disertasi saponin daun andong
advertisement
DISERTASI SAPONIN DAUN ANDONG (CORDYLINE TERMINALIS KUNTH) MENURUNKAN KOLESTEROL PLASMA DENGAN MENINGKATKAN EKSKRESI KOLESTEROL DAN ASAM EMPEDU FESES PADA TIKUS WISTAR SERTA MEMBENTUK KOMPLEKS DENGAN KOLESTEROL SECARA IN VITRO NI WAYAN BOGORIANI PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015 DISERTASI SAPONIN DAUN ANDONG (CORDYLINE TERMINALIS KUNTH) MENURUNKAN KOLESTEROL PLASMA DENGAN MENINGKATKAN EKSKRESI KOLESTEROL DAN ASAM EMPEDU FESES PADA TIKUS WISTAR SERTA MEMBENTUK KOMPLEKS DENGAN KOLESTEROL SECARA IN VITRO NI WAYAN BOGORIANI NIM 1190271004 PROGRAM DOKTOR PROGRAM STUDI ILMU KEDOKTERAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015 SAPONIN DAUN ANDONG (CORDYLINE TERMINALIS KUNTH) MENURUNKAN KOLESTEROL PLASMA DENGAN MENINGKATKAN EKSKRESI KOLESTEROL DAN ASAM EMPEDU FESES PADA TIKUS WISTAR SERTA MEMBENTUK KOMPLEKS DENGAN KOLESTEROL SECARA IN VITRO Disertasi untuk memperoleh Gelar Doktor pada Program Doktor, Program Studi Ilmu Kedokteran Program Pascasarjana Universitas Udayana NI WAYAN BOGORIANI NIM 1190271004 PROGRAM DOKTOR PROGRAM STUDI ILMU KEDOKTERAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015 Disertasi Ini Telah Diuji pada Ujian Tertutup pada Tanggal: 19 November 2014 Panitia Penguji Disertasi berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana No. 4030/UN14.4/HK/2014 Tanggal 22 Oktober 2014 Ketua : Prof. Dr. drh. I Ketut Berata, M.Si. Anggota : 1 .Prof. Dr. Ir. Ida Bagus Putra Manuaba,M.Phil. 2. Prof. Dr. Dr. Ketut Suastika, Sp.PD.KE. 3. Prof. Dr. dr. I Wayan Wita, Sp.JP. 4. Prof. Dr.drh. Iwan Harjono Utama,M.S. 5. Prof. Dr. Drs. I Made Sutajaya, M.Kes. 6. Dr. dr. I Wayan Putu Sutirta Yasa, M.Si. 7. Dr. dr. I Dewa Made Sukrama, M.Kes.Sp.MK(K) ASUPAN SAPONIN DAUN ANDONG DAPAT MENURUNKAN KOLESTEROL PLASMA, MENINGKATKAN EKSKRESI ASAM EMPEDU DAN KOLESTEROL FESES PADA TIKUS WISTAR SERTA MEMBENTUK KOMPLEKS DENGAN KOLESTEROL SECARA IN VITRO ABSTRAK Saponin di duga dapat menurunkan kolesterol plasma dengan dua cara yaitu menghambat penyerapan kolesterol di usus (langsung) dan menghambat penyerapan asam empedu di usus (tidak langsung), dengan berbagai mekanisme yang belum jelas. Tujuan penelitian ini adalah membuktikan bahwa asupan saponin daun andong, dapat menghambat penyerapan kolesterol dan asam empedu di usus sehingga menurunkan kolesterol total dan asam empedu total plasma, dengan meningkatkan ekskresi kolesterol dan asam empedu feses. Rancangan penelitian ini adalah randomized post-test only control group design, yang dilakukan pada tikus wistar. Dua puluh lima ekor tikus dibagi menjadi empat kelompok yaitu; kontrol, perlakuan 1, perlakuan 2, dan perlakuan 3, masingmasing 6 ekor tikus. Kelompok kontrol hanya diberikan makanan standar, perlakuan 1 diberikan makanan tinggi kolesterol, perlakuan 2 diberikan makanan tinggi kolesterol dan saponin daun andong 30 mg/hari, dan perlakuan 3 diberikan makanan tinggi kolesterol dan gemfibrozil 30 mg/hari. Setelah perlakuan 30 hari dan tikus dipuasakan 18 jam, sampel darah diambil dan plasma dipisahkan untuk pemeriksaan kolesterol total, dan asam empedu. Tiga hari terakhir perlakuan dikumpulkan feses tikus untuk pemeriksaan kolesterol total dan asam empedu total. Pada penelitian ini juga dilakukan interaksi antara saponin dengan kolesterol secara in vitro. Hasil yang didapat menunjukkan terjadi kenaikkan kolesterol total plasma, dan penurunan ekskresi kolesterol total, dan asam empedu total feses yang bermakna (p<0,05). Pada perlakuan 2 dan 3 terjadi sebaliknya. Secara in vitro saponin mampu mengikat kolesteol 85,07% dan lebih tinggi daripad gemfibrozil hanya 74,83%, terjadi perbedaan yang bermakna (p<0,05). Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa asupan saponin daun andong dapat menurunkan kolesterol dan asam empedu plasma dengan cara menghambat penyerapan kolesterol dan asam empedu di usus, sehingga ekskresi kolesterol dan asam empedu total feses meningkat. Saponin daun andong juga terbukti mampu mengikat kolesterol lebih tinggi daripada gemfibrozil secara in vitro. Kata kunci : saponin, asam empedu total, kolesterol total, makanan tinggi kolesterol SAPONIN INTAKE OF ANDONG LEAVES LOWERED PLASMA CHOLESTEROL AND BILE ACIDS WITH INCREASED THE EXCRETION FECAL CHOLESTEROL AND BILE ACIDS IN WISTAR RATS AND FORMED OF COMPLEX WITH CHOLESTEROL Saponins in the suspect can lower plasma cholesterol with two of method that is inhibiting cholesterol absorption (directly) and inhibiting bile acids (indirectly) in the gut, the various mechanisms that are still unclear. The purpose of this study is to prove that saponin intake of Andong leaf, can inhibit cholesterol absorption, thus lowering plasma cholesterol and total bile acids, by increasing the excretion total cholesterol and bile acids of feces. The study design was a randomized post-test only control group design, conducted in Wistar rats. Twenty-five rats were divided into four groups; Control, treatment 1, treatment 2, and treatment 3, each of 6 rats. The control group was given only the standard diet, treatment 1 was given high-cholesterol foods, treatment 2 was given high-cholesterol foods and andong leaf saponin 30 mg / day, and treatment 3 was given high-cholesterol foods and gemfibrozil 30 mg / day. After treatment 30 days and the rats were fasted 18 hours, blood samples were taken and plasma separated for examination of cholesterol, and bile acids. Three days last treatment the rats feces were collected for examination of total cholesterol and total bile acids. The results showed an increase in total cholesterol, LDL cholesterol, triglycerides, ratio of total cholesterol / HDL and a decrease in HDL cholesterol, and excretion fecal total cholesterol, total bile acids were significantly (p <0.05). In treatments 2 happen otherwise. Saponin is capable to bind cholesterol (85.07%) more than gemfibrozil (74.83%) in vitro. Based on the results of this study concluded that the intake of saponins andong leaves can inhibit the absorption of cholesterol directly and indirectly in the intestine, thus lowering plasma cholesterol and bile acids by increasing the excretion of fecal total cholesterol and total bile acids. Saponins of andong leave too proven capable to bind cholesterol more than gemfibrozil in vitro. Keywords: saponins, total bile acids, total cholesterol, foods high in cholesterol DAFTAR ISI Halaman JUDUL……………………………………………………………………… HALAMAN PENGESAHAN……………………………………………… UCAPAN TERIMA KASIH……………………………………………… DAFTAR ISI……………………………………………………………….. DAFTAR TABEL…………………………………………………………. DAFTAR GAMBAR..................................................................................... DAFTAR LAMBANG/SINGKATAN…………………………………….. DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………. i ii iii v vii viii ix x BAB I PENDAHULUAN………………………………………………….. 1.1 Latar Belakang Masalah….………………………………………… 1.2 Rumusan Masalah………………………………………………….. 1.3 Tujuan Penelitian…………………………………………………… 1.3.1 Tujuan umum………………………………………………… 1.3.2 Tujuan khusus………………………………………………… 1.4 Manfaat Penelitian…………………………………………………. 1.4.1 Manfaat akademik…………………………………………… 1.4.2 Manfaat praktis………………………………………………. 1 1 7 8 8 8 8 8 9 BAB II KAJIAN PUSTAKA…….………………………………………… 2.1 Tanaman Andong…………………………………………………… 2.1.1 Khasiat dan kegunaan tanaman andong……………………… 2.1.2 Kandungan Kimia Daun Andong ……..................................... 2.1.3 Saponin……………………………………………………...... 2.1.4 Identifikasi saponin………………………………………….. 2.1.5 Biosintesis steroid atau triterpen…………………………….. 2.1.6 Aktivitas biologi saponin……………………………………. 2.1.6.1 Aktivitas hipokolesterolemia………………………….. 2.1.6.2 Aktivitas antikarsinogenik…………………………….. 2.2 Metabolisme Kolesterol…………………………………………… 2.2.1 Kolesterol……………………………………………………. 2.2.2 Penyerapan kolesterol di usus……………………………….. 2.2.3 Pengaturan metabolisme kolesterol ......................................... 2.2.4 Transport kolesterol................................................................. 10 10 10 10 13 17 19 20 21 22 22 22 24 26 30 2.3 Metabolisme Asam Empedu.............................................................. 2.3.1 Struktur asam empedu............................................................. 32 32 35 36 2.3.2 Biosintesis asam empedu....................................................... 2.3.3 Sintesis asam empedu pada hati............................................. 2.4 Dislipidemia..................................................................................... 38 2.4.1 Klasifikasi dislipidemia........................................................... 42 2.4.2 Etiologi dislipidemia ............................................................... 2.5 Pengaruh Saponin terhadap Metabolisme Kolesterol........................ 43 44 BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS............... 3.1 Kerangka Berpikir Penelitian………………………………………. 3.2 Konsep Penelitian…………………………………………………... 3.3 Hipotesis Penelitian………………………………………………… 49 49 50 51 BAB IV METODE PENELITIAN………………………………………… 4.1 Rancangan Penelitian………………………………………………. 4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian………………………………………. 4.3 Penentuan Sumber Data dan Sampel………………………………. 4.3.1 Populasi……………………………………………………… 4.3.2 Kriteria inklusi dan eksklusi…………………………………. 4.3.3 Besar sampel…………………………………………………. 4.4 Variabel Penelitian…………………………………………………. 4.4.1 Hubungan antar variabel……………………………………. 4.4.2 Definisi Operasional Variabel………………………………. 4.5 Bahan Penelitian…………………………………………………… 4.6 Instrumen Penelitian....................................................................... 4.7 Prosedur Penelitian............................................................................. 4.7.1 Ekstraksi saponin....................................................................... 4.7.2 Ekstraksi kolesterol secara in vitro........................................... 4.7.3 Penelitian terhadap tikus ......................................................... 4.7.4 Tahap Pemeriksaan Laboratorium............................................. 4.7.5 Alur Penelitian ......................................................................... 4.9 Analisis Data………………………………………………………… 52 52 53 53 53 53 53 54 54 55 56 56 56 56 57 58 59 60 61 DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………… 64 LAMPIRAN……………………………………………………………….. 73 DAFTAR TABEL Halaman 2.1 Komposisi lipoprotein plasma darah manusia…………………………… 2.2 Klasifikasi kolesterol total, kolesterol LDL,kolesterol HDL dan Tg…….. 31 43 DAFTAR GAMBAR Halaman 2.1 2.2 2.3 2.4 Tanaman Andong (Wijayakusuma,1994)............................................ Struktur sapogenin steroid (Blunden et al., 1981) Struktur saponin steroid daun andong (Bogoriani, 2001 dan 2008)..... Struktur sapogenin dari saponin(Hostettmann and Marton, 1995; Chaieb, 2010)..................................................................................... 2.5 Hasil reaksi hidrolisis total dan parsial saponin(Ahmed et al., 2012).. 2.6 Biosintesis triterpen dan steroid(Hostettmann and Marton, 1995)..... 2.7 Struktur molekul kolesterol (Ros, 2000)........................................... 2.8 Penyerapan kolesterol intestinal(Charlton-Menys and Durrington, 2007). 2.9 Pengaturan metabolisme kolesterol (Wirahadikusumah, 1985)........... 2.10 Konversi kolesterol menjadi asam empedu(Vance and Vance, 2002).. 2.11 Aksi garam empedu sebagai pengemulsi lemak dalam usus (Almatsier, 2002)................................................................................................... 2.12 Metabolisme Asam empedu (BA) pada manusia ((Lefebvre, et al.,2009) 2.13 CVD dan penyebab kematian utama yang lain untuk laki-laki dan perempuan (National Center for Health Statistics. Health, United States, 2000)……………………………………………………. 2.14 Diagram Skematik dari struktur pembentukan misel oleh (a) asam empedu (b) saponin dan (c) saponin dan asam empedu (Shidu and Oakenfull,1986).............................................................................. …. 11 11 12 3.1 Bagan kerangka konsep penelitian........................................................... 50 4.1 4.2 4.3 4.3 52 54 60 61 Bagan rancangan penelitian................................................................... Hubungan antar Variabel........................................................................... Skema proses perlakuan saponin dan ekstraksi kolesterol....................... Bagan Alur Penelitian.............................................................................. 16 18 19 22 27 29 32 34 40 42 47 DAFTAR SINGKATAN/LAMBANG ATP ABC-1 ABCG8 ABCG5 APO B48 ASBT C : Adenosine Triphosphat : Adenosine Triphosphate Binding Cassette transforter-1 : Adenosine Triphosphat Binding Cassette Transforter-G8 : Adenosine Triphosphat Binding Cassette Transforter-G5 : Apolipoprotein B48 : Apical sodium codependent bile acid trasporter : Carbon CETP CVD : Cholesterol Ester Transfer Protein : Cardiovasculer Desease CYP7A CYP27 : 7α-hidroksilase : 27- hidroksilase DM : Diabetes Melitus Enzim-ACAT : Acyl CoA-Cholesterol-Acyltransferase ER FFA FL : Endoplasma Ritikulum : Free Fatty Acid : Fosfolipid HDL-C HMG-CoA IBAT IDL LCAT LDL-C : High Density Lipoprotein- Cholesterol : Hidroksil Metil Glutaril CoA : Ileal Na+/bile acid cotransporter : Intermediate Density Lipoproteins : Lecithin Cholesterol Acetyl Transferase : Low Density Lipoprotein-Cholesterol Lp : Lipoprotein LOX-1 : Ox LDL Receptor1 LPL : Lipoprotein lipase MTP : Mikrosomal Trigliserida Transfer Protein NADPH : Nikotinamid adenin dinukleotida pospat tereduksi NPC1L1 : Niemann-Pick C1 like 1 NCEP-ATP III : National Cholesterol Education Program Adult Panel III PJK : Penyakit Jantung Koroner RBC SR-A SR-B1 Tg : Red Blood Cell : Scavenger Receptor –A : Scavenger Receptor Class B Type 1 : Trigliserida VLDL : Very high density lipoprotein BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Masalah Kemajuan jaman dewasa ini telah membuat sebagian besar masyarakat mengalami perubahan gaya hidup yang dipengaruhi oleh urbanisasi dan modernisasi serta kurangnya aktivitas olah raga, termasuk diantaranya pola makan. Dalam hal pola makan, masyarakat cenderung memilih hal-hal yang bersifat cepat dan instant tanpa memperhatikan efek samping yang ditimbulkannya, sehingga dapat menyebabkan munculnya beragam penyakit, seperti kanker, diabetes mellitus, hipertensi, stroke, aterosklerosis, katarak, dan penyakit jantung koroner (PJK) (Kopin and Lowenstein, 2010). Salah satu penyebab timbulnya penyakit-penyakit degeneratif tersebut adalah karena kelebihan kolesterol dalam tubuh. Kolesterol dalam tubuh berasal dari dua sumber, yaitu sepertiga kolesterol berasal dari makanan disebut kolesterol eksogen, dan duapertiga kolesterol yang diproduksi sendiri oleh tubuh disebut kolesterol endogen (Wilson and Rudel, 1994; Iqbal and Hussain, 2009). Kolesterol sebenarnya sangat diperlukan dalam berbagai proses metabolisme tubuh, misalnya sebagai bahan pembentuk dinding sel, membuat asam empedu untuk mengemulsikan lemak, selain itu juga dibutuhkan untuk membuat vitamin D dan juga berperan sebagai bahan untuk hormon sex dan kortikosteroid. Tetapi kadar kolesterol yang berlebihan di dalam tubuh akan berdampak buruk bagi kesehatan, dapat menimbulkan dislipidemia dan penyakit jantung (Iqbal and Hussain, 2009). Ada korelasi positif antara peningkatan konsentrasi kolesterol serum dan resiko penyakit jantung koroner. Penyakit jantung merupakan penyebab utama kematian di United States (http://www.cdc.gov/). Berdasarkan hasil penelitian pada hewan dan manusia menunjukkan bahwa terjadi peningkatan kolesterol plasma karena asupan kolesterol dan lemak jenuh yang menyebabkan dislipidemia (Sieber, 1993). Dislipidemia adalah metabolisme abnormal lipoprotein, biasanya berhubungan dengan over-produksi atau kekurangan lipoprotein. Dislipidemia juga sering dikatakan sebagai hiperlipidemia yang dapat memicu terjadinya aterosklerosis. Aterosklerosis adalah suatu kondisi di mana dinding arteri menebal sebagai akibat dari penumpukan bahan lemak seperti kolesterol dan menjadi salah satu faktor resiko penyakit kardiovaskuler (Charlton-Menys and Durrington, 2006). Hal ini merupakan suatu sindrom yang dapat mempengaruhi pembuluh darah arteri, respon peradangan kronis pada dinding arteri, dan sebagian besar akumulasi sel darah putih pada makrofag dipromosikan oleh low-density lipoprotein tanpa pengangkutan yang memadai oleh kolesterol high-density lipoprotein (HDL) untuk mengeluarkan lemak dan kolesterol dari makrofag. Hal ini menyebabkan terjadinya pengerasan arteri yang dapat menghambat aliran darah arteri sehingga mengakibatkan serangan jantung dan stroke (Charlton-Menys and Durrington, 2006; Lakshmi et al., 2012). Saat ini beberapa obat seperti statin dapat digunakan untuk mengobati dislipidemia. Pengobatan hiperlipidemia dengan menggunakan statin yang dapat menurunkan kolesterol dan trigliserida tingkat serum, tetapi tidak mempunyai efek yang cukup kuat untuk meningkatkan kadar kolesterol HDL. Obat golongan statin dapat penghambat HMG-KoA reduktase yang bekerja dengan jalan menghambat 3hydroxy-3-methylglutaryl koenzim A yaitu enzim yang mengontrol sintesis kolesterol. Hal ini disebabkan adanya serangkaian proses yang pada akhirnya mengakibatkan peningkatan kualitas reseptor LDL pada sel-sel hepatosit sehingga mempercepat pembersihan kolesterol LDL dari dalam plasma. Golongan statin juga dapat menimbulkan efek samping seperti miositis, dispepsia, hepatotoksik, nyeri ulu hati, dan rasa tidak nyaman pada perut (Jones et al., 1998). Oleh karena itu, sangat diperlukan obat alami untuk pengembangan terapi pengobatan hiperlipidemia. Pencegahan terhadap dislipidemia dan aterosklerosis dilakukan dengan menurunkan kadar kolesterol dalam tubuh yaitu dengan cara mengkonsumsi obat alami sehingga dapat menurunkan kadar kolesterol darah sampai batas normal. Penurunan kolesterol darah dapat dilakukan dengan menurunkan kolesterol makanan yang dikonsumsi, menghambat penyerapan kolesterol, menurunkan sintesis endogen, serta meningkatkan pengeluaran empedu dan ekskreta. (Charlton-Menys and Durrington, 2006). Salah satu obat alami yang dapat digunakan untuk menurunkan kolesterol dalam darah adalah saponin. Saponin adalah deterjen alami yang mempunyai sifat aktif permukaan, dimana struktur molekulnya terdiri dari aglikon steroid atau triterpen yang disebut dengan sapogenin dan glikon yang mengandung satu atau lebih rantai gula (Osbourn, 2003; Guclu-Ustundag and Mazza, 2007; Vincken et al., 2007). Saponin berasal dari kata Latin yaitu ‘sapo’ yang bearti mengandung busa stabil bila dilarutkan dalam air. Kemampuan busa dari saponin disebabkan oleh kombinasi dari sapogenin yang bersifat hidrofobik (larut dalam lemak) dan bagian rantai gula yang bersifat hidrofilik (larut dalam air) (Naoumkina et al., 2010). Saponin dengan sifat deterjennya dapat mempengaruhi substan yang larut dalam lemak pada pencernaan, meliputi pembentukan misel campuran yang mengandung garam empedu, asam lemak, digliserida dan vitamin yang larut dalam lemak serta saponin mampu membentuk kompleks dengan logam-logam seperti Fe, Mg, Zn, dan Ca (Southon et al. 1988; Cheeke, 2001). Saponin bertindak sebagai pengemulsi dan dapat menstabilisasi antarmuka minyak/air dan juga mempunyai kemampuan untuk melarutkan monogliserida. Berdasarkan aktivitas tersebut diyakini bahwa saponin mampu mengemulsi lemak (Cheeke, 2001). Famili Liliaceae dikenal sebagai salah satu famili yang sangat kaya akan kandungan saponin. Bawang putih juga termasuk famili Liliaceae yang mengandung saponin steroid (Matsuura,2001). Tanaman andong termasuk famili Liliaceae yang banyak mengandung saponin. Berdasarkan hasil penelitian bahwa daun andong mengandung saponin steroid tetapi aktivitas biologis terhadap hewan uji belum dilakukan (Bogoriani,2001; Bogoriani, 2008). Beberapa peneliti melaporkan bahwa saponin dari tanaman lain seperti glikosida steroid bawang putih (Matsuura,2001), dan chloragin dari Chlorophytum nimonii (Lakshmi, et al., 2012) dan juga glikosida triterpen dari alfalfa dari Medicago sativa L. (Khaleel et al., 2005) soyasaponins (Lee Sun-Ok et al., 2005), Quillaja saponaria (Cheeke, 2001), dan ginseng (Ha and Kim, 1984) mempunyai aktivitas sebagai hipokolesterolimea yaitu dapat menghambat penyerapan kolesterol dan menurunkan konsentrasi kolesterol plasma yang telah diuji pada hewan dan manusia ( Kim et al., 2003; Zhao et al., 2005; Afrose et al., 2010;). Akan tetapi mekanisme yang bertanggung jawab atas aktivitas tersebut belum diketahui dengan jelas. Saponin diduga dapat mencegah miselisasi kolesterol selama pencernaan di usus halus, sehingga dapat mengurangi tersedianya kolesterol untuk penyerapan ke enterosit. Saponin juga diduga menghambat penyerapan kolesterol dari misel dan menghambat penyerapan kembali asam empedu dan sintesis kolesterol karena interaksi saponin dengan asam empedu membentuk misel campuran yang besar yang tidak larut sehingga tidak dapat diserap diusus dan diekskresikan lewat feses (Zhao et al., 2005; Lee Sun-Ok et al., 2005). Penghambatan penyerapan kembali asam empedu dari usus memacu metabolisme kolesterol pada hati kemudian mengkonversinya menjadi asam empedu(Jenkins and Atwal, 1994; Shin et al., 2004; Han et al., 2000). Penghambatan penyerapan kolesterol di usus juga diduga karena saponin membentuk senyawa kompleks dengan kolesterol, tetapi mekanisme kerjanya belum jelas. Penurunan kolesterol tubuh dengan saponin dapat dilakukan melalui pengobatan dan pencegahan. Pengobatan dilakukan dengan mengkonsumsi saponin sesuai dengan uji hewan dan uji klinis yang telah dilakukan oleh beberapa peneliti terhadap saponin seperti saponin dari bawang putih (Matsuura, 2001), dan saponin dari Medicago sativa L. (Khaleel et al., 2005). Pada manusia, saponin secara umum dikatakan tidak menyebabkan efek samping yang merugikan, karena saponin mempunyai tiga sifat unik dalam usus: (1). Saponin memiliki sifat "sequestrants asam empedu" yang mempunyai kemampuan mengikat kolesterol dan patogen yang memasuki tubuh membentuk molekul yang besar sehingga tidak dapat diserap melalui dinding usus. Molekul kolesterol dan patogen tersebut melalui sistem pencernaan dieliminasi lewat feses. (2). Molekul saponin merupakan suatu molekul yang bersifat "nonsystemic", yang berarti hanya bekerja pada saluran usus dan tidak memasuki seluruh tubuh. Oleh karena itu, efek samping yang dapat merusak hati dan organ vital lain tidak terjadi (Hu et al., 2004; Morehouse et al., 1999). (3). Saponin bekerja sama dengan organisme flora usus, mendorong pertumbuhan bakteri yang baik dan mengurangi bakteri yang berbahaya (Gestetner et al., 1968). Pencegahan juga dapat dilakukan dengan mengurangi kolesterol dari produk-produk makanan yang dipasarkan sehingga makanan yang dikonsumsi adalah makanan yang rendah kolesterol (Lu and Jorgensen,1987; Williams and Coleman, 1992). Beberapa peneliti melaporkan bahwa saponin mampu menurunkan kolesterol dari susu, kream dan mentega, dengan mengikat kolesterol membentuk kompleks yang tidak larut, tetapi aktivitasnya tergantung pada beberapa faktor yaitu waktu reaksi, temperatur, dan jumlah saponin yang ditambahkan (Sundfeld et al., 1993a; Sundfeld et al., 1993b; Oh et al., 1998a; Oh et al., 1998b; Chang et al., 2001). Berdasarkan hasil penelitian tersebut membuktikan bahwa saponin dapat membentuk kompleks dengan kolesterol secara in vitro. Berdasarkan hasil penelitian bahwa saponin dapat menghambat penyerapan kolesterol baik secara langsung maupun tidak langsung. Saponin secara langsung dapat menghambat penyerapan kolesterol dari usus atau tidak langsung menghambat penyerapan kembali asam empedu melalui sirkulasi enterohepatik (Shin et al., 2004; Lin et al., 2005). Shneider (2001) melaporkan bahwa komponen yang penting dari sirkulasi enterohepatik adalah apical sodium codependent bile acid transporter (ASBT) atau ileal Na+/bile acid cotransporter (IBAT) yang memediasi penyerapan aktif asam empedu yang terkonjugasi kembali pada terminal ileum. Penghambatan penyerapan asam empedu pada ASBT/IBAT menyebabkan terjadinya peningkatan sintesis asam empedu hati dan mengurangi kolesterol LDL plasma (Bhat, et al., 2003). Penurunan kolesterol LDL plasma juga dapat disebabkan karena terjadi hambatan penyerapan kolesterol di usus. Para peneliti telah mengidentifikasi Niemann-Pick C1 like 1 (NPC1L1) sebagai transporter serapan kolesterol (Altmann et al., 2004) dan ATPbinding cassette (ABC) protein ABCG5 dan ABCG8 sebagai transporter efflux kolesterol (Berge et al., 2000; Lee et al., 2001; Lu et al., 2001). Ketiga molekul ini sangat berperan dalam mengendalikan penyerapan kolesterol dari lumen usus. Penghambatan pada NPC1L1 tikus mengakibatkan pengurangan penyerapan kolesterol (Altmann et al., 2004). Ezetimibe telah terbukti dapat mengikat sel NPC1L1 dan brush-border usus (Garcia-Calvo et al., 2005). Berdasarkan latar belakang di atas, dalam penelitian telah terbukti efek saponin dari daun andong (C. terminalis Kunth) terhadap kolesterol plasma, yang memiliki khasiat sebagai anti dislipidemia melalui ekskresi asam empedu dan kolesterol feses pada tikus wistar yang diberikan makanan tinggi kolesterol (kuning telur itik) dan akan dibuktikan juga kemampuan saponin dalam mengikat kolesterol dari kuning telur itik melalui pembentukan senyawa kompleks antara saponin dengan kolesterol secara in vitro. 1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan di atas maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut: 1. Apakah asupan saponin daun andong dapat menurunkan kadar kolesterol total plasma pada darah tikus wistar yang diberikan makanan tinggi kolesterol? 2. Apakah asupan saponin daun andong dapat menurunkan asam empedu total plasma pada darah tikus wistar yang diberikan makanan tinggi kolesterol? 3. Apakah asupan saponin daun andong dapat meningkatkan ekskresi asam empedu feses pada tikus wistar yang diberikan makanan tinggi kolesterol? 4. Apakah asupan saponin daun andong dapat meningkatkan ekskresi kolesterol feses pada tikus wistar yang diberikan makanan tinggi kolesterol? dan 5. Apakah saponin daun andong mampu mengikat kolesterol melalui pembentukan kompleks saponin-kolesterol secara in vitro? 1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan umum Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mengetahui mekanisme fitofarmaka dari saponin daun andong dalam mencegah dislipidemia dan aterosklerosis. 1.3.2 Tujuan khusus Tujuan khusus penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Membuktikan asupan saponin daun andong dapat menurunkan kadar kolesterol total plasma pada darah tikus wistar, yang diberikan makanan tinggi kolesterol. 2. Membuktikan asupan saponin daun andong dapat menurukan kadar asam empedu total plasma pada darah tikus wistar, yang diberikan makanan tinggi kolesterol. 3. Membuktikan asupan saponin daun andong dapat meningkatkan ekskresi asam empedu feses pada tikus wistar, yang diberikan makanan tinggi kolesterol. 4. Membuktikan asupan saponin daun andong dapat meningkatkan ekskresi kolesterol feses pada tikus wistar, yang diberikan makanan tinggi kolesterol. 5. Membuktikan kemampuan saponin daun andong dalam mengikat kolesterol melalui pembentukan kompleks saponin-kolesterol secara in vitro. 1.4 Manfaat Penelitian 1.4.1 Manfaat akademik/ilmiah Penelitian ini dapat memperluas khasanah ilmu pengetahuan terutama dapat menjelaskan patofisiologi dan mekanisme dari saponin daun andong sebagai antidislipidemia. 1.4.2 Manfaat praktis Dari aspek aplikasi saponin daun andong manfaatnya adalah: 1. Apabila saponin daun andong terbukti mampu menurunkan kadar kolesterol plasma, menurunkan kadar asam empedu total plasma, meningkatkan ekskresi asam empedu dan kolesterol feses pada tikus wistar, maka dapat dianjurkan kepada masyarakat kemungkinan pemanfaatan saponin daun andong sebagai bahan obat fitofarmaka untuk mencegah dislipidemia. 2. Apabila saponin daun andong terbukti mampu mengikat kolesterol melalui pembentukan kompleks saponin-kolesterol secara in vitro, maka dapat diinformasikan kepada masyarakat kemungkinan pemanfaatan saponin daun andong sebagai bahan pengikat kolesterol untuk menghasilkan produk-produk komersial yang rendah kolesterol. BAB II KAJIAN PUSTAKA 2.1 Tanaman Andong 2.1.1 Khasiat dan kegunaan tanaman andong Tanaman andong (C. terminalis Kunth) seperti pada Gambar 2.1 banyak digunakan sebagai obat tradisional di beberapa negara seperti di India dan Samoa. Rimpang C. terminalis Kunth secara tradisional digunakan untuk mengobati penyakit diare (Dittmar, 1998). Dittmar (1998) juga melaporkan bahwa di Samoa, Tubuai, Tahiti, daun C. terminalis Kunth secara tradisional juga digunakan sebagai obat untuk sakit telinga, sakit kepala, sesak nafas, batuk, asma, gangguan sistem pernafasan, inflamasi, sakit kulit, luka terbakar, gangguan saluran air kencing, dan sakit gajah, encok, rematik, flu, demam, dan menghilangkan rasa sakit. Selain itu Tanaman Andong di Indonesia digunakan sebagai obat untuk menghilangkan bengkak karena memar (anti swelling), menghentikan pendarahan (hemostatik), menstruasi yang banyak, air kemih berdarah, wasir berdarah, disentri, nyeri pada lambung dan ulu hati, diare, luka berdarah, dan batuk darah atau TBC paru (Wijayakusuma, 1994). 2.1.2 Kandungan kimia tanaman andong Kandungan kimia yang telah ditemukan pada daun andong yang tanamannya tumbuh di Australia adalah dua sapogenin steroid yaitu sarsasapogenin (5a) dan smilagenin (5b) (Gambar 2.2 (Blunden et al.,1981). Gambar 2.1 Tanaman Andong (Cordyline terminalis K.) (Wijayakusuma, 1994) 27 Me 21 O Me O 19 H 5a 22 16 Me HO 3 5 27 O 19 16 Me 25 Me Me 22 Me 5 25 18 18 HO 3 O 21 Me 5b H Gambar 2.2 Struktur sapogenin steroid: 5a sarsasapogenin; 5b smilagenin (Blunden et al., 1981) Bogoriani (2001 dan 2008) melaporkan dua jenis saponin steroid yang berhasil diisolasi dari daun tanaman andong yang tumbuh di daerah Tampaksiring Gianyar Bali (Gambar 2.3). ( 4,71 & 4,79 ppm, br s) ( 4,01 & 4,44 ppm, 27 dd, J = 12,0 Hz) CH2 H ( 1,02 ppm, d J = 6,6 Hz) CH3 H HO ( 4,57 ppm, d, J = 7,0 Hz) O H HO O OH H H D-fukopiranosida H H3C HO O H ( 5,56 ppm, br s) O H H H OH HO ( 0,84 ppm, L-ramnopiranosida O H H H O sapogenin ( 5,52 ppm, br d J = 5,4 Hz) ( 6,43 ppm, br s) H H OH HO L-ramnopiranosida (a) 25 26 23 18 22 20 CH3 ( 1,37 ppm, s) O 12 17 16 11 13 HO 19 CH3 15 14 9 1 2 10 8 5 3 7 4 6 OH H3C HO O 21 CH3 s) 24 steroid spirostan ( 3,49 ppm br d J = 9 Hz 26b-H ) ( 0,66 ppm,d J = 6 Hz) ( 4,13 ppm brd J = 9,3 Hz 26 a-H ) H CH 3 HO ( 1,06 ppm, d J = 6 Hz) H O ( 4,57 ppm, d, J = 7,0 Hz) H HO O OH H H D-fukopiranosida H H3C HO O H H ( 5,56 ppm, br s) O H H OH HO 21 CH 3 ( 0,85 ppm, s) L-ramnopiranosida H O H HO O 23 24 18 22 20 CH 3 ( 1,37 ppm, s) O 12 17 16 11 13 HO 19 CH 3 15 14 9 1 2 10 8 5 3 7 4 6 OH H3C 25 26 O 27 CH 3 sapoge nin ste roid spirostan ( 5,51 ppm, br d J = 5,7 Hz) ( 6,43 ppm, br s) H H H OH HO L-ramnopiranosida (b) Gambar 2.3 Struktur saponin steroid daun andong a dan b (Bogoriani, 2001; Bogoriani, 2008) 2.1.3 Saponin Saponin adalah deterjen atau glikosida alami yang mempunyai sifat aktif permukaan yang bersifat amfifilik, mempunyai berat molekul besar dan struktur molekulnya terdiri dari aglikon steroid atau triterpen yang disebut dengan sapogenin dan glikon yang mengandung satu atau lebih rantai gula (Osbourn 2003; GucluUstundag and Mazza, 2007; Vincken et al., 2007; Sirohi et al., 2014). Saponin terjadi secara alami pada berbagai tumbuhan beberapa spesies laut (Price et al., 1987; Hostettmann and Marston, 1995). Saponin berasal dari kata Latin yaitu ‘sapo’ yang berarti mengandung busa stabil bila dilarutkan dalam air. Kemampuan busa dari saponin disebabkan oleh kombinasi dari sapogenin yang bersifat hidrofobik (larut dalam lemak) dan bagian rantai gula yang bersifat hidrofilik (larut dalam air) (Naoumkina et al., 2010; Sirohi et al., 2014). Saponin dengan sifat deterjennya dapat mempengaruhi substans yang larut dalam lemak pada pencernaan, meliputi pembentukan misel campuran yang mengandung garam empedu, asam lemak, digliserida, vitamin yang larut dalam lemak dan dengan mineral (Cheeke, 2001). Saponin membentuk agregat seperti misel dalam air (Cheeke, 2001). Saponin mempunyai sifat pengemulsi yang menstabilkan antarmuka minyak/air dan mempunyai kapasitas yang tinggi untuk melarutkan monogliserida. Berdasarkan aktivitas tersebut saponin dikatakan dapat meningkatkan emulsifikasi pada pencernaan (Cheeke, 2001). Efek utama saponin terhadap pencernaan lipid terlihat melalui efek asam empedu. Saponin membentuk misel dengan asam empedu, akibatnya kemampuan asam empedu untuk membentuk misel dengan asam lemak berkurang. Bioavailabitas vitamin A dan E juga berkurang oleh saponin, diduga karena saponin adalah sequestrants asam empedu (Cheeke, 2001). Asam empedu primer disekresikan dalam empedu dan asam empedu sekunder adalah hasil metabolisme bakteri flora asam empedu primer. Sebagai contoh asam kolat adalah asam empedu primer yang dikonversi menjadi asam deoksikolat oleh aktivitas bakteri flora pada usus besar. Saponin diduga mampu mengikat asam empedu primer, sehingga mencegahnya dari aktivitas bakteri. Kemudian dengan saponin, pembentukan asam empedu sekunder berkurang pada usus (Cheeke, 2001). Pengikatan asam empedu primer oleh saponin diduga dapat mencegah kanker kolon, karena dapat mengurangi kemampuan membentuk asam empedu sekunder melalui aktivitas bakteri usus besar. Saponin dapat menurunkan konsentrasi kolesterol plasma. Beberapa peneliti melaporkan bahwa saponin dengan kolesterol di dalam usus, tidak terabsorpsi karena membentuk senyawa kompleks yang besar dan tidak larut. Saponin bisa menurunkan tingkat absorpsi kolesterol dan meningkatkan ekskresi tinja atau feses, sehingga secara langsung dapat mengurangi kolesterol yang masuk ke dalam tubuh. Saponin secara langsung dapat menghambat kolesterol dari usus atau tidak langsung menghambat penyerapan kembali asam empedu. Hambatan secara langsung dari penyerapan kolesterol menyebabkan saponin dapat mencegah absorpsi tidak hanya dari proporsi tinggi kolesterol makanan tetapi juga proporsi tinggi kolesterol yang dibawa dari empedu dan desquamation sel mukosa (Hostettmann and Marston, 1995; Shin et al., 2004; Lin et al., 2005; Lee Sun-Ok et al., 2005; Sirohi et al., 2014). Saponin mempunyai dua efek yang menguntungkan terhadap dua masalah kesehatan manusia yaitu (1) mencegah dan mengobati penyakit jantung koroner (oleh hipokolesterolemia) dan (2) mencegah kanker kolon ( sequestrants asam empedu) (Cheeke, 2001). Berdasarkan golongan aglikonnya atau sapogeninnya, saponin dapat dikelompokkan sebagai saponin triterpen (sapogeninnya adalah triterpen dengan jumlah karbon 30), saponin steroid (sapogeninnya adalah steroid dengan jumlah atom karbon 27), dan saponin steroid alkaloid (sapogeninnya adalah steroid alkaloid), yang berikatan kovalen dengan satu atau lebih monosakarida atau oligosakarida (Hostettmann and Marston, 1995; Chaieb, 2010; Sirohi et al., 2014). Sapogenin triterpen dapat dikelompokkan sebagai kelompok -amirin (1), -amirin (2), dan lupeol (3). Perbedaan kedua kerangka karbon -amirin dan -amirin terletak dari kedudukan substituen yang terikat pada C-20. Satu gugus metil terikat pada C-20 amirin, sedangkan dua gugus metil terikat pada C-20 -amirin. Karakteristik dari saponin triterpen ini adalah mempunyai gugus hidroksi pada C-3 dan gugus metil pada posisi C-4, C-8, C-10, C-14, C-17 dan C-20, untuk senyawa lupeol mengandung gugus isopropil pada C-19. Sapogenin steroid dapat dikelompokkan sebagai kelompok spirostanol (4), dan furostanol (5). Sapogenin steroid alkaloid dapat dikelompokkan sebagai kelompok solasodin (6) dan solanidin (7). Karakteristik dari saponin steroid ini adalah terikatnya gugus hidroksi pada C-3 dan gugus metil pada posisi C-10 dan C-13. Ada dua katagori yang membedakan antara saponin steroid bentuk furostanol dan spirostanol yaitu bentuk furostanol, dimana cincin E dari aglikonnya terbuka, sedangkan spirostanol cincin E tertutup, seperti pada Gambar 2.4. Semua bagian aglikonnya kemungkinan mempunyai sejumlah gugus fungsional (ROH, RCOOH, RCH3), mengakibatkan strukturnya bervariasi di alam. Perbedaan ini juga disebabkan oleh komposisi rantai gula, jumlah gula, jenis rantai gula dan jenis substitusi (Hostettmann and Marston, 1995; Sirohi et al., 2014). HO HO 1 2 O O 3 HO 4 N O O HO 5 6 N HO HO 7 Gambar 2.4 Struktur Sapogenin dari Saponin (Hostettmann dan Marston, 1995; Chaieb, 2010). Saponin selanjutnya diklasifikasikan berdasarkan jumlah rantai gula yang terikat. Satu rantai gula yang terikat pada sapogeninnya diklasifikasikan sebagai monodesmosidik, dua rantai gula sebagai bidesmosidik, dan tiga rantai gula sebagai tridesmosidik. Monosakarida yang paling umum ditemukan dalam saponin adalah jenis : D-glukosa, D-galaktosa, asam D-glukoronat, asam D-galakturonat, D-ribosa, D-xilosa, L-arabinosa, L-fukosa, dan L-ramnosa (Chaieb, 2010; Thakur et al., 2011). Struktur saponin yang sangat kompleks terjadi akibat bervariasinya struktur aglikon, sifat dasar rantai, dan posisi ikatan gugus gula pada aglikon. Hal ini menyebabkan kesulitan dalam mengidentifikasi atau menentukan struktur saponin. Saponin adalah golongan senyawa yang sangat polar dan kepolarannya meningkat sebanding dengan pertambahan jumlah satuan gula yang menyusun glikon. Orientasi ikatan glikosida tersebut adalah - dan atau -glikosida. 2.1.4 Identifikasi saponin Secara kualitatif untuk menyatakan keberadaan saponin pada contoh bahan dapat dilakukan dengan uji busa dan menghemolisis sel-sel darah merah, bila larutan saponin diinjeksikan ke dalam aliran darah. Pembentukan busa yang mantap sewaktu mengekstraksi tumbuhan atau waktu memekatkan ekstrak tumbuhan merupakan bukti terpercaya akan adanya saponin. Selanjutnya golongan sapogeninnya dapat ditentukan dengan reaksi warna menggunakan pereaksi Liebermann-Burchard. Berdasarkan warna yang terbentuk, apabila terbentuk warna merah atau ungu menunjukkan saponin triterpen, sedangkan bila terbentuk warna hijau atau biru menunjukkan saponin steroid (Harborne, 1996). Secara kualitatif, saponin steroid yang termasuk golongan spirostanol dapat dibedakan dengan furostanol. Glikosida furostanol menunjukkan warna merah pada lempeng kromatografi lapis tipis (klt) bila disemprot dengan pereaksi Ehrlich (pdimetilaminobenzaldehida dan asam klorida) dan warna kuning dengan pereaksi anisaldehida, sebaliknya tidak terjadi perubahan warna pada glikosida spirostanol (Mahato et al., 1982) Secara konvensional, elusidasi struktur saponin dilakukan melalui studi derivatisasi dan degradasi (Chen and Snyder, 1993; Qiu et al., 1999; Thakur et al., 2011; Sirohi et al., 2014). Derivatisasi saponin dilakukan melalui reaksi metilasi atau asetilasi. Degradasi saponin dilakukan melalui reaksi hidrolisis total dan atau hidrolisis parsial. Hidrolisis saponin dapat dilakukan dengan cara enzim, basa, atau asam yang menghasilkan sapogenin dan gula. Hidrolisis dalam suasana asam menghasilkan hidrolisis total maupun hidrolisis parsial tergantung konsentrasi asam, waktu, dan suhu. Secara khusus hasil hidrolisis total saponin adalah untuk mengidentifikasi sapogenin dan glikon. Posisi ikatan glikosidik inter glikon maupun antar glikon dan sapogenin, diidentifikasi dengan melakukan reaksi permetilasi dan diikuti dengan reaksi hidrolisis secara total satuan-satuan gula yang menyusun glikonnya. Bagian yang tidak termetilasi pada masing-masing satuan gula adalah sisi yang berikatan. Hasil reaksi hidrolisis total dan parsial seperti ditunjukkan pada Gambar 2.5. Gambar 2.5 Hasil reaksi hidrolisis total dan parsial senyawa saponin (Ahmed et al., 2012) 2.1.5 Biosintesis steroid atau triterpen Triterpen dan steroid terbentuk dari squalen melalui suatu proses siklisasi (Gambar 2.6). Triterpen mengandung 30 atom karbon, dan steroid mengandung 27 atom karbon karena proses pemecahan secara oksidatif tiga gugus metil dari intermediat C30 yang berbeda jalur biosintesisnya (Hostettmann and Marston, 1995). Gambar 2.6. Biosintesis triterpen dan steroid(Hostettmann and Marston, 1995). 2.1.6 Hubungan struktur, Ikatan kimia dan aktivitas biologi Respons biologis merupakan akibat interaksi molekul obat dengan gugus fungsional molekul reseptor. Interaksi ini dapat berlangsung karena kekuatan ikatan kimia tertentu. Jenis ikatan kimia yang terlibat dalam interaksi obat reseptor antara lain adalah ikatan kovalen, ikatan ion-ion yang saling memperkuat (reinforce ions), ion (elektrostatik), hidrogen, ion-dipol, dipol-dipol, van der Waal’s, ikatan hidrofob dan transfer muatan (Siswandono dan Soekardjo, 1995). a. Ikatan Kovalen Ikatan kovalen terbentuk bila ada dua atom saling menggunakan sepasang elektron secara bersama-sama. Ikatan kovalen merupakan ikatan kimia yang paling kuat dengan rata-rata kekuatan ikatan 1000 kkal/mol. Dengan kekuatan ikatan yang tinggi ini, pada suhu normal ikatan bersifat ireversibel dan hanya dapat pecah bila ada pengaruh katalisator enzim tertentu. Interaksi obat-katalisator melalui ikatan kovalen menghasilkan kompleks yang cukup stabil dan sifat ini dapat digunakan untuk tujuan pengobatan tertentu (Siswandono dan Soekardjo, 1995). b. Ikatan ion Ikatan ion adalah ikatan yag dihasilkan oleh daya tarik menarik elektrostatik antara ion-ion yang muatannya berlawanan. Kekuatan tarik-menarik akan makin berkurang bila jarak antar ion makin jauh dan pengurangan tersebut berbanding terbalik dengan jaraknya (Siswandono dan Soekardjo, 1995). c. Interaksi Ion-Dipol dan dipol-Dipol Adanya perbedaan keelektronegatifan atom C dengan atom yang lain seperti O dan N, akan membentuk distribusi elektron tidak simetrik atau dipol, yang mampu membentuk ikatan dengan ion atau dipol lain, baik yang mempunyai daerah kerapatan elektron yang tinggi maupun rendah (Siswandono dan Soekardjo, 1995). d. Ikatan hidrogen Ikatan hidrogen adalah suatu ikatan antara atom H yang mempunyai muatan positif parsial dengan atom lain yang bersifat elektronegatif dan mempunyai sepasang elektron bebas dengan oktet lengkap seperti O, N, F. Atom yang bermuatan positif parsial dapat berinteraksi dengan atom negatif parsial dari molekul atau atom lain yang berbeda ikatan kovalennya dalam satu molekul (Siswandono dan Soekardjo, 1995). e. Ikatan Van Der Waal’s Ikatan van der waal’s merupakan kekuatan tarik-menarik antar molekul atau atom yang tidak bermuatan dan letaknya berdekatan atau jaraknya ± 4-6 Å. Ikatan ini terjadi karena sifat kepolarisasian molekul atau atom. Meskipun secara individu lemah, tetapi hasil penjumlahan ikatan van der waal’s merupakan faktor pengikat yang cukup bermakna terutama untuk senyawa-senyawa yang mempunyai berat molekul tinggi. Ikatan van der waal’s terlibat pada interaksi cincin benzen dengan daerah bidang datar reseptor dan pada interaksi rantai hidrokarbon dengan makromolekul protein atau reseptor (Siswandono dan Soekardjo, 1995). f. Ikatan hidrofob Ikatan hidrofob merupakan salah satu kekuatan penting pada proses penggabungan daerah non polar molekul obat dengan daerah non polar reseptor biologis. Daerah non polar molekul obat yang tidak larut dalam air dan molekulmolekul air disekelilingnya akan bergabung melalui ikatan hidrogen membentuk struktur (Siswandono dan Soekardjo, 1995). g. Transfer Muatan Kompleks yang terbentuk antara dua molekul melalui ikatan hidrogen merupakan kasus khusus dari fenomena umum kompleks donor-aseptor, yang distabilkan melaui daya tarik-menarik elektrostatis antara molekul donor elektron dan molekul aseptor elektron (Siswandono dan Soekardjo, 1995). Suatu contoh interaksi glikosida jantung dan reseptornya dapat dilihat pada Gambar 2.7 - a O O 3 H C Keterangan: H + c H O - 3 H C A t a p m e T 3O H C b b O O H a. b. c. Ikatan hidrogen Ikatan hidrofob Ikatan elektrostatik b B t a p m e T a b b O H C t a p m e T Gambar 2.7 Model interaksi glikosida jantung dan reseptornya (Siswandono dan Soekardjo, 1995) 2.1.7 Aktivitas biologi saponin Berdasarkan beberapa peneliti melaporkan bahwa saponin dari berbagai sumber tumbuhan memiliki aktivitas antara lain sebagai: hipokolesterolemia, antikarsinogenik, dan antimikroba. Penelitian secara in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa dengan adanya saponin menyebabkan terjadinya perubahan dalam proliferasi sel, metabolisme, transkripsi dan ekspresi gen. Saponin diduga toksik pada binatang menyusui tergantung pada sumbernya, komposisi, konsentrasi, dan jalur perlakuannya (Oakenfull and Sidhu, 1990). Bila dicerna, toksisitas saponin pada binatang menyusui yang bukan pemamah biak adalah rendah (nilai LD50 kira-kira 401000 mg/kg), dan saponin tidak dimetabolisme dalam usus halus, melainkan diekskresikan lewat feses atau dimetabolisme dalam usus besar (Oakenfull and Sidhu, 1990). Akan tetapi, bila konsumsi berlebihan dilaporkan menimbulkan gejala yang meliputi muntah-muntah, diare, produksi air ludah berlebihan, kehilangan nafsu makan, dan mengalami kelumpuhan. Meskipun pemberian secara oral jarang toksik, akan tetapi pemberian secara parenteral dengan mudah toksik (nilai LD50 kira-kira l mg/kg-50 mg/kg) (Hostettmann, and Marston,1995). Sebaliknya, saponin adalah toksik pada konsentrasi 1:200.000 untuk ikan, moluska, katak dan organisme lain yang mempunyai insang. Disamping permeabilitas membran respirasi dari organisme ini, saponin juga menyebabkan kehilangan regulasi keseimbangan ion dan tekanan osmotik sehingga disfungsi fisiologikal yang terjadi mengakibatkan kematian (Carlson, 2009). 2.1.7.1 Aktivitas hipokolesterolemia Kira-kira 1 g kolesterol disintesis di dalam hati perhari, dan kolesterol dari makanan yang diperlukan untuk golongan orang barat kira-kira 0,6 g perhari (Stipanuk, 2006). Beberapa kolesterol diubah menjadi asam empedu (asam empedu primer), yang sementara disimpan dalam kandung empedu dan sebagai hormon steroidogenik. Untuk memudahkan pencernaan makanan yang kaya lipid, empedu disekresikan ke usus halus untuk membantu pencernaan lipid. Penyerapan kembali asam empedu yang disekresikan dalam ileum sangat efisien, dan asam empedu kembali ke hati melalui sistem sirkulasi enterohepatik. Residu asam empedu memasuki usus besar kemudian dimetabolisme menjadi asam empedu sekunder yang karsinogenik (Stipanuk, 2006). Beberapa hasil penelitian melaporkan bahwa saponin (soyasaponin) dapat menurunkan tingkat kolesterol plasma pada manusia dan hewan uji, tetapi apakah efek aktivitas hipokolesterolemia dari saponin tersebut adalah merugikan atau menguntungkan pada penyerapan kolesterol belum diketahui dengan jelas. Karena saponin tidak diserap, efek merugikan pada penyerapan kolesterol dan derivat garam empedunya. Inti cincin steroid planar dari saponin mungkin berinteraksi dengan cincin planar dari kolesterol dan garam empedu sehingga menghalangi penyerapannya. Efek ini mengakibatkan terjadinya penurunan konsentrasi kolesterol pada plasma dan hati (Cheeke, 1996; Friedman, 2002; Shi et al., 2004; Sirohi et al., 2014). Beberapa hasil penelitian juga menunjukkan bahwa saponin dapat menurunkan kolesterol plasma dan hati pada hewan (tikus, ayam, kelinci) yang diberi makanan mengandung saponin (Matsuura, 2001; Khaleel et al., 2005; Afrose et al., 2010; Lakshmi et al., 2012). Peneliti menghipotesiskan bahwa saponin membentuk kompleks yang tidak larut dengan kolesterol pada usus, sehingga mengakibatkan ekskresi (Friedman, 1994). 2.1.7.2 Aktivitas anti karsinogenik Kanker adalah suatu penyakit yang dikarakterisasi oleh proliferasi yang tidak terkontrol yang tersebar dari daerah lokal dan menyerang ke seluruh tubuh. Saponin dari berbagai tanaman sudah dilaporkan sebagai pencegah kanker, seperti soybeans dan tomatos. Soyasaponin dapat melawan kanker dengan meningkatkan immunokompetensi atau meningkatkan aktivitas hipokolesterolemianya (Si and Liu, 2008). 2.1.8 Pengaruh saponin terhadap penyerapan dan metabolisme kolesterol Ada korelasi positif antara peningkatan konsentrasi kolesterol serum dengan risiko penyakit jantung koroner. Penelitian pada hewan dan manusia menunjukkan bahwa kolesterol plasma meningkat karena asupan kolesterol dan lemak jenuh meningkat (Sieber, 1993). Penurunan kolesterol plasma dapat dilakukan dengan mengkonsumsi obat dan pencegahan. Pengobatan dapat dilakukan dengan mengkonsumsi obat yang sesuai dengan uji hewan dan manusia. Sedangkan pencegahan juga dapat dilakukan dengan menurunkan kolesterol makanan yang dikonsumsi. Oleh karena itu, beberapa peneliti melakukan penelitian untuk menghasilkan produk makanan komersial yang rendah kolesterol sehingga peningkatan kolesterol serum dapat dicegah (Ahn and Kwak, 1999). Ada bukti penelitian bahwa beberapa saponin mempunyai kemampuan membentuk misel antara garam empedu dan kolesterol secara in vitro (Carlson, 2009). Kemampuan ini digunakan untuk menjelaskan pengaruh pencernaan makanan yang mengandung saponin terhadap penurunan kolesterol plasma (Matsuura, 2001; Afrose et al., 2010). Keefektifan penyerapan kolesterol oleh saponin tergantung beberapa faktor yaitu: waktu reaksi, temperatur, dan jumlah saponin yang ditambahkan (Sundfeld et al., 1993a ; Sundfeld et al., 1993b; Oh et al., 1998a; Oh et al., 1998b). Penurunan tingkat kolesterol dalam lemak susu dapat dilakukan dengan beberapa cara. Salah satu cara yang digunakan untuk menurunkan lemak susu dan minyak mentega dengan pembentukan senyawa kompleks antara saponin (digitonin) dan kolesterol (Micich, 1990; Sundfeld et al., 1993a; Sundfeld et al.,1993b; Chang et al., 2001) Ada beberapa laporan mengenai efek saponin pada kolesterol-total, kolesterol-VLDL, kolest–LDL dan kolest-HDL secara in vivo. Perbedaan efek saponin ini mungkin disebabkan oleh perbedaan struktur, jenis tumbuhan dan dosis dari saponin yang digunakan (Matsuura, 2001; Son et al., 2007; Gong et al., 2010; Al-Matubsi et al., 2011). Ada beberapa hasil penelitian tentang pengaruh saponin yang dapat digunakan sebagai obat terhadap sejumlah penyakit, seperti aterosklerosis, penyakit jantung, dan kanker (Matsuura, 2001; Gong et al, 2010; Son et al., 2007). Beberapa efek yang menguntungkan dari saponin mungkin diakibatkan oleh sifat saponin yang dapat membentuk senyawa kompleks dengan kolesterol atau membentuk misel campuran antara saponin, kolesterol dan asam empedu yang dipacu oleh enzim-enzim yang terikat pada membran dan saponin juga diduga dapat digunakan sebagai alternatif obat nonsistemik yang mampu menghambat HMG-CoA reduktase dan meningkatkan aktifitas enzim lesitin kolesterol asiltranferase (LCAT) (Hosttetmann and Marston, 1995; Morehouse et al., 1999; Lakshmi et al., 2012). Saponin tidak terserap di usus, tetapi dimetabolisme dalam usus besar menjadi aglikon saponin dan gula oleh mikroflora (Gurfinkel and Rao, 2003; Hu et al., 2004). Soyasaponin atau soyasapogenol tidak ditemukan dalam darah tikus, mencit, dan ayam atau pada urine manusia (Hu et al., 2004). Hal ini mungkin disebabkan karena saponin dan asam empedu adalah senyawa amfifilik yaitu ada bagian hidrofobik yang larut dalam lemak dan bagian hidrofilik yang larut dalam air. Dalam larutan terbentuk misel, antara gugus hidrofobik dari triterpen atau steroid bergabung sehingga terbentuk seperti koin kecil (Gambar 2.8). Ukuran struktur dari misel campuran tergantung pada struktur kimia dari molekul saponin (Shidu and Oakenfull, 1986). Shidu and Oakenfull (1986) melaporkan bahwa misel yang terbentuk terlalu besar untuk melewati dinding usus sehingga saponin tetap dalam saluran pencernaan, tetapi hanya kolat bebas dan non misel yang diserap. Pembentukan misel campuran dalam usus oleh saponin tertentu dengan asam empedu dapat mempengaruhi metabolisme asam empedu dan kolesterol. Molekul misel asam empedu tidak mampu diabsorpsi kembali dan kemudian dialihkan dari siklus enterohepatik dan digantikan oleh peningkatan sintesis kolesrterol di hati. Konsekuensinya makanan yang mengandung saponin dapat meningkatkan ekskresi asam empedu feses dan dapat menurunkan konsentrasi kolesterol plasma pada penderita hiperkolesterolemia (Shidu and Oakenfull, 1986). Dari uraian hasil penelitian yang telah menunjukkan bahwa dilakukan beberapa peneliti mekanisme kerja saponin dalam usus masih merupakan perkiraan saja atau belum jelas (Hostettmann and Marston, 1995), sehingga saponin diyakini mempunyai kemampuan untuk berkaitan dengan sifat saponin yang dapat menurunkan kadar kolesterol, diduga membentuk senyawa kompleks atau membentuk misel campuran antara saponin, kolesterol dan (Matsuura, 2001; Gong et al., asam empedu 2010; Son et al., 2007). Efek yang paling menjolok setelah pemberian diet saponin menurut penelitian Lakshmi et al. (2012) adalah terjadi penurunan jumlah kolesterol VLDL, LDL dan peningkatan kolesterol HDL plasma pada tikus yang aterosklerosis. Hal ini diduga karena ada hambatan penyerapan kolesterol dan asam empedu di usus, sehingga memacu sintesis kolesterol di hati yang dikonversi menjadi asam empedu dan kemudian disekresikan ke usus. Hal ini menyebabkan ekskresi lewat feses lebih besar daripada penyerapan kolesterol di usus. Gambar 2.8 Diagram dari struktur pembentukan misel oleh (a) asam empedu, (b)saponin and (c) saponin plus asam empedu. Gugus saponin triterpen yang hidrofobik ditunjukkan oleh bentuk ellip; masing-masing gugus monosakarida ditunjukkan oleh garis lurus (Sidhu and Oakenfull, 1986). 2.1.9. Pengaruh saponin pada level seluler dan kemungkinan mekanisme aksi saponin Mekanisme aksi saponin adalah bervariasi a. Pengaruh saponin pada sirkulasi garam empedu dan ekskresi sterol feses. Penelitian secara in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa interaksi antara saponin dengan garam empedu terbentuk misel campuran yang besar (MW 1 x 106) (Oakenfull, 1986). Pembentukan misel saponin garam empedu dapat menghambat penyerapan kembali asam empedu pada usus halus tikus (Sidhu and Oakenfull, 1986; Gee and Johnson, 1988) dan meningkatkan ekskresi garam empedu feses (Oakenfull and sidhu, 1990). b. Mekanisme aksi saponin terhadap sirkulasi enterohepatik Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan oleh beberapa peneliti menunjukkan bahwa saponin yang berinteraksi dengan kolesterol endogenus yang disekresikan melalui empedu dapat mengganggu sirkulasi enterohepatik dan mencegah penyerapan kembali kolesterol (Cheeke, 2001). Molekul hidrofobik asam empedu dapat berinteraksi dengan molekul hidrofobik saponin baik dari steroid atau triterpen sehingga membentuk senyawa kompleks yang tidak larut (Oakenfull and Sidhu, 1990). Penelitian ini menunjukkan bahwa saponin dan garam empedu membentuk misel amfifilik dengan ukuran (MW x 103). Akan tetapi interaksi hidrofobik dari inti garam empedu dan aglikon saponin yang telah melepaskan gugus gula yang hidrofilik sehingga terbentuk misel campuran yang lebih besar. Soyasaponin, saponin white dan saponin quillaja, semuanya membentuk misel campuran yang lebih besar, tetapi ukuran dan struktur misel tergantung pada struktur kimia dari saponin (Oakenfull, 1986). c. Mekanisme aksi saponin yang mempengaruhi tingkat kolesterol serum 1. Pengaruh saponin terhadap sirkulasi enterohepatik Agregasi saponin dengan garam empedu dapat mempengaruhi sirkulasi enterohepatik asam empedu dan selanjutnya berpengaruh secara tidak langsung terhadap metabolisme kolesterol. Garam empedu disintesis dari kolesterol dalam hati dan melalui duktus empedu, kemudian dalam usus halus membentuk misel campuran dengan asam lemak, monogliserida dan penyerapan lipid yang membawa kolesterol pada usus bagian atas (David and Wang, 2003; Levy et al., 2007). Garam empedu bebas diserap kembali dalam usus halus distal dan dibawa kembali ke hati oleh sirkulasi darah portal (David and Wang, 2003; Levy et al., 2007). Secara normal, garam empedu dibawa kembali 90% oleh sirkulasi enterohepatik, tetapi dengan adanya saponin mengikat garam empedu pada saluran pencernaan menyebabkan tidak terserapnya garam empedu dan meningkatkan ekskresi garam empedu feses dan mempercepat sintesis garam empedu endogenus yang akhirnya dapat menurunkan tingkat kolesterol di serum dan di hati (Oakenfull and Sidhu, 1990). 2. Penurunan penyerapan kolesterol Kolesterol diserap sebagai suatu zat terlarut dalam inti non polar dari misel yang terbentuk pada usus dari garam empedu dan gliserida (Grundi, 1990). Karena pengeluaran atau keterbatasan pankreas atau sekresi empedu dapat terjadi steatorrhoea dan hipokolesterolemia. Hal ini disebabkan karena saponin membentuk senyawa kompleks yang tidak larut dengan kolesterol di lumen usus (Price et al., 1987). 3. Iritasi mukosa usus Saponin yang hipokolesterolemia dapat berinteraksi dengan sterol dalam brush border dari mukosa usus dan meningkatkan permeabilitas membran atau meningkatkan pelepasan dari membran usus yang menghasilkan ekskresi kolesterol (Price et al., 1987). 2.2 Metabolisme Kolesterol 2.2.1 Kolesterol Kolesterol adalah suatu komponen yang sangat penting dalam tubuh mamalia, yang mempunyai formula C27H45OH (Gambar 2.9), dapat dinyatakan sebagai 3hidroksi-5,6 kolestan karena hanya mempunyai satu gugus hidroksil pada atom C3 dan ikatan rangkap pada C5 dan C6 serta percabangan pada C10, C13 dan C17 (Ros, 2000; Christie, 2012). Gambar 2.9 Struktur molekul kolesterol (Ros, 2000) Untuk mengidentifikasi adanya kolesterol dalam suatu sampel dapat dilakukan dengan reaksi warna yaitu: (1) Reaksi Salkowaski: kolesterol dalam kloroform jika ditambahkan asam sulfat pekat maka timbul warna merah. (2) Reaksi Liebermann-Burchard: warna kehijauan terjadi bila larutan kolesterol dalam kloroform ditambahkan asam sulfat pekat dan anhidrid asetat (Ahmed, 2007). Kolesterol kebanyakan berasal dari kolesterol hewan, sedangkan kolesterol dari tumbuhan sukar diserap usus. Kolesterol dalam makanan (hewani) terutama berasal dari otak, kuning telur, hati, dan lemak hewan lainnya. Kolesterol makanan dalam wujud sebagai kolesterol ester. Kolesterol adalah juga molekul prekursor untuk sintesis hormon steroid, vitamin D dan garam empedu. Kolesterol berasal dari diet dan disintesis dalam tubuh. Diet mengandung 200-500 mg kolesterol. Kolesterol juga memasuki usus bersama empedu (800-1200 mg/hari) dan sebagai desquamated sel epitel usus (300 mg/hari). Kolesterol usus terserap kira-kira 30-60%. Bagian penting dari biosintesis kolesterol adalah hati dan usus. Kolesterol dalam tubuh dapat diekskresikan sebagai garam empedu dan kolesterol yang tidak terserap dalam usus akan dikeluarkan lewat feses. Kolesterol total yang hilang setiap hari baik yang berasal dari diet maupun endogenus sebesar 900 mg (David and Wang, 2003; Levy et al., 2007). Kolesterol dalam tubuh berasal dari dua sumber yaitu dari endogenus (dihasilkan oleh hati dan jaringan periferal) dan berasal dari sumber makanan yang terserap dari usus (Van et al., 2000). Kolesterol yang berasal dari makanan menyediakan kira-kira 400 mg perhari, dan hati menskeresiksn kira-kira 1 g perhari (Wilson, and Rudel, 1994). Kolesterol dalam usus diserap kira-kira 50% dan sisanya diekskresikan dalam feses (Bay, 2002; Clearfield, 2003). Hanya kolesterol bebas yang bergabung dalam misel asam empedu dan diserap oleh enterosit. Sebagian besar kolesterol makanan ada dalam bentuk kolesterol ester. Kolesterol ester kemudian dihidrolisis oleh kolesterol esterase menghasilkan kolesterol bebas untuk penyerapan. Kolesterol hanya sebagian kecil larut dalam lingkungan air dan kemudian dipartisi ke dalam bentuk misel dengan garam empedu sebelum penyerapan. Misel yang terbentuk antara garam empedu dengan triasilgliserida, fosfolipid, asam lemak yang terionisasi dan asam lemak yang tidak terionisasi, monoasilgliserida, lisofosfolipid, dan kolesterol bebas adalah membentuk misel campuran (Yao et al., 2002; David and Wang, 2003). Misel ini ditransfer ke enterosit, untuk diserap. Penyerapannya tergantung pada asam empedu dalam lumen usus (Voshol et al., 2001). 2.2.2 Penyerapan kolesterol di usus Kolesterol harus melewati diffusion barrier pada antarmuka lumen ususmembran enterosit sebelum berinteraksi dengan protein transporter yang bertanggung jawab untuk asupannya dan transporter melewati celluler brush border. Misel garam empedu memfasilitasi transfer kolesterol melewati unstirred water layer. Mekanisme kolesterol dalam misel diambil oleh sel dan melintasi membran brush border dan masih dalam investigasi. Penyerapan kolesterol dilakukan dengan proses difusi pasif oleh enterosit dengan efisiensi relatif tinggi dibandingkan fitosterol yang mempunyai kemiripan struktur (Moreau et al., 2002). Beberapa protein mempunyai peranan yang potensial sebagai pengangkut kolesterol usus, tetapi bukti untuk peranan secara langsung dalam asupan kolesterol tetap tidak dimengerti. Berdasarkan hasil penelitian dilaporkan bahwa Niemann-Pick C1 Like-1 (NPC1L1) berperan sebagai transporter kolesterol (Altmann et al., 2004) dan ATP-binding cassette (ABC) serta protein ABCG5 dan ABCG8 sebagai transporter efflux kolesterol (Berge et al., 2000; Lee et al., 2001; Lu et al., 2001). Tiga molekul tersebut menjadi kunci yang berperan sebagai kontrol penyerapan dari lumen usus. Identifikasi NPC1L1 sebagai transporter kolesterol putatif dalam enterosit yang difasilitasi oleh penemuan ezetimibe yang dapat menghambat penyerapan kolesterol (Altmann et al., 2004; Garcia-Calvo et al., 2005), yang mengurangi hiperkolesterolemia yang diinduksi diet (Ziajka et al., 2004; Tomkin and Daphne Owens, 2011). NPC1L1 adalah suatu protein terglikosilasi yang berlokasi pada membran enterosit. Penghambatan NPC1L1 pada tikus menghasilkan penurunan penyerapan kolesterol (Altmann et al., 2004; Iyer et al., 2005). Estimibe menunjukkan kemampuan mengikat NPC1L1 yang mengekpresikan sel-sel pada brush border intestinal. Penghambatan NPC1L1 juga menghasilkan eliminasi kapasitas ikatan dengan brush border intestinal, yang menunjukkan bahwa NPC1L1 adalah suatu target dari ezetimibe, sehingga mengurangi penyerapan kolesterol, karena NPC1L1 yang mengatur penyerapan kolesterol (Garcia-Calvo et al., 2005; Iqbal and Hussain, 2009). Kolesterol ester diubah menjadi kolesterol bebas dalam usus oleh kolesterol esterase dan bersama-sama dengan kolesterol bebas dari diet dan empedu, bergabung dengan sterol dari diet dalam misel campuran (Gambar 2.10), selanjutnya kolesterol terdiri dari garam empedu, monogliserida, fosfolipid, lisofosfolipid dan asam lemak. Kolesterol dan sterol lainnya dari yang terkecil (diameter 40°A) memasuki enterosit melalui saluran Nieman-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) (Huff et al., 2006;. Wang, 2007; Levy et al., 2007). Sterol selain kolesterol yang memasuki enterosit melalui NPC1L1 dicegah memasuki tubuh ke batas yang signifikan karena diangkut kembali ke dalam lumen usus oleh ATP binding cassette G5/G8 (ABSG5/ABCG8) (Kusuhara and Sugiyama, 2007). Pada Gambar 2.10 menunjukkan bahwa sterol diserap melalui saluran NiemanPick C1-Like 1 (NPC1L1). Sterol non kolesterol, seperti sterol tumbuhan, dikembalikan binding ke lumen usus melalui saluran ATP cassette G5/G8(ABCG5/ABCG8). Kolesterol diesterifikasi oleh acetyl-CoA:cholesterol acyl transferase (ACAT) dan kemudian membentuk kompleks dengan lipid dan apolipoprotein B lainnya dalam retikulum endoplasma (ER) dan badan Golgi membentuk kilomikron yang disekresikan ke dalam lacteal atau kolesterol bebas melalui saluran ATP binding cassette A1 (ABCA1) membentuk kompleks dengan nascent HDL dalam kapiler. Gambar 2.10 Penyerapan kolesterol Usus (Charlton-Menys and Durrington, 2007). Singkatan : TG,trigliserida; MTP, mikrosomal trigliserida transfer protein; dan RBC,red blood cell. 2.2.3 Transport kolesterol Kolesterol adalah molekul hidrofobik atau tidak larut dalam air. Untuk menstranportnya dalam aliran darah dan mengirimnya ke sel-sel di seluruh tubuh dimediasi oleh partikel-partikel lipoprotein yang berbeda-beda pada tiap stepnya. Lipoprotein adalah molekul terdiri dari protein dan lipid (triacylglycerol, cholesteryl ester, phospholipid dan cholesterol) yang digabungkan dengan interaksi hidrofob antara bagian (gugus) non polar dari lipid dengan molekul protein. Berdasarkan bobot molekul, kerapatan, dan ukuran partikelnya lipoprotein plasma darah manusia dibagi menjadi lima golongan utama, yaitu: kilomikron, lipoprotein kerapatan sangat rendah (very low density lipoprotein, VLDL), lipoprotein kerapatan rendah (low density lipoprotein, LDL), lipoprotein kerapatan tinggi (high density lipoprotein, HDL), dan lipoprotein kerapatan sangat tinggi (very high density lipoprotein, VHDL). Berdasarkan kecepatan, kolesterol HDL dapat dibagi lagi menjadi kolesterol HDL1, HDL2 dan HDL3. Komposisi lipoprotein dalam plasma manusia disajikan dalam Tabel 2.1 (Murray et al., 2003). Kilomikron menangkap kolesterol dan lemak dari usus. Kilomikron adalah butir-butir lemak yang mengandung sedikit protein. Lemak dikirim ke jaringan adiposa meninggalkan sisa kilomikron (Chylomicron remnants) yang mengandung sebagian besar kolesterol. Sisa kolesterol ini dibawa menuju hati. Di dalam hati kolesterol dari sisa kilomikron digabungkan dengan kolesterol yang disintesis oleh hati menjadi partikel VLDL. Kolesterol VLDL ini kemudian digunakan untuk transport lemak-lemak ke jaringan-jaringan (Murray et al., 2003). Tabel 2.1. Komposisi lipoprotein plasma darah manusia (Murray et al., 2003). Kolesterol Very low density lipoprotein (VLDL) masuk aliran darah dan memulai penyaluran lemak-lemak ke jaringan sel tepi sepanjang dinding pembuluh darah. Dalam proses perjalanannya itu, VLDL mengalami proses penguraian lipid secara bertahap. Ketika lemak-lemak disalurkan ke jaringan, VLDL menjadi lebih diperkaya kolesterol dan secara bertahap berubah menjadi kolesterol LDL. Dalam hal ini kehilangan lemak menurunkan ukuran partikel dan menaikkan konsentrasi kolesterol. Kolesterol LDL adalah pembawa kolesterol utama dalam darah. Jika selsel sudah cukup kolesterol, maka kolesterol LDL diblok masuk ke dalam sel atau jaringan dan kolesterol terakumulasi dalam darah membentuk plak arteri (aterosklerosis). Oleh karena itu kolesterol LDL disebut juga kolesterol jahat karena mereka membawa kelebihan kolesterol untuk ditimbun pada dinding arteri dan menyebabkan penyakit jantung (Murray et al., 2003). 2.3 Metabolisme Asam Empedu 2.3.1 Struktur asam empedu Struktur asam empedu sangat berperan sebagai deterjen yang efisien. Secara umum, kolesterol diubah oleh epimerizasi dari gugus 3β-hidroksil, saturasi dan hidroksilasi dari inti steroid dan pemutusan rantai samping. Gambar. 2.11 menunjukkan posisi karbon dalam inti steroid yang diubah selama biosintesis asam empedu. Dalam kondisi fisiologis normal, satu atau dua gugus hidroksil ditambahkan ke inti steroid. Modifikasi ini membuat sterol kurang hidrofobik, memungkinkan untuk berinteraksi dengan lingkungan berair lebih efisien. Kelompok-kelompok hidroksil dari asam empedu banyak berorientasi pada salah satu permukaan inti steroid yang membuat molekul memiliki karakter amfipatik(Vance and Vance, 2002; Dawson, 2011). Gambar. 2.11. Konversi kolesterol menjadi asam empedu. (Vance and Vance, 2002). Setelah pemutusan 3 karbon dari rantai samping, asam empedu 'bebas' terikat kovalen dengan salah satu dari dua asam amino yaitu taurin (H2NCH2CH2SO3H) atau glisin (H2NCH2COOH) untuk membentuk asam empedu 'terkonjugasi' yaitu: asam glikokolat, asam taurokolat, glikokenodeoksikolat dan taurokenodeoksikolat, sebelum disekresikan dalam empedu (Ahmed, 2007). Asam empedu terkonjugasi mudah mengalami ionisasi, yang memungkinkan molekul-molekul polar untuk berinteraksi efisien dengan zat hidrofobik dan hidrofilik (Gambar 2.12). Permukaan hidrofobik (Gambar 2.12) molekul garam empedu bergabung dengan triasilgliserol, dan sejumlah kompleks agregat ini untuk membentuk misel, dengan permukaan polar dari garam empedu menghadap ke luar. Hal ini memungkinkan asosiasi dengan lipase pankreas, yang menguraikan asam lemak bebas dalam misel yang lebih kecil, sehingga diserap melalui mukosa usus (Almatsier, 2002). Jumlah dan orientasi khusus dari gugus hidroksil yang ditambahkan pada inti steroid bervariasi sesuai dengan spesies hewan. Beberapa asam empedu, seperti asam kolat dan asam kenodeoksikolat, pada umumnya terdapat pada beberapa spesies mamalia, sedangkan yang lain untuk spesies tertentu. Asam ursodeoksikolat, yang berlimpah dalam empedu beruang, telah ditemukan untuk menjadi terapi yang bermanfaat untuk mengobati cirrhosis biliary primary dan melarutkan batu empedu. Ini adalah proses kimia dan biologis yang berbeda dari isomernya asam kenodeoksikolat, berbeda hanya dalam orientasi gugus hidroksil yang terikat pada atom karbon 7(C7) dari inti steroid (Lefebvre et al., 2009). Saluran gastrointestinal adalah jalur yang paling penting untuk eliminasi kolesterol dari tubuh. Faktor-faktor yang menentukan kehilangan asam empedu dalam feses belum jelas. Asam empedu yang tidak terkonjugasi pada manusia yaitu asam kolat dan asam kenodeoksikolat dihasilkan dari kolesterol dalam hati dan setelah terkonjugasi dengan taurin atau glisin disekresikan dalam empedu. Kemudian asam empedu diserap kembali dari usus halus dengan difusi pasif dan Gambar 2.12 Aksi garam empedu sebagai pengemulsi lemak dalam usus. (Almatsier, 2002). dengan mekanisme transport ileal aktif; kemudian oleh hati diekskresikan kembali. Hanya sebagian kecil garam empedu diserap kembali selama resirkulasi enterohepatik, tetapi garam empedu mensirkulasi 6-10 kali perhari, sehingga kehilangan kumulatif perhari dari ileum menuju kolon adalah proporsi garam empedu total. Adanya bakteri dalam lumen kolon melepaskan glisin atau taurin dari garam empedu dan juga mengalami dehidroksilasi asam kolat dan asam kenodeoksikolat pada posisi 7α membentuk asam deoksikolat dan asam litokolat. Deoksikolat diserap dari kolon dalam jumlah kecil, memasuki sirkulasi enterohepatik dan berakumulasi dalam garam empedu karena reabsorbsi asam empedu efisien oleh ileum. Litokolat terbentuk dari kenodeoksikolat, yang sedikit larut dan tidak diabsorbsi (Lefebvre et al., 2009). Kehilangan asam empedu perhari dalam feses manusia adalah kira-kira 200600 mg/hari (garam empedu total antara 2,5 dan 5 g). Pada tikus dan anjing, peningkatan konversi kolesterol menjadi asam empedu tampaknya menjadi mekanisme penting untuk pembuangan kolesterol karena penyerapannya yang berlebih (Lefebvre et al., 2009). Konversi menjadi asam empedu, tentu menjadi metode yang efektif untuk peningkatan ekskresi kolesterol jika reabsorbsi asam empedu ileal secara simultan berkurang. Penelitian pada monyet menunjukkan bahwa frekuensi resirkulasi meningkat menyebabkan peningkatan kehilangan asam empedu feses yang terjadi dengan lemak tak jenuh (Lefebvre et al., 2009). Kehilangan asam empedu meningkat dengan pemberian kolestiramin, suatu resin yang tidak hanya mengikat asam empedu dalam lumen usus tetapi juga meningkatkan ekskresinya ke feses. Kolesteramin adalah umumnya digunakan dalam mengatur hiperkolesteremia. Ekskresi kolesterol juga meningkat bila kehilangan asam empedu meningkat. 2.3.2 Biosintesis asam empedu Studi klasik menjelaskan langkah-langkah utama dalam jalur biosintesis asam empedu terutama menganalisis pembentukan metabolit dari Kolesterol berlabel dan oksisterol. Setidaknya 18 reaksi yang berbeda terjadi dalam berbagai kompartemen subselular (sitosol, retikulum endoplasma, mitokondria, dan peroksisom) adalah diperlukan untuk mengubah kolesterol menjadi asam empedu. Reaksi yang melibatkan modifikasi dari inti steroid terjadi dalam retikulum endoplasma dan mitokondria. Penghilangan rantai samping kolesterol melibatkan peroksisom (Vance and Vance, 2002). 2.3.3 Sintesis asam empedu pada hati Hasil sintesis asam empedu primer yang terjadi pada hati manusia melalui jalur sintesis asam empedu klasik atau netral dan alternatif atau asam adalah asam kolat (asam 3α, 7α, 12α- trihidroksi-5β-kolanoat) dan asam kenodeoksikolat (asam 3α, 7α-dihidroksi-5β-kolanoat) (Gambar 2.13). Pada binatang pengerat, reaksi hidroksilasi alternatif memberikan struktur asam empedu primer yang berbeda yaitu asam α-, asam β-, dan asam γ-murikolat (asam 3α, 6β, 7α- trihidroksi-5β-kolanoat, asam 3α, 6β, 7β- trihidroksi-5β-kolanoat, dan asam 3α, 6α, 7β- trihidroksi-5βkolanoat berturut-turut). Asam empedu primer yang terbentuk kemudian dimetabolisme dalam usus besar oleh bakteri flora menghasilkan asam empedu sekunder yaitu asam deoksikolat (asam 3α, 12α-dihidroksi-5β-kolanoat) dan asam litokolat (asam 3α-hidroksi-5β-kolanoat)(lihat Gambar 2.13 (Lefebvre et al., 2009). Jalur klasik beroperasi sepenuhnya dalam hati (Gambar. 2.13). Ini dimulai dengan α-hidroksilasi karbon 7 dari inti steroid kolesterol atau dari posisi C24, C25 atau C27 pada rantai samping. Reaksi ini dikatalisis oleh mikrosomal monooksigenase sitokrom P-450 disebut sebagai kolesterol 7α -hidroksilase (CYP7A1) dan langkah berpartisipasi dalam pembatas dari jalur klasik. Beberapa enzim yang transformasi kolesterol menjadi asam empedu milik famili sitokrom P-450. Secara umum, kelas enzim ini mengkatalisis hidroksilasi berbagai senyawa organik menggunakan molekul oksigen sebagai kosubstrat. Heme yang mengandung monooksigenase untuk mengenali molekul tertentu, atau sekelompok senyawa terkait, dan bekerja dengan NADPH: sitokrom P-450 oksidoreduktase yang memasok elektron untuk reaksi. CYP7A menunjukkan derajat selektif yang tinggi terhadap kolesterol. Asam empedu keluar dari hati yang berkorelasi dengan aktivitas CYP7A, dan umumnya dianggap bahwa jalur klasik adalah sumber dari sebagian besar asam empedu yang dibuat oleh hati (Vance and Vance, 2002). Keberadaan jalur alternatif untuk sintesis asam empedu diduga karena oksisterol dikonversi menjadi asam empedu. Sekarang diakui bahwa berbagai oksisterol dihasilkan oleh bermacam-macam tipe sel yang dapat diubah menjadi asam empedu. Produksi oksisterol tersebut dikatalisis oleh beberapa sterol hidroksilase: sterol 27-hidroksilase (CYP27), kolesterol 25-hidroksilase dan kolesterol 24- hidroksilase (CYP46). Kolesterol 25-hidroksilase bukanlah monooksigenase sitokrom P-450, seperti dua enzim lainnya. Hampir semua 24-hidroksikolesterol yang berakhir di hati yang berasal dari otak, dan telah dinyatakan bahwa produksi oksisterol tersebut adalah mekanisme utama yang bertanggung jawab untuk menghilangkan kelebihan kolesterol dari organ ini. CYP27 juga penting dalam tahap terakhir dari sintesis asam empedu dalam hati, karena merupakan enzim utama yang mengkatalisis hidroksilasi dari rantai samping untuk memfasilitasi pembelahan rantai samping sterol. Oksisterol dihasilkan di luar hati adalah 7α -dihidroksilasi, terutama oleh hidroksilase oksisterol yang berbeda dari CYP7A. CYP7Bl oksisterol 7α - hidroksilase memilih 25-hidroksikolesterol dan 27-hidroksikolesterol, sedangkan oksisterol CYP37Al 7α-hidroksilase adalah selektif untuk 24-hidroksikolesterol. CYP7A dapat menerima beberapa oksisterol sebagai substrat, meskipun sebagian besar lebih suka kolesterol (Vance and Vance, 2002). 2.4 Dislipidemia Dislipidemia adalah metabolisme abnormal lipoprotein, biasanya berhubungan dengan over-produksi atau kekurangan lipoprotein. Dislipidemia juga sering dikatakan sebagai hiperlipidemia merupakan peristiwa peningkatan lipid serum sebagai faktor risiko penyakit kardiovaskular. Hal ini disebabkan oleh dislipidemia juga ada prilaku kolesterol yang berperan pada aterosklerosis. Jadi yang membedakan antara hiperkolesterolemia dengan dislipidemia adalah pada hiperkolesterolemia terjadi peningkatan kolesterol serum melebihi 200 mg/dL setelah sembilan sampai dua belas jam puasa. Sebaliknya, pada dislipidemia di samping kriteria untuk hiperkolesterolemia juga terjadi peningkatan kolesterol LDL-serum > 160 mg/dL, trigliserida serum sebesar 150 mg/dL, atau kolesterol HDL-serum < 40 mg/dL untuk laki-laki dan < 50 mg/dL untuk perempuan. Simptom Tingginya kolesterol pada dislipidemia tidak dapat dirasakan oleh seorang penderita, tetapi hanya dapat diketahui dengan tes kolesterol darah secara rutin. Diet kolesterol tinggi dapat menginduksi dislipidemia di samping juga dapat dipicu akibat faktor genetik (Goldberg, 2008; Turner et al., 2010). Gambar. 2.13. Metabolisme Asam empedu pada manusia (Lefebvre et al.,2009). Langkah-langkah biokimia utama dalam sintesis asam empedu dari kolesterol yang ditunjukkan dan diuraikan secara rinci untuk bio-transformasi yang terjadi di hati. Kolesterol yang dimodifikasi untuk asam kolestanoat (C 27) kemudian asam kolanoat (C24). Asam empedu primer yang paling berlimpah dalam empedu manusia adalah asam kenodeoksikolat dan asam kolat. Asam empedu Primer lebih lanjut dimodifikasi oleh bakteri usus dan dikonversi menjadi deoksikolat asam empedu sekunder yang berasal dari kolat, dan litokolat yang berasal dari kenodeoksikolat. Kolat dan jumlah derivat kolat untuk 70-80% dari asam empedu total manusia. Sebagian besar asam empedu primer dan sekunder diserap melalui usus dan mengikuti siklus enterohepatik. Pentingnya fungsional enzim (berwarna merah) dibahas secara rinci dalam teks (CH25H, kolesterol-25-hidrolase). Lokalisasi subseluler reaksi enzimatik juga diindikasikan (ER, endoplasma retikulum) (Lefebvre et al.,2009). Adanya peningkatan penanganan penyakit kardiovaskular pada dua dekade terakhir ini telah berbuah pada penurunan mortalitasnya. Namun, belakangan ini terlihat adanya kecenderungan mortalitas akibat penyakit kardiovaskular yang kembali meningkat, bukan saja di negara-negara barat (Gambar 2.14), namun juga di kawasan Eropa timur, negara-negara pecahan Uni Soviet, serta banyak negara sedang berkembang di kawasan Asia. Alasan yang paling rasional untuk menjelaskan perubahan fenomena epidemiologi dari penyakit kardiovaskular ini adalah adanya peningkatan keadaan yang dikenal sebagai sindroma metabolik, yaitu suatu kumpulan gangguan metabolisme dan klinis yang ditandai oleh adanya peningkatan LDL-kolesterol, penurunan HDL-kolesterol, peningkatan trigliserida, gula darah yang tinggi, resistensi insulin, obesitas, dan hipertensi. Penurunan HDL-kolesterol dianggap meningkatkan risiko terjadinya penyakit kardiovaskular karena sedikitnya tiga alasan, yaitu HDL dinilai dapat mencegah terhadap atherogenesis, rendahnya kadar HDL menggambarkan adanya peningkatan lipoprotein yang mengandung apoB yang bersifat atherogenik, dan rendahnya HDL umumnya berkaitan dengan faktor risiko non-lipid dari sindroma metabolik. Kemampuan untuk mempertahankan derajat kompensasi hiperinsulinemia, yang penting untuk mencegah intoleransi glukosa pada individu dengan resistensi insulin merupakan proses homeostasis yang penting. Sindroma metabolik merupakan hasil interaksi antara gangguan genetik dengan perubahan gaya hidup, yang akan muncul saat seseorang dengan kecenderungan genetik mendapatkan sindroma metabolik mengalami obesitas. Gangguan metabolik dan klinik yang ditemukan pada sindroma metabolik memberikan risiko yang lebih besar terhadap penyakit kardiovaskular ketimbang risiko penyakit jantung koroner lainnya bila berdiri sendiri (Goldberg, 2008; Turner et al., 2010). Gambar 2.14: CVD dan penyebab kematian utama yang lain untuk laki-laki dan perempuan A. Total CVD B. Cancer C. Accidents D. Chronic lower respiratory disease E. Diabetes Mellitus and F. Alzheimer’s Disease (National Center for Health Statistics. Health, United States, 2000.). 2.6 Gemfibrozil Definisi dan Sifat Fisikokimia Gemfibrozil adalah obat yang membantu mengurangi kolesterol dan trigliserida dalam darah. Tingginya jenis lemak ini dalam darah dihubungkan dengan meningkatnya risiko atherosclerosis (Rubins et al., 1999). Gemfifbrozil sebagai agen hipolipidemik turunan asam fibrat. Hipolipidemik adalah obat yang digunakan untuk menurunkan kadar lipid plasma. Tindakan menurunkan kadar lipid plasma merupakan salah satu tindakan yang ditujukan untuk menangani hiperlipidemia dan menurunkan risiko penyakit aterosklerosis sehingga menurunkan risiko terjadinya penyakit jantung koroner (Rubins et al., 1999; Rubins et al., 2001). Gemfibrozil adalah turunan asam fibrat generasi pertama turunan klofibrat. Secara farmakologis gemfibrozil berhubungan dengan penurunan kadar VLDL dan peningkatan lipase lipoprotein. Gemfibrozil secara struktural merupakan non-halogen asam fenoksipentanoat. Bentuknya berupa masa padat berwarna putih dengan berat molekul 250.333 g/mol. Kelarutan gemfibrozil dalam air sebesar 19 mcg/ml dan 100 mg/ml dalam alkohol pada temperatur ruangan. Tablet gemfibrozil harus disimpan pada wadah yang rapat dengan temperatur dibawah 30°C. Formula gemfibrozil adalah C15H22O3 (Murai et al., 2004). Farmakokinetik Absorpsi Gemfibrozil diabsorbsi sempurna melalui usus setelah pemberian per oral. Bioavailabilitasnya hampir mencapai 97%. Kadar puncak gemfibrozil dalam plasma dicapai dalam 1-2 jam dan keadaan mantap tercapai dalam 7-14 hari pada pemberian 2 kali 600 mg sehari. Pada pemberian per oral 800 mg kadar puncak plasma rata-rata mencapai 33 mcg/ml setelah 1-2 jam. Pada pemberian per oral 600 mg kadar puncak plasma rata-rata mencapai 16-23 mcg/ml setelah 1-2 jam. Distribusi Gemfibrozil secara luas menyebar ke seluruh tubuh, terikat erat 95% pada protein plasma. Konsentrasi in vitro-nya 0,1-12 mcg/ml. 97% dari obat ini berikatan pada 4% albumin serum manusia. Gemfibrozil mengalami sirkulasi enterohepatis dan menembus plasenta dengan mudah. Pada hewan, konsentrasi maksimum gemfibrozil di jaringan tercapai setelah 1 jam pemberian per oral dosis tunggal, konsentrasi tertinggi terdapat di hati dan ginjal (Murai et al., 2004). Metabolisme Gemfibrozil dimetabolisme di hati oleh enzim CYP34A. Obat ini mengalami hidroksilasi dan konjugasi. Hati memodifikasi sebagian obat pada gugus metil-nya menjadi hidroksimetil atau turunan karboksil dan sebagian dari senyawa tersebut menjadi quinol, lihat (Gambar 2.15) (Murai et al., 2004; Ogilvie et.al., 2005). → ↓ (A) (B) Gambar 2.15 Metabolisme gemfibrozil di hati (A) (Murai et al., 2004) dan (B) (Ogilvie et.al., 2005). Ekskresi Waktu paruh gemfibrozil adalah 1,5 jam setelah pemberian dosis tunggal dan sekitar 1,3-1,5 jam setelah pemberian dosis multipel pada individu dengan fungsi ginjal yang normal. Gemfibrozil dan metabolitnya diekskresikan terutama melalui urin. 94% dari obat ini dieliminasi melalui ginjal, diekskresikan dalam urin sebagian besar dalam bentuk tidak berubah dan 6% dari obat ini diekskresikan melalui feses. (http://somelus.wordpress.com/2008/11/27/ gemfibrozil-pada-hiperlipidemia/) Farmakodinamik Mekanisme Kerja Gemfibrozil diyakini meningkatkan aktivitas peroxisome proliferatoractivated receptor-alpha (PPAR-α), suatu reseptor yang terlibat dalam metabolisme karbohidrat dan lemak, yang akan meningkatkan aktivitas lipoprotein lipase. Gemfibrozil menyebabkan penurunan trigliserol plasma dengan memacu aktivitas lipase lipoprotein tersebut, sehingga menghidrolisis triasilgliserol pada kilomikron dan VLDL serta mempercepat pengeluaran partikel-partikel ini dari plasma. Terdapat suatu penurunan kadar kolesterol LDL dalam plasma, sebagian terjadi karena penurunan sekresinya oleh hati. Hanya sedikit terjadi penurunan kadar kolesterol LDL pada sebagian besar pasien. Pada pasien lainnya, terutama dengan hiperlipidemia gabungan, kadar kolesterol LDL sering meningkat ketika trigliserida menurun. Gemfibrozil dilaporkan dapat menghambat penyerapan kolesterol, sehingga tingkat kolesterol serum menurun (Umeda et al., 2001). Kadar kolesterol HDL meningkat, sebagian dari peningkatan kadar kolesterol HDL ini merupakan suatu konsekuensi langsung dari penurunan kandungan trigliserida dalam plasma, dengan penurunan sebagai pertukaran trigliserida ke dalam koolesterol HDL yang seharusnya ditempati oleh ester kolesterol (Umeda et al., 2001). Penelitian pada hewan uji menunjukkan bahwa fibrat dapat menyebabkan penurunan kolesterol dalam hati (mekanismenya tidak diketahui) dan meningkatkan ekskresi biliar kolesterol ke dalam feses. Fibrat juga dapat menurunkan kadar fibrinogen plasma. Efek metabolik: Gemfibrozil dapat menyebabkan efek yang sangat minimal pada peningkatan aktivitas hepatik α-glycerophosphate dehydrogenase atau liver catalase. Gemfibrozil meningkatkan proliferasi peroxisome (fungsi peroksidatif yang terkait dengan katalase dan oksidasi asam lemak) (http://somelus.wordpress.com/2008/11/27/gemfibrozil-pada-hiperlipidemia/ BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS PENELITIAN 3.1 Kerangka Berpikir Penelitian Saponin steroid daun andong merupakan suatu glikosida tumbuhan yang mengandung aglikon (sapogenin steroid) yang larut dalam pelarut nonpolar (lemak) dan glikon (gula) yang larut dalam pelarut polar. Saponin dengan sifat deterjennya dapat mempengaruhi substansi yang larut dalam lemak pada pencernaan, meliputi pembentukan misel campuran yang mengandung garam empedu, asam lemak, digliserida, vitamin yang larut dalam lemak dan mineral-mineral yang sangat berperan sebagai antidislipidemia. Dislipidemia dapat memicu aterosklerosis. Aterosklerosis dapat terjadi bila banyak mengkonsumsi makanan yang kaya kolesterol dan asam lemak jenuh (aterogenik), Sebaliknya, dapat menurunkan kadar kolesterol plasma dan meningkatkan ekskresi asam empedu dan kolesterol pada feses. Saponin daun andong dapat mencegah dan mengobati aterosklerosis sebagai pemicu penyakit jantung koroner. Hal ini berkaitan dengan pembentukan senyawa kompleks yang tidak larut antara saponin dan kolesterol, sehingga menghambat penyerapan kolesterol di usus. Saponin juga dapat membentuk misel campuran, antara saponin, kolesterol dan asam empedu sehingga terjadi hambatan penyerapan kolesterol pada NPC1L1 dan hambatan penyerapan kembali asam empedu pada IBAT usus. Hambatan tersebut dapat meningkatkan ekskresi kolesterol dan asam empedu lewat feses. Penurunan penyerapan kembali asam empedu menyebabkan peningkatan sintesis kolesterol yang dikonversi menjadi asam empedu sehingga kolesterol plasma menurun. Pembentukan kompleks antara saponin dan kolesterol juga dapat dibuktikan secara in vitro, sehingga diyakini bahwa pembentukan kompleks tersebut yang menyebabkan terjadinya penghambatan penyerapan kolesterol di usus dan terjadi peningkatan ekskresi kolesterol pada feses. 3.2 Konsep Penelitian Berdasarkan kerangka berpikir di atas dibuat konsep penelitian seperti Gambar 3.1. Asupan saponin daun andong Makanan tinggi kolesterol pada Tikus wistar Umur, Jenis Kelamin, makanan, strain Penyerapan kolesterol NPC1L1 dan Penyerapan asam empedu pada IBAT Output Kolesterol plasma↓↓ , Asam empedu plasma↓↓ asam empedu feses ↑↑ dan kolesterol feses↑↑, interaksi saponin-kolesterol in vitro↑↑ Gambar 3.1 Bagan Kerangka Konsep Penelitian Keterangan Gambar : = V. Kendali ↑ = Peningkatan; ↓ = = Meningkatkan 3.3 Hipotesis Penelitian = V. Bebas = Menurunkan = Berpengaruh = V. Tergantung 3.3 Hipotesis Penelitian Dari kajian pustaka yang ditelaah dan kerangka pikir dan konsep penelitian yang diuraikan di atas maka diajukan hipotesis sebagai berikut: 1. Asupan saponin daun andong menurunkan kadar kolesterol plasma pada tikus wistar yang diberikan makanan tinggi kolesterol; 2. Asupan saponin daun andong menurunkan asam empedu total plasma pada tikus wistar yang diberikan makanan tinggi kolesterol; 3. Asupan saponin daun andong meningkatkan kadar asam empedu feses pada tikus wistar yang diberikan makanan tinggi kolesterol; 4. Asupan saponin daun andong meningkatan kadar kolesterol bebas feses pada tikus wistar yang diberikan makanan tinggi kolesterol; dan 5. Saponin daun andong mampu mengikat kolesterol melalui pembentukan kompleks saponin- kolesrerol secara in vitro. BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan rancangan randomized posttest only control group design, bagannya disajikan pada Gambar 4.1. P R .S KLP0 O1 KLP1 O2 KLP2 O3 KLP3 O4 Ra Gambar 4.1 Bagan Rancangan Penelitian Keterangan: P = Populasi R.S. = menunjukkan sampel yang dipilih secara random dari populasi Ra = Random alokasi untuk memilih sampel menjadi kelompok kontrol dan kelompok perlakuan. KLP0 = Kontrol negatif (diberi makanan standar + air minum) KLP1 = Kontrol positif (perlakuan makanan tinggi kolesterol + air minum) KLP2 = Kelompok perlakuan 2 diberi makanan tinggi kolesterol+ saponin 30 mg/ hari diberikan secara oral. KLP3 = Kelompok perlakuan 3 diberi makanan tinggi kolesterol + gemfibrozil 30mg/hari diberikan secara oral. O1 = Post test kontrol negatif (rata-rata kadar kolesterol dan asam empedu plasma, ekskresi asam empedu dan kolesterol feses) O2 = Post test kontrol positif (rata-rata kadar kolesterol dan asam empedu plasma, ekskresi asam empedu dan kolesterol feses) O3 = Post test perlakuan 2 (rata-rata kadar kolesterol dan asam empedu plasma, ekskresi asam empedu dan kolesterol feses) O4 = Post test perlakuan 3 (rata-rata kadar kolesterol dan asam empedu plasma, ekskresi asam empedu dan kolesterol feses) 4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian Persiapan tikus coba dilakukan di UPT. Laboratorium Analitik Universitas Udayana. Pemeriksaan kolesterol dan asam empedu plasma, asam empedu feses, kolesterol feses serta pembentukan kompleks saponin-kolesterol secara in vitro dilakukan di UPT. Balai Laboratorium Kesehatan Provinsi Bali; UPT. Laboratorium Analitik Universitas Udayana dan UPT. Balai Laboratorium Penelitian Ternak Bogor. Penelitian ini berlangsung selama delapan bulan dari bulan Oktober 2013 sampai dengan Juni 2014. 4.3. Penentuan Sumber Data dan Sampel 4.3.1 Populasi Populasi target dalam penelitian eksperimental adalah seluruh tikus yang diberi makan tinggi kolesterol. Populasi terjangkau adalah meliputi tikus dengan berat badan 150 g sampai dengan 200 g, berumur 2,5 bulan sampai 3 bulan, dan tikus jantan strain wistar. 4.3.2 Kriteria inklusi, eksklusi dan Droup out Objek penelitian adalah tikus putih jantan strain Wistar dengan kriteria inklusi berat badan 150 g sampai dengan 200 g, berumur 2,5 bulan sampai dengan 3 bulan. Kriteria eksklusi adalah tikus jantan strain Wistar dengan kondisi sakit. Kriteria droup out adalah selama penelitian tikus mati. 4.3.3 Besar sampel Besar sampel dan teknik penelitian sampel diambil secara acak, dan dihitung berdasarkan rumus Federer (1983) dalam Rochiman (1989) sebagai berikut: (t-1)(r-1)≥ 15 Keterangan: t : banyaknya perlakuan r : ulangan Berdasarkan rumus tersebut didapat jumlah tikus minimal dalam penelitian ini adalah 24 ekor (6 ekor tiap kelompok). 5.4 Variabel Penelitian a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah saponin daun andong. b. Variabel tergantung adalah: kolesterol total darah, asam empedu plasma, ekskresi asam empedu, kolesterol pada feses dan ekskresi kolesterol melalui kompleks saponin-kolesterol secara in vitro . c. Variabel kendali adalah: jenis kelamin, kesehatan, berat badan, makanan standar, dan air minum (air kran yang dipanaskan). 4.4.1 Hubungan antar variabel Untuk lebih memudahkan memahami hubungan antar variabel penelitian dibuat skema hubungan antar variabel seperti disajikan pada (Gambar 4.2). Strain, berat badan, umur, jenis kelamin, makanan dan minuman PEMBERIAN SAPONIN DARI DAUN ANDONG Variabel bebas PENURUNAN KADAR KOLESTEROL PLASMA. PENINGKATAN ASAM EMPEDU DAN KOLESTEROL PADA FESES Variabel tergantung Variabel kendali Gambar 4.2 Hubungan antar Variabel 4.4.2 Definisi operasional variabel 1. Saponin adalah metabolit sekunder yang diisolasi dari daun andong dengan cara ekstraksi dan pengendapan (Mimaki, et al., 1997; Ahmed, 2012) 2. Kadar kolesterol total plasma adalah jumlah keseluruhan kolesterol yang ada dalam darah, diukur dengan metode CHOD-PAP (Bochringer-Mennhein GmBb) dalam satuan mg/dl. 3. Kadar asam empedu total plasma adalah jumlah keseluruhan asam empedu primer yang ada dalam darah, diukur menggunakan kit total bile acids cristal chem. Inc USA dalam satuan μmol/L. 4. Kadar asam empedu total feses adalah jumlah keseluruhan asam empedu primer yang ada dalam feses, diukur dengan menggunakan kit total bile acids cristal chem,Inc USA dalam satuan μmol/hari per 100 g BB 5. Kadar kolesterol total pada feses adalah jumlah keseluruhan kolesterol yang ada pada feses, diukur dengan spektrofotometri IKM 30 dalam satuan mg/kg 6. Kadar kolesterol hasil pembentukan kompleks saponin-kolesterol adalah jumlah kolesterol yang bereaksi dengan kolesterol, yang diukur secara in vitro dengan spektrofotometri IKM 30 dalam satuan mg/L (ppm). 7. Tikus yang digunakan dalam penelitian adalah tikus putih jantan strain Wistar, berumur 2,5 bulan sampai dengan 3 bulan, dengan berat badan antara 150 g sampai dengan 200 g yang didapatkan dari Laboratorium CSAD (Center Study of Animal Diseases) Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana. 8. Makanan tinggi kolesterol adalah makanan yang terdiri dari campuran 40 % kuning telur itik dan 60% makanan standar (CP 551). 4.5 Bahan Penelitian Bahan penelitian yang dipakai adalah darah tikus coba yang diambil dari sinus orbita (mata) menggunakan syringe ukuran 3 mL. Selanjutnya, bahan-bahan kimia yang diperlukan disesuaikan dengan pemeriksaan kolesterol total plasma, asam empedu dan kolesterol feses tikus, asam kolat Sigma-Aldrich Jepan , kolesterol Sigma-Aldrich Jepan, Zeolit , Kit asam empedu total USA dan pelarut-pelarut organik. Kandang tikus dikonstruksi dari kawat tinggi 17,5 cm dan lebar 26,25 cm untuk satu ekor tikus. Semua tikus diperlakukan sesuai dengan aturan Komisi Etik Penelitian Kesehatan (KNEPK) yang telah disosialisasikan kepada masyarakat peneliti kesehatan. 4.6 Instrumen Penelitian Instrumen yang digunakan dalam penelitian ini adalah blender, pembuat pellet, zonde, pipet kapiler, sentrifuge, spektrofotometer double beam, timbangan analitik, seperangkat alat gelas, syringe, micro pipette, marbles glass, waterbath, micro tube, dan well plate. 4.7 Prosedur Penelitian 4.7.1 Ekstraksi saponin Saponin adalah metabolit sekunder yang diisolasi dari daun andong dengan cara ekstraksi dan pengendapan. Serbuk kering daun andong 500 gram dimasukkan ke dalam gelas kimia ukuran 2,5 liter, ditambahkan n-heksan sebanyak dua liter dan didiamkan selama 24 jam untuk mengekstraksi lipid dalam sampel. Campuran disaring dan filtratnya ditampung. Ekstraksi diulang dengan cara yang sama sebanyak empat kali, sampai lipid terekstrak sempurna. Selanjutnya residu dikeringkan pada suhu kamar sampai bebas n-heksana, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak dua liter selama 24 jam. Campuran disaring dan filtrat ditampung. Maserasi diulang lima kali, sampai semua senyawa yang bisa terekstraksi dengan metanol sempurna. Filtrat yang ditampung, digabung dan diuapkan. Ekstrak metanol yang diperoleh dipartisi antara air dan n-butanol. Kemudian fraksi n-butanol dipekatkan, dicuci dengan dietileter, dilarutkan dalam metanol, kemudian disaring. Filtrat metanol kemudian ditambahkan dietileter berlebih agar terbentuk endapan saponin. Endapan yang terbentuk disaring dan dibiarkan kering pada suhu kamar (Mimaki et al., 1997; Ahmed, 2012). Endapan saponin yang diperoleh kemudian diberikan sebagai takaran percampuran diet pada konsentrasi 30 mg/hari 4.7.2 Penelitian terhadap tikus Penelitian diawali dengan pemilihan tikus wistar jantan berwarna putih dengan berat 150 g sampai dengan 200 g. Semua tikus yang telah dipilih diadaptasikan dengan makanan standar selama satu bulan. Bila ada tikus yang sakit atau mati segera diganti. Setelah adaptasi satu bulan dilakukan random alokasi dari tikus tersebut menjadi 4 kelompok masing-masing 6 ekor. Perlakuan dilakukan selama 30 hari, terhadap masing-masing kelompok, kelompok kontrol negatif hanya diberikan makanan standar 20 gram/ hari (CP 551) sekali setiap hari. Tikus juga diberikan air minum (air kran yang telah dipanaskan) ad libitum. Kelompok kontrol positif (perlakuan 1) diberikan makanan tinggi kolesterol dengan dosis 20 gram/hari, komposisi makanan tinggi kolesterol 60 % makanan standar ditambah kuning telur itik 40% dicampur dijadikan pellet yang diberikan secara oral dan ditambah air minum ad libitum. Kelompok perlakuan 2 sama dengan kelompok perlakuan 1, serta ditambahkan pemberian saponin daun andong 30 mg/hari secara oral dengan zonde. Kelompok perlakuan 3, sama dengan kelompok perlakuan 1, dan diberikan gemfibrozil 30 mg/hari. Setelah perlakuan selama 30 hari dilakukan pemeriksaan post-test dengan mengambil darah sinus orbita (mata) menggunakan syringe ukuran 3 ml. Darah yang dikumpulkan dalam tabung darah yang sudah berisi larutan EDTA, didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar, kemudian dilakukan sentrifugase pada 1000 rpm selama 20 menit. Plasma dipisahkan dan dimasukkan ke dalam botol lalu ditutup. Sampel kemudian disimpan pada suhu 40C atau dibekukan sampai analisis. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan darah di Laboratorium yang sesuai (Gambar 4.4). 4.7.3 Tahap pemeriksaan laboratorium Pemeriksaan laboratorium dilakukan saat post-test yaitu dengan prosedur pemeriksaan sebagai berikut: a. Analisis Lipid Plasma dan Asam Empedu Total Plasma Penentuan kolesterol total plasma menggunakan metode CHOD-PAP menurut E. Merck. Metode CHOD-PAP merupakan uji enzimatik-kolorimetrik yang sangat spesifik untuk pengukuran pada daerah cahaya yang dapat dilihat oleh mata, dan dapat dibedakan dari yang lain karena fleksibelitasnya tinggi. Kolesterol total dihitung dengan cara: absorbansi sampel dibagi dengan absorbansi standar kolesterol (0,240) dikalikan dengan konstanta standar kolesterol (200mg/dl). Prinsip analisis kadar kolesterol HDL menurut Human (1980), yaitu pemberian phosphotongstic acid dan ion magnesium ke dalam sampel sehingga kilomikron, VLDL dan LDL akan mengendap. Kadar kolesterol HDL dihitung dengan jalan absorbansi sampel dikalikan 318 (mg/dl). Pemeriksaan kolesterol LDL dilakukan dengan cara mengurangi total kolesterol dengan VLDL dan HDL, sedangkan perhitungan VLDL dilakukan dengan menggunakan trigliserida, dimana VLDL sama dengan seperlima (1/5) trigliserida. Pemeriksaan trigliserida dilakukan dengan metode GPO-PAP. Trigliserida ditentukan setelah hidrolisis enzimatik dengan lipase. Indikator quinoneimin terbentuk dari hidrogen peroksida, 4-aminoantipirin dan 4-klorofenol dibawah pengaruh katalisis peroksida. Kadar trigliserida dihitung dengan cara: absorbansi sampel dibagi dengan absorbansi standar trigliserida (0,145) dikalikan dengan konstanta trigliserida (200mg/dl). Pemeriksaan asam empedu total plasma dilakukan dengan kit rat total bile acids (cristal chem. Inc USA) dalam satuan μmol/L dengan metode spektrofotometri. Rat total bile acids kit adalah berdasar pada teknologi enzimatik dari 3-α hidroksisteroid dehidrogenase. Adanya NAD, asam empedu adalah diubah menjadi 3-keto steroid dan NADH. Terbentuknya NADH akan bereaksi dengan nitrotetrazolium blu (NBT) membentuk warna. Pembentukan warna dimonitor oleh pengukuran absorbansi pada 540 nm dan pengukuran secara langsung dari konsentrasi asam empedu plasma tikus. b. Analisis Kolesterol total dan Asam Empedu Total Feses Tiga hari/72 jam periode akhir penelitian. Jumlah kolesterol total feses diukur dengan spektrofotometri IKM 30. Dua gram feses diekstraksi dengan heksana. Hasil ekstraksi sambil dikocok dan dipanaskan dengan water bath. Dipipet 0,3 ml sampel dan larutan standar. Kemudian dipanaskan dalam water bath pada 80 oC selama 5 menit dan selanjutnya disimpan dalam oven 105 oC selama 30 menit. Dinginkan pada suhu kamar dan tambahkan 4 ml asetat anhidrida, asam asetat glasial dan asam sulfat pekat, dikocok dan didiamkan 35 menit, selanjutnya dibaca pada spektrofotometer pada panjang gelombang 630 dengan satuan (mg/kg). Pemeriksaan asam empedu feses dilakukan dengan menimbang satu gram feses kemudian dimaserasi dalam metanol : n-butanol 1:1 selama 24 jam kemudian disaring. Ambil 1 g aliquot masukkan ke dalam tabung 50 ml dan ditambah 300 μl 1μg/100 μl asam kolat sebagai standar internal, kemudian tambah larutan sodium borohidrida dan dikocok selama 1 jam untuk mereduksi 3-keto-BAs. Timbang berat badan tikus sebelum dan sesudah pengumpulan tiga hari. Untuk saponifikasi BAs tambahkan 500 μl 2 N HCl dan 2 ml 10 N NaOH, setelah proses disaring. Pipet 20 μl sampel dan ditambah Cristal Chem Rat Total bile Acids Kit untuk pengukuran asam empedu total feses dengan spektrofotometer dengan satuan (μmol/hari 100g BB). c. Interaksi saponin- kolesterol secara in vitro Untuk menguji pengaruh pembentukan kompleks kolesterol-saponin dilakukan dengan 600 ppm kolesterol dan 600 ppm saponin ditempatkan dalam suatu erlenmeyer flask 300 ml dan ditambahkan marbles glass 5 mm untuk meningkatkan pencampuran. Flasks ditempatkan pada waterbath sambil dikocok. Setelah kolesterol dan saponin kontak, zeolite ditambahkan secara langsung pada flask, yang dikocok dalam waterbath selama 60 menit. Setelah proses selesai campuran disentrifugase pada 3500 rpm, 4oC, selama 25 menit. Supernatan yang mengandung kolesterol dipisahkan dan digunakan untuk penentuan kolesterol dengan spektofotometri IKM 30 (Chang, et al., 2001). 4.7.4 Alur Penelitian Untuk lebih mempermudah dalam pelaksanaan penelitian maka dibuat alur penelitian yang ditunjukkan dengan bagan alur penelitian pada (Gambar 4.3). Tikus jantan galur Wistar (24 ekor ) dilakukan pengukuran berat badan Diet Standar (4 Minggu) 150-200 g Kontrol negatif 6 ekor tikus diberkan makanan standar 30 hari Kontrol negatif 6 ekor Tikus Wistar setelah 30 hari Pemeriksaan kolesterol dan asam empedu plasma, ekskresi asam empedu, dan kolesterol feses (post-test) Kontrol positif (Perlakuan 1) 6 ekor tikus diberikan makanan tinggi kolesterol 30 hari Kontrol positif (Perlakuan 1) 6 ekor Tikus Wistar setelah 30 hari Pemeriksaan kolesterol dan as. Empedu plasma, ekskresi asam empedu dan kolesterol feses (post-test) Perlakuan 2 6 ekor diberikan makanan tinggi kolesterol + saponin 30mg/hari 30 hari Perlakuan 2 6 ekor Tikus Wistar setelah 30 hari Pemeriksaan kolesterol dan as. Empedu plasma, ekskresi asam empedu dan kolesterol feses (post-test) Analisis Statistik Simpulan penelitian Gambar 4.3 Bagan Alur Penelitian Perlakuan 3 6 ekor diberikan makanan tinggi kolesterol + gemfibrozil 30 mg/hari 30 hari Perlakuan 3 6 ekor Tikus Wistar setelah 30 hari Pemeriksaan kolesterol dan as. Empedu plasma, ekskresi asam empedu dan kolesterol feses (post-test) 4.8 Analisis Data Semua data yang didapat dianalisis secara statistik dengan langkah-langkah sebagai berikut: 1. Seleksi data termasuk editing, coding dan tabulasi digunakan file navigator program Statistik for windows (Triton, 2006; Pramesti, 2007). 2. frekuensi ekspektasi, Ha: frekuensi observasi ≠ frekuensi ekspektasi. Ho diterima (data berdistribusi normal) bila p > . Ho ditolak (data tidak berdistribusi normal). 3. Homogenitas varians dianalisis dengan Levent’s test untuk mengetahui apakah varians di masing-masing kelompok homogen. Hipotesis; Ho: variasi kelompok kontrol = variasi kolompok perlakuan 0 (Po) = variasi kelompok perlakuan 1 (P1) = variasi kelompok perlakuan 2 (P2) = variasi kelompok perlakuan 3 (P3). Ha: variasi kelompok kontrol ≠ variasi kelompok perlakuan 0 (P0) ≠ kelompok perlakuan 1 (P1) variasi ≠ variasi kelompok perlakuan 2 (P2) ≠ variasi kelompok perlakuan 3 (P3). Ho diterima bila p>, Ho ditolak bila p<. 4. Perbedaan rata-rata penurunan kadar kolesterol dan asam empedu plasma, dan peningkatan kadar ekskresi asam empedu dan kolesterol feses serta interaksi saponin-kolesterol secara in vitro dari masing-masing kelompok dianalisis menggunakan one way Anova pada tingkat kemaknaan = 0,05. Hipotesis; Ho: I = . Ha: ≠ ≠ . Ho diterima (tidak ada perbedaan rata-rata penurunan kadar kolesterol dan asam empedu plasma, peningkatan ekskresi asam empedu dan kolesterol feses pada tikus coba pada masing-masing kelompok) pada p> 0,05. Ho ditolak (ada perbedaan rata-rata penurunan kolesterol dan asam empedu plasma, peningkatan ekskresi asam empedu dan kolesterol feses pada tikus coba pada masing-masing kelompok) serta interaksi saponin-kolesterol secara in vitro bila p < 0,05. 5. Uji lanjut analisis one way anova adalah Post Hoc Test; dengan anggapan varians adalah homogen maka Post Hoc Test yang dipilih adalah LSD pada tingkat kemaknaan = 0,05 Ho diterima bila p>, Ho ditolak bila p< 0,05. BAB V HASIL PENELITIAN 5.1 Isolat Saponin Daun Andong Saponin daun andong diisolasi dengan metode ekstraksi dan pengendapan. Selanjutnya uji aktivitas secara in vitro dilakukan terhadap isolat saponin, untuk mengetahui kemampuan saponin mengikat radikal bebas dari DPPH (Diphenyl Picryl Hidrazyl) dapat dilihat pada Gambar 5.1. Data hasil penelitian menunjukkan bahwa pada konsentrasi 10 ppm, 50 ppm, 100 ppm dan 200 ppm berturut-turut mampu mengikat radikal bebas 5,9%; 29,1%; 44,5% dan 80,2%. Isolat saponin dengan konsentrasi 200 ppm mempunyai aktivitas terhadap radikal bebas dari DPPH paling tinggi, sehingga konsentrasi tersebut digunakan sebagai uji pada tikus wistar. Uji aktivitas saponin dengan kolesterol juga dilakukan secara in vitro seperti terlihat pada Tabel 5.2 dan Gambar 5.7. 5.2 Berat Badan dan Berat Feses Tikus Perlakuan terhadap semua kelompok tikus uji, setelah dilakukan selama 30 hari sesuai dengan prosedur penelitian, pada hari ke 28, 29 dan 30 dilakukan pengumpulan feses pada masing-masing kelompok. Pada hari ke 31 tikus dipuasakan 18 jam kemudian dilakukan pengambilan darah dan dievaluasi sesuai dengan protokol penelitian. Pengamatan perkembangan berat badan pada masing-masing kelompok hewan uji, setiap minggu selama 30 hari penelitian juga dilakukan dan disajikan pada Gambar 5.1. Perbandingan rata-rata berat feses 3 hari terakhir penelitian untuk masing-masing kelompok perlakuan dapat dilihat pada Tabel 5.1 dan Gambar 5.2. 300 Berat Badan Tikus (g) Kontrol TK TK + SP TK + GB 150 BB.AWAL BB.MG1 BB.MG2 BB.MG3 BB.MG4 Gambar 5.1 Perkembangan rata-rata berat badan tikus selama penelitian Keterangan Gambar: BB.Awal:berat badan awal; BB.MG1: berat badan minggu 1; BB.MG2: berat badan minggu 2; BB.MG3:berat badan minggu 3; BB. MG4 : berat badan minggu 4; kontrol; TK : tikus pada kelompok tinggi kolesterol; TK + SP: tinggi kolesterol + saponin; TK + GB : tinggi kolesterol + gemfibrozil. Berdasarkan data hasil penelitian (Gambar 5.1) menunjukkan bahwa ratarata berat badan ke 4 kelompok tikus pada awal penelitian hampir sama (p>0,05). Rata-rata berat badan awal kelompok kontrol sebesar 160,73±9,93 g, kelompok tikus dengan perlakuan tinggi kolesterol sebesar 157,48±2,55 g, kelompok tikus dengan perlakuan tinggi kolesterol dan saponin sebesar 168,93±7,63 g dan kelompok tikus dengan perlakuan tinggi kolesterol dan gemfibrozil sebesar 167,93±9,00 g. Semua kelompok tikus perlakuan mengalami penambahan rata-rata berat badan setiap minggu. Namun untuk kelompok tikus dengan perlakuan tinggi kolesterol mengalami kenaikan rata-rata berat badan dengan perbedaan yang bermakna (p<0,05) pada minggu 2, ke 3 dan minggu 4 penelitian dibandingkan dengan kontrol, TK + SP, dan TK + GB, sedangkan untuk kelompok kontrol, kelompok TK + SP dan kelompok TK + GB menunjukkan peningkatan rata-rata berat badan tikus coba hampir sama (p>0,05). Jadi memang ada pengaruh perlakuan terhadap penambahan berat badan tikus. Rata-rata berat badan tikus minggu ke 4 masingmasing untuk kelompok kontrol adalah 218,51±18,51, kelompok tikus dengan perlakuan TK adalah 257,38±22,09, kelompok tikus dengan perlakuan TK + SP adalah 219,40±9,52 dan kelompok tikus dengan perlakuan TK + GB adalah 219,38±5,74. Jadi berdasarkan data hasil pengamatan rata-rata berat badan tikus minggu 4 dengan perlakuan TK + SP daun andong mampu mendekati rata-rata berat badan tikus kontrol, hal tersebut diduga karena ada beberapa faktor yang berpengaruh yaitu (1) rasa sepat dari saponin menyebabkan nafsu makan tikus menurun, (2) saponin daun andong, di samping mampu mengikat kolesterol dan asam empedu juga dapat mengikat asam lemak, yang dapat menekan kenaikan rata-rata berat badan tikus, sehingga menyebabkan konsentrasi TG dan kolesterol LDL plasma turun kemudian lebih banyak diekskresikan lewat feses. Berdasarkan analisis dari perkembangan rata-rata berat badan tikus coba selama 30 hari penelitian menunjukkan bahwa kelompok tikus dengan perlakuan TK + SP dapat menekan kenaikan rata-rata berat badan tikus coba sehingga berpotensi sebagai obat anti obesitas. Tabel 5.1 Rata-rata berat feses tikus Wistar Berat rata-rata Feses (gram) kelompok p Kontrol 12,433 ± 0,49 TK 7,433 ± 0,50a 0,000 TK + SP 14,883 ± 2,79a,b 0,000; 0,000 TK + GB 12,380 ± 0,66b 0,864; 0,000 TK: tinggi kolesterol; TK + SP : Tinggi kolesterol + saponin; TK + GB : Tinggi kolesterol + gemfibrozil. a menunjukkan perbedaan yang nyata dari kontrol pada p < 0,05. b menunjukkan perbedaan yang nyata dari TK pada p < 0,05. 14.883 12.433 12.383 7.433 Berat Feses (g) Kontrol TK TK+ SP TK + GB Gambar 5.2 Perbandingan berat rata-rata feses tikus Rata-rata berat feses ke 4 kelompok tikus percobaan (Gambar 5.2) pada pengumpulan 3 hari terakhir penelitian menunjukkan perbedaan yang bermakna (P<0,05). Berat rata-rata feses kelompok kontrol adalah 12,43±0,49 g, kelompok tikus coba dengan perlakuan TK adalah 7,43±0,50 g, kelompok tikus percobaan dengan perlakuan TK + SP adalah 14,88±2,79 dan kelompok tikus percobaan dengan perlakuan TK + GB adalah 12,38±0,66. Berat rata-rata feses kelompok tikus dengan perlakuan TK paling rendah dan kelompok perlakuan TK + SP paling tinggi. Jadi ada pengaruh perlakuan terhadap perbedaan berat feses tikus percobaan tersebut. Dengan jumlah rata-rata berat feses tikus dengan perlakuan TK + SP paling tinggi, menunjukkan bahwa ada korelasi positif antara perlakuan TK + SP dengan kenaikan berat badan tikus yang mendekati kontrol, yang berarti perlakuan tikus dengan TK + SP dapat menekan kenaikan berat badan tikus dan diduga juga dapat mencegah kenaikan konsentrasi TG dan kolesterol LDL, sehingga asupan saponin kemungkinan berpotensi dapat menurunkan obesitas. Berdasarkan hasil pengamatan sifat fisik dari feses untuk masing-masing kelompok tikus percobaan, menunjukkan bahwa warna feses kelompok tikus dengan perlakuan TK + SP paling mengkilap yang kemudian diikuti oleh kelompok perlakuan TK + GB, kelompok kontrol dan kelompok dengan perlakuan TK. Jumlah rata-rata berat feses terbanyak dan menunjukkan warna paling mengkilap ternyata mengandung konsentrasi kolesterol, asam empedu dan lemak lebih tinggi dibanding kontrol. 5.3 Konsentrasi Lipid dan Asam Empedu Total Plasma Tikus wistar yang diberikan perlakuan selama 30 hari dan pada hari terakhir penelitian tikus dipuasakan selama 18 jam dengan menarik semua makanan dan minuman dari kandangnya, kemudian diambil darahnya dan dievaluasi sesuai protokol penelitian. Perbandingan rata-rata kolesterol total, kolesterol LDL, kolesterol HDL, TG, rasio kolesterol total/HDL dan asam empedu plasma disajikan pada Tabel 5.2. Hasil penelitian (Tabel 5.1) menunjukkan bahwa pada kelompok yang diberikan makanan TK terjadi kenaikan rata-rata kolesterol total, kolesterol LDL, TG dan ratio kolesterol total/HDL dengan perbedaan yang bermakna (p<0,05), dibandingkan kelompok kontrol, dan kelompok lain (TK + SP dan TK + GB). Pada kelompok dengan perlakuan TK, juga terjadi penurunan rata-rata kolesterol HDL yang bermakna (p<0,05), dibandingkan kelompok lain (kelompok kontrol, perlakuan TK + SP dan perlakuan TK + GB). Pemberian makanan tinggi kolesterol pada tikus wistar dapat menyebabkan terjadinya kenaikan rata-rata kolesterol total plasma, kolesterol LDL, TG dan rasio kolesterol total/HDL sehingga berpotensi terjadi aterosklerosis. Pemberian asupan saponin daun andong diduga dapat mencegah kenaikan rata-rata kolesterol total, Kolesterol LDL, TG dan rasio kolesterol total/HDL dan penurunan kolesterol HDL akibat kolesterolemia, sehingga Tabel 5.2 Rata-rata Kolesterol total, LDL, HDL, TG, Rasio kolesterol total/HDL, Asam Empedu Total plasma, Asam empedu total, Kolesterol Total dan Lemak total Feses. Kelompok Kontrol TK TK + SP TK + GB (mg/dl) 64,83±8,13 157,83±9,11a 79,83±9,11a,b 105,33±5,43a,b LDL(mg/dl) 13,67±7,07 95,53±4,27a 25,57±6,40a,b 38,77±3,12a,b HDL(mg/dl) 42,27±4,76 28,87±1,05a 47,50±4,63a,b 58,07±3,97a,b TG (mg/dl) 52,67±1,86 169,67±4,72a 36,00±5,55a,b 42,33±6,68a,b 1,53±0,11 5,48±0,34a 1,69±0,19b 1,82±0,74a,b 45,79±0,69 46,23±0,84 25,10±0,34a,b 47,17±1,91a Plasma Kolesterol Total Rasio Kol. Tot./HDL As. Empedu Tot.(μmol/L) Feses Kolesterol Total (mg/Kg) 576,95±115,33 212,82±59,84a 1401,29±168,38a,b 1151,99±208,52a,b 18,65±0,76 3,75±0,38a 34,31±0,88a,b 26,42±1,18a,b 3,43±0,40 7,20±0,47a 8,71±0,67a,b 6,81±0,60a As.Empedu Tot. (μmol/hari/100 g BB. Lemak Total (g/100 g) TK: tinggi kolesterol; TK + SP : Tinggi kolesterol + saponin; TK + GB : Tinggi kolesterol + gemfibrozil. a menunjukkan perbedaan yang bermakna dari kontrol pada p < 0,05. b menunjukkan perbedaan yang bermakna dari TK pada p < 0,05. nilai rata-rata kolesterol total plasma, yang paling mendekati nilai rata-rata kolesterol plasma kontrol dibandingkan dengan perlakuan lain (Gambar 5.3). Pemberian asupan saponin daun andong juga dapat menurunkan asam empedu total plasma dengan perbedaan yang bermakna (p<0,05) dibanding kelompok kontrol dan TK, hal tersebut menunjukkan bahwa telah terjadi interaksi antara saponin dengan kolesterol dan asam empedu sehingga menyebabkan terjadinya hambatan penyerapan kolesterol dan asam empedu di usus. rata-rata asam empedu total plasma pada kelompok perlakuan TK paling rendah (p<0,05), dibandingkan kelompok lain (kelompok kontrol, perlakuan TK dan perlakuan TK + GB dapat dilihat pada Gambar 5.4. 157.83 Kolesterol Total Plasma (mg/dl) 79.83 64.83 Kontrol TK TK + SP 105.33 TK + GB Gambar 5.3 Perbandingan Rata-rata Kolesterol Total Plasma Darah Tikus Wistar 45.79 46.23 47.17 25.1 Asam Empedu Total Plasma (μmol/L) Kontrol TK TK + SP TK + GB Gambar 5.4 Perbandingan Rata-rata Kadar Asam Empedu Total Plasma Darah Tikus Wistar. 5.4 Kolesterol Total, Asam Empedu dan Lemak Total pada Feses Tikus Tikus wistar yang diberikan perlakuan selama 30 hari dan pada 3 hari terakhir penelitian, feses tikus dikumpulkan, dikeringkan, ditimbang dan dievaluasi sesuai protokol penelitian. Perbandingan rata-rata kolesterol total feses, asam empedu total dan lemak total feses dapat dilihat pada Tabel 5.1;Gambar 5.5, dan Gambar 5.6. 1401.29 Kolesterol Total Feses (mg/Kg) 1151.99 576.95 212.82 Kontrol TK TK + SP TK + GB Gambar 5.5 Perbandingan Rata-rata Kolesterol Total Feses Tikus Wistar Asam Empedu Total Feses (μmol/hari/100 g BB) 34.31 26.42 TK + SP TK + GB 18.65 3.75 kontrol TK Gambar 5.6. Perbandingan Rata-rata Asam Empedu Total Feses Tikus Wistar Berdasarkan data hasil penelitian yang telah dilakukan terhadap feses tikus wistar (Gambar 5.5, dan 5.6) menunjukkan bahwa rata-rata kolesterol total dan asam empedu total (asam kolat) feses pada kelompok perlakuan TK paling rendah dan kelompok perlakuan TK + SP paling tinggi (p<0,05) dibanding kelompok kontrol. Hasil penelitian dengan perlakuan TK + SP menunjukkan bahwa rata-rata lemak total feses tikus (Tabel 5.1) memberikan perbedaan yang bermakna (p<0,05) dibanding kelompok kontrol dan kelompok TK. Dengan demikian asupan saponin daun andong mampu meningkatkan ekskresi asam empedu total (asam kolat) dan kolesterol total feses pada tikus dengan kenaikan yang bermakna (p<0,05), dibandingkan kelompok lain. 5.5 Interaksi Saponin dengan Kolesterol secara in vitro Interaksi saponin dengan kolesterol juga dilakukan secara in vitro dengan hasil seperti terlihat pada Tabel 5.2 dan Gambar 5.7. 508.75 Kolesterol yang Bereaksi (ppm) 447.5 Saponin Gemfibrozil Gambar 5.7 Perbandingan Rata-rata Kolesterol yang Bereaksi secara in vitro Tabel 5.2 Rata-rata kolesterol yang bereaksi secara in vitro p Kelompok Kolesterol yang Kolesterol yang bereaksi(ppm) bereaksi (%) Kolesterol 598,00 ±1,08 - Kolesterol + Saponin Kolesterol + Gemfibrozil a 508,75 ± 6,18a 0,00 85.07 a 0,00 74.83 447,50 ± 1,29 menunjukkan perbedaan yang nyata dari kolesterol pada p < 0,05. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Interaksi saponin dengan kolesterol secara in vitro menunjukkan bahwa saponin mampu mengikat kolesterol (85,07%) lebih tinggi daripada gemfibrozil (74,83%). BAB VI PEMBAHASAN 6.1 Konsentrasi Lipid dan Asam empedu Total Plasma Darah Tikus Wistar serta Interaksi Saponin- Kolesterol secara In vitro Pada penelitian ini terjadi peningkatan yang bermakna (p<0,05) rata-rata kolesterol total, kolesterol LDL, TG dan rasio kolesterol total/kolesterol HDL dan terjadi penurunan yang bermakna (p<0,05) rata-rata kolesterol HDL plasma darah tikus wistar yang diberikan makanan tinggi kolesterol, dibanding tikus kontrol. Hal ini membuktikan bahwa walaupun tikus kontrol tidak diberikan makanan yang mengandung kolesterol, tetapi dalam plasma darahnya tetap mengandung kolesterol, hal tersebut menunjukkan bahwa kolesterol dalam tubuh berasal dari dua sumber yaitu 1/3 berasal dari makanan yang dikonsumsi, dan 2/3 juga disintesis oleh tubuh sendiri. Peningkatan kolesterol plasma pada kelompok tikus dengan perlakuan TK menunjukkan bahwa tidak terjadi hambatan penyerapan kolesterol di usus, sehingga kolesterol yang diekskresikan lewat feses lebih kecil dibanding kontrol. Peningkatan kolesterol total, kolesterol LDL, TG, rasio kolesterol total/kolesterol HDL (di atas angka 4) dan penurunan kolesterol HDL merupakan suatu pertanda yang sangat berpotensi terjadinya dislipidemia sehingga mendorong peningkatan terbentuknya aterosklerosis yang menjadi faktor risiko terjadinya penyakit jantung koroner (Bhat et al., 2003; Khaleel et al., 2005). Dislipidemia merupakan metabolisme abnormal lipoprotein yang memicu terjadinya aterosklerosis. Aterosklerosis adalah suatu kondisi dimana dinding arteri menebal sebagai akibat dari penumpukan bahan lemak seperti kolesterol yang menjadi salah satu faktor risiko penyakit kardiovaskuler (Charlton-Menys and Durrengton, 2006). Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan pada tikus dan diberikan makanan tinggi kolesterol terjadi kenaikan kolesterol total, kolesterol LDL, TG dan penurunan kolesterol HDL yang sangat bermakna (p<0,01) (Lakshmi et al., 2012). Peningkatan kolesterol total dan kolesterol LDL juga terjadi pada penelitian dengan kelinci yang diberikan makanan tinggi kolesterol selama 28 hari (Khaleel et al., 2005). Kenaikan kolesterol total, kolesterol LDL dan penurunan kolesterol HDL pada serum darah ayam petelur yang diberikan makanan tinggi kolesterol selama 60 hari juga terjadi dengan bermakna (p<0,05)(Afrose et al., 2010). Pada tikus percobaan yang diberikan makanan tinggi kolesterol dan saponin daun andong 30 mg/hari terjadi penurunan kolesterol total, kolesterol LDL, TG, rasio kolesterol total/kolesterol HDL dan asam empedu total serta terjadi peningkatan kolesterol HDL plasma yang bermakna (p<0,05) dibandingkan tikus yang diberikan makanan tinggi kolesterol dan tikus kontrol. Hasil penelitian ini didukung oleh penemuan yang dilaporkan oleh Al-Matubsi et al., 2011, bahwa saponin diosgenin mampu menurunkan kolesterol total, kolesterol LDL dan meningkatan kolesterol HDL dengan perbedaan yang sangat bermakna (p<0,01). Karaya saponin juga mampu menurunkan kolesterol total, kolesterol LDL dan meningkatan kolesterol HDL serum darah ayam petelur (Afrose et al., 2010). Saponin steroid dari Chlorophytum nimonii juga dapat menurunkan kolesterol total, kolesterol LDL, TG dan menaikkan kolesterol HDL dengan sangat bermakna (p<0,01) (Lakshmi et al., 2012). Soyasaponin, saponin alfalfa dan saponin platycodin juga terbukti menurunkan kolesterol total, kolesterol LDL, TG dan rasio kolesterol total/kolesterol HDL dengan bermakna (p<005) (Khaleel et al., 2005; Lee Sun-Ok et al., 2005; Zhao et al., 2005; Egbung et al., 2010). Asupan saponin daun andong ternyata juga mampu menurunkan kolesterol total, kolesterol LDL, TG, asam empedu total dan rasio kolesterol total/kolesterol HDL serta meningkatkan kolesterol HDL dengan perbedaan yang bermakna (p<0,05) dibandingkan dengan perlakuan TK. Dari hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa saponin daun andong diduga mempunyai aktivitas biologis sebagai antikolesterolemia yang dapat mencegah terjadinya aterosklerosis yaitu salah satu faktor risiko timbulnya penyakit jantung koroner. Asupan saponin daun andong tidak hanya mengikat kolesterol dari makanan yang dikonsumsi, tetapi juga mengikat kolesterol yang berasal dari hati yang disekresikan ke usus bersama empedu. Saponin juga dapat mengikat asam empedu sehingga menyebabkan konsentrasi asam empedu dan kolesterol total plasma darah tikus wistar menurun. Sirohi et al. (2012) melaporkan bahwa saponin adalah suatu glikosida tumbuhan yang mempunyai sifat amfifilik dan zat aktif permukaan. Aktivitas biologinya ditentukan oleh struktur kimianya yang akan menentukan kepolaran, hidrofobisitas, dan keasaman dari senyawa tersebut. Aktivitas biologis dari saponin meningkat dengan meningkatnya jumlah rantai gula (jumlah gugus polar) yang terikat pada aglikonnya atau sapogeninnya. Kekuatan rantai gula juga mempengaruhi aktivitas biologis baik dari saponin steroid maupun saponin triterpen dengan rantai gula tunggal (monodesmosidik) yang terikat pada sapogeninnya lebih aktif daripada dua rantai gula (bidesmosidik) (Sirohi et al., 2012). Stereokimia rantai gula terminal dan inti steroid adalah sangat penting untuk menentukan keseluruhan aktivitas molekul saponin karena dapat mempengaruhi keseluruhan konformasi saponin. Secara umum gugus aglikon dan glikon saponin memegang peranan penting pada aktivitas biologisnya. Saponin dengan sifat deterjennya dapat mempengaruhi substans yang larut dalam lemak pada pencernaan meliputi pembentukan misel campuran yang mengandung garam empedu, asam lemak, digliserida (Cheeke, 2001). Kolesterol, asam empedu, gugus OH, inti steroid, gugus C=C dari saponin berinteraksi membentuk agregat seperti misel dan membentuk kompleks yang tidak larut (Siswandono dan Soekardjo B., 1995; Khan et al., 2012). Cincin aglikon /sapogenin dari saponin dengan posisi cis-trans-cis memberikan aktivitas maksimal, sedangkan posisi equatorial dari gugus OH yang terikat pada cincin sapogenin atau pada gula lebih mudah berinteraksi daripada yang aksial karena halangan ruang lebih kecil (Elliel, 1975). Dua struktur saponin daun andong telah ditemukan mempunyai rantai gula tunggal yang terdiri dari dua gula terminal dan satu gula sentral dari metilpentosa (2 L-ramnosa dan 1 D-fukosa) yang terikat pada aglikonnya dengan berat molekul masing-masing 866 g/mol dan 868 g/mol (Bogoriani, 2001; Bogoriani, 2008) sehingga kemampuannya menurunkan kolesterol plasma darah tikus lebih tinggi daripada gemfibrozil. Saponin dengan berat molekul besar tidak mampu diserap usus, hal ini terbukti tidak ditemukan adanya saponin dalam darah tikus, mencit dan ayam (Hu et al., 2004). Saponin merupakan suatu molekul yang bersifat nonsistemik yang berarti hanya bekerja pada usus dan tidak memasuki seluruh tubuh. Oleh karena itu efek samping yang dapat merusak hati dan organ vital lainnya tidak terjadi (Morehouse, et al., 1999; Hu, et al., 2004). Aktivitas saponin daun andong sebagai penurun kolesterol juga ditunjukkan pada reaksi antara saponin dengan kolesterol secara in vitro, saponin daun andong mampu mengikat kolesterol 85,07% dibandingkan gemfibrozil hanya 74,83%, sehingga dapat dikatakan bahwa kemampuan saponin daun andong mengikat kolesterol lebih besar dari gemfibrozil dengan perbedaan yang bermakna (p<0,05). Kemampuan saponin mengikat kolesterol kemungkinan disebabkan karena saponin daun andong dapat membentuk senyawa kompleks yang tidak larut dengan kolesterol, lalu diserap oleh adsorben Zeolit, sehingga kolesterol bebas atau yang tidak terikat dengan saponin teranalisis lebih sedikit. Interaksi saponin daun andong dengan kolesterol maupun asam empedu diduga melibatkan ikatan hidrogen (gugus OH), ikatan hidrofob atau ikatan van der Waals (inti steroid) dan ikatan elektrostatik (C=C) sehingga memungkinkan terbentuknya stabilitas kompleks yang cukup besar dan tidak larut atau terbentuk misel campuran yang besar sehingga menyebabkan terjadinya hambatan penyerapan kolesterol ke enterosit melalui NPC1L1 di usus. Saponin termasuk senyawa yang mempunyai berat molekul besar dan interaksinya dengan kolesterol maupun asam empedu dapat molekul yang lebih besar sehingga terjadi hambatan penyerapan di usus yang menyebabkan adanya penurunan kolesterol dan asam empedu plasma, yang kemudian lebih banyak diekskresikan ke feses sehingga konsentrasi kolesterol dan asam empedu feses meningkat. Richard, et al., (1999) melaporkan bahwa penurunan penyerapan kolesterol akan memacu ekskresi kolesterol feses baik yang berasal dari endogen maupun dari makanan yang dikonsumsi. Beberapa peneliti melaporkan bahwa saponin dengan kolesterol di dalam usus, tidak terserap karena membentuk senyawa kompleks yang tidak larut, sehingga secara langsung dapat mengurangi kolesterol yang masuk ke dalam tubuh oleh NPC1L1. Hambatan secara langsung dari penyerapan kolesterol menyebabkan saponin dapat mencegah penyerapan tidak hanya dari proporsi tinggi kolesterol makanan, tetapi juga proporsi tinggi kolesterol yang dibawa dari empedu dan desquamation sel mukosa (Hostettmann and Marston, 1995; Shin et al., 2004; Lin et al., 2005; Lee Sun-Ok et al., 2005). Pada penelitian ini juga ditemukan bahwa asupan saponin daun andong dapat menurunkan asam empedu total plasma dengan perbedaan yang bermakna (p<0,05) dibandingkan dengan kontrol dan perlakuan TK. Beberapa peneliti melaporkan bahwa saponin membentuk misel dengan asam empedu, akibatnya kemampuan asam empedu untuk membentuk misel dengan asam lemak berkurang, sehingga diduga bahwa saponin adalah sequestrants asam empedu (Cheeke, 2001), yang didukung oleh pengamatan Oakenfull and Sidhu (1990) bahwa saponin mampu mengikat asam empedu secara in vitro. Saponin adalah senyawa amfifilik yaitu ada bagian hidrofilik yang larut dalam air dan bagian hidrofobik yang larut dalam lemak, sehingga dalam larutan terbentuk misel seperti koin kecil. Ukuran struktur dari misel campuran tergantung pada struktur kimia saponin (Shidu and Oakenfull, 1986). Pembentukan misel campuran dengan asam empedu dalam usus, dapat mempengaruhi metabolisme asam empedu dan kolesterol. Berdasarkan struktur yang dimiliki saponin, secara umum mempunyai sifat yang mirip dengan asam empedu yaitu sebagai pengemulsi dan bersifat amfifilik dan zat aktif permukaan. Saponin dikenal dengan sifat deterjennya, kemungkinan dapat membentuk misel dengan lemak. Berdasarkan hasil penelitian, saponin daun andong kemungkinan membentuk misel yang besar dengan asam empedu, sehingga menghalangi atau menghambat penyerapan kembali asam empedu pada sirkulasi enterohepatik oleh apical sodium codependent bile acid transporter (ASBT) atau ileal Na+/bile acid cotransporter (IBAT), sehingga menyebabkan penurunan asam empedu total plasma secara langsung dan penurunan kolesterol plasma secara tidak langsung dan terjadi peningkatan ekskresi asam empedu lewat feses. Hasil penelitian ini berbeda dengan hasil penelitian yang dilaporkan oleh Afrose et al., 2010, bahwa karayasaponin tidak menghambat penyerapan kembali asam empedu melalui sirkulasi enterohepatik sehingga konsentrasi asam empedu hati meningkat dan asam empedu feses juga meningkat. Jadi penurunan kolesterol plasma diduga disebabkan oleh peningkatan ekskresi asam empedu feses, bukan oleh penghambatan penyerapan kolesterol karena ekskresi kolesterol feses tidak terjadi perbedaan yang bermakna (p>0,05) dibanding dengan kontrol. Penghambatan penyerapan asam empedu dengan menghambat ASBT adalah suatu target untuk meningkatkan sintesis asam empedu hati dan mengurangi kolesterol LDL plasma. Hambatan penyerapan asam empedu pada sirkulasi enterohepatik oleh ASBT dapat mengurangi risiko aterosklerosis (Bhat, et al., 2003). Apical Sodium Codependent Bile Acid Transporter (ASBT) adalah komponen yang penting pada sirkulasi enterohepatik yang memediasi penyerapan kembali asam empedu pada terminal ileum (Sheneider, 2001). Penghambatan spesifik ASBT protein akan menghalangi penyerapan kembali asam empedu pada terminal ileum dan memacu ekskresinya lewat feses, sehingga mengurangi jumlah asam empedu kembali ke hati (Bhat et al., 2003). 6.2 Kolesterol Total, Lemak Total dan Asam Empedu Total Feses Tikus Wistar Pada penelitian ini ditemukan adanya peningkatan ekskresi kolesterol total dan asam empedu feses tikus yang diberikan makanan tinggi kolesterol dan asupan saponin daun andong terjadi perbedaan yang bermakna (p<0,05) dibandingkan dengan perlakuan TK. Saponin daun andong ternyata dapat menghambat penyerapan kolesterol dari misel ke enterosit melalui NPC1L1 dan menghambat penyerapan kembali asam empedu melalui ASBT karena diduga terjadi interaksi antara saponin dengan asam empedu membentuk misel campuran yang besar dan tidak larut, sehingga tidak dapat diserap di usus melalui ASBT pada sirkulasi enterohepatik dan lebih banyak diekskresikan lewat feses sehingga asam empedu feses meningkat. Penelitian ini didukung oleh pengamatan beberapa peneliti yang melaporkan bahwa saponin dapat meningkatkan ekskresi kolesterol dan asam empedu feses, saponin dikatakan mempunyai aktivitas hipokolesterolemia (Salma et al., 2007; Afrose et al.,2009; Afrose et al., 2010). Peningkatan ekskresi asam empedu pada feses mendorong metabolisme kolesterol pada hati dengan meningkatkan konversi kolesterol menjadi asam empedu, sehingga diduga terjadi penurunan kolesterol plasma baik langsung maupun tidak langsung. Berdasarkan hasil penelitian tersebut saponin daun andong diduga merupakan sequestrants asam empedu, yang mempunyai kemampuan membentuk misel yang besar dan tidak larut sehingga tidak terserap melalui IBAT pada sirkulasi enterohepatik, menyebabkan asam empedu plasma menurun dan asam empedu feses meningkat. Saponin daun andong juga terbukti dapat mengikat kolesterol secara in vitro sehingga membuktikan bahwa saponin daun andong dapat membentuk kompleks yang tidak larut dengan kolesterol dan terjadinya hambatan penyerapan kolesterol oleh NPC1L1 pada enterosit yang menyebabkan menurunnya kolesterol plasma dan meningkatkan ekskresi kolesterol lewat feses. Saponin daun andong bersifat nonsistemik karena berat molekulnya besar, tidak mampu terserap usus sehingga hanya bekerja pada saluran usus, dan yang tidak diserap akan diekskresikan lewat feses, sehingga konsentrasi kolesterol feses meningkat. Pada penelitian ini juga terjadi peningkatan rata-rata lemak total feses yang bermakna (p<0,05) pada kelompok perlakuan TK, kelompok perlakuan TK + SP, kelompok perlakuan TK + GB dibandingkan kelompok kontrol. berdasarkan hasil penelitian tersebut asupan saponin daun andong tidak hanya dapat mengikat kolesterol dan asam empedu tetapi juga dapat mengikat asam lemak sehingga terhambat penyerapannya di usus dan lebih banyak diekskresikan ke feses, akibatnya TG plasma menurun dan juga dapat menekan kenaikan berat badan tikus sehingga konsentrasi lemak meningkat di feses. Berdasarkan hasil penelitian tersebut saponin daun andong berpotensi sebagai obat anti obis dan mencegah kegemukan. 6.3 Temuan Baru Penelitian Adapun temuan baru dari penelitian ini adalah 1. Penelitian ini merupakan penelitian pertama yang membuktikan bahwa saponin daun andong dapat menurunkan kolesterol total, kolesterol LDL, rasio kolesterol total/kolesterol HDL, asam empedu total dan meningkatkan kolesterol HDL plasma darah tikus wistar yang dipapar dengan makanan tinggi kolesterol. 2. Penelitian ini membuktikan bahwa saponin daun andong mampu mengikat kolesterol secara in vitro lebih tinggi daripada gemfibrozil, sehingga hambatan penyerapan kolesterol memang disebabkan karena terbentuk kompleks yang tidak larut antara saponin dengan kolesterol, kemudian dieksresikan ke feses. Hal ini dapat dibuktikan dengan adanya peningkatan kadar kolesterol di feses. BAB VII SIMPULAN DAN SARAN 7. 1 Simpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas dapat ditarik simpulan sebagai berikut: 1. Asupan saponin daun andong menurunkan kolesterol total plasma darah tikus wistar yang diberikan makanan tinggi kolesterol. 2. Asupan saponin daun andong menurunkan asam empedu plasma darah tikus wistar yang diberikan makanan tinggi kolesterol. 3. Asupan saponin daun andong meningkatkan ekskresi kolesterol total feses tikus wistar yang diberikan makanan tinggi kolesterol . 4. Asupan saponin daun andong meningkatkan ekskresi asam empedu total feses tikus wistar yang diberikan makanan tinggi kolesterol. 5. Saponin daun andong mampu mengikat kolesterol melalui pembentukan kompleks saponin-kolesterol secara in vitro. 6. Asupan saponin daun andong dapat menurunkan kolesterol plasma darah tikus wistar dengan dua cara yaitu dengan menghambat penyerapan kolesterol dan asam empedu di usus sehingga meningkatkan ekskresi kolesterol dan asam empedu feses. 7.2 Saran 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui aktivitas masingmasing saponin murni dari daun andong terhadap konsentrasi kolesterol total dan asam empedu baik di plasma, hati, serta feses tikus wistar, sebab khasiat antidislipidemia dari saponin ditentukan oleh struktur kimia dari masing-masing saponin. 2. Perlu dilakukan uji klinik terhadap khasiat saponin daun andong pada manusia sehat dan sakit dengan melihat beberapa indikator kolesterol dan asam empedu di darah dan feses. 3. Perlu dibuat kemasan dalam berbagai rasa untuk mempermudah mengkonsumsi saponin daun andong yang mempunyai rasa sepat. DAFTAR PUSTAKA Afrose, S., Hossain, Md. S., Salma, U., Miah,A.G., and Tsujii, H. 2010. Dietary karaya Saponin and Rhodobacter capsulatus Exert Hypocholesterolemic Effects by suppression of Hepatic Cholesterol and Promotion of Bile Acid Synthesis in Laying Hens. Cholesterol :272731 PMCID: 3065839. P. 1-9. Ahmed, B. 2007. Chemistry of Natural Products. Steroids. Department of Pharmaceutical Chemistry Faculty of Science Jamia Hamdard New Delhi110062.P. 1-26. Ahmed, D. B., Chaieb, I., Salah, K. B., Boukamcha, H., Jannet, H. B., Mighri , Z. and Daami-Remadi, M. 2012. Antibacterial and antifungal activities of Cestrum parqui saponins: possible interaction with membrane sterols. International Research J. of Plant Sci. (ISSN: 2141-5447): 3:1: 001-7. Available online http://www.interesjournals.org/IRJPS. Ahn, J. and Kwak, H.S. 1999. Optimizing cholesterol removal in cream using βcyclodextrin and response surface methodology. J.Food. Sci. 64:629-32. Al-Matubsi, H.Y., Nasrat, Oriquat, G.A., Abu-Samak M., Al-Mzain, K.A., Salim M. 2011. The hypocholesterolemic and antioxidative effect of dietary diosgenin and chromium chloride supplementation on high-cholesterol fed Japanese quails. Pak. J. Bio.l Sci. 14:7:425-32. Altmann, S.W., Davis, H.R. Jr., Zhu, L.J., Yao, X., Hoos, L.M., Tetzioff, G., Iyer, S.P., Magure, M., Golovko, A., Zeng, M., Wang, L., Murgolo, N. 2004. Niemann-Pick C1 Like 1 protein is critical for intestinal cholesterol absorption. Science.303:1201-4. Bay, H. 2002. Ezetimibe. Expert Opin Investing Drugs.11:1587-604. Berge, K.E., Tian, H., Graf, G.A., Yu, L., Grishin, N.V., Schultz, J., Kwiterov- ich, P., Shan, B., Barnes, R., Hobbs, H.H. 2000. Accumulation of dietary cholesterol in sitosterolemia caused by mutations in adjacent ABC transporters. Science. 290: 1771–75. Bhat, B.G., Rapp, S.R., Beaudry, J.A., Napawan, N., Butteiger, D.N., Hall, K.A., Null, C.L., Luo, Y., and Keller, B.T. 2003. Inhibition of ileal bile acid transport and reduced atherosclerosis in apo E-/-mice by SC-435. J. of Lipid Res, 44: 16 14-21. Blunden, G., Jaffer, J. A., Jewers, K., and Griffin, W. J. 1981. Steroidal sapogenins from leaves of Cordyline species. J. of Nat. Prod. 44 :4: 441-7. Bogoriani, W. 2001. Isolasi d totalan Identifikasi Senyawa Saponin dari Daun Andong (Cordyline terminalis Kunth.) Chemical Review. 4: 3: 92-7. Bogoriani, W. 2008. Isolasi dan Identifikasi Glikosida Steroid dari Daun Andong (Cordyline terminalis Kunth.) Jurnal Kimia. 2: 1: 40-4. Carlson, B.S.E.M. 2009. Saponin: Biactivity and potential impact on intestinal health. Thesis.The Ohio State University. Centers for Disease Control and Prevention. 2009. (http://www.cdc.gov/). Chaieb, I. 2010. Saponins as insecticides: a review. Tunisian J. of Plant Protect., 5:1:39-50. Chang, E.J., Oh, H.I and kwak, H.S. 2001. optimization of Cholesterol Removal Conditions from Homogenized Milk by Treatment with Saponin. AsianAust.J. Aninm.Sci., 14:6:844-9. Charlton-Menys, V. and Durrington, P. N. 2007. Human cholesterol metabolism and therapeutic molecules. Experimental Physiology – Review Article:93.1:27-42. Cheeke, P.R. 1996. Biological effects of feed and forage saponins and their impacts on animal production. Saponins Used in Food and Agriculture. In GR Waller and K Yamasaki (Eds.), Saponins Used in Food and Agriculture: 377-85. New York: Plenum Press. Cheeke, P.R. 2001. Actual and potential applications of Yucca schidigera and Quillaja saponaria saponins in human and animal nutrition. Recent Advances in Animal Nutrition in Australia, 13:115-26. Chen, S. and Snyder, J.K. 1993. General strategy for the structure determination of saponin: Molluscicidal saponins from Allium vineale, in Colegate, S.M., Molyneux, R.J. Bioactive natural products. Detection, isolation, and structural determination, CRC Press, Boca raton, Ann Arbor, London, Tokyo, 349-99. Christie, W.W. 2012. Sterols1. Cholesterol and cholesterol esters structure, occurrence, biochemistry and analysis © lipidlibrary.aocs.org.p. 1-13 Clearfield, M.B. 2003. A novel therapeutic approach to dyslipidemia. J Am Osteopath Assoc,103:S16-20. David, Q.H. and Wang, M.D. 2003. New Concepts of Mechanisms of Intestinal Cholesterol Absorption. Annals of Hepatology,2:3:113-21. Dawson, P.A. 2011. Role of the Intestinal Bile Acid Transporters in Bile Acid and Drug Disposition. Handb Exp Pharmacol, 169–203. doi:10.1007/978-3-64214541-4_4. Egbung, G.E., Essien, E.U., Itam E.H., and Onuoha, A.H. 2010. The Effect of Saponin Consumption on Cholesterol Metabolism in Wistar Albino Rats. Research J. of Agric and Biol. Sci,6(6):1071-73. Eliel, E.L.,1975. Stereochemistry of Carbon International Book CO. Singapure. Coumpounds. McGraw-Hill Friedman, M., Levin, C.E., McDonald, G.M. 1994. α-Tomatine determination in tomatoes by HPLC using pulsed amperometric detection. J. Agric. Food Chem.42: 1959-64. Friedman, M. 2002. Tomato glycoalkaloids: role in the plant and in the diet. J. Agric. Food Chem.50: 5751-75. Garcia-Calvo, M., Lisnock, J., Bull, H.G., Hawes, B.E., Burnett, D.A., Braun, M.P., Crona, J.H., Davis, H.R. Jr., Dean, D.C., Detmers, P.A., Graziano, M.P., Hughes, M., Macintyre, D.E., Ogawa, A., O’neill, K.A., Iyer, S.P., Shevell, D.E., Smith, M.M., Tang, Y.S., Makarewicz, A.M., Ujjainwalla, F., Altmann, S.W., Chapman, K.T., Thornberry, N.A. 2005. The target of ezetimibe is Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1). Proc Natl Acad Sci USA, 102: 8132– 37. Gee, J.M.& Johnson, I.T. 1988. Interactions between haemolytic saponins, bile salts and small intestinal mucosa in the rat. J. of Nutr. 118:1391-7 Gestetner, B., Burk, Y., Tencer, Y. 1968. Soybean saponins. Fate of ingested soybean saponins and the physiological aspect of their hemolytic activity. J. Agric. Food Chem.16: 1031-35. Goldberg, A. C. 2008. Dyslipidemia (Hyperlipidemia). The Merck Manuals. America. Gong, G., Qin, Y., Huang, W., Zhou, S., Wu, X., Yang, X., Zhao, Y., Li, D. 2010. Protective effects of diosgenin in the hyperlipidemic rat model and in human vascular endothelial cells against hydrogen peroxide-induced apoptosis. Chem Biol Interact. 184 :3:366-75. Grundy, S. M. 1990. Cholesterol and Atherosclerosis:Diagnosis and Treatment. Philadelphia:Lippincott, NJ: Gower Medical Publ. Guclu-Ustundag, O., and Mazza, G. 2007. Saponins:Preperties, Application and Processing. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 47:3:231-58. Gurfinkel, D.M., and Rao, A.V. 2003. Soyasaponins: the relationship between chemical structure and colon anticarcinogenic activity. Nutr Cancer,47:24-33. Ha, C.J. and Kim, S.H. 1984. Effects of ginseng saponins on cholesterol solubility. Saengyak Hakhoechi. 15:134-38. Han, L.K., Xu, B.J., Kimura, Y., Zheng, Y.N. and Okuda, H. 2000. Platycodi radix affects lipid metabolism in mice with high fat diet-induced obesity. J of Nutr, 130:2760-64. Harborne, J.B.(Penerjemah: Dr. Kosasih Padmawinata dan Dr. Iwang Soediro).1996. Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan. Metode Fitokimia. Terbitan kedua. ITB Bandung. Hostettmann, K. and Marston, A. 1995. Saponins. Cambridge University Press, Cambridge, UK. http://somelus.wordpress.com/2008/11/27/ gemfibrozil-pada-hiperlipidemia/ Hu, J., Zheng, Y., Hyde, W., Hendrich, S., Murphy, P.A. 2004. Human fecal metabolism of soyasaponin I. J. Agric. Food Chem.52:2689-96. Hu, J., Hendrich, S., Murphy, P.A. 2004. Soyasaponin I and sapogenol B have limited absorption by caco-2 intestinal cells and limited bioavailability in women. J. Nutr.134:1867-73. Huff, M.W., Pollex, R.L. & Hegele, R.A. 2006. NPC1L1: evolution from pharmacological target to physiological sterol transporter. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 26: 2433–38. Human, S. 1980. Human Gessellschaff for Biochemistry and Diagnostica. Silberbachtrebue, Germany. Iqbal, J. and Hussain, M.M. 2009. Intestinal lipid absorption. Am J Physio Endocrinol Metab. 296:E1183-94. Iyer, S.P., Yao, X., Crona, J.H., Hoos, L.M., Tetzloff, G., Davis, H.R. Jr., Graziano, M.P., Altmann, S.W. 2005. Characterization of the putative native and recombinant rat sterol transporter Niemann-Pick C1 Like 1 (NPC1L1) protein. Biochem. Biophys. Acta, 1722: 282–92. Jenkins, K.J. and Atwal, A.S. 1994. Effects of dietary saponin on fecal bile acids and neutral sterols, and availability of vitamins A and E in the chick. J of Nutr Biochem,5:134-38. Jhon ME Adam. 2006. Dislipidemia dalam Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam edisi 4 editor oleh: Aru W.Sudoyo dkk. Pusat Penerbitan Departemen Ilmu Penyakit Dalam FKUI, Jakarta , 1948- 54. Jones P, kafonek S, Laurora I, Hunninghake D. 1998. For the CURVES investigators. Comparative dose-efficacy study of atorvastatin versus simvastatin,pravastatin, lovastatin and fluvastatin inpatients with hypercholesterolemia. The CURVES Study. Am J Cardiol.;81:582-87. Khaleel, A.E., Gad, M.Z., El-Maraghy, S.A., Hifnawy, M.S. and Abdel-Sattar, E. 2005. Study of Hypocholesterolemic and Antiantherosclerotic Propertis of Menticago sativa L. Cultivated in Egypt. J of Food and Drug Analy,13:3: 212-18. Khan, A.A.M.M., Naqvi, T.S. and Naqvi, M.S. 2012. identification of phytosaponins as novel biodynamic agent:an updated overview. Asian J. Exp Biol. Csi.:3(3):459-67. Kim, S.-W., Park, S.-K., Rang, S.-I., Kang, H.-C., Oh, H.-J., Bae, C.-Y., and Bae, D.H. 2003. Hypocholesterolemic property of Yucca schidigera and Quillaja saponaria extracts in human body. Arch. Pharm. Res. 26:1042-46. Kopin, L., and Lowenstein, C. 2010. In the dyslipidemia. American College of Physicians. Kusuhara, H. and Sugiyama, Y. 2007. ATP-binding cassette, subfamily G (ABCG family). Pflugers Arch . 453: 735–44. Lakshmi, V., Mahdi, A.A., agarwal, S. K . and Khanna, A. K. 2012. Steroidal saponin from Chlorophytum nimonii (Grah) with lipid-lowering and antioxidant activity. Original article, 3:227-32. Lee, M.H., Lu, K., Hazard, S., Yu, H., Shulenin, S., Hidaka, H., Kojima, H., Allikmets, R., Sakuma, N., Pegoraro, R., Srivastava, A.K., Salen, G., Dean, M, Patel, S.B. 2001. Identification of a gene, ABCG5, important in the regula tion of dietary cholesterol absorption. Nat Genet, 27: 79 – 83. Lee Sun-Ok, Simon A.L., Murphy P.A., and Hendrich S. 2005. Soyasaponin Lowered Plasma cholesterol and increased Fecal bile Acids in Female Golden Syrian hamsters. Experimental Biology and Medicine, 230:472-78. Lefebvre, P., Cariou, B., Lien, F., Kuipers, F., and Staels, B. 2009. Role of bile acids and bile acid receptors in metabolic regulation. Physiol Rev. 89: 147-91. Levy, E., Spahis, S., Sinnett, D., Peretti, N., Maupas-Schwalm, F., Delvin, E., Lambert, M. & Lavoie, M.A. 2007. Intestinal cholesterol transport proteins: an update and beyond. Curr Opin Lipidol, 18:310–18. Lin, C-Y., Tsai, C-Y., Lin, S-H. 2005. Effects of soy components on blood and liver lipids in rats fed high-cholesterol diets. World J of Gastroenterology,11:35:5549-52. Lu, C.D., and Jorgensen, N.A. 1987. Alfalfa saponins affect site and extent of nutrient digestion in ruminants. J of Nutr,117: 919–27. Lu, K., Lee, M.H., Hazard, S., Brooks-Wilson, A., Hidaka, H., Kojima, H., Ose, L., Stalenhoef, A.F., Mietinnen, T., Bjorkhem, I., Bruckert, E., Pandya, A., Brewer, H.B. Jr., Salen, G., Dean, M., Srivastava, A., Patel, S.B. 2001. Two genes that map to the STSL locus cause sitosterolemia: genomic structure and spectrum of mutations involving sterolin-1 and sterolin-2, encoded by ABCG5 and ABCG8, respectively. Am J Hum Genet.69: 278 –90. Matsuura, H. 2001. Saponinsin garlic as modifiers of the risk of cardiovascular disease. J. Nutr.131:1000S-5S. Micich, T.J. 1990. Behaviors of polymer supported digitonin with cholesterol in the absence and presence of butteroil. J. Agric. Food Chem.38:1839-43. Mimaki, Y., Kuroda, M., Takaashi, Y., and Sashida, Y. 1997. Steroidal glucosides from leaves of Cordyline stricta, Phytochemistry, 45:6: 1229-34. Moreau, R.A., Whitaker, B.D., Hicks, K.B. 2002. Phytosterols, phytostanols, and their conjugates in foods: structural diversity, quantitave analysis, and healthpromoting uses. Prog Lipid Res. 41: 457-500. Morehouse, L.A., Bangerter, F. W. and DeNinno, M. P. 1999. Comparison ofsynthetic saponin cholesterol absorptioninhibitors in rabbits: evidence for a NonStoichiometric, intestinal mechanism of action,” J of Lipid Res.40: 464– 74. Murai, T., Iwabuchi, H., and Ikeda, T. 2004. Identification of Gemfibrozil Metabolites, Produced as Positional Isomers in Human Liver Microsomes, by On-line AnalysesUsing Liquid Chromatography/Mass Spectrometryand Liquid Chromatography/Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn.:52(5):277-83. Murray, R.K., Granner, D.K., Mayes, P.A., Rodwell, V.W. 2003. Harper’s Illustrated Biochemistry Twenty-Sixth Edition. Internattional Edition. Mcgraw-Hill Companies inc. Lange Medical Publication. Naoumkina, M., Modolo, L.V., Huhman, D.V., Urbanczyk-Wochniak, E., Tang, Y. 2010. Genomic and Coexpression Analyses Predict Multiple Gene Involved Triterpene Saponin Biosynthesis in Medicago truncatula(C)(W) Plant Cell ,22:3: 850- 66. National Center for Health Statistics. Health, United States, 2000. Hyattsville, Maryland: Public Health Service. Oakenfull, D. 1981. Saponins in food. Food Chem.;6: 19-40. Oakenfull, D. 1986. Aggregation of saponins and bile acids in aqueous solution. Aust. J. Chem. :39:1671-83. Oakenfull, D. and Sidhu, G.S. 1990. Could saponins be a useful treatment for hypercholesterolaemia. Eur J Clin Nutr.44: 79-88. Ogilvia, B.W., Zhang, D., Li, W., Rodrigues, A.D., Gipson, A.E., Holsapple, J., Toren, P., and Parkinson, A. 2005. Accelerated Communication. Glucuronidation Converts Gemfibrozil To A Potent, Metabolism Dependent Inhbitor of CYP2C8: Implications for Drug-Drug Interactions. Drug Metabolism and disposition:34(1):191-7. Oh, H.I., Chang, E.J and Kwak, H.S. 1998a. Condition of the removal of cholesterol from milk by treatment with saponin. Korean J. Dairy Sci.20:253-90. Oh, H.I., Chang, E.J and Kwak, H.S. 1998b. Condition of the removal of cholesterol from cream by saponin treatment. Korean J. Food Sci. Ani. Resour,18:22431. Osbourn, A.E. 2003. Saponins in cereals. Phytochemistry, 62: 1-4. Price, K.R., Johnson, I.T. and Fenwick, G.R. 1987. The chemistry and biological significance of saponins in food and feeding stuffs. CRC Critical Review of Food Science Nutrition :26, 27-133 Pramesti, G. 2007. Aplikasi SPSS 15.0 dalam Model Linier Statistika. Jakarta: Penerbit PT Elex Media Komputindo. Qiu, S.X., Cordell, G.A., Kurmar, B.R., Rao, Y.N., Ramesh, M., Kokate, C. and Rao, A.V.N.A. 1999. Bisdesmosidic pregnane glycosides from Caralhuma lasiantha, Phytochemistry, 50:485-91. Richard E Ostlund Jr, Curtis A Spilburg, and William F Stenson. 1999. Am. J. Clin. Nutr.:70:826-31. Rochiman, K. 1989. Dasar Perancangan Percobaan dan Rancangan Acak Lengkap. Surabaya: Universitas Airlangga. Ros, E. 2000. Intestinal absortion of triglyceride and cholesterol. Dietary and pharmacological inhibition to reduce cardiovascular risk.Review article. Atherosclerosis, 151:357-79. Rubins,H.B.M.D., Sander, J. Robins, M.D., Dorothea Collins, SC.D., Carol L. Fye, R.PH., M.S., james W. Anderson, M.D., Marshakll, B. Elam, M.D., PH.D., Fred, H. Faas, M.D., Esteban Linares, M.D., Ernst, J. Schaefer, M.D., Gordon Schectman, M.D., Timothy, J. Wilt, M.D., M.P.H., and Janet Wilttes, PH.D. 1999. Gemfibrozil for the secondary Prevention of Coronary Heart Disease in Men with Lows of High-Density Lipoprotein Cholesterol. 1999. The New England J of Medic. :811-18. Rubins,H.B., Davenport, J., Babikian,V., Brass,L.M., Collins, D., Wexler,L., Wagner, S., Papademetriou,V., Rutan, G., and Robins, S.J. 2001. Reduction in Stroke With Gemfibrozil in Men With Coronary Heart Disease and Low HDL Cholesterol: The Veterans Affairs HDL Intervention Trial (VA-HIT). Circulation. :103:2828-33. Shi, J., Arunasalam, K., Yeung, D., Kakuda, Y., Mittal, G., Jiang, Y. 2004. Saponins from edible legumes: chemistry processing, and health benefits. J Med Food,7: 67-68. Shin, D.H., Heo, H. J. Lee, Y. J. and Kim, H. K. 2004. Amaranthsqualene is reduced serum and liver lipid levels in been fed a cholesterol diet,” British J of Biomedic Sci, 61: 11–14. Shneider, B.I. 2001. Intestinal bile acid transport: biology, physiology and pathophysiology. J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.32:407-17. Si, H., and Liu, D. 2008. Genistein, a soy phytoestrogen, upregulates the expression of human endothelial nitric oxide synthase and lowers blood pressure in spontaneously hypertensive rats. J. Nutr.138: 297-304. Sidhu, G.S. and Oakenfull, D.G.1986. A mechanism for the hypocholesterolaemic activity of saponin. British J of Nutr,55:3:643-49. Sieber, R. 1993. In Cholesterol Removal from Animal Food-Can it be Justified? CH3097 Fed. Dairy Res. Inst., Liebefeld, Switzerland: 375-87. Sirohi, S.K., Goel, N. and Singh, N., 2014. Utilization of saponins, a plant secondary metabolite in enteric methane mitigation and rumen modulation. Annual Research & Review in Biology:4(1):1-19. Siswandono dan Soekardjo, B., 1995. Kimia Medisinal. Airlangga University Press. Son, I.S., Kim, J.H., Sohn, H.Y., Kim, J.S., Kwon, C.S. 2007. Antioxidative and hypolidemic effects of diosgenin, a steroidal saponin of yam (Dioscorea spp.), on high-cholesterol fed rats. Biosci Biotechnol Biochem. 71:12:3063-71. Southon, S., Johnson, I.T., Gee, J.M. & Price, K.R. 1988. The effect of Gypsophylla saponins in the diet on mineral status and plasma cholesterol concentration in the rat. British J of Nutr,59:49-55. Stipanuk, M. 2006. Biochemical, Physiological, Molecular Aspects of Human Nutrition. St. Louis: Saunders Elsevier. Sundfeld, E., Yun, S., Krochta J.M., and Richardson, T. 1993a. separation of cholesterol from butteroil using quillaja saponins. Effects of pH, contact time and adsorbent. J.Food Process Eng. 16:191-205. Sundfeld, E., Yun, S., Krochta, J.M., and Richardson, T. 1993b. separation of cholesterol from butteroil using quillaja saponins. Effects of temperature, agitation and concentration of quillaja saponin. J.Food Process Eng. 16:20726. Thakur, M., Melzig ,M. F. and Fuchs, H. 2011. Review. Alexander weng1Chemistry and pharmacology of saponins: special focus on cytotoxic properties. Botanics: Targets and Therapy,1: 19–29. http://dx.doi.org/10.2147/BTAT.S17261 Tomkin Gerald, H. and Daphne Owens. 2011. Review Article.The Chylomicron: Relationship to Atherosclerosis. International Journal of Vascular Medicine. 1-13 Hindawi Publishing Corporation.Volume 2012, Article ID 784536, doi:10.1155/2012/784536 Triton, P. B. 2006. Riset Statistik Parametrik. Yogyakarta: Penerbit Andi. Turner, B., Williams, S., Taichman, D., Kopin, L., Lowenstein, C. 2010. In the clinic Dyslipidemia. Annals of Internal Medicine. American college of physicians :ITC21-ITC216. Umeda, Y., Kako, Y., Mizutani, K., Iikura,Y., Kawamura,M., Seishima, M., and Hayashi, H. 2001. Inhibitory action of gemfibrozil on cholesterol absorption in rat intestine. J of Lipid res :42: 1214-19. Van Heek, M., Farley, C., Compton, D.S., Hoos, L., Alton, K.B., Sybertz, E.J., Davis, H.R.Jr. 2000. Comparison of the activity and disposition of the novel cholesterol absortion inhibitor, SCH58235, and its glucuronida, SCH60663. Br.J Pharmacol,129:1748-54. Vance, D.E. and Vance, J.E. 2002. Biochemistry of Lipid. Lipoprotein and Membranes (4th Edn.) Elsevier Science B.V. All rights reserved. Vincken, J.-P., Heng, L., De Groot, A., and Gruppen, H. 2007. Saponins, classification and occurrence in the plant kingdom. Phytochemistry, 68: 27597. Voshol, P.J., Schwarz, M., Rigotti, A., Krieger, M., Groen, A.K., Kuipers, F. 2001. Down-regulation of intestinal scavenger receptor class B, type I (SR-BI) expression in rodents under conditions of deficient bile delivery to the intestine. Biochem J. 356:317-25. Wang, D.Q. 2007. Regulation of intestinal cholesterol absorption. Annu Rev Physiol. 69:221–248. Wijayakusuma, H.1994. Tanaman berkhasiat obat di Indonesia. Penerbit Kartini. Jilid II:19 Williams, A.G. and Coleman, G.S. 1992. The Rumen Protozoa. New York: Springer Verlag New York Inc. Wilson, M.D. and Rudel, L.L. 1994. Review of cholesterol absorption with emphasis on dietary and biliary cholesterol. J of Lipid Res, 35:943-55. Yao, L., Heubi J.E., Buckly, D.D, Fierra H., Setchell, K.D., Granholm, N.A., Tso, P., Hui, D.Y., Woollett, L.A. 2002. Separation of micelles and vesicles within luminal aspirates from healthy human: solubilization of cholesterol after a meal. J Lipid Res. 43:654-60. Zhao, H.L., Sim, J-S., Shim, S.H., Ha, Y.W., Kang, S.S. and Kim, Y.S. 2005. Antiobese and hypolipidemic effects of platycodin saponins in diet-induced obese rats; evidences for lipase inhibition and calorie intake restriction. International J of obesity,29: 983-90. Ziajka, P.E., Reis, M., Kreul, S., King, H. 2004. Initial low-density lipoprotein response to statin therapy predicts subsequent low-density lipoprotein response to the addition of ezetimibe. Am J Cardiol. 93: 779 –80.
