DARI BEKASAM IKAN PATIN (Pangasius sp.) (Skripsi)
advertisement
SELEKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) DARI BEKASAM IKAN PATIN (Pangasius sp.) (Skripsi) Oleh Hafiz Auzar FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2017 ii ABSTRAK SELEKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) DARI BEKASAM IKAN PATIN (Pangasius sp.) Oleh Hafiz Auzar Bekasam merupakan produk fermentasi dengan bahan dasar berupa ikan. Pembuatan bekasam umumnya masih memanfaatkan fermentasi spontan tanpa adanya penambahan starter bakteri. Proses fermentasi bekasam dilakukan oleh bakteri asam laktat (BAL) dengan lama fermentasi selama 3-7 hari. Selama proses fermentasi bekasam, BAL menghasilkan berbagai jenis enzim untuk mendegradasi substratnya, salah satunya enzim protease. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat BAL dari bekasam ikan patin yang memiliki kemampuan proteolitik dan mengetahui kemampuan proteolitik BAL berdasarkan aktivitas protease secara kualitatif dan kuantitatif serta karakterisirik enzim yang dihasilkan. Data dianalisis secara deskriptif dengan menampilkan data dalam bentuk tabel dan gambar. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ditemukan 8 isolat BAL proteolitik dari bekasam ikan patin, yaitu BP1, BP2, BP3. BP4, BP5, BP6, BP7 dan BP8. Keenam isolat, yaitu BP2, BP4, BP5, BP6, BP7 dan BP8 dilakukan uji indeks proteolitik. Hasil uji menunjukkan bahwa isolat BP7 memiliki nilai IP tertinggi sebesar 4,80. Hasil uji kualitiatif menunjukkan bahwa enzim protease dari isolat BP2 memiliki pH optimum 8 dan suhu optimum 40 oC sebesar 0,57 U/ml. Aktivitas enzim protease meningkat dengan penambahan logam Fe3+, Mg2+ dan Mn2+ (5 mM), sedangkan penambahan logam Fe3+, Mg2+ dan Mn2+ (1 mM), Ca2+, Cu2+ dan EDTA ( 1 mM dan 5 mM) menurunkan aktivitas enzim protese. Kata kunci : Bekasam, BAL, Proteolitik, Uji Kualitatif, Uji Kuantitatif iii SELEKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) DARI BEKASAM IKAN PATIN (Pangasius sp.) Oleh Hafiz Auzar Skripsi Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar SARJANA SAINS Pada Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2017 iv RIWAYAT HIDUP Penulis lahir pada tanggal 8 Oktober 1994 di sebuah desa kecil yang bernama sungai batang, tepatnya disekitaran danau Maninjau. Penulis merupakan anak keenam dari enam bersaudara oleh pasangan Bapak Auzar dan Ibu Iryana. Penulis mengawali pendidikan di Taman Kanak-kanak (TK) Tunas Harapan, Maninjau. Penulis melanjutkan pendidikan Sekolah Dasar di SDN 11 Duo Sidang pada tahun 2000, Sekolah Menengah Pertama di SMPN 15 Padang pada tahun 2006, dan Sekolah Menengah Atas di SMAN 8 Padang pada tahun 2009. Pada tahun 2013 penulis terdaftar sebagai mahasiswa di Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung melalui Seleksi Bersama Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SBMPTN). Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten dosen dalam Praktikum Mikrobiologi Umum dan Mikrobiologi Lingkungan. Selain itu penulis juga aktif dalam organisasi Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMBIO) sebagai anggota Bidang SAINTEK. Penulis Melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) di Desa Bujung Buring, Kecamatan Tanjung Raya, Kabupaten Mesuji pada bulan Januari-Maret 2016 dan melaksanakan Kerja Praktik di Balai Uji Standar Karantina Ikan Pengendalian vii Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BUSKIPM) Jakarta Timur pada bulan JuliAgustus 2016 dengan judul “Identifikasi Bakteri Hama Penyakit Ikan (HPI) Pada Ikan Lele Dumbo (Clarias gariepinus) di Balai Uji Standar Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BUSKIPM) Jakarta Timur” viii PERSEMBAHAN Dengan mengucapkan rasa syukur kepada Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan nikmat ksehatan, kekuatan dan kesempatan dalam penyelesaian penulisan skripsi ini. Kupersembahkan karya sederhana ini untuk : Ayah dan ibu yang senantiasa menjagaku melaui setiap doa disujudnya, menjadi penyemangat dan alasan terbesar kesuksesan hidupku serta sumber dari segala kasih sayang. Kakak, ni Rini, Nina, Abang dan Uda serta seluruh keluargaku tersayang yang senantiasa mendukung dan memberikan semangat. Bapak dan ibu dosen utamanya pembimbingku yang tak pernah lelah dan selalu sabar dalam membimbing dan memberikan ilmu. Teman-temanku Atas pengalaman, dukungan, dan bantuannya selama masa studi Serta Almamaterku tercinta Universitas Lampung ix Motto Merantaulah... Orang berilmu dan beradab tidak diam beristirahat di kampung halaman. Tinggalkan negerimu dan hidup asing di negeri orang. Kau akan dapatkan pengganti dari orang-orang yang engkau tinggalkan (kerabat dan kawan). Berlelah-lelahlah, manisnya hidup terasa setelah lelah berjuang. Aku melihat air menjadi rusak karena diam tertahan. Jika mengalir menjadi jernih, jika tidak, akan keruh menggenang. Singa jika tak tinggalkan sarang, tak akan dapat mangsa. Anak panah jika tak tinggalkan busur, tak akan kena sasaran. Jika matahari di orbitnya tak bergerak dan terus berdiam, tentu manusia bosan padanya dan enggan memandang. Biji emas tak ada bedanya dengan tanah biasa di tempatnya (sebelum ditambang). Kayu gaharu tak ubahnya seperti kayu biasa jika di dalam hutan. Jika gaharu itu keluar dari hutan, ia menjadi parfum yang tinggi nilainya. Jika biji memisahkan diri dari tanah, barulah ia dihargai sebagai emas murni. Merantaulah… Orang berilmu dan beradab tidak diam beristirahat di kampung halaman. Tinggalkan negerimu dan hidup asing di negeri orang (Al-Imam AsySyafi’i). x SANWACANA Dengan mengucap Alhamdulillah, puji syukur penulis ucapakan kepada Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan nikmatNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “SELEKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) DARI BEKASAM IKAN PATIN (Pangasius sp.)”. Penelitian ini merupakan bagian dari proyek penelitian mandiri bapak Dr. Sumardi, M.Si. Dalam menyelesaikan skripsi ini, penulis menyadari bahwa banyak sekali bantuan yang penulis dapatkan dari berbagai pihak. Dengan terselesaikannya skripsi ini, penulis ingin menyampaikan rasa terimakasih kepada : 1. Ibu dan Ayah tercinta yang telah menjaga, mendidik, menyayangi, menasehati serta senantiasa mendoakan penulis. 2. Kakak, Ni Rini, Nina, Abang dan Uda yang selalu memberikan dukungan dan semangat dalam perkuliahan. 3. Bapak Dr. Sumardi, M.Si., selaku pembimbing I yang telah memberikan bimbingan dan arahan dalam melakukan penelitian hingga menyelasaikan skripsi ini. 4. Ibu Dra. C.N. Ekowati, M.Si selaku pembimbing II yang telah memberi nasehat, saran, dan bimbingan selama penyelesaian skripsi ini. xi 5. Bapak Ir. Salman Farisi, M.Si.,selaku pembahas yang telah banyak memberikan kritik dan koreksi pada penulis skripsi ini. 6. Bapak Drs. Hendri Busman, M.Biomed selaku pembimbing akademik yang telah memberikan arahan dalam perkuliahan 7. Ibu Dra. Nuning Nurcahyani, M.Sc., selaku Ketua Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung. 8. Bapak Prof. Warsito, S.Si., D.E.A., Ph.D sekalu Dekan FMIPA Universitas Lampung. 9. Bapak ibu Dosen jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung, karyawan dan staff serta laboran di Jurusan Biologi. 10. Teman-teman terdekatku selama perkuliahan Purwo Kuncoro, Nur Rohman, Muhammad Pazry, Rio Riski Ananda, , Hendra Verry Setiawan, Rizani Oktanisyah P, Nadia Eka Yulian, Nuraeni Prija Agustin, Iffa Affiqa dan Silvia Andriani. 11. Teman terbaikku Artika Bunga Maharani, terima kasih. 12. Teman-teman seperjuangan Biologi angkatan 2013 dan Microholic ’13 atas kebersamaanya selama di lab Mikrobiologi 13. Almamater tercinta Universitas Lampung. Bandar Lampung, 8 Agustus 2017 Penulis Hafiz Auzar xii DAFTAR ISI Halaman ABSTRAK .................................................................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... v RIWAYAT HIDUP ..................................................................................... vi SANWACANA ............................................................................................ xi DAFTAR ISI .............................................................................................. xiii DAFTAR TABEL ..................................................................................... xvi DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xvii I. PENDAHULUAN ............................................................................... 1 A. B. C. D. E. II. Latar Belakang............................................................................... 1 Tujuan Penelitian ........................................................................... 3 Manfaat Penelitian ......................................................................... 4 Kerangka Pikir ............................................................................... 4 Hipotesis ........................................................................................ 6 TINJAUAN PUSTAKA A. Deskripsi Ikan Patin (Pangasius sp.)............................................. 7 1. 2. 3. 4. Habitat Ikan Patin ..................................................................... 7 Morfologi Ikan Patin ................................................................. 7 Klasifikasi Ikan Patin ................................................................ 8 Kandungan Gizi Ikan Patin ....................................................... 9 B. Bekasam ........................................................................................ 9 1. 2. 3. 4. Pengertian Bekasam .................................................................. 9 Pembuatan Bekasam .............................................................. 10 Kandungan Bekasam .............................................................. 11 Bahan Pembuatan Bekasam .................................................... 11 xiii C. Bakteri Asam Laktat (BAL) ........................................................ 12 1. 2. 3. 4. Karakteristik BAL................................................................... 12 Jenis BAL ............................................................................... 13 Peranan BAL........................................................................... 13 Hasil Fermentasi BAL ............................................................ 14 D. Enzim Protease ............................................................................ 14 1. Pengertian Enzim Protease ..................................................... 14 2. Pemanfaatan Enzim Protease .................................................. 15 3. Jenis Enzim Protease .............................................................. 16 E. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim .................. 17 1. Suhu ........................................................................................ 17 2. pH............................................................................................ 18 3. Aktivator dan Inhibitor ........................................................... 19 III. METODE KERJA A. B. C. D. E. Waktu dan Tempat .................................................................... 20 Alat dan Bahan .......................................................................... 20 Metode Penelitian ...................................................................... 21 Analisis Data ............................................................................. 21 Cara Kerja ................................................................................. 22 1. Pembuatan Bekasam .......................................................... 22 2. Isolasi dan Seleksi BAL Proteolitik ................................... 22 3. Pemurnian Isolat BAL Proteolitik ...................................... 23 4. Karakteristik BAL Proteolitik ............................................ 23 5. Peremajaan Isolat BAl Proteolitik ...................................... 23 6. Penentuan Indeks Proteolitik.............................................. 24 7. Karakterisasi Terbatas Aktivitas Enzim Protease .............. 25 7.1 Pembuatan Starter Isolat BAL .................................... 25 7.2 Produksi Enzim Protease ............................................ 25 7.3 Penentuan pH Optimum Aktivitas Enzim Protease .... 26 7.4 Penentuan Suhu Optimum Aktivitas Enzim Protease . 27 7.5 Penentuan Pengaruh Ion-ion Logam terhadap Aktivitas Enzim Protease ............................................................ 27 F. Diagram Alir ............................................................................. 29 xiv IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. B. V. Hasil Penelitian ........................................................................ 30 1. Isolat BAL Proteolitik dari Bekasam Ikan Patin ................ 30 2. Daya Hidup dan Indeks Proteolitik BAL ........................... 32 3. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Protease ............. 33 4. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Protease .......... 34 5. Pengaruh Ion-ion Logam.................................................... 35 Pembahasan ............................................................................... 36 SIMPULAN DAN SARAN A. B. Simpulan.................................................................................... 47 Saran .......................................................................................... 47 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 48 LAMPIRAN ................................................................................................ 54 A. B. C. D. E. F. G. Isolasi dan Karakterisasi BAL Proteolitik Bekasam Ikan Patin 55 Hasil Uji Aktivitas Enzim protease Secara Kualitatif ............... 58 Karakterisasi Enzim Protease (pH, suhu dan ion-ion logam) ... 58 Pembuatan Pereaksi Enzim Protease......................................... 60 Pembuatan Inhibitor EDTA dan Ion-ion Logam....................... 61 Bekasam Ikan Patin, Isolasi dan Karakterisasi BAL................. 62 Uji Kuantitatif Aktivitas Enzim Protease .................................. 66 xv DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Golongan Enzim Protease............................................................. 16 Tabel 2. Metode Pengujian Aktivitas Enzim Protease................................ 28 Tabel 3. Hasil Karakterisasi BAL Proteolitik ............................................. 31 Tabel 4. Daya Hidup dan Indeks Proteolitik BAL...................................... 32 Tabel 5. Hasil Isolasi BAL Proteolitik Hari Ke 3 Fermentasi .................... 55 Tabel 6. Hasil Isolasi BAL Proteolitik Hari Ke 5 Fermentasi .................... 55 Tabel 7. Hasil Isolasi BAL Proteolitik Hari Ke 7 Fermentasi .................... 55 Tabel 8. Karakterisasi BAL Proteolitik Hari Ke 3 fermentasi .................... 56 Tabel 9. Karakterisasi BAL Proteolitik Hari Ke 5 Fermentasi ................... 56 Tabel 10.Karakterisasi BAL Proteolitik Hari Ke 7 Fermentasi ................... 56 Tabel 11.BAL Proteolitik Bekasam Ikan Patin............................................ 57 Tabel 12.Hasil Uji Indeks Proteolitik........................................................... 58 Tabel 13. Hasil Uji Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim Protease......... 58 Tabel 14. Hasil Uji Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim Protease ..... 58 Tabel 15. Hasil Uji Pengaruh Ion-ion Logam terhadap Aktivitas Enzim Protease (1 mM) .......................................................................... 59 Tabel 16. Hasil Uji Pengaruh Ion-ion Logam terhadap Aktivitas Enzim Protease (5 mM) .......................................................................... 59 xvi DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Morfologi Ikan Patin .................................................................... 8 Gambar 2. Hubungan Aktivitas Enzim dengan Suhu .................................. 17 Gambar 3. Hubungan Kecepatan Reaksi dengan pH ................................... 18 Gambar 4. Penentuan Indeks Proteolitik BAL............................................. 24 Gambar 5. Diagram Alir Penelitian ............................................................. 29 Gambar 6. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Protease .................... 33 Gambar 7. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Protease.................. 34 Gambar 8. Pengaruh Ion-ion Logam Terhadap Aktivitas Enzim Protease . 35 Gambar 9. Bekasam Ikan Patin Hari Ke 3, 5 dan 7 Fermentasi................... 62 Gambar 10. Isolasi BAL Proteolitik Hari Ke 3 Fermentasi ........................ 62 Gambar 11. Isolasi BAL Proteolitik Hari Ke 5 Fermentasi ......................... 63 Gambar 12. Isolasi BAL Proteolitik Hari Ke 7 Fermentasi ......................... 63 Gambar 13. Pewarnaan Gram Isolat BP2 ................................................... 64 Gambar 14. Pewarnaan Spora Isolat BP2 ................................................... 64 Gambar 15. Uji Katalase Isolat BP2 ............................................................ 65 Gambar 16. Uji Motilitas Isolat BP2 .......................................................... .65 Gambar 17. Uji Indeks Proteolitik Isolat BP2 ............................................ 66 Gambar 18. Uji Aktivitas Enzim Protease Isolat BP2 ................................ 66 xvii 1 I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Fermentasi merupakan salah satu cara untuk mengawetkan makanan. Makanan yang difermentasi memiliki banyak kelebihan, yaitu lebih tahan lama, mudah untuk dicerna, mengandung mikronutrisi seperti vitamin dan kofaktor, menghasilkan probiotik dan prebiotik (Tanasupawat dan Visessanguan, 2008). Salah satu contoh makanan fermentasi adalah bekasam. Menurut Desniar (2012), bekasam merupakan produk fermentasi dengan bahan dasar berupa ikan. Pembuatan bekasam umumnya masih memanfaatkan fermentasi spontan tanpa adanya penambahan starter bakteri. Ikan yang digunakan untuk membuat bekasam umumnya adalah ikan air tawar dengan penambahan garam dan nasi. Garam berfungsi untuk menghambat pertumbuhan bakteri yang intoleran garam sedangkan nasi sebagai sumber karbohidrat. Proses fermentasi pada bekasam dilakukan oleh bakteri asam laktat (BAL) dengan lama fermentasi selama 3-7 hari. Beberapa penelitian yang telah dilakukan menunjukkan BAL dari bekasam merupakan bakteri yang memiliki bentuk batang atau bulat, tidak menghasilkan spora, bersifat Gram positif, tidak motil dan katalase negatif (Desniar, 2012). 2 Selama proses fermentasi bekasam, BAL menghasilkan berbagai jenis enzim untuk mendegradasi substratnya, salah satunya enzim protease. Keberadan enzim selama proses fermentasi bekasam akan mengubah rasa, tekstur, aroma dan akan meningkatkan nilai gizi (Suri, 2013). Menurut Kwok dan De Vos (1994), beberapa strain BAL mempunyai kemampuan proteolitik sehingga memungkinkan bakteri ini tumbuh pada substrat yang kaya protein. Kemampuan proteolitik BAL diperoleh karena bakteri ini dapat menghasilkan enzim protease. Protease merupakan enzim yang berperan untuk menghirolisis ikatan peptida pada protein sehingga dihasilkan senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti paptida kecil dan asam amino. Hasil isolasi yang dilakukan oleh Vichaslip (2008) dari makanan fermentasi sejenis bekasam yang berasal dari Thailand, yaitu pla-ra ditemukan beberapa jenis BAL yang memliliki aktivitas proteolitik, yaitu Pediococcus, Lactobacillus spp., L. plantarum dan L. brevis. Kemampuan proteolitik BAL berbeda-beda tergantung dari level genus dan strain pada spesies yang sama. Pada bekasam ikan bandeng ditemukan BAL yang memiliki kemampuan proteolitik sebesar 62,26 % (33 dari 53 isolat BAL), ikan tuna 43,63 % (24 dar 55 isolat BAL) dan pada bekasam ikan nila ditemukan BAL dengan kemampuan proteolitik sebesar 64,2% (27 dari 42 isolat BAL) (Wikandari et.al, 2012). 3 Perbedaan jenis ikan dalam pembuatan bekasam dapat menyebabkan perbedaan jenis BAL yang berperan dalam fermentasi bekasam sehingga kemampuan proteolitiknya juga berbeda. Hal ini disebabkan kandungan protein pada setiap jenis ikan berbeda. Penelitian yang dilakuakan Widowati et.al (2011) pada fermentasi bekasam ikan patin menganalisis kadar air, pH, total asam, total bakteri dan total bakteri penghasil asam. Sejauh ini informasi tentang BAL yang memiliki kemampuan proteolitik dalam fermentasi bekasam ikan patin belum jelas. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian ini untuk mendapatkan BAL dari bekasam ikan patin yang memiliki kemampuan proteolitik berdasarkan nilai indeks proteolitik dan aktivitas enzim protease yang meliputi pengaruh pH, suhu dan ion-ion logam. B. Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah : 1. Mendapatkan isolat BAL dari bekasam ikan Patin yang memiliki kemampuan proteolitik. 2. Mengetahui kemampuan proteolitik BAL berdasarkan nilai indeks proteolitik. 3. Mengetahui karakter aktivitas enzim protease BAL dari bekasam ikan patin yang meliputi pH optimum, suhu optimum dan pengaruh ion-ion logam. 4 C. Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai isolat BAL dari bekasam ikan Patin yang memiliki kemapuan proteolitik sehingga dapat digunakan sebagai bahan kajian untuk memproduksi enzim protease. D. Kerangka Pikir Bekasam merupakan makanan fermentasi dengan bahan dasar berupa ikan. Umumnya pembuatan bekasam berlangsung secara spontan tanpa adanya penambahan starter bakteri. Munculnya BAL pada bekasam disebabkan adanya proses penggaraman. Garam memiliki tekanan osmotik yang tinggi sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri yang intoleran garam. Bakteri yang toleran garam akan tumbuh dan menghasilkan asam selama proses fermentasi. Bakteri yang toleran pada garam diantaranya adalah BAL. Bakteri ini juga tahan terhadap lingkungan asam. BAL mampu menghasilkan berbgai jenis enzim salah satunya adalah enzim protease. Menurut Elfahri (2012), aktivitas tertinggi enzim protease BAL adalah pada jam ke 12 pada suhu 37 oC. Penelitian yang dilakukan oleh Putranto (2006) salah satu jenis BAL, yaitu Lactobacillus plantarum memiliki aktivitas enzim protease tertinggi pada jam ke-18 sebesar 0,752 U/ml. 5 Hasil penelitian Desniar (2012), menunjukkan bahwa aktivitas protease tertinggi L. palntarum terjadi pada jam ke-16. Perbedaan lamanya waktu aktivitas enzim protease diduga karena adanya perbedaan perlakuan saat inkubasi. Jenis ikan yang digunakan dalam fermetasi bekasam menyebabkan BAL yang dihasilkan memiliki kemampuan proteolitik yang berbeda. Hal ini disebabkan perbedaan kandungan protein pada setiap jenis ikan. Selain itu jenis BAL juga menentukan kemapuan proteolitiknya. Menurut Saravanakumar (2010), aktivitas enzim protease dipengaruhi beberapa parameter, yaitu sumber karbon, sumber nitrogen, pH, suhu, konsentrasi substrat dan waktu inkubasi. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Kurniati (2015), menunjukkan bahwa aktivitas proteolitik tertinggi BAL dari jenis L. plantarum terjadi pada konsentrasi glukosa 6%, pepton 6%, pH 6 dan pada jam ke- 12 inkubasi. Menurut penelitian Vishalsip (2008), pada makanan fermentasi sejenis bekasam, yaitu plara dengan bahan dasar ikan kembung ditemukan BAL dari genus Lactobacillus yang memiliki nilai indeks proteolitik sebesar 2.71 sedangkan Pediococcus memiliki indeks proteolitik sebesar 1.66. 6 Pada bekasam ikan bandeng ditemukan 33 isolat BAL proteolitik sedangkan pada bekasam ikan nila ditemukan 27 isolat BAL proteolitik. Hal ini diduga karena ikan bandeng memiliki kandungan protein lebih besar, yaitu ±20% sedangkan ikan nila memiliki kandungan protein ±17 %. Ikan patin merupakan salah satu jenis ikan yang memiliki kandungan protein cukup tinggi, yaitu 16-20%. Ini menunjukkan bahwa BAL yang memiliki kemampuan proteolitik dapat ditemukan pada bekasam ikan patin. E. Hipotesis Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah 1. BAL dari bekasam ikan patin mampu menghasilkan enzim protease. 2. BAL dari bekasam ikan patin memiliki nilai indeks proteolitik yang berbeda-beda. 3. Aktivitas enzim protease BAL dari bekasam ikan patin dipengaruhi oleh pH, suhu dan ion-ion logam. 20 III. METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2017 sampai dengan bulan April 2017 di Laborartorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung. B. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini, yaitu oven, inkubator, shaker incubator, laminar air flow cabinet, autoclave, hot palte magnetic stirrrer, centrifuge, spektrofotometer, mikroskop, water bath, cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, gelas ukur, mikropipet, mikrotip, botol aquadest, kuvet, vortex mixer, alumunium foil dan jarum ose. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu bekasam ikan Patin (Pangasius sp.), Skim Milk Agar (SMA), MRSA, MRS Broth, Trichloroacetic Acis (TCA), Na2CO3, folin ciocalteau, buffer fosfat, alkohol 70%, aquadest, garam fisiologis, ion logam MgSO4, MnSO4, CaCl2, FeCl3, CuSO4, inhibitor EDTA dan kasein hammerstein. 7 II. TINJAUAN PUSTAKA A. Deskripsi Ikan Patin 1. Ikan patin (Pangasius sp.) berasal dari sungai Mekong di Vietnam sampai sungai Chao Praya di Thailand. Keberadaan ikan patin di Indonesia merupakan hasil introduksi pada tahun 1975 di Bogor. Ikan patin merupakan ikan air tawar yang tergolong catfish, yaitu ikan yang memiliki kumis atau antenna. Ikan patin biasanya hidup di sungai terutama di liang-liang tepi sungai dan merupakan hewan yang aktif pada malam hari atau nocturnal. Kepala ikan patin berbentuk relatif kecil dengan dua pasang antenna pada sudut mulutnya. Antenna pada ikan patin berfungsi untuk petunjuk arah atau radar saat berenang serta sebagai alat peraba. Tubuh ikan patin berbentuk memanjang dengan warna putih perak dan kebiru-biruan pada bagian punggung serta tidak memiliki sisik. Ikan patin dewasa dapat mencapai ukuran panjang 120 cm (Khairuman, 2002). 2. Ikan patin memiliki sirip pada bagian punggung berbentuk jari-jari lunak sebanyak 6-7 buah. Pada bagian perut terdapat sirip yang terdiri dari 6 jari-jari lunak dan memiliki sirip anal yang tersusun dari 30-33 jari-jari lunak. 8 3. Selain itu ikan patin juga memliki sirip pada bagian dada sebanyak 1213 jari-jari lunak dan satu jari-jari keras sebagai patil (Khairuman, 2002) Berikut ini adalah gambar morfologi ikan Patin (Pangasius sp.) Gambar 1. Morfologi ikan Patin (Zarkasih, 2014). Menurut Hernowo (2001), klasifikasi ikan Patin adalah sebagai berikut : Kerajaan : Animalia Filum : Chordata Kelas : Pisces Bangsa : Ostoriophisi Suku : Schilbeidae Marga : Pangasius Jenis : Pangasius sp. 9 4. Ikan Patin merupkan salah satu ikan yang memiliki kandungan protein cukup tinggi, yaitu 16%-20%. Selain itu ikan Patin juga memiliki kandungan air sebesar 56,79%, abu 2,5%-4,5%, lemak 5,85%, karbohidrat 0,5%-1,5%, vitamin A 50.000 IU/g, vitamin D 20-200.000 IU/g, asam amino esensial 10%, asam amino non esensial 10% dan kolesterol 70 mg/g (Muhamad dan Mohamad, 2012). Ikan Patin dapat hidup pada kisaran pH antar 5-9, kandungan oksigen (O2) terlarut 3-6 ppm dan (CO2) 9-20 ppm. Ikan Patin hidup pada suhu optimum 28-30 o C (Khairuman dan Dodi, 2000). B. Bekasam 1. Bekasam merupakan makanan fermentasi yang berasal dari ikan. Bekasam banyak ditemukan di daerah Sumatera, Jawa Tengah dan Kalimantan dengan nama yang berbeda-beda. Bekasam merupakan salah satu cara pengawetan ikan yang memanfaatkan nasi sebagai sumber karbohidrat dan garam dengan proses fermentasi selama beberapa hari. Fermentasi pada bekasam akan mengubah 95% glukosa menjadi asam laktat (Hidayati, 2102). Ikan yang sering digunakan untuk membuat bekasam adalah jenis ikan air tawar. Pembuatan bekasam di daerah Kalimantan Selatan menggunakan jenis ikan air tawar, seperti ikan sepat siam, gabus, sepat rawa dan betok. Selama proses fermentasi ditambhakan garam sekitar 15-20% dan ditambahkan samu atau beras ginseng sebanyak 15%. Bekasam difermentasi selama lebih kurang satu minggu (Adawyah, 2007). 10 Bekasam juga ditemukan di berbagai negara lainnya dengan nama yang berbeda. Burong isda, Bangus merupakan nama bekasam di Philipina, heshiko dan nakazuke (Jepang) dan pla-ra, pla-chom, somfak (Thailand). Ikan hasil fermentasi bekasam akan memiliki aroma yang khas, rasa asin, asam dan tekstur ikan lebih kenyal (Wikandari, 2012). 2. Menurut Irianto (2008), pembuatan bekasam diawali dengan pemotongan dan pembersihan isi perut ikan, penggaraman dan penambahan sumber karbohidrat. Ikan segar dipotong kemudian dibersihkan sisiknya, insang dan isi perutnya. Ikan yang telah bersih selanjutnya dicuci dengan air bersih. Setelah dicuci bersih ikan direndam dalam larutan air garam 16-20% dari bobot segar ikan selama 24-48 jam. Perendaman dengan larutan garam berfungsi untuk mencegah terjadinya pembusukan sehingga tidak boleh ada kontak langsung antara ikan dengan udara luar dan larutan garam harus merendam secara sempurna. Ikan yang telah digarami kemudian dicuci dengan air bersih lalu ditiriskan. Setelah larutan garam ditiriskan selanjutnya ditambahkan sumber karbohidrat beupa campuran nasi dan tape ketan masing-masing 50% dan 25% berat ikan segar. Ikan kemudian dimasukkan ke dalam wadah yang tertutup rapat. Proses fermentasi biasanya dilakukan selama satu minngu atau lebih tergantung citarasa bekasam yang diinginkan. 11 3. Selama proses fermentasi bekasam dari hari ke 1 sampai 11 terjadi peningkatan kadar air dan total asam sebalikanya terjadi penurunan kadar protein, nilai pH, kadar abu, kadar lemak dan total volatile base (TVB). Pada hari ketujuh fermentasi penurunan kadar abu dan pningkatan kadar air dianggap konstan karena tidak terlihat perubahan yang signifikan. Sebaliknya kadar protein menurun dari 10,2% menjadi 7,8%, pH menurun dari 5,22 menjadi 3,68, kadar lemak menurun dari 4,2% menjadi 0,7%, pati menurun dari 6,12% menjadi 3,23%, TVB meningkat dari 0,12% menjadi 0,15% dan total asam meningkat dari 0,2% menjadi 0,55% (Yahya, 1997). 4. Garam merupakan salah satu bahan yang ditambahkan dalam proses fermentasi bekasam. Menurut Purwaningsih (2011), penambahan garam berfungsi untuk pemberi cita rasa bekasam dan juga berperan dalam seleksi mikroba golongan lipolitik dan proteolitk. Selama proses fermentasi protein akan dipecah oleh enzim proteolitik yang dihasilkan BAL menjadi molekul-molekul yang lebih sederhana (Thariq, 2014). Selama proses fermentasi bekasam garam akan menyebabkan kadar air berkurang sehingga menghambat pertumbuhan bakteri tertentu. Garam akan menyebabkan kondisi fermentasi lebih terkontrol sehingga hanya mikroorganisme halofilik yang mampu menghasilkan enzim proteolitik yang dapat bertahan hidup. Enzim proteolitik akan memecah protein menjadi asam amino khususnya asam glutamat yang 12 berperan dalam pembentukan rasa gurih pada makanan (Estiasih, 2009). Karbohidrat merupakan sumber energi utama dalam fermentasi bekasam. Karbohidrat akan dipecah menjadi molekul sederhana seperti glukosa oleh enzim amilase. Selanjutnya glukosa dipecah menjadi senyawa-senyawa lain tergantung jenis fermentasi. (Sastra, 2008). Menurut Setiadi (2001), penambahan sumber karbohidrat pada fermentasi bekasam dilakukan karena dapat dimanfaatkan sebagai sumber energi bagi pertumbuhan bakteri terutama BAL. BAL akan mengubah karbohidrat menjadi asam laktat sehingga terjadi penurunan pH dan menciptakan suasana asam yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak tahan pH rendah. C. Bakteri Asam Laktat (BAL) 1. Bakteri asam laktat (BAL) merupakan golongan bakteri yang dapat menghasilkan asam laktat sebabgai produk akhir fermentasi. BAL memiliki cici-ciri, yaitu berbentuk batang atau kokus, tidak motil, tidak dapat menghasilkan spora, katalase negatif, gram positif, tahan terhadap kondisi asam dan bersifat anarob fakultatif (Hutkins, 2006). BAL umumnya bersifat mesofilik namun ada beberapa jenis yang dapat tumbuh pada suhu 4 oC. BAL memiliki pH pertumbuhan 4,0-4,5 namun beberapa galur tahan pada pH 3,2 dan pH di atas 9,0 (Bamforth, 2005). 13 2. Menurut Salminen (2004) terdapat beberapa jenis BAL, yaitu : 1. Lactobacillus lactis, L. achidophilus, L. bulgaricus, L. plantarum dan L. delbrueckii. Bakteri dari genus Lactobacillus banyak ditemukan pada sayuran, berbentuk batang, sering berbentuk pasangan atau rantai dan gram positif. 2. Leuconostoc mesenteroides dan L. dextranicum Bakteri dari genus Leuconostoc umumnya ditemukan pada fermentasi sayuran, sari buah dan anggur. Leuconostoc berbentuk bulat, tersusun berpasangan seperti rantai dan gram positif. 3. Streptococcus thermophilus, S. lactis, S. cremoris. Bakteri ini umumnya ditemukan pada fermentasi susu, berbentuk bulat yang tersusun seperti rantai dan gram positif. 4. Pediococcus cerevisae Bakteri ini biasanya ditemukan pada fermentasi sayuran dan daging, gram positif, berbentuk bulat berpasangan dua-dua atau empat-empat (tetrads). 3. BAL merupakan golongan bakteri yang mampu menghasilkan asam laktat, antimikroba, hidogen peroksida dan hasil metabolisme lainnya. BAL juga bermanfaat bagi kesehatan, diantaranya dapat menurunkan kolesterol, menghambat tumor, memperbaiki daya cerna laktosa, mengendalikan bakteri patogen dalam saluran pencernaan, 14 antikarsinogenik, antimutagenik, produksi vitamin B, dan dapat mencegah sembelit (Bachrudin et al., 2000). Menurut Diop et al. (2007), BAL dalam industri pangan berperan dalam mengawetkan kualitas nutrisi bahan baku dan menghambat pertumbuhan bakteri patogen dan pembusuk. 4. Menurut Suardana (2007) BAL dapat dibedakan menjadi 2 kelompok berdasarkan hasil fermentasinya, yaitu: 1. BAL homofermentatif, yaitu BAL yang hanya menghasilkan asam laktat sebgai produk akhir fermentasi. Contohnya yaitu Pediococcus, Streptococus, dan beberapa Lactobacillus. 2. BAL heterofermentatif, yaitu BAL yang menghasilkan beberapa jenis produk akhir fermentasi seperti asam laktat, etanol, asam asetat dan CO2. Contohnya yaitu Leuconostoc, dan beberapa spesies Lactobacillus. D. Enzim Protease 1. Enzim merupakan katalisator yang berfungsi untuk meningkatkan suatu reaksi kimia. Suatu reaksi yang menggunakan enzim akan berlangsung 103-108 kali lipat lebih cepat dibandingkan tanpa enzim. Enzim dapat merubah 100-1000 molekul substrat menjadi produk tiap detiknya. Enzim memiliki sisi aktif tempat terikatnya substrat. Substrat 15 yang terikat akan membentuk kompleks enzim substrat kemudian akan dihasilkan produk. Kemampuan katalik enzim dapat hilang akibat denaturasi. Denatutasi merupakan kondisi putusnya struktur tiga dimensi enzim. Penyebab terjadinya denaturasi, yaitu suhu tinggi, ion logam berat, asam dan basa kuat dan adanya pelarut organik (Campbell dan Farrell 2006). 2. Enzim protease merupakan enzim golongan hidrolase yang mampu memecah protein menjadi molekul-molekul sederhana seperti asam amino dan oligopeptida pendek. Enzim ini diperlukan oleh semua makhluk hidu karena bersifat esensial dalam metabolisme protein (Poliana, 200). Enzim protease merupakan enzim yang memiliki banyak manfaat dalam bidang industri, baik industri pangan maupun nonpangan. Beberapa industri pangan yang menggunakan protease, contohnya industri susu, roti dan bir. Enzim dalam industri pangan bermanfaat untuk mengkonversi bahan baku menjadi bahan yang lebih mudah diolah dan lebih aman. Sedangkan dalam bidang nonpangan enzim protease dimanfaatkan untuk industri kulit, pembuatab detergen dan pakan ternak (Sawat dan Nagendran 2014). Menuurut Poernomo (2004), pemilihan bakteri dalam memproduksi enzim protease memiliki beberapa keunggulan, yaitu biaya produksi enzim relatif lebih murah, skala dalam produksi enzim mudah ditingkatkan, kondisi produksi tidak tergantung musim dan waktu dan 16 bakteri lebih mudah tumbuh dengan pertumbuhan yang lebih cepat dibandingkan organisme lainnya. 3. Enzim protease terdiri dari beberapa golongan yang dapat diisolasi dari hewan, tumbuhan dan mikroorganisme. Berikut ini adalah golongan enzim protease dan sumbernya menurut Motyan et.al (2013) : Tabel 1. Golongan Enzim Protease Golongan Protease Protease Serin Protease sistein Metaloprotease Protease aspartat Protease serin* Protease sistein* Metaloprotease* Jenis Protease Tripsin Kimotripsin Enterokinase Endoproteinase Elastase Substilin Protease K Trombin Faktor Xa WNV Protease Bromelin Papain Fisin (ficain) Rhinovirus 3C TEV protease TVWV protease Endoproteinase Termolisin Kolagenase Dispase Pepsin Katepsin D Karboksipeptidase Y Katepsin D DAPase Karboksipeptidase A Karboksipeptidase B *Enzim protease golongan eksopeptidase Sumber Hewan Hewan Hewan Mikroorganisme Hewan Mikroorganisme Mikroorganisme Hewan Hewan Mikroorganisme Tumbuhan Tumbuhan Tumbuhan Mikroorganisme Mikroorganisme Mikroorganisme Mikroorganisme Mikroorganisme Mikroorganisme Mikroorganisme Hewan Hewan Mikroorganisme Hewan Hewan Hewan Hewan 17 E. Faktor-faktor Yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim 1. Suhu Aktivitas suatu enzim sangat dipengaruhi oleh suhu. Enzim memerlukan sejumlah panas tertentu agar dapat aktif. Peningkatan suhu akan menyebabkan aktivitas enzim juga meningkat hingga titik optimum tercapai. Aktivitas enzim akan meningkat sebanyak dua kali lipat seiring peningkatan suhu sebsesar 10 0C di atas suhu minimum. Aktivitas enzim akan terus menigkat hingga tercapai titik optimum. Akan tetapi peningkatan suhu melebihi titik optimum akan menyebabkan aktivitas enzim mengalami penurunan (Pratiwi, 2008). Suhu maksimum akan menyebabkan enzim mengalami denaturasi. Denaturasi terjadi karena struktur protein terbuka dan gugus non polar yang berada di dalam molekul menjadi terbuka keluar. Hal ini menyebabkan kelarutan protein di dalam air menjadi turun, sehingga aktivitas enzim juga mengalami penurunan (Lehninger, 2005). Hubungan antara aktivitas enzim dengan suhu ditunjukkan dalam Gambar 2. Gambar 2. Hubungan aktivitas enzim dengan suhu (Poedjiadi, 1994) 18 2. pH Enzim memiliki konstanta disosiasi pada gugus asam maupun basa sehingga disebut amfolitik. Sifat amfolitik enzim ini terjadi terutama pada gugus terminal amino dan gugus residu terminal karboksilnya. Enzim mengalami perubahan kereaktifan disebabkan pengaruh pH lingkungan. Kenaikan dan penurunan pH akan mempengaruhi efektivitas enzim dalam membentuk kompleks enzim-substrat. Peningkatan pH di atas titik optimum akan menyebabkan enzim mengalami denaturasi sehingga mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim (Winarno, 1989). Hubungan kecepatan reaksi dengan pH ditunjukkan pada Gambar 3. Gambar 3. Hubungan kecepatan reaksi dengan pH (Page, 1997). 19 3. Aktivator dan Inhibitor Beberapa enzim memerlukan aktivator dalam reaksi katalisnya. Aktivator adalah senyawa atau ion yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi enzimatis. Ion logam yang dapat bertindak sebagai aktivator, diantaranya Ca, Mg, Zn dan Fe yang menginduksi aktivitas enzim protease ( Emmanuelle, 2013). Aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh senyawa penghambat enzim (inhibitor). Inhibitor dapat bersaing dengan substrat untuk berikatan dengan sisi aktif enzim sehingga dapat terjadi pengurangan laju reaksi. Inhibitor biasanya menyerupai substrat normal dengan bentuk tiga dimensinya. Karena persamaan ini, enzim dapat berikatan dengan inhibitor (Pratiwi, 2008). Ion logam yang dapat menjadi inhibitor enzim, yaitu Cd2+ dan Hg2+ dapat menghambat aktivitas protease (Nailola dkk., 2008). 21 C. Metode Penelitian Isolat BAL proteolitik diisolasi dari bekasam ikan patin melalui pengayaan pada media selektif MRSA+ skim milk. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan dan mengetahui kemampuan proteolitik secara kualitatif dan kuantitatif isolat BAL dari bekasam ikan patin serta mengaetahui karakteristik enzim yang dihasilkan. Uji kualitatif ditentukan berdasarkan indeks proteolitik melalui perbandingan antara diameter zona bening dengan diameter koloni bakteri. Isolat terpilih kemudian dilanjutkan dengan uji kuantitatif. Uji kuantitatif ditentukan berdasarkan aktivitas enzim protease melalui metode Bergemeyer dan Grassl (1983) dengan mengukur jumlah tirosin yang terbentuk. Jumlah tirosin yang terbentuk diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 578 nm. Karakterisasi terbatas enzim protease meliputi pengaruh pH, suhu dan ionion logam. D. Analisis Data Data hasil uji kualitatif dan kuantitatif yang diperoleh pada penelitian ini dianalisis secara deskriptif. 22 E. Cara Kerja 1. Pembuatan Bekasam Ikan patin segar ditimbang seberat ± 250 gram kemudian insangnya dibuang dan dibersihkan isi perutnya. Setelah dibersihkan dilakukan penggaraman dengan jumlah garam 10% bobot ikan. Selanjutnya ditambahkan nasi dengan perbandingan ikan dan nasi 1:1 dan inkubasi sampai 7 hari pada suhu ruang (Wikandari, 2012). 2. Isolasi dan Seleksi BAL Proteolitik dari Bekasam ikan Patin Isolasi dilakukan dengan cara menghaluskan bekasam sebanyak 1 gram. Kemudian bekasam dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril yang telah berisi 9 ml larutan pengencer garam fisiologis 0,85% sehingga diperoleh larutan pengenceran 10-1. Untuk pengenceran 10-2 diambil 1ml suspensi bekasam dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml ml larutan pengencer garam fisiologis lalu dihomogenkan menggunakan vortex mixer. Pengenceran dilakukan sampai 10-8 dengan cara yang sama (Candra, 2006). Selanjutnya dipipet sebanyak 1ml suspensi dari pengenceran 10-6-10-8 dan diinokulasikan pada media MRSA yang telah ditambahkan susu skim 1%, kemudian diinkubasi pada inkubator pada suhu 37 oC 23 selama 48 jam (Desniar, 2012). BAL proteolitik ditandai dengan pembentukan zona bening disekitar koloni bakteri. 3. Pemurnian Isolat BAL Proteolitik Koloni BAL proteolitik terpilih dimurnikan dengan metode goresan pada medium MRSA miring di dalam tabung reaksi. Isolat kemudian diinkubasi selama 1-2 hari pada suhu 37 oC. 4. Karakterisasi BAL Proteolitik Karakterisasi BAL proteolitik dilakukan untuk membedakan anatara isolat BAL terpilih. Karakter yang diamati adalah morfologi koloni, morfologi sel (pewarnaan Gram dan pewarnaan spora) motilitas dan uji katalase (Candra, 2006). 5. Peremajaan Isolat BAL Proteolitik BAL proteolitik yang telah dikarakterisasi kemudian diremajakan pada medium MRSA miring. Isolat diinkubasi di dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37 oC. 24 6. Penentuan Indeks Proteolitik Isolat BAL diuji kemampuan proteolitik secara kualitatif menggunakan metode Brown (2007), pada media Skim Milk Agar (SMA). Isolat BAL berumur 24 jam diambil sebanyak 1 ose kemudian di point plate ke dalam cawan petri yang berisi media Skim Milk Agar (SMA). Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Kemampuan proteolitik BAL ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening disekitar koloni (Kurniati, 2015 ). Perbandingan antara diameter area zona bening dengan diameter koloni bakteri disebut sebagai indeks proteolitik (Baehaki, 2011). Rumus indeks proteolitik: Keterangan: a = diameter zona bening b = diameter koloni (Setyaningsih, 2013). Gambar 4. Penentuan Indeks Proteolitik BAL 25 7. Karakterisasi Terbatas Aktivitas Enzim Protease 7.1. Pembuatan Starter Isolat Bakteri Asam Laktat Isolat BAL proteolitik berumur 24 jam pada media MRSA miring diambil sebanyak 3 ose kemudian diinokulasikan ke dalam erlenmeyer 250 ml yang berisi 50 ml media MRS Broth + Skim milk 2%. Selanjutnya diinkubasi pada Shaker Incubator dengan kecepatan 120 rpm selama 24 jam. 7.2. Produksi Enzim Protease Enzim protease diproduksi dengan cara menginokulasikan 10% starter isolat proteolitik ke dalam 50 ml media MRS Broth + Skim Milk. Isolat kemudian diinkubasi di atas Shaker Incubator dengan kecepatan 120 rpm selama 24 jam. Setelah 24 jam, kultur dipindahkan ke dalam tabung dan enzim dipanen dengan cara disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim yang akan diukur aktivitas proteasenya (Baehaki, 2011). 26 7.3. Penentuan pH Optimum Aktivitas Enzim Protease Penentuan pH optimum aktivitas enzim protease mengunakan berbagai macam buffer yang berbeda. Buffer yang digunakan, yaitu buffer sitrat pH 4 dan 5, buffer posfat pH 6 dan 7 dan buffer tris-HCl pH 8 dan 9. Penentuan aktivitas enzim protease diiukur berdasarkan metode Bergemeyer dan Grassl (1983). Pada uji ini dilakukan karakterisasi pH, suhu dan pengaruh ion-ion logam. Sebanyak 0.1 ml ekstrak kasar enzim ditambahkan pada campuran yang berisi 0.5 ml bufer fosfat dengan substrat kasein pH 7, 0.1 ml tirosin standar dan 0,1 ml aquadest. Selanjutnya diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37 oC Setelah 10 menit ditambahkan 0,5 ml TCA (0.1 M). Larutan diinkubasi kembali selama 10 menit pada suhu 37 o C dan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC. Kemudian diambil 0.375 ml supernatan dan ditambahkan 1.25 ml larutan Na2CO3 (0.4 M) dan 0.25 ml pereaksi Folin, selanjutnya diinkubasi selama 20 menit pada suhu 37 oC dan absorbansinya diukur pada panjang gelombang 578 nm. Satu unit aktivitas enzim protease merupakan jumlah enzim yang dapat menghasilakn 1 mmol tirosin per menit pada kondisi pengukuran. 27 Aktivitas ptotease dihitung dalam satuan PU (Protease Unit) per ml ekstrak enzim. 7.4. Penentuan Suhu Optimum Aktivitas Enzim Protease Suhu optimum enzim diketahui melalui proses inkubasi enzim dengan variasi suhu yang berbeda yaitu 35 oC, 37 oC, 40 oC, 45 oC, 50 oC, 55 oC, 60 oC dan 65 oC pada pH optimum. Selanjutnya dilakukan pengukuran aktivitas enzim dengan mengikuti metode Bergmeyer dan Grassl (1983). Suhu yang menghasilkan aktivitas enzim tertinggi menunjukkan suhu optimum. 7.5. Penentuan Pengaruh Ion-ion Logam Terhadap Aktivitas Enzim Protease Pada penelitian ini digunakan senyawa inhibitor asam etilen diamintetraasetat (EDTA), sedangkan logam yang digunakan, yaitu MgSO4, MnSO4, CaCl2, FeCl3 dan CuSO4 dengan konsentrasi 1 mM dan 5 mM. Uji ini dilakukan dengan pH dan suhu optimum enzim protease yang telah diketahui berdasarkan metode Bergmeyer dan Grassl (1983). 28 Tabel 2. Metode Pengujian Aktivitas Enzim Protease Blanko Standars Sampel (ml) 0.5 (ml) 0.5 (ml) 0.5 0.1 0,1 - 0.1 - Inkubasi pada 37 oC selama 10 menit TCA (0,1 M) 0.5 Enzim 0.1 Aquadest - 0.5 0.1 - 0.5 0.1 Kasein 2 mM dalam buffer Fosfst (0.01) M pH 7 Enzim Tirosin standard Aquadest Inkubasi pada 37 oC selama 10 menit Sentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC Supernatan 0.375 0.375 Na2CO3 (0,4M) 1.25 1.25 Pereaksi Folin (1:2) 0.25 0.25 0.375 1.25 0.25 Diamkan selama 20 menit pada suhu 37 oC Baca absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm Aktivitas ptotease dihitung dalam satuan PU (Protease Unit) per ml ekstrak enzim (Djajasukma, 1993). PU = X Keterangan : PU : Unit Aktivitas Protease (Unit/ml) Asb : Nilai Absorbansi Sampel Ast : Nilai Absorbansi Standard Abl : Nilai Absorbansi Blanko T : Waktu 29 F. Diagram Alir Diagram alir penelitian adalah sebagai berikut. Pembuatan Bekasam Ikan Patin Isolasi dan Seleksi BAL Proteolitik Pemurnian Isolat BAL Proteolitik Karakterisasi BAL Proteolitik Peremajaan Isolat BAL Proteolitik Uji Kemampuan Proteolitik Penentuan Indeks Proteolitik (IP) Penentuan Aktivitas Enzim protease - Pembuatan Starter BAL Produksi Enzim Protease Penentuan Pengaruh pH, Suhu dan Ion-ion Logam Gambar 5. Diagram Alir Penelitian 47 V. SIMPULAN DAN SARAN A. Simpulan Berdasarkan hasil penelitian maka dapat disimpulkan : 1. BAL dari Bekasam Ikan Patin mampu menghasilkan enzim protease. 2. Enam isolat BAL dari bekasam ikan patin memiliki nilai indeks proteolitik yang berbeda-beda. 3. Aktivitas tertinggi enzim protease isolat BP2 terjadi pada pH 8 dan suhu 40 oC sebesar 0,57 U/ml. Logam Fe3+, Mg2+ dan Mn2+ (5 mM) digolongkan kedalam aktivator enzim protease, sedangkan logam Fe3+, Mg2+ dan Mn2+ (1 mM), Ca2+, Cu2+ dan EDTA ( 1 mM dan 5 mM) digolongkan kedalam inhibitor enzim protease. B. Saran Disarankan dilakukan pengujian lanjutan dengan pemurnian enzim protease terlebih dahulu, sehingga diperoleh karakter pH, suhu, pengaruh inhibitor dan ion-ion logam yang lebih tepat. 48 DAFTAR PUSTAKA Adawyah R. 2007. Pengolahan dan Pengawetan Ikan. Jakarta: Bumi Aksara. Anggrahini, D.N.D. 2016. Produksi, Pemekatan dan Karakterisasi Enzim Protease dari Lactobacillus plantarum SK(5). Tesis. Institut Pertanian Bogor. Bogor Atlas, M., R. Bartha. 1997. Microbial Ecology : Fourth Edition. Addison Wesley Longman. USA. Axelsson L. 2004. Lactic acid bacteria: classification and physiology. Di dalam Salminen S, Wright SV, Ouwehand A, editor. Lactic Acid Bacteria. Microbiological and Functional Aspects Third edition, Revised and Expanded. New York: Marcel Dekker, Inc. hlm 19-68. Bachrudin, Z., Astuti, dan Y.S. Dewi. 2000. Isolasi dan seleksi mikroba penghasil laktat dan aplikasinya pada fermentasi. Limbah Industri Tahu. Prosiding Seminar Nasional Industri Enzim dan Bioteknologi. Mikrobiologi Enzim dan Bioteknologi. Baehaki, A., Suhartono, M.T., Palupi, N.S., dan Nuhayati, T., 2004, Karakterisasi protease dari bakteri patogen Staphylococcus aureus dan Klebsiella sp. ProsidingSeminar Nasional dan Kongres PATPI, ISBN: 979-99965-0-3, 281 – 287. Baehaki, A., T. Nurhayati, dan M.T. Suhartono. 2005. Karakteristik Protease Dari Bakteri Patogen Saphylococcus epidermidis. Buletin Teknologi Hasil Pertanian. Vol. VIII Nomor 2. Baehaki, A., Suhartono, M.T, Palupi N.S dan Nurhayati, T. 2008. Purufikasi dan Karakterisasi Protease dari Bakteri Patogen Pseudomonas aeruginosa. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan Vol. XIX No. 1 Th. 2008. Baehaki, A., Rinti dan A. Budiman. 2011. Isolasi Dan Karakterisasi Protease Dari Bakteri Tanah Rawa Indralaya, Sumatera Selatan. Jurnal Akta Agrosia Edisi Khusus No. 2 : 172-175. Bamforth CW. 2005. Food, Fermentation and Micro-organisms. Iowa: University of California. Blackwell Science Ltd. hlm 31-33. Beg, Q.K., dan Gupta, R., 2003, Purification and Characterization of An Oxidation-stable, Thioldependent Serine Alkaline Protease from Bacillus mojavensis, Enzyme and Microbial Technology, 32(2), 294 – 304. 49 Bergmeyer, H.U. and M. Grassl. 1983. Methods of Enzymatic Analysis Vol 2. Verlag Chenie. Weinheim. Brown, A.E. 2007. Laboratory Manual In General Microbiology. Mc Graw Hill. New York. Campbell MK, Farell SO. 2006. Biochemistry. Ed ke-5. Weinheim (US): Yhomson Learning Inc. Candra, J.I. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Dari Produk Bekasam Ikan Bandeng (Chanos chanos). Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Desniar. 2012. Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Produk Fermentasi Ikan (Bekasam). Tesis. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Dewi, K.W. 2006. Pemurnian dan Pencirian Protease dari Isolat Bakteri W-1 yang Dihasilkan Oleh Tauco Hitam. Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Djajasukma. 1993. Isolasi Enzim Protease Dari Mucor javanicus. Pros. Seminar Hasil Litbang SDH. Diop MB, Dubois-Dauphin R, Tine E, Ngom A, Destain J, Thonart P. 2007. Bacteriocin producers from traditional food products. Biotechnol Agron Soc Environ. 11(4): 275–281. Elfahri K. 2012. Release of bioactive peptides from milk proteins by Lactobacillus spesies [tesis]. Melbourne (US): Victoria University. Emmanuelle, Amanda. 2013. Integrated Process Production and Extraction of the Fibrinolytic Protease from Bacillus sp. UFPEDA 485. Biochem Biotechnol (2013) 170:1676–1688. Fathimah, A.N dan Wardani A.K. 2014. Ekstraksi dan Karakterisasi Enzim Protease dari Daun Kelor (Moringa olifera Lamk.). Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 15 No. 3. Fatoni, A., Zusfhair dan Lestari, P. 2008. Isolasi dan Karakterisasi Protease Ekstraseluler dari Bakteri dalam Limbah Cair Tahu. Jurnal Nature Indonesia. 10(2): 83-88. Femi-Ola TO, Oladakun DO. 2012. Partial purification and characterization of a thermostable alkaline protease from Lactobacillus brevis. Mal J Microbiol. 8: 1-5. Fithri, Choirunnisa,. Joni, Kusnadi. dan R. Chrisnasari. 2008. Viabilitas dan Deteksi Subletal Bakteri Probiotik pada Susu Kedelai Fermentasi Instan Metode Pengeringan Beku (Kajian Jenis Isolat dan Konsentrasi Sukrosa sebagai Krioprotektan). Jurnal Tek.Pertanian, Vol. 9 No. 1. 40-51. Hames BD, Hooper NM. 2000. Biochemistry: The Instant Notes 2nd ed. Hongkong: Springer-Verlag. p83-84. 50 Hernowo. 2001. Pembenihan Ikan Patin. Penebar Swadaya. Jakarta. Huang G, Ying T, Huo P, Jiang J. 2006. Purification and characterization of a protease from thermophilic Bacillus strain HS08. Biotechnology. 5:24332438. Hutkins RW. 2006. Microbiology and Technology of Fermented Foods. Lowa: IFT Press. Blackwell Publishing Ltd. hlm 3-49. Hidayati, L., Chisbiyah, L.A., Kiranawati, T.M. 2012. Evaluasi Mutu Organoleptik Bekasam Ikan Wader. Jurnal TIBBS Vol. 3 No. 1: 44-51. Irianto HE. 2008. Produk ikan fermentasi tradisional Indonesia. Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, Badan Riset Kelautan dan Perikanan. Departemen Kelautan dan Perikanan. Jakarta Khairuman. 2002. Budidaya Patin Secara Intensif. PT. Agromedia Pustaka. Jakarta Khairuman dan Dodi, S. 2000. Budidaya Patin Secara Intensif. Agromedia Pustaka. Jakarta. Kosim, M., dan Putra, S.R., 2010, Pengaruh Suhu Pada Protease Dari Bacillus subtilis, Prosiding Skripsi Semester Genap 2009-2010, Jurusan Kimia FMIPA ITS, Surabaya. Kurniati, N. 2015. Produksi Enzim Protease Dari Bakteri Asam Laktat Asal Bekasam. Tesis. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Kwok, J. De Vos W.M. 1994. The Proteolytic System of Lactic Acid Bacteria. In : Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria. Ed Gasson abd De Vos. 1994. Balckie Academic & Profesional. Glasgow. Lehninger, A.L. 2005. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga. Jakarta. Motyan JA, Toth F, Tozser J. 2013. Research application of proteolytic enzymes in molecular biology. Biomolecules. 3: 923-942. Muhamad NA, Mohamad J. 2012. Fatty Acids Composition of selected Malaysian fishes. Sains Malaysiana 41(1):81–94. Murniyati dan Sunarman. 2000. Pendinginan, Pembekuan dan Pengawetan Ikan. Kanius. Yogyakarta. Murti, T.W., dan T. Hidayat. 2009. Pengaruh Pemakaian Kultur Tiga Macam Bakteri Asam Laktat dan Pemeraman Terhadap Komposisi Kimia dan Flavour Keju. Journal of the Indonesian Tropical Animal Agriculture. Murtini JT. 1992. Bekasam Ikan Mas. Kumpulan Hasil-hasil Penelitian Pasca Panen Perikanan. Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Pusat Penelitian dan Pengembangan Perikanan 51 Nailola, E dan Nunuk W. 2008. Semi Purifikasi dan Karakterisasi Enzim Protease Bacillus sp.. Jurnal Bidang Mikrobiologi LIPI. 13(51-56). Page, D.S. 1997. Prinsip-Prinsip Biokimia. Erlangga. Jakarta. Poedjiadi, A.1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta.UI-Press. 155, 158-160. Poernomo, A. T., dan Purwanto, D.A., 2003. Uji Aktifitas Crude Enzim Proteolitik Bacillus subtilis FNCC 0059 Hasil Fermentasi Curah. Majalah Farmasi Airlangga, 3: 103–107. Poliana J dan Mac CAP. 2007. Industrial enzymes: structure, function, and applications. Dordrecht: Springer Hal: 24. Pramono, Y. B., Rahayu, E. S., Saparno dan Utami, T. 2007. The Microbiologycal, Physical, and Chemical Changes of Petis Liquid during Dry Spontaneous Fermentation. [J.Indon.Trop.Anim.Agric. 32 [4] Dec 2007]. Universitas Diponegoro, Semarang. Pratiwi, S.T.2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Yogyakarta. Purwaningsih, S, Garwan, R dan Santoso, J. 2011. Karakteristik Organoleptik Bakasang Jeroan Cakalang (Katsuwonus pelamis, Lin) sebagai Pangan Tradisional Maluku Utara. [Journal of Nutrition and Food, 2011, 6(1): 13– 17]. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Putranto, WS. 2006. Purifikasi dan karakterisasi protease yang dihasilkan Lactobacillus acidophilus dalam fermentasi susu sapi perah. Seminar Nasional Bioteknologi “Capturing opportunities through biotechnology”; 2006 November 15-16; Cibinong, Indonesia. Cibinong (ID): Pusat Penelitian Bioteknologi. Rahayu WP, Ma’oen S, Suliantari, Fardiaz S. 1992. Teknologi Fermentasi Produk Perikanan. Bogor: Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor Rahmani, Yunianta dan Martati, E. 2007. Pengaruh Penggaraman Basah terhadap Karakteristik Produk Ikan Asin Gabus (Ophiocephalus striatus). [Jurnal Teknologi Pertanian, Vol.8 No.3]. Teknologi Hasil Pertanian, Universitas Brawijaya, Malang. Ross RP, Morgan S, Hill C. 2002. Preservation and fermentation: past, present and future. Int J Food Microbiol 79:3-16. Said I.M. dan Ningrum E.M. 2009. Karakterisasi dan purifikasi protease bakteri Bacillus sp. dan jamur Aspergillus sp. serta aplikasinya sebagai soaking agent pada proses penyamakan kulit kambing (Abstrak). Hibah Penelitian Kerjasama (Hibah Pekerti) : LP2M, UNHAS. Makasar. Salminen, S., A.V. Wright, dan A. Ouwehand. 2004. Lactic Acid Bacteria Microbiological and functional Aspects. Marcel Dekker, Inc, New York. 52 Sastra, W. 2008. Fermentasi Rusip. [Skripsi]. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Saravanakumar K, Baskaran R, Kubendran TR. 2010. Acoustic and thermodynamic properties of binary liquid mixtures of acetophenone and benzene. J Appl Sci. 10: 1616-1621. Setiadi, A.N. 2001. Mempelajari Penggunaan Cairan Pikel ketimun sebagai Sumber Bakteri Asam Laktat pada Pembuatan Bekasam Ikan Tawes. [Skripsi]. IPB. Bogor. Setyanigsih, I., Nurhayati,T., Aremhas, U. 2013. Pengaruh Media Kultivasi Chaetoceros gracilis Terhadap Kandungan Kimiawi dan Potensi Inhibitor Protease. J.Teknol. dan Industri Pangan 24(2). Institut Pertanian Bogor. Bogor. Sharmin S, Hossain T, Anwar MN. 2004. Proteolytic activity of a Lactobacillus spesies isolated from rumen. Pakist J Biol Sci. 7: 2105-2108. Suardana, W. 2007. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Cairan Rumen Sapi Bali sebagai Kandidat Biopreservatif. J. Veter. 8(4) : 155-159. Suri WL, Syukur S, Jamsari. 2013. Optimization of protease activity from lactic acid bacteria (LAB) Pediococcus pentosaceus isolated from soursop fermentation (Annona muricata L.). J Kimia Unand. 2:1. Tanasupawat S, Visessanguan W. 2008. Thai fermented foods: microorganisms and their health benefits. Dalam: Farnworth ER, editor. Handbook of Fermented Functional Foods. Edisi. ke-2. Boca Raton: CRC Press Taylor & Francis Group. hlm 495-512. Thariq, A.S., Swastawati, F. dan Surti, T.2014.Pengaruh Perbedaan Konsentrasi Garam padaPeda Ikan Kembung (Rastrelliger neglectus) terhadap Kandungan Asam Glutamat Pemberi Rasa Gurih (UMAMI). Jurnal Pengolahan dan Bioteknologi Hasil Perikanan. Vol. 3 No. 3: 104-111. Vichasilp C, Sangjindavon M, Wiliapun P. 2008. The use of selected lactic acid bacteria isolates for accelaration of fermented fish (Pla-ra) process. Kasetsart Univ Fish Res Bull. 32(3) :17-25. Wanenoor. 2011. Sentral Dogma Biologi, Pengertian Gen, DNA, RNA, Ekspresi Gen, serta Transkripsi DNA. http://wanenoor.blogspot.com/2011/11/sentraldogma-biologi-pengertian-gen.html. Diakses tanggal 15 April 2017. Wardani AK, Nindita LO. 2012. Purifikasi dan karakterisasi protease dari bakteri hasil isolasi dari whey tahu. J Teknol Pertan. 13: 149-156. Widowati, T.W, Taufik M, dan Wijaya A. 2011. Pengaruh Pra Fermentasi Garam Terhadap Karakteristik Kimiawi Dan Mikrobiologis Bekasam Ikan Patin. Prosisding Semirata BKS Barat Bidang Ilmu Pertanian. 53 Wikandari PR, Suparmo, Marsono Y, Rahayu ES. 2012. Karakterisasi bakteri asam laktat proteolitik pada bekasam. J Natur Indones. 14(2):120-125. Winarno, F.G. 1986. Enzim Pangan dan Gizi. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. Halaman 155. Yahya D, Wibowo P, Darmadji. 1997. Karakteristik bakteri asam laktat dan perubahan kimia pada fermentasi "bekasam" ikan mujair (Tilapia mossambica). Berkala Penelitian Pasca Sarjana. X(1): 105-118. Yanti. 2003. Pemurnian dan karakterisasi protease cacing tanah Lumbricus rubellus yang bersifat fibrinolitik [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Yuningsih, S. 2006. Isolasi dan Pencirian Protease dari Bakteri Isolat Nato. Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Bogor Zelvina, O. 2009. Analisis Pendapatan Usaha Pembenihan dan Pemasaran Benih Ikan Patin di Desa Tegal Waru Kecamatan Ciampea Kabupaten Bogor. [Skripsi]. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Zarkasih, M.H. 2014. Pengaruh Pemberian Cacing Sutera (Tubifex sp.) dan Keong Sawah (Pila ampullacea) Terhadap Pertumbuhan Ikan Patin (Pangasius sp.) Skripsi. Universitas Sumatera Utara. Medan.
