4 sebagai sumber enzim intraseluler. E.coli B1O4 ditumbuhkan dalam medium fermentasi menurut
formula morita dan iwata dengan asam fenil asetat 0,2% sebagai induser. Sel dipecah dengan ultrasonikator
o
pada suhu 4 C. Ekstrak enzim dipisahkan dengan sentrifuga dan diikuti dengan pengendapan enzim dengan
menggunakan ammonium sulfat. Aktivitas enzim ditentukan berdasarkan jumlah 6-APA yang dihasilkan dari
hidrolisis substrat benzil penisilin. 6-APA ditentukan berdasarkan metodekornfeld. Kadar protein ditentukan
dengan metodelowry. Aktivitas spesifik ekstrak kasar enzim adalah 0,65 unit/mg protein dan setelah
pemurnian dengan amonium sulfat 20-60% aktivitas spesifik enzim meningkat menjadi 2,85 unit/mg protein
o
30 menit.
pada kondisi optimum pH 7,5 suhu 45 C dengan lama inkubasi
Amobilisasi enzim penisilin asilase dilakukan dengan menggunakan bahan pendukung poliakrilamida.
Aktivitas spesifik enzim amobil adalah 2,70 unit/mg protein pada kondisi pH 7,5 dan suhu 45 oC dengan lama
inkubasi 30 menit. Bila dibandingkan aktivitas spesifik enzim penisilin asilase bebas dengan enzim amobil
terjadi penurunan aktivitas spesifik setelah diamobilisasi, namun demikian enzim penisilin asilase amobil lebih
menguntungkan karena dapat digunakan secara berulang.
Kata kunci: E. coli B104, Enzim penicilin, Asilase, Amobilisasi
A. PENDAHULUAN
Sampai saat ini penggunaan penisilin dan
derivatnya di Indonesia cukup tinggi dan
diperkirakan akan meningkat dari tahun ke
tahun. Penisilin alam dikenal sebagai
antibiotik yang secara kimia tidak stabil,
sehingga pada pemakaian penisilin untuk
tujuan medis sering ditemukan beberapa
kekurangan dalam pemakaiannya. Seperti
timbulnya gejala alergi, waktu paruh
dalam tubuh sempit, tidak tahan terhadap
asam dan beta-laktamase serta spektrum
kerjanya sempit.
Berdasarkan kenyataan ini perlu dilakukan
perbaikan sifat penisilin yaitu membuat
derivat penisilin-G sehingga diperoleh
penisilin semisintetik yang sifatnya lebih
efektif dan lebih bermanfaat. Pengembangan
penisilin baru dapat ditempuh dengan
jalan modifikasi spektrum kimia benzil
penisilin (penisilin-G) menjadi asam 6amino penisilanat (6-APA) dan merupakan
bagian inti penisilin.
6-APA ini merupakan prekursor pada
pembuatan penisilin semisintetik yang
sifatnya lebih baik dari penisilin alam. Dari
6-APA
dapat
dihasilkan
proposilin,
ampisilin, metesilin, oksasilin, kloksasilin,
karbenesilin, fenetesilin, dan sebagainya.
Sedangkan
produksi
antobiotik
di
Indonesia masih sangat terbatas sehingga
harga antibiotik di pasaran cukup tinggi
akibatnya sulit dijangkau oleh masyarakat.
Terbatasnya
produksi
antibiotik
di
Indonesia diperkirakan karena bahan baku
serta enzim yang terkait dalam produksi
antibiotik tersebut masih harus diimpor.
Untuk mengurangi ketergantungan akan
bahan baku dari luar negeri maka perlu
dilakukan
upaya
penelitian
untuk
pemuliaan galur mikroba yang dapat
menghasilkan antibiotik.
Langkah awal yang dilakukan untuk
mengkonversi benzil penisilin menjadi
6-APA diperlukan enzim penisilin asilase.
Enzim penisilin asilase dapat dihasilkan
oleh beberapa jenis mikroba baik
termasuk jamur dan bakteri yang
diproduksi secara intraseluler maupun
ekstraseluler. Transformasi benzil penisilin
secara enzimatis menggunakan enzim
1
Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005
Firman Sebayang
panisilin asilase
sebagai berikut:
dapat
digambarkan
permukaan melokul enzim. Gugus fungsi
inilah yang berikatan dengan gugus fungsi
bahan pedukung untuk membentuk ikatan
kovalen atau non kovalen.
Teknik amobilisasi enzim dapat dilakukan
dengan cara (1) cara fisik yang meliputi
teknik
penjebakan
(entrapment,
encapsulation), (2) cara kimia yang meliputi
teknik pengikatan baik secara kovalen,
non kovalen dan teknik ikatan silang
(crosslinking), (3) Kombinasi cara fisik dan
kimia. Beberapa metode amobilisasi
enzim dapat digambarkan sebagai berikut:
Walaupun enzim merupakan katalis yang
efisien dan cara kerjanya berlangsung
secara spesifik dan selektif namun
demikian enzim tidak terlalu ideal untuk
penggunaan dalam berbagai reaksi kimia
karena stabilitas enzim yang rendah, dan
secara teknik sulit untuk memperoleh
kembali enzim yang masih aktif dari
campuran reaksi untuk dapat digunakan
kembali.
Adanya perkembangan rekayasa enzim
akan dapat mengatasi kekurangan dari
reaksi enzimtais biasa. Cara ini dikenal
sebagai tenik amobilisasi enzim. Amobilisasi
enzim adalah suatu proses di mana
pergerakan molekul enzim ditahan pada
tempat tertentu dalam suatu ruang reaksi
kimia yang dikatalisisnya. Proses ini dapat
dilakukan dengan cara mengikatkan
molekul enzim tersebut pada suatu bahan
pendukung (matriks) tertentu melalui
pengikatan kimia atau menahan secara
fisik
dalam
suatu
rongga
bahan
pendukung. Hal ini dimungkinkan karena
molekul enzim yang struktur globular
(tertier maupun kuartener) mempunyai
gugus hidrofilik yang mengarah keluar dari
2 Bahan
pendukung
yang
banyak
digunakan untuk amobilisasi enzim adalah
kalsium
alginat,
kappa-karagenan,
poliakrilamida dan resin sintetis. Dalam
penelitian ini digunakan bahan pendukung
amobilisasi emzim penisilin asilase adalah
poliakrilamida.
Struktur
poliakrilamida
dibentuk oleh reaksi polimerisasi larutan
akrilamida dan
N-Nmetilenbisakrilamida
(BIS)
sebagai
pembentuk ikatan silang. Pada reaksi
polimerisasi ini digunakan kalium ferosulfat,
K2S2O8 sebagai bahan inisiator serta betadimetilaminopropionitril (DMAPN) sebagai
Firman Sebayang
aselerator. DMAPN dapat diganti dengan
N,N,N,N-tetrametilendiamin (TEMED).
Reaksi polimerisasi gel poliakrilamida ini
dapat dilihat seperti gambar berikut:
Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005
fermentasi ditambahkan asam fenil asetat
0,2% sebagai penginduksi. Pasta sel
bakteri dipisahkan dari medium cair
dengan sentrifuga dingin 2-4 oC pada
5000 rpm selama 30 menit. Pasta sel
dicuci dengan NaCl 0,95%, selanjutnya
pasta sel disuspensikan dengan 5 ml bufer
fosfat 0,01 M pH 7,0.
Pemecahan sel bakteri dilakukan dengan
ultrasonikator pada suhu 2-4 oC. Ekstrak
enzim kasar dipisahkan dari komponenkomponen sel lainnya dengan sentrifuga
dingin pada 5000 rpm selama 30 menit.
3. Pemurnian Enzim Penisilin Asilase.
Metode pemurnian enzim dilakukan
berdasarkan metode balshingham dan
kawan-kawan.
Ekstrak
enzim
kasar
dimurnikan dengan penambahan amonium
sulfat secara pengendapan bertingkat 0-20%
jenuh; 20-60% jenuh; dan 60-80% jenuh.
Masing-masing fraksi dipisahkan dari
cairannya secara sentrifugasi pada 12000
rpm suhu
2-4 oC selama 20 menit.
Endapan
enzim
yang
diperoleh
disuspensikan dalam bufer fosfat 0,01 M
pH 7,0. Larutan enzim setiap fraksi
dilakukan dialisa menggunakan selofan.
B. BAHAN DAN METODA
1. Pembuatan Inokulum.
Sebanyak 2 mata ose biakan E. coli B104
dipindahkan ke dalam 100 ml medium
fermentasi.
Medium
yang
telah
diinokulasikan ini dikocok selama 24 jam
pada suhu 30 oC, 180 rpm. Jumlah sel
yang
tumbuh
diukur
berdasarkan
turbiditasnya pada panjang gelombang
650 nm.
2. Isolasi Enzim Penisilin Asilase
Sebanyak 3000 ml medium fermentasi
diinokulasi dan dikocok selama 20 jam
pada 180 rpm dan suhu 30 oC. 8 jam
setelah
diinokulasi
pada
medium
4. Pengujian Aktivitas Enzim Penisilin
Asilase
Sebanyak 0,1 ml enzim hasil isolasi
direaksikan dengan 0,4 ml substrat benzil
penisilin. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml
bufer fosfat 0,1 M pH 7,5. Inkubasi selama
30 menit pada 45 oC. Setelah inkubasi, ke
dalam campuran reaksi ditambahkan 1,90 ml
bufer fosfat 0,5 M pH 6,8 dan 0,1 ml
larutan 2,4-pentanadion, kocok dalam
vortek dan langsung dipanaskan dalam air
mendidih selama 20 menit. Dinginkan
dalam air es selama 10 menit. Selanjutnya
tambahkan 1,5 ml regen erlich, campuran
reaksi dikocok dan biarkan 10 menit.
Warna merah yang terjadi diukur
serapannya pada panjang gelombang 538
nm. Sebagai kontrol digunakan enzim
penisilin asilase hasil isolasi yang telah
dimatikan
aktivitasnya
melalui
3
Firman Sebayang
pemanasan. Untuk mengetahui jumlah 6APA yang terbentuk digunakan kurva
standar 6-APA (Lampiran 1).
5. Penentuan Kadar Protein Enzim
Penisilin Asilase
Penentuan kadar protein dilakukan
dengan metode lowry. Sebanyak 1 ml
larutan enzim direaksikan dengan 5 ml
reagen C, kocok dan biarkan selama 10
menit pada suhu kamar. Tambahkan 0,5
ml reagen D (folinciocalteu 1 N) kocok dan
biarkan
30 menit pada suhu kamar.
Warna biru yang terbentuk diukur
serapannya pada panjang gelombang 750
nm. Untuk mengetahui konsentrasi protein
digunakan kurva standar bovin serum
albumin (Lampiran 2).
6. Pembuatan Enzim Penisilin Asilase
Amobil
Sebanyak 750 mg akrilamid dicampur
dengan 40 mg N,N-metilenbisakrilamida
dalam 100 ml gelas kimia yang berisi 5 ml
bufer fosfat 0,01 M pH 7,0. Diaduk sampai
homogen. Tambahkan 1 ml larutan enzim
penisilin asilase hasil isolasi dan diaduk.
Tambahkan 0,5 ml larutan N,N,N,Ntetrametilendiamin (TEMED) 5% dan 0,5
ml larutan kalium persulfat. Setiap kali
penambahan bahan selalu diaduk.
Dibiarkan
membeku
dalam
kamar
pendingin agar enzim yang diamobilkan
tidak rusak akibat pengaruh panas pada
proses reaksi polimerisasi. Gel yang telah
dibentuk dipotong-potong dengan ukuran
2 x 2 x 2 mm, kemudian dengan bufer
fosfat dengan volume tertentu. Gel yang
telah dicuci merupakan enzim penisilin
asilase amobil.
7. Pengujian Aktivitas Enzim Penisilin
Asilase Amobil.
Proses yang dilakukan adalah sistem
batch. Sebanyak 2 gr gel poliakrilamida
yang mengandung 0,4 ml enzim
ditambahkan sebanyak 0,8 ml substrat
4
Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005
benzil penisilin dan 1,2 ml bufer fosfat 0,1
M pH 7,5. Inkubasi dalam inkubator
goyang pada suhu 45 oC selama 30 menit.
Jumlah 6-APA yang dihasilkan ditentukan
seperti cara penentuan jumlah 6-APA
dengan menggunakan enzim penisilin
asilase bebas.
8. Pengujian Aktivitas Enzim Penisilin
Asilase Amobil pada Pemakaian
Berulang.
Penentuan ativitas enzim amobil pada
pemakaian berulang sama halnya dengan
cara penentuan aktivitas enzim amobil,
hanya saja setelah pemakaian pertama
selesai, enzim amobil tersebut dicuci
dengan
air,
selanjutnya
digunakan
kembali. Demikian seterusnya sampai
pemakaian berulang 6 kali.
C. HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Isolasi Enzim Penisilin Asilase
Pada tahap isolasi enzim dilakukan
sentrifugasi sel E. coli yang masih
tercampur dengan mediumnya. Pengujian
terhadap
sisa
medium
fermentasi
menunjukkan tidak adanya aktivitas enzim
penisilin asilase. Hal ini membuktikan
bahwa enzim penisilin asilase dari E. coli
B104 bersifat intraseluler sehingga untuk
memperoleh enzim harus dilakukan
pemecahan
sel
menggunakan
ultrasonikator.
Ekstrak
kasar
enzim
dipisahkan dari komponen-komponen sel
lainnya dengan sentrifugasi.
2. Pemurnian Enzim Penisilin Asilase
Ekstrak enzim yang diperoleh masih
merupakan campuran dari berbagai
macam
enzim
sehingga
untuk
mendapatkan enzim yang lebih murni
dilakukan pemurnian dengan fraksinasi
menggunakan amonium sulfat. Aktivitas
spesifik sebelum dan sesudah pemurnian
dapat dilihat pada Tabel 1.
Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005
Firman Sebayang
Tabel 1.
Aktivitas
Spesifik
Enzim
Penisilin
Asilase
Sebelum
dan
Sesudah Pemurnian.
Fraksi Enzim
Kadar
Protein
(mg/ml)
Ekstrak enzim
kasar
(NH4)2SO4
0 - 20%
20 - 60%
60 - 80%
12.50
Aktivitas
spesifik
(Unit/ mg
Protein)
0.65
12.10
10.35
9.78
0.85
2.82
1.15
Dari tabel dapat dilihat bahwa aktivitas
spesifik enzim tertinggi diperoleh pada
fraksi 20-60%. Hal ini menunjukkan bahwa
pada fraksi tersebut enzim penisilin
asilase realtif lebih murni.
5
Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005
Firman Sebayang
Kurva 1.
Grafik Aktivitas Enzim Penisilin pada Berbagai pH
Kurva 2. Grafik Aktivitas Enzim Penisilin Asilase pada Berbagai Suhu
Kurva 3. Grafik Enzim Penisilin Asilase Amobil pada Pemakaian Berulang
3. Penentuan pH Optimum Enzim
Penisilin Asilase
PH optimum enzim penisilin asilase
dapat dilihat pada Kurva 1. Dari kurva
dapat dilihat bahwa pH optimum enzim
penisilin asilase adalah 7,5. pH ini
berhubungan dengan struktur enzim
yang terdiri dari asam amino.
Perubahan
pH
dalam
larutan
menunjukkan perubahan ion H+.
Jumlah ion akan mempengaruhi
struktur enzim terutama pada ikatan
hidrogen. Pada pH optimum jumlah ion
6 H+ tidak mempengaruhi konformasi enzim
sehingga pada pH optimum konformasi
enzim sama dengan konformasi substrat
sehingga pada pH optimum aktivitas
enzim paling tinggi.
4. Penentuan Suhu Optimum Enzim
Penisilin Asilase.
Suhu optimum enzim dapat dilihat seperti
Kurva 2. Dari kurva dapat dilihat bahwa
suhu optimum enzim penisilin asilase
adalah 45 oC. Sebelum mencapai suhu
optimum aktivitas enzim masih rendah.
Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005
Firman Sebayang
Hal ini disebabkan karena energi
aktivasi yang diperlukan enzim untuk
menghidrolisa substrat benzil penisilin
belum cukup sehingga enzim tidak
bekerja secara efektif. Kenaikan
temperatur menyebabkan kenaikan
aktivitas enzim meningkat sampai
mancapai kondisi optimum. Setelah
tercapai suhu optimum ternyata dengan
kenaikan
suhu
aktivitas
enzim
menurun.
Terjadinya
penurunan
aktivitas
diperkirakan karena enzim mengalami
denaturasi
akibat
panas.
Ikatan
hidrogen yang merupakan ikatan yang
lemah pada molekul enzim mungkin
terputus sehingga terjadi perubahan
struktur tertier dan kuartener dan
menurunkan aktivitas enzim.
5. Aktivitas Enzim Penisilin Asilase
Sebelum
dan
Sesudah
Diamobilisasi
Aktivitas
enzim
penisilin
asilase
sebelum dan sesudah diamobilisasi
dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Aktivitas Enzim Penisilin Asilase
Fraksi Enzim
Enzim
penisilin
asilase bebas
Enzim
penisilin
asilase amobil
Aktivitas Spesifik
(unit/mg Protein)
2.85
2.70
Bila dibandingkan aktivitas enzim
bebas dengan enzim amobil dengan
bahan pendukung poliakrilamida ternyata
aktivitas enzim penisilin asilase amobil
lebih rendah. Hal ini mungkin
disebabkan karena enzim sebagai
molekul protein yang bersifat hidrofilik
sangat mudah dipengaruhi oleh
keadaan lingkungan. Dengan demikian
diperkirakan struktur molekul enzim
rusak akibat terjadinya perubahan
panas pada saat berlangsungnya
reaksi polimerisasi. Selain itu turunnya
aktivitas
enzim
amobil
mungkin
disebabkan karena orientasi antara
molekul substrat dengan sisi aktif enzim
kurang efektif sehingga akan menurunkan
aktivitas enzim.
6. Pengujian Aktivitas Enzim Penisilin
Asilase Amobil pada Pemakaian
Berulang
Dari hasil pengujian aktivitas enzim
penisilin asilase amobil pada pemakaian
berulang untuk enzim yang sama ternyata
mengalami penurunan seperti terlihat
pada Kurva 3.
Dari kurva dapat dilihat bahwa penurunan
aktivitas ini berhubungan dengan stabilitas
dan daya katalitik molekul enzim. Daya
katalitik dan stabilitas enzim dipengaruhi
oleh faktor lingkungan terutama gugus
fungsi reaktif enzim pada pusat aktif. Bila
suatu enzim sering digunakan maka
adanya interaksi antara substrat dengan
enzim akan mempengaruhi gugus reaktif
sehingga terjadi perubahan konformasi
struktur enzim, dengan demikian akan
mempengaruhi daya katalitik enzim
tersebut.
Bila dilihat stabilitas enzim penisilin
asilase amobil pada pemakaian berulang
ternyata pada pemakaian 1 sampai ke-4
relatif belum menunjukkan perubahan
aktivitas enzim yang berarti. Namun
setelah pemakaian yang ke-5 dan ke-6
terjadi penurunan aktivitas yang tajam. Hal
ini kemungkinan kerusakan perubahan
konformasi enzim penisilin asilase cukup
besar sehingga menyebabkan aktivitas
enzim menurun secara drastis.
D. KESIMPULAN
1. E. coli B104 dapat memproduksi enzim
penisilin asilase jika bakteri tersebut
ditumbuhkan dalam medium fermentasi
menurut formula morita dan iwata yang
mengandung asam fenil asetat 0,2%
sebagai penginduksi.
2. Aktivitas spesifik ekstrak kasar enzim
adalah 0.65 unit/mg protein, dan
setelah pemurnian dengan amonium
7
Firman Sebayang
sulfat
20-60% jenuh aktivitas
spesifik meningkat menjadi 2,85
unit/mg protein dengan kondisi
optimum reaksi enzim adalah pH 7,5
dan suhu 45 oC.
3. Aktivitas spesifik enzim penisilin
asilase amobil dengan bahan
pendukung poliakrilamida adalah
2,70 unit/mg protein pada pH 7,5
dan suhu 45 oC.
4. Mekipun terjadi penurunan aktivitas
enzim penisilin asilase amobil
namun penggunaan enzim amobil
lebih menguntungkan karena enzim
amobil
dapat
meningkatkan
stabilitas serta dapat digunakan
secara berulang.
E. DAFTAR PUSTAKA
Widiawati Adinoto, dkk., (1987),
Pemilihan Anti Mikroba yang
Rasional, MKB. XX, No.1, Juli,
30-35.
Carrington,
T.R.,
(1971),
The
Development
of
Commersial
Processes for the Production of
6-amino Penisilanic Acid (6-APA),
Proc.R.Soc.Lond.B., 179, 321333.
8
Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005
Crueger, W., and A. Crueger, (1984),
Biotechnology: A Textbook of Industrial
Micribiology, Brock, T.D., editor,
Science Tech., Inc., Madison, USA,
178-180, 202-206.
Savidge, T.A., and M.Cole, (1975),
Penicillin Acylase (Bacterial) in
Hash,
J.H.(ed.),
Methods
in
Enzymology-Antibiotics, Academic
Press, New York, 705-720.
Chibata, Inchiro, (1978), Immobilized
Enzymes, Kodansha Ltd., Tokyo, 954.
Morita, H., and T. Iwata, J., (1984),
Ferment. Technol., 62, 217-218.
Balashingham, K, et al., (1972), The
Isolation and Kinetics of Penicillin
Amidase from Escherichia coli,
Biochim, Biophys, Acta, 276, 250251.
Kornfeld, J.M., (1987), A New Colorimetric
Methods for The Determination of 6Aminopenicillanic Acid, Anal. Chem.,
86, 118-126.
Lowry D.C.H., RoseBrough, N.J. dan Farr,
Randall, (1951), J. Biol.Chem, 193.
Kawashima, K. and umeda K., (1974),
Immobilization Of Enzymes By
Radiopolimerization Of Acrilamide,
Biotechnology And Bioenginering,
16, 609-621.
Firman Sebayang
Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005
LAMPIRAN
Lampiran 1.
9
Firman Sebayang
Lampiran 2.
10
Jurnal KOMUniKASI PENELITIAN
Volume 17 (3) 2005