studi hubungan kuantitatif struktur- aktivitas anti

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTURAKTIVITAS ANTI-TUBERKULOSIS SENYAWA
AMIDASI ETIL P-METOKSISINAMAT DENGAN
PENDEKATAN HANSCH DAN PENAMBATAN
MOLEKULER PADA ENZIM Inh A
SKRIPSI
WAHIDIN SALEH
NIM: 1111102000072
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
JUNI 2015
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTURAKTIVITAS ANTI-TUBERKULOSIS SENYAWA
AMIDASI ETIL P-METOKSISINAMAT DENGAN
PENDEKATAN HANSCH DAN PENAMBATAN
MOLEKULER PADA ENZIM Inh A
SKRIPSI
Diajukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Far)
WAHIDIN SALEH
NIM: 1111102000072
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
JUNI 2015
ii
iii
iv
v
ABSTRAK
Nama
: Wahidin Saleh
Program Studi: Farmasi
Judul
: Studi Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Anti-tuberkulosis
Senyawa Amidasi Etil p-metoksisinamat dengan Pendekatan
Hansch dan Penambatan Molekuler pada Enzim Inh A
Telah dilakukan uji aktivitas anti-tuberkulosis senyawa amidasi etil pmetoksisinamat dengan Metode Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA)
Hansch dan penambatan molekuler pada Enzim Inh A. HKSA di analisa dengan
regresi multilinier menggunakan program SPSS. Penambatan molekuler di analisa
dengan program autodockvina dan divisualisasi dengan program Pymol dan
Ligplot. Hasil persamaan HKSA terbaik adalah Log(1/MIC) = -18.7 +
0.298(logD) -1.22(Energi HOMO) - 2.812(Energi LUMO) + 0.034(Harary Index)
- 1.106(Randic Index) + 0.243(MolarRefractivity). Hasil penambatan molekuler,
menunjukkan senyawa ((2E)-N,N-dibenzyl-3-(4- methoxyphenyl)prop-2-enamide)
memiliki nilai ΔGbind terendah (-9,4 kcal/mol) dan hasil dari HKSA memiliki nilai
MIC prediksi terkecil (0,008 μM). Hal ini menunjukkan bahwa senyawa tersebut
diprediksikan memiliki aktivitas anti-tuberkulosis yang potensial dibandingkan
oleh EPMS.
Kata kunci: Anti-tuberkulosis, Hansch, penambatan molekul
vi
UIN Syarif HIdayatullah Jakarta
ABSTRACT
Name
: Wahidin Saleh
Program Study
: Pharmacy
Title
: Quantitative Structure-Activity Relationship study of
amidation derivate of Ethyl p-methoxycinnamate on its Antituberculosis using Hansch analysis and molecular docking at
Inh A enzyme.
The anti-tuberculosis activity of amidation derivatives ethyl p-methoxycinnamate
has been determined by using Quantitative Structure-Activity Relationship
(QSAR) Hansch’s method and molecular docking at Inh A enzyme. QSAR was
analyzed by multilinier regression using SPSS. Molecular docking was analyzed
by autodockvina program and visualized by Pymol dan Ligplot program. The best
QSAR equation is Log(1/MIC) = -18.7 + 0.298(logD) -1.22(Energy HOMO) 2.812(Energy LUMO) + 0.034(Harary Index) - 1.106(Randic Index) +
0.243(MolarRefractivity). Results of molecular docking, indicated that ((2E)-N,Ndibenzyl-3-(4- methoxyphenyl)prop-2-enamide) compound has the lowest ΔGbind
value (-9.4 kcal / mol) and the result of QSAR has the smallest MIC predictive
value (0,008 μM). It’s suggested that this compound have potential antituberculosis activity compared by EPMC.
Key Word: Anti-tuberculosis, Hansch, Molecular docking
vii
UIN Syarif HIdayatullah Jakarta
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah
melimpahkan rahmat dan karunia-Nya, serta shalawat dan salam selalu tercurah
kepada junjungan kita, Nabi Muhamad SAW karena dengan segala rahmat dan
karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi dengan
judul “Studi Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Anti-tuberkulosis Senyawa
Amidasi Etil p-metoksisinamat dengan Pendekatan Hansch dan Penambatan
Molekuler pada Enzim Inh A”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi tugas akhir
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah,
Jakarta.
Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan
terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Kedua orang tua bapak dan ibu tercinta, Bapak Mamat dan Ibu Tri Larasati
yang telah memberikan kasih sayangnya, doa, semangat, dukungan moril
maupun materi, tiada yang bisa penulis balas atas semua pemberiannya,
hanya ucapan terimakasih ini yang bisa penulis sampaikan.
2. Bapak Supandi, M.Si.,Apt sebagai pembimbing I dan Ibu Ismiarni
Komala, M.Sc.,Ph.D.,Apt sebagai pembimbing II yang telah memberikan
ilmu, nasihat, waktu, tenaga, dan pikirannya selama penelitian dan
penulisan skripsi ini.
3. Bapak Professor Dr. Dede Rosyada, MA selaku rektor UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta.
4. Bapak Dr. H. Arif Sumantri, SKM.,M.Kes selaku Dekan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah Jakarta.
5. Bapak Yardi.,Ph.D., Apt, selaku Kepala Program Studi Farmasi dan Ibu
Nelly Suryani., Ph.D., Apt selaku sekertaris Program Studi Farmasi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah Jakarta.
viii
UIN Syarif HIdayatullah Jakarta
6. Ibu Dr. Hj. Delina Hasan, M. Kes., Apt selaku pembimbing akademik
yang telah memberikan arahan selama masa perkuliahan
7. Bapak dan Ibu dosen staf pengajar yang telah memberikan ilmu
pengetahuan yang banyak dalam menempuh pendidikan di Program Studi
Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam
Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
8. Bapak Andrianopsyah Mas Jaya Putra M.Sc dan Kak Fikri yang turut
membantu dan menambahkan ilmu tentang penelitian ini.
9. Teman-teman seperjuangan “Docking Team”: Eko, Cacad, Haidar,
Mazaya, dan Wahyu yang telah memberikan waktu dan pikiran untuk
saling sharing permasalahan dan ilmu tentang penelitian ini.
10. Teman satu kontrakan dan bermain: Ali, Rijal, Mozer, Andis, Rais, Galih,
Ari, Akas, dll.
11. Teman belajar selama kuliah: Reza, Echa, Aziz, Fio, Achi, Nicky, Ayu,
Henny, Ichob, Wina, Gina, Merri, dll.
12. Teman-teman Farmasi 2011, khususnya untuk kelas C atas kebersamaan
dan memori selama menempuh ilmu dikampus ini.
13. Para staf dan karyawan program studi farmasi, staf laboran, ka Eris, ka
Tiwi, ka Lisna, Ka liken, Mba Rani, dan Ka Rahmadi yang banyak
membantu selama penelitian dan praktikum semester sebelumnya.
Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna.
Oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis
harapkan guna tercapainya kesempurnaan skripsi ini.
Akhirnya, dengan segala kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil
penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis, khususnya bagi
mahasiswa Farmasi, Masyarakat pada umumnya dan bagi dunia ilmu
pengetahuan.
Ciputat,
Juni 2015
Penulis
ix
UIN Syarif HIdayatullah Jakarta
x
UIN Syarif HIdayatullah Jakarta
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ............................................................................................. ii
HALAMAN PERNYATAAN ORISIONALITAS ............................................ iii
HALAMAN PERSETUJUAN PEBIMBING .................................................... iv
HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI .............................................................. v
ABSTRAK ............................................................................................................ vi
ABSTRACT ......................................................................................................... vii
KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii
HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI.......................... x
DAFTAR ISI ......................................................................................................... xi
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii
DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiv
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xv
DAFTAR ISTILAH ........................................................................................... xvi
BAB 1 PENDAHULUAN ..................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ..................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah................................................................................ 4
1.3 Tujuan Penelitian ................................................................................. 4
1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................... 4
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................ 5
2.1 Etil p-Metoksisinamat ........................................................................ 5
2.2 Reaksi Amidasi .................................................................................. 6
2.3 Tuberkulosis ....................................................................................... 8
2.4 Pengobatan Tuberkulosis ................................................................... 9
2.5 Isoniazid ........................................................................................... 10
2.6 Asam Amino, Protein, dan Enzim.................................................... 12
2.7 Enzim Inh A .................................................................................... 17
2.8 Jenis Ikatan ....................................................................................... 18
2.9 Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Biologis (HKSA)
pendekatan Hansch ............................................................................ 18
2.9.1 Parameter hidrofobik ...................................................... 20
2.9.2 Parameter elektronik ...................................................... 21
2.9.3 Parameter sterik .............................................................. 22
2.9.4 Analisis statistik HKSA Hansch .................................... 23
2.9.5 Kriteria Statistik ............................................................. 24
2.10 Penambatan molekuler (Molecular Docking) .................................. 25
2.11 Pemograman HKSA dan Penambatan Molekuler ............................ 27
2.11.1 Hyperchem ..................................................................... 27
2.11.2 Protein Data Bank .......................................................... 27
2.11.3 Discovery Studio 4.0 Visualizer .................................... 28
2.11.4 Marvin Sketch ................................................................ 28
2.11.5 Autodock ........................................................................ 28
2.11.6 Autodock Vina ............................................................... 29
2.11.7 Pymol ............................................................................. 30
2.11.8 Ligplot ............................................................................ 30
xi
UIN Syarif HIdayatullah Jakarta
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN ............................................................ 31
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian............................................................ 31
3.2 Alat .................................................................................................... 31
3.2.1 Perangkat Keras ............................................................. 31
3.2.2 Perangkat Lunak............................................................. 31
3.3 Bahan ................................................................................................. 32
3.3.1 Struktur molekul tiga dimensi Enzim Inh A
Mycobacterium tuberculosis .......................................... 32
3.3.2 Struktur tiga dimensi Ligan senyawa Amidasi Etil pmetoksisinamat............................................................... 32
3.3.3 Data Anti-tuberculosis beberapa Senyawa beserta
strukturnya ..................................................................... 32
3.4 Cara Kerja .......................................................................................... 32
3.4.1 HKSA pendekatan Hansch ............................................. 32
3.4.1.1 Pemilihan data sets ........................................... 32
3.4.1.2 Pemilihan deskriptor training sets .................... 33
3.4.1.3 Membangun persamaan HKSA ........................ 33
3.4.1.4 Perhitungan deskriptor test sets ........................ 33
3.4.1.5 Validasi persamaan HKSA ............................... 34
3.4.1.6 Prediksi aktivitas sample sets ........................... 34
3.4.2 Penambatan Molekul ...................................................... 34
3.4.2.1 Penyiapan dan optimasi enzim Inh A ............... 34
3.4.2.2 Penyiapan dan optimasi ligan (Senyawa uji) .... 35
3.4.2.3 Penambatan molekul dengan autodock vina .... 35
3.4.2.4 Analisa dan visualisasi hasil penambatan
molekul ............................................................. 36
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 37
4.1 Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas pendekatan Hansch .......... 37
4.1.1 Pemilihan data sets ........................................................ 37
4.1.2 Pemilihan deskriptor training sets ................................. 40
4.1.3 Membangun dan Validasi persamaan HKSA ................ 42
4.1.4 Prediksi aktivitas sample sets ......................................... 46
4.2 Penambatan molekul.......................................................................... 51
4.2.1 Penyiapan dan optimasi makromolekul enzim Inh A .... 51
4.2.2 Penyiapan dan optimasi ligan (senyawa uji) .................. 52
4.2.3 Penambatan molekul dengan Autodock vina ................. 56
4.2.4 Analisa dan Visualisasi penambatan molekul ................ 57
BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 63
5.1 Kesimpulan ........................................................................................ 63
5.2 Saran .................................................................................................. 63
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 64
LAMPIRAN ................................................................................................... 68
xii
UIN Syarif HIdayatullah Jakarta
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Struktur Etil p-metoksisinamat............................................................ 5
Gambar 2.2 Contoh Penamaan amida ..................................................................... 7
Gambar 2.3 Contoh Struktur amida yang penting .................................................. 7
Gambar 2.4 Reaksi Sintesis Amida......................................................................... 7
Gambar 2.5 Struktur Isoniazid .............................................................................. 11
Gambar 2.6 Mekanisme kerja Isoniazid................................................................ 12
Gambar 2.7 Struktur umum Asam Amino ............................................................ 13
Gambar 2.8 Koefisien Partisi dan Distribusi senyawa terion dan tak terion ........ 21
Gambar 4.1 Grafik korelasi perbandingan Log (1/MIC) eksperimen dan Log
(1/MIC) prediksi .............................................................................. 46
Gambar 4.2 Perbandingan Struktur EPMS, EPHS, Amida_9, dan Amida_11 ..... 50
Gambar 4.3 Visualisasi interaksi Makromolekul dan Ligan (Isoniazid dan 3
senyawa uji dengan ∆Gbind terendah ................................................ 60
xiii
UIN Syarif HIdayatullah Jakarta
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 Asam Amino ......................................................................................... 13
Tabel 2.2 Pengelompokan Asam Amino .............................................................. 15
Tabel 2.3 Penggolongan Enzim ............................................................................ 16
Tabel 4.1 Data sets yang digunakan ..................................................................... 37
Tabel 4.2 Data Training sets ................................................................................. 39
Tabel 4.3 Data test sets.......................................................................................... 39
Tabel 4.4 Data nilai setiap deskriptor training sets............................................... 41
Tabel 4.5 Hasil analisa persamaan HKSA ............................................................ 42
Tabel 4.6 Model Persamaan .................................................................................. 43
Tabel 4.7 Data Nilai PRESS ................................................................................. 44
Tabel 4.8 Data deskriptor terpilih pada test set ..................................................... 45
Tabel 4.9 Nilai RMSD Model persamaan 2 dan 3 pada test set ........................... 45
Tabel 4.10 Data sample sets .................................................................................. 47
Tabel 4.11 Data deskriptor sample sets ................................................................ 48
Tabel 4.12 Data aktivitas prediksi sample sets menggunakan persamaan HKSA
2 ........................................................................................................... 49
Tabel 4.13 Senyawa ligan yang akan di-docking .................................................. 53
Tabel 4.14 Hasil penambatan molekuler ............................................................... 58
Tabel 4.15 Perbanding ∆Gbind dan MIC prediksi .................................................. 61
xiv
UIN Syarif HIdayatullah Jakarta
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Alur Penelitian .................................................................................. 68
Lampiran 2. Prosedur Kerja HKSA ...................................................................... 70
Lampiran 3. Prosedur Kerja Penambatan Molekuler ............................................ 77
Lampiran 4. Hasil penambatan molekul dan visualisasinya ................................. 81
xv
UIN Syarif HIdayatullah Jakarta
DAFTAR ISTILAH
Enzim Inh A
Enoyl acyl carrier protein reductase
EPHS
Etil p-hidroksisinamat
EPMS
Etil p-metoksisinamat
HKSA
Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktifitas
HOMO
Highest Occupied Moleculer Orbital
INH
Isoniazid
LUMO
Lowest Unoccupied Molecular Orbital
MIC
Minimum Inhibitor Concentration
NADH
Nicotinamide Adenin Dinucleotide
PDB
Protein Data Bank
PRESS
Predicted Residual Sums of Squares
RMSD
Root Mean Square Deviation
SE
Standard Error
ΔGbind
Energi bebas Gibss
xvi
UIN Syarif HIdayatullah Jakarta
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang
Tuberkulosis adalah suatu penyakit infeksi yang disebabkan oleh
bakteri basil tahan asam Mycobacterium tuberculosis serta bertahan dalam
tubuh manusia selama bertahun-tahun, ditularkan melalui droplet yang
mengandung basil tersebut (airborne disease). Sebagian besar kuman TB
menyerang paru, tetapi dapat juga mengenai organ tubuh lainnya (Depkes
RI, 2011). Genus Mycobacterium mempunyai karakteristik unik karena
dinding selnya kaya akan lipid, dan lapisan tebal peptidoglikan yang
mengandung arabinogalaktan, lipoarabinomanan dan asam mikolat. Asam
mikolat tidak biasa dijumpai pada bakteri dan hanya dijumpai pada
dinding sel Mycobacterium dan Corynebacterium. Dalam jaringan tubuh
kuman Mycobacterium tuberculosis dapat mengalami fase dorman
(tertidur lama) selama beberapa tahun (Poeloengan et al., 2007; Depkes
RI, 2002).
Diperkirakan sekitar sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi oleh
Mycobacterium tuberculosis. Pada tahun 2013, 6,1 juta kasus TB telah
dilaporkan pada WHO. Dari jumlah tersebut, 5,7 juta merupakan pasien
dengan diagnosa baru dan 0,4 juta lainnya telah menjalani pengobatan.
Pada tahun 2009, Indonesia merupakan negara dengan pasien TB
terbanyak ke-5 di dunia setelah India, Cina, Afrika Selatan dan Nigeria.
Diperkirakan jumlah pasien TB di Indonesia sekitar 5,8% dari total jumlah
pasien TB didunia. (Depkes RI, 2011; WHO, 2014).
1
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2
Obat yang umum dipakai pada pengobatan tuberkulosis adalah
Isoniazid,
Etambutol,
Rifampisin,
Pirazinamid,
dan
Streptomisin.
Kelompok obat ini disebut sebagai obat primer. Isoniazid adalah obat TB
yang paling poten dalam hal membunuh bakteri dibandingkan dengan
rifampisin dan streptomisin (Depkes RI, 2005).
Isoniazid bekerja dengan menghambat biosintesis asam mikolat
yang merupakan unsur penting dinding sel mikobakterium. Beberapa
hipotesis
diajukan
berkaitan
dengan
mekanisme
kerja
isoniazid,
diantaranya adalah efek pada lemak, biosintesis asam nukleat dan
glikolisis. (Goodman and Gilman, 2005; Katzung, B., 2004).
Enzim Inh A atau enoyl acyl carrier protein reductase dari
Mycobacterium tuberculosis, merupakan salah satu enzim penting yang
terlibat dalam jalur biosintesis asam lemak tipe II dari M. tuberculosis.
Adanya isoniazid yang berikatan dengan kofaktor Nicotinamide Adenine
Dinucleotide (NADH) membentuk INH-NAD akan menghambat aktivitas
enzimatik Inh A, sehingga akan mengganggu biosintesis asam mikolat
yang merupakan unsur utama dari dinding sel mikobakterium (He et al,
2007).
Etil p-metoksisinamat (EPMS) yang merupakan salah satu zat
kimia dari rimpang kencur (Kaempferia galanga), telah dilaporkan tidak
hanya memiliki aktivitas analgesik-anti inflamasi seperti NSAID yang
menghambat siklooksigenase, tetapi juga menghambat proliferasi sel
tumor dalam spesimen epidermis tikus, selain itu juga memiliki aktivitas
biologis
terhadap
penghambatan
pertumbuhan
Mycobacterium
tuberculosis dan Candida albicans (Dash et al., 2014). Hasil dari
penelitian Lakhsmanan et al., (2011), Etil p-metoksisinamat diprediksikan
memiliki sifat anti-tuberkulosis dengan mekanisme yang mirip dengan
isoniazid, yaitu berpengaruh terhadap proses biosintesis asam mikolat.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3
Berdasarkan penelitian tersebut, peneliti tertarik untuk melakukan
uji aktivitas anti-tuberkulosis senyawa hasil modifikasi struktur dari reaksi
amidasi senyawa EPMS sebagai senyawa penuntunnya (lead compound),
yang telah diketahui memilki aktivitas anti-tuberkulosis. Salah satu cara
untuk memberikan informasi aktivitas biologis suatu senyawa adalah
dengan menggunakan metode hubungan kuantitatif struktur-aktivitas
(HKSA).
HKSA merupakan bagian penting rancangan obat dalam usaha
mendapatkan obat baru dengan aktifitas yang lebih besar, keselektifan
yang lebih tinggi, toksisitas atau efek samping sekecil mungkin dan
kenyamanan yang lebih besar. Selain itu dengan menggunakan model
HKSA, akan lebih banyak menghemat biaya atau lebih ekonomis, karena
untuk mendapatkan obat baru dengan aktifitas yang dikehendaki, faktor
coba-coba ditekan sekecil mungkin sehingga jalur sintesis menjadi lebih
pendek (Siswandono, 2008).
Selain dengan pendekatan HKSA antara senyawa turunan amidasi
EPMS dengan senyawa turunan asam sinamat yang memiliki aktivitas
anti-tuberkulosis, diketahui juga penentuan aktivitas bisa menggunakan
metode penambatan molekuler (molecular docking). Senyawa amidasi
EPMS akan digunakan sebagai ligan yang akan diprediksi hasil
penambatannya dengan suatu makromolekul, yaitu enzim Inh A yang
terdapat di M. tuberculosis, kemudian divisualisasi interaksi liganmakromolekul dengan menggunakan program Pymol dan LigPlot. Hasil
dari penelitian ini, diharapkan akan mendapatkan senyawa amidasi EPMS
yang memiliki prediksi aktivitas yang baik untuk pengobatan antituberkulosis dengan metode HKSA Hansch dan penambatan molekul pada
enzim Inh A. Sehingga, senyawa tersebut pada penelitian selanjutnya
dapat disintesis dan diuji secara in-vitro dan in-vivo terhadap aktivitas antituberkulosisnya.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4
1.2
Rumusan Masalah
Apakah senyawa amidasi Etil p-metoksisinamat memiliki aktivitas
anti-tuberkulosis dengan menggunakan metode hubungan kuantitatif
struktur-aktivitas pendekatan Hansch dan melalui penambatan molekuler
pada enzim Inh A?
1.3
Tujuan Penelitian
a.
Memperoleh hubungan kuantitatif struktur-aktivitas anti-tuberkulosis
senyawa amidasi etil p-metoksisinamat dengan pendekatan Hansch.
b.
Melihat interaksi senyawa amidasi etil p-metoksisinamat dengan
enzim Inh A dalam penghambatan pembentukan asam mikolat
Mycobacetrium tuberculosis.
1.4
Manfaat Penelitian
a. Memberikan informasi acuan senyawa amidasi etil p-metoksisinamat
yang akan disintesis dan diujikan secara in-vitro untuk aktivitas antituberkulosis.
b. Membantu dalam memberi informasi pada pembuatan obat antituberkulosis baru.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Etil p-metoksisinamat
Senyawa etil p-metoksisinamat termasuk dalam golongan
senyawa ester yang mengandung cincin benzena dan gugus metoksi
yang bersifat nonpolar dan juga gugus karbonil yang mengikat etil
yang bersifat sedikit polar sehingga dalam ekstraksinya dapat
menggunakan pelarut-pelarut yang mempunyai variasi kepolaran
yaitu etanol, etil asetat, metanol, air dan heksana, termasuk turunan
asam sinamat, dimana asam sinamat adalah turunan senyawa phenil
propanoad. Senyawa-senyawa yang termasuk turunan sinamat
adalah para hidroksi sinamat, 3,4-dihidroksisinamat, dan 3,4,5
trimetoksisinamat (Barus, 2009).
Gambar 2.1 Struktur Etil p-metoksisinamat (Barus, 2009)
Tanaman kencur memang mengandung senyawa tabir surya
yaitu etil p-metoksisinamat, yang telah dibuktikan kebenarannya
oleh pengalaman nenek moyang kita. Etil p-metoksisinamat (EPMS)
adalah salah satu senyawa hasil isolasi rimpang kencur yang
merupakan bahan dasar senyawa tabir surya yaitu pelindung kulit
dari sengatan sinar matahari. (Barus, 2009). Umar et al, (2014)
menyatakan bahwa
Etil p-metoksisinamat memilki potensi anti-
inflamasi
menghambat
dengan
sitokin
proinflamasi
dan
angiogenesis, sehingga menghambat fungsi utama dari sel endotel.
Dengan demikian, etil p-metoksisinamat bisa menjadi agen terapi
yang menjanjikan untuk pengobatan penyakit inflamasi dan
gangguan yang berkaitan dengan angiogenesis.
5
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
6
Sebagai antimikroba, Etil p-metoksisinamat diisolasi dari
ekstrak Kampheria galanga memiliki aktivitas yang cukup terhadap
Mycobacterium tuberculosis dan Candida albicans. (Kanjanapothi et
al., 2004; Techaprasan et al., 2010). Baru-baru ini, Etil pmetoksisinamat dengan uji microtiter resazurin telah terbukti
menghambat isolat klinis pasien multidrug resistant (MDR) dari
Mycobacterium tuberculosis dengan konsentrasi hambat minimum
(MIC) dari 0,242-0,485 mM. (Lakshmanan et al., 2011). Aktivitas
larvasida Etil p-metoksisinamat telah ditunjukkan oleh Kim et al.,
(2008), sekitar (LC50 = 12,3-20,7 mg/L) terhadap A. aegypti, O.
togoi dan C. pipens pallens. Namun, etil-sinamat dan 3-Carene
memiliki aktivitas larvasida yang lebih (LC50 = 24,1 dan 21,6 mg/L
masing-masing) terhadap C. pipens pallens tapi kurang aktivitas
(LC50=40-60 mg/L) terhadap A. aegypti dan O. togio.
2.2
Reaksi Amidasi
Proses amidasi adalah suatu reaksi penambahan gugus aktif
amin dengan pengantian atom nitrogen pada gugus karbonil dengan
struktur R–CO–NR′R″. Amin merupakan senyawa organik dan
memiliki gugus fungsional yang mengandung atom Nitrogen. Amin
adalah turunan ammonia dengan salah satu atom hidrogen diganti
dengan alkil atau aril (David, 2007). Amida adalah suatu senyawa
yang mempunyai suatu nitrogen trivalent yang terikat pada gugus
karbonil.
Suatu amida diberi nama dari nama asam kaboksilat
induknya, dengan mengubah imbuhan asam …-oat (atau -at)
menjadi –amida. Amida di sintesa dari derivat asam karboksilat dan
ammonia atau amina yang sesuai (Fessenden, 1999).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
7
a.
b.
Gambar 2.2 Contoh Penamaan amida (Fessenden, 1999)
a. IUPAC: etanamida
b. IUPAC: butanamida
Trivial: asetamida
Trivial: butiramida
Berikut ini beberapa amida yang penting, gugus amidanya
dilingkari:
a.
b.
c.
Gambar 2.3 Contoh Struktur amida yang penting (Fessenden, 1999):
a. nikotinimida b. kafeina c. LSD
Amida disintesis dari derivat asam karboksilat dan amonia
atau amina yang sesuai (Fessenden, 1999). Contoh reaksi pembuatan
amida adalah seperti di bawah ini:
Gambar 2.4
Reaksi Sintesis Amida (Fessenden, 1999)
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
8
2.3
Tuberkulosis
Tuberkulosis atau TB adalah penyakit bakteri menular yang
disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis, yang paling sering
menyerang paru-paru. Hal ini ditularkan dari orang ke orang melalui
droplet dari tenggorokan dan paru-paru orang dengan penyakit
pernapasan aktif. Pada orang yang sehat, infeksi Mycobacterium
tuberculosis sering tidak menimbulkan gejala, karena sistem
kekebalan tubuh seseorang bertindak sebagai "wall off" bakteri.
Gejala TB aktif paru seperti batuk, kadang-kadang dengan sputum
atau darah, nyeri dada, kelemahan, penurunan berat badan, demam
dan berkeringat di malam hari. Tuberkulosis bisa diobati dengan
program antibiotik enam bulan (WHO, 2015).
Tuberkulosis (TB) adalah penyakit infeksius, yang terutama
menyerang penyakit parenkim paru (Brunner et al., 2002).
Diperkirakan sekitar sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi oleh
Mycobacterium tuberkulosis. Pada tahun 1995, diperkirakan ada 9
juta pasien TB baru dan 3 juta kematian akibat TB diseluruh dunia.
Diperkirakan 95% kasus TB dan 98% kematian akibat TB
didunia, terjadi pada negara-negara berkembang. Demikian juga,
kematian wanita akibat TB lebih banyak dari pada kematian karena
kehamilan, persalinan dan nifas. Pada tahun 2013, 6,1 juta kasus TB
telah dilaporkan pada WHO, dari jumlah tersebut, 5,7 juta
merupakan pasien dengan diagnosis baru dan 0,4 juta lainnya telah
menjalani pengobatan. Pada tahun 2009, Indonesia merupakan
negara dengan pasien TB terbanyak ke-5 di dunia setelah India,
Cina, Afrika Selatan dan.Nigeria. Diperkirakan jumlah pasien TB di
Indonesia sekitar 5,8% dari total jumlah pasien TB didunia.
Diperkirakan, setiap tahun ada 429.730 kasus baru dan kematian
62.246 orang. Insidensi kasus TB BTA positif sekitar 102 per
100.000 penduduk. (Depkes RI 2011; WHO 2014).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
9
Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri aerob obligat
yang pertumbuhannya di bantu oleh tekanan CO2 5-10 %, tetapi di
hambat oleh pH di bawah 6,5 dan asam lemak rantai panjang. Basil
tuberkel tumbuh hanya pada suhu 35-37ºC, yang sesuai dengan
kemampuannya menginfeksi organ dalam terutama paru. Genus
Mycobacterium mempunyai karakteristik unik karena dinding selnya
kaya akan lipid, dan lapisan tebal peptidoglikan yang mengandung
arabinogalaktan, lipoarabinomanan dan asam mikolat.
Asam mikolat tidak biasa dijumpai pada bakteri dan hanya
dijumpai pada dinding sel Mycobacterium dan Corynebacterium.
Bersifat tahan asam sehingga dikenal juga sebagai Basil Tahan
Asam (BTA). Bakteri ini pertama kali ditemukan oleh Robert Koch
pada tanggal 24 Maret 1882, sehingga untuk mengenang jasanya
bakteri tersebut diberi nama basil Koch (Poeloengan et al., 2007).
Mycobacterium tuberculosis ini berbentuk batang, berukuran
panjang 1-4 mikron dan tebal 0,3-0,6 mikron, mempunyai sifat
khusus yaitu tahan terhadap asam pada pewarnaan. Oleh karena itu
disebut pula sebagai Basil Tahan Asam (BTA). Secara khas kuman
membentuk granula dalam paru menimbulkan nekrosis atau
kerusakan jaringan. Kuman TB cepat mati dengan sinar matahari
langsung, tetapi dapat bertahan hidup beberapa jam di tempat gelap
dan lembab. Dalam jaringan tubuh dapat mengalami fase dorman
selama bertahun-tahun (Suarni, 2009; Depkes RI, 2002).
2.4
Pengobatan Tuberkulosis
Pengobatan TB bertujuan untuk menyembuhkan pasien,
mencegah kematian, mencegah kekambuhan, memutuskan rantai
penularan dan mencegah terjadinya resistensi kuman terhadap Obat
Anti Tuberkulosis (OAT) (Depkes RI, 2011). Pengobatan terhadap
TB dimulai sejak 1940-an dengan streptomisin. Obat anti
tuberkulosis pada saat ini digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu
lini pertama dan lini kedua.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
10
Kelompok
lini
pertama,
yaitu
isoniazid,
rifampisin,
etambutol, streptomisin, dan pirazinamid. Secara umum kelompok
lini pertama ini efektifitasnya tinggi, toksisitas dapat ditolerir.
Kelompok lini kedua, adalah antibiotika golongan fluorokuinolon,
sikloserin, etionamid, amikasin, kanamisin, kapreomisin, dan para
aminosalisilat (Niemann, S. dan Gerdes, S.R., 2003).
Pengobatan tuberkulosis dilakukan dengan prinsip-prinsip
sebagai berikut:
a. Obat anti TB (OAT) harus diberikan dalam bentuk
kombinasi beberapa jenis obat, dalam jumlah cukup dan
dosis tepat sesuai dengan kategori pengobatan. Jangan
gunakan OAT tunggal (monoterapi). Pemakaian OATKombinasi
Dosis
Tetap
(OAT-KDT)
lebih
menguntungkan dan sangat dianjurkan.
b. Untuk menjamin kepatuhan pasien menelan obat,
dilakukan pengawasan langsung (DOT = Directly
Observed Treatment) oleh seorang Pengawas Menelan
Obat (PMO).
c. Pengobatan TB diberikan dalam 2 tahap, yaitu tahap
intensif dan lanjutan.
2.5
Isoniazid
Isoniazid (Hydrazide Penisilamin, INH) telah digunakan
sebagai anti-tuberkulosis yang paling umum sejak pengakuan
tentang aktivitas klinisnya pada tahun 1952 (Robitzek et al., 1952).
Terdiri dari cincin piridin dan gugus hydrazide, INH adalah analog
nikotinamid, secara struktural terkait dengan obat anti-TB Etionamid
dan pirazinamid (Kolyva et al., 2012).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
11
Gambar 2.5 Struktur Isoniazid (Kolyva et al., 2012)
Isoniazid adalah turunan hidrazida dan merupakan obat
utama dalam pengobatan penyakit tuberkulosis. Sering digunakan
dalam bentuk kombinasi. Penggunaan pada pasien dewasa secara
umumnya adalah 300 mg per hari melalui oral pada keadaan
lambung kosong. Sedangkan pada pasien anak-anak bervariasi,
yakni: 5 mg/kg per hari (WHO), 10 mg/kg per hari di Inggris dan 10
mg/kg hingga 15 mg/kg per hari di Amerika Serikat (USA), dengan
semuanya mencantumkan batas maksimum 300 mg per hari
(Sweetman, 1999).
INH merupakan obat anti tuberkulosis yang bersifat pro-drug
dimana obat ini akan dirubah menjadi metabolit aktifnya didalam sel
supaya menjadi substansi yang toksik untuk sel mikobakterial. INH
yang telah aktif ini nantinya akan mempengaruhi sintesis asam
mikolat. Asam mikolat ini merupakan salah satu komponen penting
untuk pembentuk dinding sel (Nofriyanda, 2010).
Setelah masuk ke dalam sel mikobakterium, INH dirubah
menjadi bentuk aktifnya oleh enzim katalase–peroksidase (Kat G)
dimana enzim ini dikode oleh gen katG. INH yang telah aktif ini
akan bereaksi dengan Nicotinamide Adenine Dinucleotide ( NADH )
yang merupakan suatu kofaktor yang terikat pada enzim Inh A. INH
aktif dengan NADH ini akan membentuk suatu ikatan kovalen INH–
NAD. Enzim Inh A atau enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase
merupakan suatu enzim yang berperan dalam proses katalisis tahap
awal sintesis asam mikolat dimana enzim ini di kode oleh gen InhA.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
12
Kepekaan
terhadap
INH
yang
disebabkan
karena
penggabungan INH–NAD akan menghambat aktivitas enzimatik
InhA dan akan menghambat sintesis asam mikolat yang merupakan
salah satu bahan utama sebagai pembentuk dinding sel (Nofriyanda,
2010).
Gambar 2.6 Mekanisme kerja Isoniazid
2.6
Asam amino, protein, dan enzim
Asam amino adalah senyawa yang memiliki satu atau lebih
gugus karboksil (−COOH) dan satu atau lebih gugus amino (−NH2)
yang salah satunya terletak pada atom C tepat disebelah gugus
karboksil (atom C alfa). Asam-asam amino bergabung melalui ikatan
peptida yaitu ikatan antara gugus karboksil dari asam amino dengan
gugus amino dari asam amino yang disampingnya (Sudarmadji,
1989). Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut
dalam pelarut organik non polar seperti eter, aseton, dan kloroform.
Sifat asam amino ini berbeda dengan asam karboksilat maupun
dengan sifat amina. Asam karboksilat alifatik maupun aromatik yang
terdiri atas beberapa atom karbon umumnya kurang larut dalam air
tetapi larut dalam pelarut organik. Demikian amina pula umumnya
tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik (Poejiadi,
1994).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
13
Gambar 2.7 Struktur umum Asam Amino (Sumardjo, 2008)
Ada dua struktur kimia asam amino, yaitu struktur yang tidak
bermuatan dan struktur ion pada pH fisiologis. Gugus karboksil
bersifat sebagai sebagai donor proton; gugus amino bersifat sebagai
akseptor proton; dan gugus R yang dikenal sebagai rantai samping
atau rantai cabang mempunyai sifat yang khas (Sumardjo, 2008).
Di alam, terdapat sekitar 300 jenis asam amino. Namun
ternyata hanya 20 asam amino yang secara alami merupakan bahan
pembangun protein. Asam amino pembangun atu penyusun protein
adalah alfa asam amino, yaitu asam amino yang gugus anionnya
terikat pada atom karbon alfa (Sumardjo, 2008).
Tabel 2.1 Asam Amino (Sumardjo, 2008)
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
14
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
15
Rantai samping atau rantai cabang asam-asam amino
mempunyai sifat yang khas. Berdasarkan sifat yang khas tersebut,
asam-asam amino diklasifikasikan menjadi tiga kelompok: asam
amino yang bersifat basa yaitu asam amino dengan rantai samping
mengandung gugus anion atau lingkar heterosiklik berupa hetero
atom nitrogen; asam amino yang bersifat asam, yaitu asam amino
dengan rantai samping mengandung gugus karboksil; dan asam
amino netral, yaitu asam amino dengan rantai samping selain yang
telah disebutkan (Sumardjo, 2008).
Tabel 2.2 Pengelompokan Asam Amino (Sumardjo, 2008)
Protein merupakan makrobiomolekul asam-asam alfa amino
dengan susunan yang kompleks dan berat molekulnya sekitar 5000
sampai beberapa juta. Struktur tiga dimensi protein tersebut dapat
dijelaskan
dengan
mempelajari
tingkat
organisasinya,
yaitu
menyangkut struktur primer, sekunder, tersier, dan quartener.
Struktur primer protein adalah jumlah, jenis, serta urutan asam
amino yang membentuk rantai polipeptida. struktur primer
menentukan sifat dasar berbagai macam protein. Struktur sekunder
adalah struktur yang berikatan kovalen dan berikatan hydrogen dari
polipeptida dalam molekul protein dan dapat berbentuk spiral (αheliks) atau lembaran (zig-zag).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
16
Struktur tersier terbentuk karena terjadi pelipatan rantai
polipetida sehingga membentuk protein globular. Struktur kuartener
protein dibentuk oleh dua atau lebih rantai polipeptida saling
dihubungkan oleh ikatan elektrostatik dan ikatan hidrogren. Dalam
struktur kuartener protein yang kompleks, gaya van der walls di
antara atom-atom yang berdekatan kemungkinan ikut berperan
(Sumardjo, 2008).
Enzim merupakan senyawa protein yang dapat mengkatalisis
seluruh reaksi kimia dalam sistem biologis. Semua enzim murni
yang telah diamati sampai saat ini adalah protein. Aktivitas
katalitiknya bergantung kepada integritas strukturnya sebagai
protein. Enzim dapat mempercepat reaksi biologis, dari reaksi yang
sederhana, sampai ke reaksi yang sangat rumit. Enzim bekerja
dengan cara menempel pada permukaan molekul zat-zat yang
bereaksi sehingga mempercepat proses reaksi. Percepatan reaksi
terjadi karena enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan
sendirinya akan mempermudah terjadinya reaksi. Enzim mengikat
molekul substrat membentuk kompleks enzim substrat yang bersifat
sementara dan lalu terurai membentuk enzim bebas dan produknya
(Lehninger, 1995).
Penggolongan enzim secara internasional telah dilakukan
secara sistematis. Sistem ini menempatkan semua enzim ke dalam
enam kelas utama, masing-masing dengan sub kelas, berdasarkan
atas jenis reaksi yang dikatalisa.
Tabel 2.3 Penggolongan Enzim
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
17
2.7
Enzim Inh A
Inh A atau enoyl acyl carrier protein reductase dari
Mycobacterium tuberculosis, merupakan salah satu enzim penting
yang terlibat dalam jalur biosintesis asam lemak tipe II dari M.
tuberculosis. Dependent-NADH enoil-ACP reduktase dikodekan
oleh gen Inha Mycobacterium yang telah diketahui sebagai target
molekul utama dari frontline obat anti tuberkulosis isoniazid (INH).
Penelitian terbaru menunjukkan bahwa Inh A juga sebagai
secondline target untuk obat antitubercular etionamid (ETA). Inh A
mengkatalisis pengurangan rantai panjang trans-2-enoil-ACP di jalur
biosintesis asam lemak tipe II dari M. tuberculosis. Penghambatan
Inh A mengganggu biosintesis asam mikolat yang merupakan unsur
utama dari dinding sel mikobakteri. Sebagai pro-drug, INH pertamatama harus diaktifkan oleh mikobakteri katalase-peroksidase katG ke
dalam bentuk aktif radikal asilnya. Produk adisi yang dihasilkan dari
ikatan kovalen INH diaktifkan dengan Inh A kosubstrat NADH, atau
produk oksidasi NAD+, berfungsi sebagai Inh A inhibitor yang
ampuh. (He et al., 2007).
Gen katG berfungsi dalam mengkode enzim catalaseperoxidase (Kat G). Enzim ini berperan dalam merubah INH
menjadi metabolit aktifnya supaya INH bisa berikatan dengan
NADH membentuk ikatan INH-NAD. Terjadinya mutasi pada gen
katG akan menyebabkan hilangnya aktivitas enzim catalaseperoxidase sehingga INH yang masuk ke dalam sel tidak dapat
dirubah menjadi bentuk aktifnya. INH yang tidak dalam bentuk
aktifnya tidak dapat mengganggu aktivitas enzim enoyl acyl carrier
protein (ACP) reductase.
INH yang telah aktif ini akan bereaksi dengan Nicotinamide
Adenine Dinucleotide (NADH) yang merupakan suatu kofaktor yang
terikat pada enzim Inh A. INH aktif dengan NADH ini akan
membentuk suatu ikatan kovalen INH–NAD.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
18
Enzim Inh A atau enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase
merupakan suatu enzim yang berperan dalam proses katalisis tahap
awal sintesis asam mikolat dimana enzim ini di kode oleh gen inhA.
Kepekaan terhadap INH yang disebabkan karena penggabungan
INH–NAD akan menghambat aktivitas enzimatik InhA dan akan
menghambat sintesis asam mikolat yang merupakan salah satu bahan
utama sebagai pembentuk dinding sel.
Setelah terjadi perubahan INH menjadi bentuk aktifnya, maka
INH ini akan bekerja pada target utamanya yaitu mengganggu Inh A
atau enzim enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase melalui
adanya ikatan kovalen INH-NAD. Dengan adanya ikatan ini maka
terjadi hambatan aktivitas enzimatik Inh A sehingga mengganggu
sintesis asam mikolat. (Nofriyanda, 2010).
2.8
Jenis Ikatan
Ada beberapa bentuk ikatan yang berperan dalam interaksi
ligan-makromolekul. Biasanya dalam bentuk interaksi ikatan
intermolekular seperti ikatan ion, ikatan hidrogen, ikatan van der
waals, dan ikatan dipol–dipol. Beberapa obat juga membentuk ikatan
kovalen terhadap targetnya (Patrick, 2001). Selain ikatan tersebut,
terdapat ikatan hidrofob yang merupakan salah satu
kekuatan
penting pada proses penggabungan daerah non polar molekul obat
dengan daerah non polar reseptor biologis (Siswandono, 2008)
2.9
Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA) pendekatan
Hansch
Pendekatan hubungan struktur dan aktivitas biologis mulai
berkembang pesat setelah tahun 1960-an, dengan dipelopori oleh
Corwin Hansch dan kawan-kawan, yang menghubungkan struktur
kimia dan aktivitas biologis obat melalui sifat-sifat kimia fisika
umum seperti kelarutan dalam lemak, derajat ionisasi, atau ukuran
molekul (Siswandono, 2008).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
19
Analisis Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA)
merupakan salah satu aplikasi dari kimia komputasi dan juga bagian
yang dipelajari dalam bidang kimia medisinal. Dengan metoda
analisis HKSA, senyawa yang akan disintesis dapat didesain terlebih
dahulu berdasarkan hubungan antara sifat-sifat kimia serta fisik
molekul
dengan aktivitas
biologisnya, dengan menggunakan
hubungan tersebut, aktivitas teoritik suatu senyawa baru dapat
diprediksi, dan dengan demikian fokus riset dapat dipersempit, biaya
dan waktu pun dapat dihemat. Saat ini telah dikenal tiga metoda
analisis HKSA yakni metoda HKSA Free-Wilson, metoda Hansch
dan metoda HKSA tiga dimensi (Kubinyi, 1993).
Hansch
(1963),
mengemukakan
suatu
konsep
bahwa
hubungan struktur kimia dengan aktivitas biologis (log 1/C) suatu
turunan senyawa dapat dinyatakan secara kuantitatif melalui
parameter-parameter
sifat
kimia-fisika
dari
substituent
yaitu
parameter hidrofobik (π), elektronik (σ) dan sterik (Es).
Model pendekatan ini disebut juga dengan model hubungan
energi bebas linier (linier free energy relationship = LFER) atau
pendeakatan ekstra termodinamika. Pendekatan ini menggunakan
dasar persamaan Hammet yang didapat dari kecepatan hidrolisis
turunan asam benzoat (Siswandono, 2008).
Proses interaksi obat-reseptor sangat dipengaruhi oleh ikatan
kimia, kerapatan elektron, ukuran molekul, dan efek sterokimia.
Dalam hubungan struktur dan aktivitas, ketiga parameter tersebut
dilibatkan, terutama parameter eketronik dan sterik.
Pendekatan hubungan struktur aktivitas melalui parameter
sifat kimia fisika oleh Hansch dinyatakan melalui persamaan regresi
linier dibawah ini:
=
+d
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
20

C : Kadar untuk respons biologis baku

: Sumbangan sifat-sifat lipofilk, elektronik,
dan sterik dari gugus-gugus terhadap sifat-sifat senyawa
induk yang berhubungan dengan aktivitas biologis

a, b, c, dan d : Bilangan yang didapat dari perhitungan analisis
regresi linier (Siswandono, 2008).
2.9.1
Parameter hidrofobik
Parameter hidrofobik (lipofilik) yang sering digunakan
dalam HKSA antara lain adalah logaritma koefisien partisi
(log P), tetapan π Hansch, tetapan fragmentasi f RekkerMannhold dan tetapan kromatografi Rm (Siswandono, 2008).
Koefisien partisi oktanol/air yang dinyatakan dalam log P
merupakan
standar
kuantitas
hidrofobik/hidrofilik
suatu
untuk
menentukan
molekul.
sifat
Parameter
hidrofobik/hidrofilik adalah sifat yang sangat penting dalam
aplikasi biomedis (Katritzky et al., 1996).
Koefisien partisi atau log P dapat diartikan sebagai
perbandingan konsetrasi suatu senyawa dalam oktanol dan air.
Selain log P terdapat juga parameter hidrofobik yang sering
digunakan, yaitu koefisien distribusi atau Log D. Koefisien
distribusi adalah perbandingan konsentrasi dari seluruh jenis
senyawa dalam oktanol dan air. Berdasarkan reaksi disosiasi
asam-basa, konsep koefisien partisi digunakan untuk senyawa
bersifat kationik, anionic, dan netral (ChemAxon, 2014)
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
21
Gambar 2.8 Koefisien Partisi dan Distribusi senyawa terion dan tak terion
(ChemAxon, 2014)
2.9.2
Parameter Elektronik
Ada tiga jenis sifat elektronik yang digunakan dalam
HKSA model LFER Hansch, yaitu:
a. Pengaruh berbagai substituent terhadap reaktivitas
bagian molekul yang tidak mengalami perubahan.
Penetapannya
menggunakan
perhitungan
orbital
molekul, contoh : tetapan σ Hammet
b. Sifat elektronik yang berkaitan dengan tetapan
ionisasi (pKa) dan berhubungan bentuk terionkan dan
tak terionkan dari suatu senyawa pada pH tertentu.
Penetapannya menggunakan persamaan HandersonHasselbach.
c. Sifat oksidasi-reduksi atau reaktivitas senyawa.
Penetapannya menggunakan perhitungan mekanika
kuantum dari energi orbital (Siswandono, 2008).
Energi HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital)
dan energi LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital)
merupakan deskriptor yang sangat populer dalam kimia
kuantum. Orbital-orbital ini memainkan peran yang sangat
penting dalam menentukan berbagai reaksi kimia dan dalam
penentuan celah pita elektronik.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
22
Energi HOMO berhubungan langsung dengan potensial
ionisasi dan sifat kerentanan molekul dalam penyerangan
terhadap elektrofil (Katritzky et al, 1996). Sedangkan energi
LUMO berhubungan langsung dengan afinitas elektron dan
sifat kerentanan molekul dalam penyerangan terhadap
nukleofil. Selisih antara energi HOMO dan LUMO (celah
HOMO-LUMO) penting dalam penentuan ukuran stabilitas
molekul. Molekul dengan celah HOMO-LUMO yang besar
berarti molekul tersebut memiliki stabilitas yang tinggi,
sehingga memiliki reaktivitas yang rendah dalam reaksireaksi kimia. Celah ini juga digunakan pada perkiraan energi
eksitasi terendah molekul (Katritzky et al., 1996).
2.9.3
Parameter sterik
Tetapan sterik substituent dapat diukur berdasarkan sifat
meruah gugus-gugus dan efek gugus pada kontak obat dengan
sisi reseptor yang berdekatan (Siswandono, 2008). Parameter
sterik yang sering digunakan para kimiawan dalam setiap
kasus adalah indeks topologi untuk melakukan evaluasi
terhadap toksisitas dan untuk memprediksi aktivitas biologi.
Hal ini karena indeks topologi menawarkan cara yang mudah
dalam pengukuran cabang molekul, bentuk, ukuran, siklisitas,
simetri, sentrisitas, dan kompleksitas (Devillers, 1997).
Indeks topologi menjelaskan bahwa suatu struktur kimia,
disebut sebagai grafik kimia, yaitu suatu model kimia yang
digunakan untuk menjelaskan sifat interaksi antara obyekobyek kimia (atom, ikatan, gugusan atom, molekul, pasangan
molekul, dan sebagainya). Salah satu jenis indeks topologi
yang ada adalah indeks harary, Indeks Harary yang
dinyatakan dengan H diturunkan dari hubungan timbal balik
(resiprokal) matriks jarak dan dari sejumlah sifat-sifat yang
menarik.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
23
Indeks ini berdasarkan pada dugaan para kimiawan
bahwa situs-situs yang terletak berjauhan dalam suatu struktur
seharusnya memiliki pengaruh yang lebih kecil antara satu
dengan lainnya daripada situs-situs yang letaknya berdekatan
(Fatimah, 2008).
Indeks Randic atau indeks konektivitas molekular Randic
sangat mirip dengan indeks Zagreb, namun lebih dapat
diterima dan digunakan secara luas. Secara matematis
dituliskan pada persamaan:
Sesuai dengan definisi yang diberikan, maka semakin
rapat grafik, maka akan semakin rendah harga χ (Fatimah,
2008). Selain itu descriptor parameter sterik yang biasa
digunakan adalah Refraksi molar (molar refraction = MR)
Refraksi molar dihitung melalui persamaan Lorenz-Lorenz
sebagai berikut:
MR= (n2-1) x BM / (n2-1) x d
n : indeks refraksi
d : kerapatan (density) (Siswandono, 2008).
2.9.4
Analisis statistik HKSA Hansch
Perhitungan statistic yang sering digunakan dalam
hubungan struktur dan aktivitas melalui parameter-parameter
kimia fisika adalah analisa regresi linier dan non linier. Untuk
mengetahui hubungan kuantitatif antara struktur kimia dan
aktivitas biologis melalui parameter kimia fisika, dapat
dilakukan perhitungan statistic dengan bantuan computer,
menggunakan program MICROSAT, ABSTAT, QSAR,
STATGRAPHIC, STATISTICA, SIGMASTAT, SPSS, atau
program statistic lainnya (Siswandono, 2008).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
24
Analisa regresi linier bila dilihat dari jumlah variabel
bebas yang digunakan, terbagi menjadi dua yaitu analisa
regresi linier tunggal yang menggunakan satu variabel bebas
dan analisa regresi multi linier (Multilinier Regresion) yang
menggunakan lebih dari satu variabel bebas. Perhitungan
regresi linier digunakan untuk mencari hubungan antara
aktivitas biologis dengan satu parameter kimia fisika atau
lebih. Salah satu contoh bentuk persamaan untuk regresi
multilinier yang menggunakan dua dan tiga parameter adalah
sebagai berikut:
Y = aX1+ bX2 + c
Y= aX1 + bX2 + cX3 + d
X1, X2, X3 : parameter-parameter kimia fisika 1, 2, dan 3
(Siswandono, 2008).
2.9.5
Kriteria Statistik
Keabsahan persamaan yang diperoleh dan arti perbedaan
parameter yang digunakan dalam hubungan struktur-aktivitas
model Hansch, dapat dilihat dengan beberapa kriteria statistik,
seperti r, r2, F, t dan s. arti kriteria statistik:
a) Nilai
r
(koefisien
kolerasi)
menunjukkan
tingkat
hubungan antara data aktivitas biologis pengamatan
percobaan dengan data hasil perhitungan berdasarkan
persamaan yang diperoleh dari analisi regresi. Koefisien
korelasi adalah angka bervariasi mulai dari 0 sampai 1.
Semakin tinggi nilai koefisien kolerasi maka semakin
baik hubungannya.
b) Nilai r2 menunjukkan berapa % aktivitas biologis yang
dapat dijelaskan hubungannya dengan parameter sifat
fisika-kimia yang digunakan.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
25
c) Nilai
F
menunjukkan
kemaknaan
hubungan
bila
dibandingkan dengan tabel F. Makin besar nilai F makin
besar derajat kemaknaan hubungan. Nilai F adalah
indikator bilangan untuk menunjukkan bahwa hubungan
yang dinyatakan oleh persamaan yang didapat, adalah
benar atau merupakan kejadian kebetulan. Semakin tinggi
nilai F semakin kecil kemungkinan hubungan tersebut
adalah karena kebetulan.
d) Nilai t menunjukkan perbedaan koefisien regresi a, b, c,
dan d dari persamaan regresi bila dibandingkan dengan
tabel t
e) Nilai s (simpangan baku) menunjukkan nilai variasi
kesalahan dalam percobaan.
2.10
Penambatan molekuler (Molecular Docking)
Molecular docking atau penambatan molekuler adalah
prosedur komputasional yang digunakan untuk memprediksikan
ikatan non kovalen makromolekul, lebih sering, sebuah molekul
besar (reseptor) dan sebuah molekul kecil (ligan) secara efisien,
dimulai dari struktur-struktur yang tidak saling berikatan, struktur
yang ditemukan dari simulasi dinamika molekul, homology
modeling, dll. Tujuan dari molecular docking adalah untuk
memprediksikan konformasi ikatan dan afinitas pengikatan (Yanuar,
2012).
Dalam bidang pemodelan molekul, docking adalah metode
untuk memprediksi orientasi yang lebih diutamakan dari suatu
molekul ketika terikat satu sama lain untuk membentuk kompleks
yang stabil.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
26
Informasi tentang oreintasi ini dapat digunakan untuk
memprediksi kekuatan hubungan atau afinitas ikatan antara dua
molekul yang digunakan misalnya fungsi penilaian. Hubungan
antara molekul biologis yang relevan seperti protein, asam nukleat,
karbohidrat, dan lipid memainkan peran sentral dalam transduksi
sinyal.
Selanjutnya, orientasi relatif dari dua pasangan yang
berinteraksi dapat mempengaruhi jenis sinyal yang dihasilkan. Oleh
karena itu docking berguna untuk memprediksi baik kekuatan dan
jenis sinyal yang dihasilkan. Docking sering digunakan untuk
memprediksi orientasi ikatan kandidat obat bermolekul kecil
terhadap target proteinnya untuk memprediksi afinitas dan aktivitas
molekul kecil. Maka docking memainkan peran penting dalam
desain obat secara rasional (Mukesh & Rakesh, 2011).
Prediksi pengikatan molekul kecil pada protein penting
karena data tersebut digunakan untuk screening database virtual
molekul mirip obat untuk menemukan senyawa penuntun untuk
mengembangkan obat selanjutnya. Docking juga dapat digunakan
untuk mencoba memprediksi konformasi ikatan dari pengikat yang
diketahui, ketika percobaan seluruh struktur tidak tersedia (Yanuar,
2012).
Untuk melakukan skrining penambatan, syarat pertama
adalah struktur protein yang dikehendaki. Biasanya struktur telah
ditentukan dengan menggunakan teknik biofisik seperti kristalografi
sinar-x, atau spektroskopi NMR.
Struktur protein dan basis data ligan yang potensial ini
berfungsi sebagai input untuk program docking. Keberhasilan
program docking tergantung pada dua komponen: pencarian
algoritma dan fungsi scoring (Mukesh, 2011). Fungsi scoring dapat
memprediksi afinitas ikatan antara makromolekul dengan ligan.
Identifikasi ini didasarkan pada beberapa teori seperti teori energi
bebas Gibbs.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
27
Nilai energi bebas Gibbs yang kecil menunjukkan bahwa
konformasi yang terbentuk adalah stabil, sedangkan nilai energi
bebas Gibbs yang besar menunjukkan tidak stabilnya kompleks yang
terbentuk. Sedangkan penggunaan algoritma berperan dalam
penentuan konformasi (docking pose) yang paling stabil dari
pembentukan kompleks (Funkhouser, 2007).
2.11
Pemograman HKSA dan Penambatan Molekuler
2.11.1 Hyperchem
Program HyperChem, merupakan program kimia aplikasi
32 bit, yang dikembangkan oleh HyperCube Inc. HyperChem
merupakan program yang handal dari pemodelan molekul yang
telah diakui mudah digunakan, fleksibel dan berkualitas. Dengan
menggunakan
visualisasi
dan
animasi
tiga
dimensi
hasil
perhitungan kimia kuantum, mekanika dan dinamika molekular,
menjadikan
HyperChem
terasa
sangat
mudah
digunakan
dibandingkan dengan program kimia kuantum yang lain. Program
Kimia menyediakan fasilitas pembuatan model tiga dimensi (3D),
perhitungan
mekanika
molekular
dan
mekanika
kuantum
(semiempiris dan ab initio). Disamping itu tersedia pula database
dan program simulasi Monte Carlo dan molecular dynamics (MD)
(Pranowo, 2009).
2.11.2 Protein Data Bank
Protein data bank (PDB; http://www.pdb.org) merupakan
kumpulan arsip tunggal mengenai data structural makromolekul
biologi dari seluruh dunia. Penentuan struktur molekul protein yang
terdapat berkas PDB diperoleh dengan menggunakan data
eksperimen. Data eksperimen ini berasal dari kristalografi sinar x
atau spektroskopi Nuclear Magnetic Resonance (NMR).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
28
Kemudian dilakukan proses dengan program komputer untuk
membuat molekul yang paling sesuai dengan data eksperimen
(Berman et al, 2000). PDB merupakan tempat penampungan data
struktur 3D dari protein dan asam nukleat. Situs PDB dapat diakses
pada alamat http://www.pdb.org oleh seluruh pengguna internet
seluruh dunia secara gratis (Yanuar, 2012).
2.11.3 Discovery Studio 4.0 Visualizer
Discovery Studio Visualizer adalah penampil gratis yang dapat
digunakan untuk membuka, mengedit data serta alat untuk
melakukan analisis data yang dihasilkan oleh perangkat lunak lain.
Perangkat ini dirancang untuk memberikan gambaran yang
interaktif untuk melihat dan mengedit struktur molekul, urutan,
data refleksi X-ray, script, dan data lainnya.Aplikasi ini dapat
digunakan pada Windows dan Linux dan terintegrasi dengan
desktop yang menyediakan akses ke fitur sistem operasi standar
seperti sistem berkas, clipboard, dan percetakan (Accelrys
Enterprise Platform, 2005).
2.11.4 MarvinSketch
MarvinSketch merupakan aplikasi mendesain gambar struktur
yang
didirikan
oleh
ChemAxon,
perangkat
lunak
yang
dikembangkan untuk bioteknologi dan farmasetikal industry.
MarvinSketch adalah perangkat chemical drawing berbasis Java
yang memungkinkan membuat dan mengedit molekul dalam
berbagai format file (DBM et al., 2014).
2.11.5 Autodock
Autodock merupakan sebuah perangkat lunak yang dibangun
untuk melakukan suatu prosedur dalam rangka memprediksi
interaksi sebuah molekul kecil dari suatu senyawa dengan molekul
target.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
29
Hal yang menyebabkan tercetusnya pembuatan software ini
adalah karena adanya permasalahan dalam merancang suatu
senyawa bioaktif, khususnya dalam hal perancangan obat dengan
bantuan komputer (Computer Aided Drug Design). Program ini
bertujuan sebagai alat yang dapat digunakan pada computer untuk
membantu proses pembentukan interaksi yang akurat (Yanuar,
2012).
Setiap proses docking dengan AutoDock membutuhkan paling
sedikit empat input file, yaitu: PDBQT file untuk ligan; PDBQT
file untuk makromolekul atau reseptor; grid parameter file (GPF)
untuk perhitungan oleh AutoGrid; dan docking parameter file
(DPF) untuk perhitungan oleh AutoDock (Yanuar, 2012).
2.11.6 Autodock Vina
AutoDock Vina adalah salah satu perangkat lunak yang tepat
dan dapat diandalkan yang tersedia untuk penemuan obat,
penambatan molekul dan skrining virtual yang dirancang dan
diterapkan oleh Dr. Oleg Trott. Vina menawarkan fungsi yang
beragam, tingkat kinerja tinggi dan meningkatkan akurasi untuk
mempermudah penggunaan. Perangkat lunak ini dapat dioperasikan
dengan bantuan AutoDockTools (ADT) atau instruksi command
line.
Untuk hasil input dan output vina, file type yang digunakan
dalah struktur molekul PDBQT seperti yang digunakan pada
software Autodock. Untuk pengaplaksiannya, hanya diperlukan
struktur molekul yang akan di docking dan spesifikasi binding site
(Yanuar, 2012).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
30
2.11.7 Pymol
Pymol adalah program visualisasi molekuler yang diciptakan
oleh Warren Lyford DeLano. Pymol memberikan kualitas gambar
tiga dimensi yang baik dari molekul kecil dan makromolekul
seperti protein.
Pymol merupakan salah satu program visualisasi yang
digunakan untuk memahami suatu struktur biologi dan dapat
menampilkan gambar tiga dimensi yang berkualitas dan mampu
menyajikan tampilan struktur dalam beberapa warna dari suatu
molekul kecil maupun makromolekul seperti protein. Visualisasi
sangatlah penting untuk lebih memahami dan mendalami struktur
suatu molekul (DeLano & Bromberg, 2004).
2.11.8 LigPlot
Program
Ligplot
secara
otomatis
menghasilkan
skema
gambaran 2-D dari interaksi kompleks protein-ligan dari input file
standar Protein Data Bank. Hasil Output yang diberikan berupa
warna, atau hitam-putih, file PostScript memberikan representasi
sederhana dan informatif tentang interaksi antarmolekul dan
kekuatan
interaksinya,
termasuk
ikatan
hidrogen,
interaksi
hidrofobik dan aksesibilitas atom. Program ini sepenuhnya secara
umum digunakan untuk ligan apapun dan juga dapat digunakan
untuk menunjukkan jenis interaksi protein dan asam nukleat
(Wallace et al., 1994).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1.
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan (FKIK) Universita Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta
dan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Serpong selama bulan
Maret hingga Juni 2015.
3.2.
Alat
3.2.1. Perangkat Keras
Notebook Asus (X44C series) dengan spesifikasi Intel®
celeron® CPU (B800 @ 1.50GHz (2 CPUS), ~1.50 GHz), RAM
(Random Access Memory) 2.00 gigabyte, dan Graphic Card (Intel®
HD Graphics Family) 784 MB. Notebook terhubung dengan
AC/DC adapter dan terkoneksi internet.
3.2.2. Perangkat Lunak
Sistem operasi menggunakan Windows 7 Ultimate 64 bit,
Autodock Tools, Discovery Studio 3.5 Visualizer (Accelrys
Enterprise Platform), Open Babel 2.3.2, Autodock Vina, Pymol
(De
Lano
Scitientific
LLC),
Marvin
Sketch
5.5.1.0
(http://www.chemaxon.com), LigPlot, HyperchemTM trial for
Windows, Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb), SPSS
16.0 for windows, Microsoft Excel 2007.
31
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
32
3.3.
Bahan
3.3.1. Struktur molekul tiga dimensi enzim Inh A Mycobacterium
tuberculosis
Struktur tiga dimensi enzim Inh A diunduh dari Bank Data
Protein melalui situs http://www.rcsb.org/pdb. Makromolekul
protein yang dipilih adalah enzim Inh A pada Mycobacterium
tuberculosis yang didapat dari metode X-ray Diffraction dengan
resolusi 2,70 Å. Identitas makromolekul tersebut adalah 1ENY
dengan format .pdb.
3.3.2. Struktur tiga dimensi ligan senyawa amidasi Etil p-metoksisinamat.
Ligan yang digunakan adalah ligan dari senyawa amidasi
etil p-metoksisinamat (EPMS) yang dibuat dengan Marvin Sketch
dengan format .mol untuk perhitungan deskriptor dan format .pdb
untuk proses docking.
3.3.3
Data anti-tuberculosis beberapa senyawa beserta strukturnya
Data anti-tuberkulosis beberapa senyawa di ambil dari
referensi dan jurnal penelitian, kemudian digunakan sebagai
training sets dan test sets untuk membangun persamaan HKSA.
Data aktivitas anti-tuberkulosis yang didapat adalah nilai Minimum
Inhibitor Concentration (MIC) dan strukturnya dalam format .mol.
3.4.
Cara Kerja
3.4.1. HKSA pendekatan Hansch
3.4.1.1 Pemilihan Data Sets
Pemilihan Senyawa Data sets anti-tuberkulosis yang digunakan
melalui pencarian literatur kemudian dibagi menjadi 2 kelompok
yaitu senyawa training sets dan test sets. Senyawa training sets
digunakan untuk membangun persamaan HKSA. Sedangkan
senyawa test sets digunakan untuk memvalidasi persamaan HKSA
yang telah dibuat.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
33
3.4.1.2 Pemilihan deskriptor training sets
Data
deskriptor
yang
digunakan
mewakili
parameter
hidrofobik, elektronik, dan sterik. Untuk parameter hidrofobik
digunakan
nilai
Log
D
dengan
menggunakan
aplikasi
Marvinsketch. Parameter elektronik yang digunakan adalah energi
HOMO, energi LUMO, dan Momen dipol dengan menggunakan
aplikasi
Hyperchem,
perhitungan
menggunakan
metode
semiempiris AM1. Sedangkan parameter sterik yang digunakan
adalah Harary index, Randic index, dan Molar refractivity dengan
aplikasi Hyperchem dan Marvinsketch. Training sets yang telah
dipilih kemudian dihitung tiap deskriptornya untuk membangun
persamaan HKSA.
3.4.1.3 Membangun persamaan HKSA
Persamaan HKSA dibuat melalui perhitungan statistik analisis
regresi multilinier dengan program SPSS. Analisa regresi
multilinier dilakukan dengan metode backward, yaitu dengan
memasukkan semua variabel bebas (data deskriptor) yang
digunakan. Kemudian dicoba penghilangan satu-persatu dalam satu
waktu. Persamaan HKSA tersebut merupakan hubungan parameter
sifat fisika-kimia yang merupakan variable bebas pada metode
Hansch dengan aktivitas anti-tuberkulosis (log 1/MIC) sebagai
variable terikat.
3.4.1.4 Perhitungan deskriptor test sets
Test set yang telah dipilih dihitung nilai descriptor log D,
Energi HOMO, energi LUMO, Momen dipol, Harary index,
Randic index, dan Molar refractivity menggunakan aplikasi
Hyperchem dan MarvinSketch.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
34
3.4.1.5 Validasi persamaan HKSA
Setelah membangun persamaan multilinier regression metode
backward akan didapatkan beberapa model persamaan. Kemudian
diuji validitasnya dengan menghitung nilai r2, Fhit/Ftabel, Standar
Error, dan predicted residual sums of squares (PRESS). Persamaan
yang diterima harus memenuhi syarat:
1. nilai r2 dari 0,8 hingga 1
2. nilai Fhit/Ftabel > 1
3. nilai SE dan PRESS terkecil atau mendekati 0
Kemudian dihitung nilai Root Mean Standar Deviation
(RMSD) dengan membandingkan nilai Log (1/MIC) eksperimen
pada data test sets dengan Log (1/MIC) prediksi test sets dari hasil
model persamaan yang dibuat. Model persamaan yang diterima
bila nilai RMSD terkecil atau mendekati 0.
3.4.1.6 Prediksi aktivitas sample sets
Senyawa amidasi etil p-metoksisinamat pada format .mol
dihitung nilai deskriptor dengan model persamaan yang telah
memenuhi syarat. Nilai deskriptor yang didapat kemudian di
masukkan kedalam persaman HKSA untuk mendapatkan prediksi
aktivitas anti-tuberkulosis (Log 1/MIC) yang baik.
3.4.2. Penambatan Molekuler
3.4.2.1 Penyiapan dan Optimasi Enzim Inh A
Makromolekul enzim InhA diunduh dari Bank Data Protein
melalui situs http://www.rcsb.org/pdb/. Identitas molekul pada
situs tersebut adalah 1ENY dalam format .pdb.
Makromolekul protein kemudian dilakukan proses pemisahan
molekul air dan ligan atau residu non standar. Proses ini dilakukan
dengan menggunakan software Discovery Studio 3.5 Visualizer.
Hasil makromolekul yang telah dipisahkan disimpan pada dalam
format .pdb.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
35
Selanjutnya,
dilakukan
proses
optimasi
makromolekul
menggunakan software Autodock Tool. Buka software Autodock
tool  klik file  read molecul  pilih makromolekul dengan
format .pdb. Optimasi meliputi penambahan atom hidrogen dan
pengaturan grid box parameter untuk menentukan lokasi
penambatan molekul ligan. Hasil optimasi makromolekul disimpan
dalam format .pdbqt.
3.4.2.2 Penyiapan dan Optimasi Ligan (senyawa uji)
Ligan yang digunakan sebagai pembanding adalah Isoniazid
yang
dapat
diunggah
melalui
PubChem
(http://PubChem.ncbi.blm.nih.gov). Sedangkan senyawa amidasi
Etil p-metoksisinamat yang akan diujikan
dibuat struktur tiga
dimensinya dengan software Marvinsketch dan disimpan dalam
format .mol, kemudian dikonversi menjadi .pdb dengan program
open babel. Optimasi struktur ligan yang telah dibuat dengan
menggunakan software Autodock Tools. Dengan cara: Buka ligan
yang telah dibuat (ligand → input → open). Kemudian, optimasi
pengaturan number of active torsion. Simpan ligan hasil optimasi
(ligand → output → save as pdbqt →save) dalam format .pdbqt.
3.4.2.3 Penambatan Molekul dengan Autodock Vina
Langkah
awal
yang dilakukan
adalah
mengkopi
atau
menyimpan data Ligan dan Protein format .pdbqt yang telah
dioptimasi kedalam folder Vina. Kemudian buat pengaturan
konfigurasi file vina pada notepad dan disimpan dengan format
conf.txt. Selanjutnya, jalankan software Vina melalui Command
prompt.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
36
3.4.2.4 Analisis dan Visualisasi Penambatan Molekul
Hasil kalkulasi penambatan dilihat pada output dalam format
out.pdbqt. Pemilihan hasil penambatan dengan memilih ligan yang
memilki nilai energi bebas Gibbs (∆Gbind) terendah. Data nilai
energi ikatan setiap ligan dapat dilihat pada output hasil
penambatan ‘log.txt’.
Visualisasi posisi setiap ligan pada makromolekul dan asam
amino yang terikat pada ligan dengan menggunakan program
Pymol dan Ligplot. Pymol digunakan untuk melihat kecocokan
situs tambat pada makromolekul dengan ligan. Pymol akan
menvisualisasi secara 3 dimensi, sedangkan ligplot secara 2
dimensi.
Makromolekul yang sebelumnya telah dioptimasi dengan
format .pdbqt dan data hasil penambatan output.pdbqt, dibuka
menggunakan wordpad. Data dari output.pdbqt disalin kedalam
data makromolekul, kemudian disimpan dalam format .pdb dan
dilihat interaksi asam amino dan ligannya menggunakan program
Ligplot secara dua dimensi.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas pendekatan Hansch
4.1.1 Pemilihan data sets
Data sets yang digunakan adalah senyawa turunan asam sinamat
yang memiliki kemiripan dengan senyawa amidasi EPMS dan
mempunyai aktivitasi anti-tuberkulosis. Data senyawa turunan sinamat
yang digunakan adalah hasil percobaan secara in-vitro yang dilakukan
oleh Guzman et al, (2014) terhadap penghambatan pertumbuhan
Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv atau konsentrasi hambat
minimum (MIC). Data senyawa yang digunakan adalah sebanyak 14,
kemudian dibagi menjadi 2 bagian, yaitu 9 senyawa sebagai training
sets dan 5 senyawa sebagai test sets.
Tabel 4.1 Data sets yang digunakan
No.
Nama Senyawa dan Struktur
Kode
MIC
Senyawa
(μM)
S1
485
S2
270
S3
312
ethyl p-methoxycinnamate
1
Cinamic acid
2
3,4-methylenedioxycinnamic acid
3
37
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
38
3-Coumaric acid
4
S4
366
S6
258
S7
86.1
S8
66.8
S9
172
S10
81.2
S12
112
2-O-prenylcoumaric acid
5
4-O-prenylcoumaric acid
6
4-O-geranylcoumaric acid
7
Methyl 3-O-Prenylcoumarate
8
Methyl 4-O-Prenylcoumarate
9
Methyl 2-Coumarate
10
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
39
Caffeic aldehyde
11
S13
154
S14
122
S15
224
S16
127
2-Coumaric acid
12
Methyl 4-Coumarate
13
3-O-prenylcoumaric acid
14
Catatan: Untuk mempermudahkan input data, nama senyawa selanjutnya akan
digantikan oleh kode senyawa
Tabel 4.2 Data Training sets
Tabel 4.3 Data test sets
No.
Kode Senyawa
MIC
No.
Kode Senyawa
MIC
1
S1
485
1
S4
366
2
S2
270
2
S3
312
3
S6
258
3
S16
172
4
S15
224
4
S14
122
5
S9
172
5
S7
86.1
6
S13
154
7
S12
112
8
S10
81.2
9
S8
66.8
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
40
4.1.2 Pemilihan deskriptor Training sets
Deskriptor yang digunakan merupakan hasil dari perhitungan
logika matematika yang mengubah informasi yang dikodekan dalam
suatu molekul kemudian direpresentasikan kedalam angka-angka yang
berguna bagi penelitian berikutnya, baik sebagai pengetahuan tentang
molekul tersebut maupun sebagai model untuk mempresiksi molekul
lain (Todeschini, 2009).
Sehingga hasil dari deskriptor tersebut dapat mewakili parameter
hidrofobik, elektronik, dan sterik pada HKSA model Hansch. Hal ini
dikarenakan proses distribusi, penembusan membran biologis sangat
dipengaruhi oleh sifat kelarutan obat dalam lemak/air, suasana pH dan
derajat ionisasi (pKa) sehingga dalam HKSA, parameter yang sering
digunakan adalah parameter hidrofobik dan elektronik.Sedangkan untuk
proses interaksi obat-reseptor sangat dipengaruhi oleh ikatan kimia,
kerapatan elektron, ukuran molekul, dan efek sterokimia, sehingga
dalam HKSA, ketiga parameter tersebut ikut dilibatkan, terutama
parameter elektronik dan sterik (Siswandono, 2008).
Deskriptor yang digunakan untuk mewakili parameter hidrofobik
adalah nilai Log D dengan menggunakan program Marvin sketch,
Struktur training sets yang telah dibuat dalam aplikasi Marvin sketch
kemudian pilih clean 3D, setelah itu pilih tools  partitioning  logD,
untuk mendapatkan nilai logD.
Untuk deskriptor elektronik yang digunakan adalah nilai energi
HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital), energi LUMO (Lowest
Unoccupied Molecular Orbital), dan momen dipol menggunakan
aplikasi Hyperchem. Setelah struktur training sets dibuat, kemudian
pilih Build  add H and model build. Sebelum dilakukan perhitungan
deskriptor, dilakukan optimasi struktur dengan metode semiempiris
AM1 dan optimasi geometri.
Pemilihan metode semiempiris AM1, karena metode tersebut
sering digunakan dan merupakan metode semiempiris standar untuk
perhitungan senyawa organik (Bultink et al., 2004).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
41
Proses optimasi struktur berfungsi untuk mendapatkan struktur
yang stabil ketika dilakukan perhitungan parameter elektroniknya,
sehingga hasil perhitungan deskriptor yang didapat sesuai dengan sifatfisika kimia senyawa yang sebenarnya. Proses perhitungan deskriptor
energi HOMO dan LUMO dengan cara, pilih Compute kemudian pilih
Orbitals. Sedangkan untuk momen dipol, pilih Compute  Single Point
 Properties.
Kemudian, pemilihan deskriptor yang mewakili parameter sterik
adalah Molar refractivity, Harary Index, dan Randic Index. Pehitungan
molar refractivity menggunakan aplikasi Hyperchem dengan cara, pilih
Compute  QSAR Properties  Refractivity  klik Compute.
Sedangkan untuk Harary Index dan Randic Index menggunakan
aplikasi MarvinSketch. Setelah struktur dibuat dan telah di-clean 3D,
pilih tools GeometryTopological analysispilih Harary Index dan
Randic IndexOk. Semua data kemudian dikumpulkan pada program
SPSS dan Microsoft Excel, yang nantinya digunakan untuk membangun
persamaan HKSA. Selanjutnya, aktivitas senyawa yaitu nilai MIC
diubah menjadi Log (1/MIC) sebagai variabel tak bebas dan 7 data
deskriptor sebagai variabel bebas.
Tabel 4.4 Data nilai setiap deskriptor training set
No
Kode
Senyawa
1
S1
2
S2
3
S6
4
S15
5
S9
6
S13
7
S12
8
S10
9
S8
Log
(1/MIC)
-2.686
-2.431
-2.412
-2.350
-2.236
-2.188
-2.049
-1.91
-1.825
logD
Energi
HOMO
Energi
LUMO
Momen
dipol
Harary
index
Randic
index
Molar
refractivity
2.71
-8.943
-0.639
2.346
39.412
12.815
63.09
-0.665
-9.471
-0.793
2.679
25.102
8.734
47.2
0.183
-9.394
-0.615
2.02
47.893
14.695
72.69
2.207
-9.059
-0.731
3.731
32.25
10.419
53.57
0.237
-9.215
-0.784
4.055
47.233
14.695
72.69
1.36
-8.974
-0.847
5.397
29.204
9.272
49.48
2.205
-9.304
-0.72
1.099
32.639
10.419
53.57
3.719
-8.922
-0.642
3.029
50.65
15.842
77.46
1.845
-8.97
-0.71
3.959
66.316
20.222
96.49
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
42
4.1.3 Membangun dan validasi Persamaan HKSA
Persamaan HKSA yang dibuat dengan
cara analisa regresi
multiliner dengan metode backward dibantu oleh program SPSS.
Pemilihan analisa regresi multilinier dikarenakan dalam pembuatan
persamaan, parameter-parameter sifat fisika-kimia yaitu data deskriptor
yang digunakan lebih dari satu. Sembilan data akitivitas (Log 1/MIC)
senyawa training sets dengan masing-masing memiliki 7 data
deskriptor di input pada program SPSS. Kemudian dilakukan analisa
statistic regresi multiliner metode backward dengan cara, pilih analyze
RegressionLinier pilih dependent variabel adalah aktivitas
senyawa (Log 1/MIC) dan independent variabel adalah 7 deskriptor
yang digunakanubah method menjadi backwardOk.
Hasil yang didapat dari program SPSS adalah 3 model persamaan
HKSA dengan nilai r, r2, Fhitung, SE (Standar Error), dan Deskriptor
yang digunakan. Data tersebut dapat dilihat pada tabel 4.5. Model
persamaan yang diterima dalam penelitian HKSA adalah yang memiliki
nilai r diantara 0,9 hingga 1, nilai r2 antara 0,8 hingga 1, nilai standar
error (SE) < 1 atau mendekati 0, dan nilai Fhitung lebih kecil dari Ftabel
atau Fhit/Ftab>1. Nilai r (koefisien kolerasi) menunjukkan tingkat
hubungan antara data aktivitas biologis pengamatan percobaan dengan
data hasil perhitungan berdasarkan persamaan yang diperoleh dari
analisa regresi. Sedangkan nilai r2 menunjukkan persentase aktivitas
biologis yang dapat dijelaskan hubungannya dengan sifat fisika kimia
yang digunakan (Siswandono, 2008; Rifai. et al., 2014).
Tabel 4.5 Hasil analisa persamaan HKSA
Model
1
2
3
Deskriptor yang digunakan
Log D, energi HOMO, energi
LUMO, Momen dipol, Harary
Index, Randic Index, Molar
refractivity
Log D, energi HOMO, energi
LUMO, Harary Index, Randic
Index, Molar refractivity
Log D, energi HOMO, energi
LUMO , Randic Index, Molar
refractivity
r
0.994
r2
0.988
SE
0.083
Fhit
12.218
Ftab
237
Fhit/Ftab
0.052
0.992
0.985
0.0679
21.179
19.33
1.096
0.988
0.976
0.0684
24.906
9.01
2.764
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
43
Tabel 4.6 Model Persamaan
Model
Bentuk Persamaan
1
log(1/MIC) = -14.130+0.251(logD)-0.693(EH)-3.027(EL)-0.068(MD)+0.044(HI)1.364(RI)+0.294(MR)
2
log(1/MIC) = -18.7+0.298(logD)-1.22(EH)-2.812(EL)+0.034(HI)-1.106(RI)+0.243(MR)
log(1/MIC) = -19.106+0.302(logD)-1.226(EH)-2.828(EL)-1.083(RI)+0.265(MR)
3
Keterangan: EH = energi HOMO, EL = energi LUMO, MD = momen dipole, HI =
Harary Index, RI = Randic Index, MR = Molar refractivity
Dari hasil analisa yang didapat, model persamaan yang memenuhi
syarat adalah persamaan model 2 dan 3. Karena pada persamaan model
1, nilai Fhit/Ftab kurang dari 1 yaitu 0,052. Hal ini dikarenakan nilai F
menunjukkan kemungkinan persamaan tersebut adalah suatu hubungan
yang bermakna diantara hasil-hasil yang didapat. Jika nilai F
perhitungan data percobaan lebih besar dari nilai F tabel maka hasilhasil percobaan mempunyai hubungan yang besar pada tingkat
probabilitas yang diberikan (Siswandono, 2008).
Setelah dilakukan validasi pada data output SPSS dilakukan uji
PRESS (prediction sum of squares) dengan menggunakan data aktivitas
senyawa training sets berdasarkan eksperimen (Log 1/MIC eksperimen)
dan data aktivitas senyawa training sets dengan menggunakan model
persamaan yang terpilih ( Log 1/MIC prediksi), yaitu model 2 dan 3.
Perhitungan nilai PRESS dengan menggunakan rumus:
Σ{(log 1/MIC eksperimen) – (Log 1/MIC prediksi)}2
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
44
Tabel 4.7 Data Nilai PRESS
Kode
Log(1/MIC)
Senyawa
eksperimen
S1
-2.686
S2
-2.431
S6
-2.412
S15
-2.350
S9
-2.236
S13
-2.188
S12
-2.049
S10
-1.910
S8
-1.825
Nilai PRESS
Log(1/MIC) prediksi
Model 2
Model 3
-2.688
-2.676
-2.450
-2.404
-2.416
-2.446
-2.344
-2.354
-2.166
-2.172
-2.203
-2.227
-2.064
-2.085
-1.878
-1.859
-1.874
-1.874
0.009
0.014
Dari tabel 4.7 diketahui nilai PRESS yang terkecil atau mendekati
0 adalah model 2 yaitu 0,009. Nilai PRESS yang kecil menandakan
aktivitas prediksi dari suatu persamaan HKSA mendekati aktivitas
eksperimen. Untuk memvalidasi lagi model persamaan yang terpilih,
maka dilakukan uji diluar data senyawa pembuat persamaan HKSA
yaitu pada data test sets.
Sebanyak 5 data tes sets yang digunakan dihitung data deskriptor
terpilih dari persamaan model 2 dan 3, yaitu; Log D, energi HOMO,
energi LUMO, Harary Index, Randic Index, dan Molar refractivity.
Setelah semua data deskriptor terkumpul, maka dilakukan
perhitungan aktivitas yaitu nilai Log 1/MIC prediksi senyawa tes set
menggunakan persamaan model 2 dan 3 untuk mendapat nilai RMSD
(root mean square deviation) terkecil, dengan membandingkannya pada
Log 1/MIC eksperimen senyawa tes set. Perhitungan RMSD dengan
rumus:
n = jumlah senyawa test sets yang digunakan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
45
Tabel 4.8 Data deskriptor terpilih pada test set
Kode
Senyawa
log(1/MIC)
logD
Energi
HOMO
Energi
LUMO
Harary
Index
Randic
Index
Molar
Refractivity
S4
-2.563
-1.322
-9.323
-0.889
28.921
9.272
48.8
S3
-2.494
-1.77
-9.086
-0.947
38.024
10.103
52.79
S16
-2.236
-0.19
-9.172
-0.816
47.233
14.695
72.69
S14
-2.086
-1.309
-9.316
-0.942
29.136
9.272
48.8
S7
-1.935
0.186
-8.973
-0.713
46.751
14.695
72.69
Tabel 4.9 Nilai RMSD Model persamaan 2 dan 3 pada test set
Kode
Log(1/MIC)
Senyawa eksperimen
S4
-2.563
S3
-2.494
S16
-2.236
S14
-2.086
S7
-1.935
Nilai RMSD
Log(1/MIC) prediksi
Model 2
Model 3
-2.633
-2.671
-2.533
-2.775
-2.255
-2.263
-2.481
-2.526
-2.692
-2.684
0.384
0.411
Dari hasil RMSD dapat diketahui bahwa model persamaan dengan
nilai RMSD kecil adalah model persamaan 2, hal ini sesuai dengan hasil
uji PRESS, dimana model persamaan 2 memiliki nilai PRESS terkecil.
Sehingga dapat disimpulkan dari hasil validasi model persamaan,
persamaan 2 telah memenuhi syarat pemodelan persamaan HKSA.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
46
Log (1/MIC) eksperimen
0
-3
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
-0.5
-1
-1.5
R² = 0.9843
-2
Log (1/MIC)
prediksi
-2.5
-3
Log(1/MIC) = -18.7 + 0.298(logD) - 1.22(Energi HOMO) - 2.812(Energi LUMO) + 0.034(Harary
Index) - 1.106(Randic Index) + 0.243(MolarRefractivity)
(r = 0.992; r2 = 0.98; SE = 0.0679; Fhit/Ftab = 1.096)
Gambar 4.1 Grafik korelasi perbandingan Log (1/MIC) eksperimen dan Log (1/MIC)
prediksi dengan model persamaan HKSA 2 pada 9 senyawa training sets.
Dari persamaan diatas dapat dilihat bahwa semakin besar nilai
deskriptor log D, Harary index, dan Molar refractivity akan
meningkatkan aktivitas anti tuberkulosis. Sedangkan semakin kecil nilai
deskriptor energi HOMO, energi LUMO, dan Randic Index akan
meningkatkan aktivitas anti tuberculosis. Hal ini dikarenakan koefisien
pada setiap deskriptor mempengaruhi nilai aktivitas suatu senyawa.
4.1.4 Prediksi aktivitas sample sets
Sampel yang digunakan yaitu 11 senyawa amidasi EPMS dan
EPHS (etil p-hidroksisinamat) dibuat bentuk strukturnya dan dihitung
nilai deskriptor terpilih pada persamaan HKSA kedua. Senyawa yang
diujikan merupakan senyawa yang dimungkinkan dapat disintesis,
sehingga nantinya dapat dilakukan uji in-vitro aktivitas antituberkulosis pada senyawa tersebut.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
47
Sebelum
melakukan
proses
perhitungan
deskriptor
pada
Hyperchem maupun Marvinsketch, dilakukan optimasi yang sama
seperti perhitungan deskriptor pada training sets dan test sets, yaitu
menggunakan metode semiempirik AM1 pada Hyperchem dan
dilakukan clean 3D pada marvin sketch. Setelah semua data deskriptor
di
dapat,
dengan menggunakan Microsoft excel
semua data
direkapitulasi dan dilakukan perhitungan MIC prediksi senyawa
sampel.
Tabel 4.10 Data sample sets
No.
Kode
Senyawa
Nama IUPAC
Struktur
1
Amida_1
(2E)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2enamide
2
Amida_2
(2E)-N-hydroxy-3-(4methoxyphenyl)prop-2-enamide
3
Amida_3
(2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N-methylprop2-enamide
4
Amida_4
(2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N,Ndimethylprop-2-enamide
5
Amida_5
(2E)-N-(hydroxymethyl)-3-(4methoxyphenyl)prop-2-enamide
6
Amida_6
(2E)-N,N-bis(hydroxymethyl)-3-(4methoxyphenyl)prop-2-enamide
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
48
7
Amida_7
(2E)-N-(2-hydroxyethyl)-3-(4methoxyphenyl)prop-2-enamide
8
Amida_8
(2E)-N,N-bis(2-hydroxyethyl)-3-(4methoxyphenyl)prop-2-enamide
9
Amida_9
(2E)-N-benzyl-3-(4-methoxyphenyl)prop2-enamide
10
Amida_10
ethyl (2E)-3-(4-aminophenyl)prop-2enoate
11
Amida_11
(2E)-N,N-dibenzyl-3-(4methoxyphenyl)prop-2-enamide
12
EPHS
ethyl (2E)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2enoate
Catatan: Untuk mempermudah analisa data, nama senyawa IUPAC diganti
dengan kode senyawa
Tabel 4.11 Data deskriptor sample sets
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Kode
Senyawa
Amida_1
Amida_2
Amida_3
Amida_4
Amida_5
Amida_6
Amida_7
Amida_8
Amida_9
Amida_10
Amida_11
EPHS
Log D
1.171
1.165
1.395
1.619
0.815
0.459
0.705
0.239
3.12
2.043
5.068
2.564
Energi
HOMO
-8.866
-9.01
-8.842
-8.862
-8.942
-9.022
-8.862
-8.891
-8.874
-8.527
-8.673
-9.039
Energi
LUMO
-0.484
-0.737
-0.468
-0.505
-0.544
-0.546
-0.491
-0.472
-0.279
-0.528
-0.204
-0.698
Harary
Index
32.302
35.874
35.874
39.946
39.412
47.938
42.951
56.083
60.358
35.697
97.07
35.697
Randic
Index
10.791
11.329
12.003
13.214
12.563
14.335
13.813
16.835
16.678
12.041
22.565
11.669
Molar
Refractivity
55.4
56.87
60.29
65.19
61.39
67.39
66.58
77.77
89.04
60.27
122.69
58.32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
49
Tabel 4.12 Data aktivitas prediksi sample sets menggunakan persamaan HKSA 2
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Kode
Senyawa
Amida_11
Amida_9
EPHS
Amida_2
Amida_4
Amida_1
Amida_3
Amida_5
Amida_10
Amida_6
Amida_7
Amida_8
log(1/MIC)
2.122
-0.916
-2.466
-2.779
-3.401
-3.548
-3.586
-3.655
-3.662
-3.870
-3.935
-4.269
MIC prediksi
(μM)
0.008
8.249
292.434
601.082
2518.767
3530.954
3856.257
4519.205
4587.203
7410.952
8619.499
18581.125
Keterangan: MIC EPMS = 485 μM
Dari tabel diatas dapat dilihat 3 senyawa yang memiliki nilai MIC
terkecil bila dibandingkan dengan EPMS, yaitu Amida_11, Amida_9,
dan EPHS. Prediksi aktivitas pada senyawa amida_11 adalah 0,008 μM,
amida_9 adalah 8,249 μM, dan EPHS adalah 292,434 μM. Bila dilihat
dari data deskriptor yang berpengaruh terhadap aktivitas, pada
amida_11 terdapat deskriptor yang memiliki nilai yang besar yaitu Log
D, Harary index, Randic index, dan Molar refractivity. Hal ini
berbanding lurus dengan persamaan yang digunakan, semakin besar
deskriptor Log D, Harary index, dan Molar refractivity, aktivitas
semakin besar (MIC kecil).Walaupun nilai randic index senyawa
amida_11 besar yang seharusnya kecil, hal ini tidak terlalu berpengaruh
dan juga untuk nilai deskrptor lainnya tidak terlalu berbeda nilainya
dengan deskriptor senyawa lain. Pada amida_9 sama seperti dengan
senyawa amida_11 deskriptor yang memiliki nilai terbesar adalah Log
D, Harary index, Randic index, dan Molar refractivity.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
50
Untuk senyawa EPHS (etil p-hidroksi sinamat), peneliti mencoba
melihat pengaruh modifikasi pada gugus metoksi pada cincin benzene
EPMS, yaitu menggantinya dengan gugus hidroksi pada posisi para.
Terlihat bahwa hal ini mempengaruhi nilai energi HOMO dan energi
LUMO yang lebih kecil dari senyawa lainnya. Sedangkan untuk
deskriptor lainnya, nilainya tidak terlalu berbeda dengan deskriptor
senyawa lain. Tetapi peningkatan aktivitas pada EPHS tidak terlalu jauh
dengan MIC EPMS, sehingga perubahan gugus metoksi menjadi
hidroksi tidak terlalu berpengaruh pada aktivitas anti-tuberkulosis.
EPMS
EPHS
Amida_9
Amida_11
Gambar 4.2 Perbandingan Struktur EPMS, EPHS, Amida_9, dan Amida_11
Penelitian yang dilakukan oleh De et al., (2011), tentang desain,
sintesis, dan uji aktivitas anti-tuberkulosis senyawa turuan asam
sinamat baru, menyatakan bahwa gugus samping pada posisi para
cincin benzene asam sinamat berperan penting terhadap sifat lipofilitas
senyawanya. Sedangkan gugus samping karbonil asam sinamat, yang
pada penelitian ini digantikan oleh gugus amina, merupakan gugus
mirip obat (drug-like molecule) yang berperan penting dalam aktivitas
anti tuberkulosisnya. Berdasarkan hal itu, pada amida_9 dan amida_11
memiliki aktivitas yang baik kemungkinan karena adanya gugus
benzilamin dan dibenzilamin yang memiliki kemiripin dengan struktur
isoniazid.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
51
4.2 Penambatan molekuler
4.2.1 Penyiapan dan optimasi makromolekul enzim Inh A
Dalam proses penambatan molekul, hal yang harus disiapkan
adalah makromolekul dan ligan yang akan ditambatkan, kemudian
dilakukan optimasi terhadap makromolekul dan ligan tersebut.
Penyiapan makromolekul pada penelitian ini adalah dengan cara
mengunduh makromolekul enzim Inh A dalam 3D pada Protein Data
Bank (http://www.rcsb.org). Enzim Inh A yang di unduh dengan format
.pdb adalah makromolekul dengan kode 1ENY dan merupakan enzim Inh
A pada Mycobacterium tuberculosis yang diperoleh dari kristalografi
sinar X dengan resolusi 2,20 Å. Pemilihan kode 1ENY mengacu pada
penelitian sebelumnya yang telah dilakukan oleh Cohen et a.,(2011),
tentang penambatan molekul pada enzim Inh A.
Enzim Inh A yang telah diunduh kemudian dilakukan optimasi
makromolekul. Optimasi bertujuan untuk menghilangkan molekul non
standar dan menargetkan ruang tambat ligan pada makromolekul.
Molekul non standar seperti ligan dan molekul air yang ikut terunduh
dihilangkan dengan menggunakan program Discovery studio, dengan
cara, Pilih ScriptSelectionSelect water molecul dan ligandelete.
Dengan menghilangkan molekul air dan ligan, makromolekul nantinya
akan tepat menambat pada senyawa uji (ligan sampel). Enzim Inh A yang
telah teroptimasi dengan menggunakan program Discovery studio
kemudian di simpan dalam format .pdb.
Optimasi kedua yang dilakukan adalah penambahan atom hidrogen
dan penentuan grid box parameter menggunakan program Autodock
tools. Penambahan atom hidrogen penting untuk interaksi ligan dan
reseptor. Atom hidrogen yang diperhitungkan adalah yang bersifat polar,
karena atom ini terlibat dalam ikatan hidrogen (Yanuar, 2012). Proses
penambahan atom hidrogen adalah, pilih EditHydrogenAddOk.
Setelah dilakukan penambahan atom hidrogen, dilakukan optimasi
grid box parameter. Optimasi grid box parameter berfungsi untuk
membuat peta tiga dimensi interaksi protein dengan setiap jenis atom
yang terdapat pada ligan (Yanuar, 2012).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
52
Peta tiga dimensi tersebut merupakan ruang tambat antara
makromolekul dan ligan. Penentuan grid box parameter bisa melalui
pencarian literatur atau melihat ruang tambat ligan yang berasal dari
makromolekul itu sendiri.
Pada penelitian ini grid box parameter mengikuti penelitian yang
dilakukan oleh Cohen et al., (2011). Pengaturan pada grid box meliputi
center_x, center_y, center_z, untuk mengatur letak parameter box pada
makromolekul. Kemudian size_x, size_y, size_z, dan spacing (angstrom),
untuk menentukan ukuran grid box sebagai ruang tambat ligan tersebut.
Hasil pengaturan grid box yang diperoleh adalah center_x = -3.609,
center_y = 37.853 center_z = 18.312, size_x = 37, size_y = 22, size_z =
22, dan spacing (angstrom) = 0,375. Cara pengaturan grid box adalah
dengan
pilih
Gridgrid
boxatur
grid
box
parameter
yang
adafileclose saving current. Setelah semua optimasi selesai,
makromolekul tersebut di simpan dalam format .pdbqt, untuk selanjutnya
akan dilakukan proses penambatan molekul dengan program autodock
vina.
4.2.3 Penyiapan dan optimasi ligan (senyawa uji)
Ligan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 12 senyawa
amidasi etil p-metoksi sinamat dengan kontrol positifnya adalah isoniazid.
Senyawa yang digunakan dianggap sebagai bukan pro-drug, sehingga
tidak berikatan dengan NADH untuk berinteraksi dengan enzim Inh A.
Hal ini dikarenakan belum diketahui secara langsung bagaimana proses
senyawa amidasi EPMS berinteraksi dengan enzim Inh A. Sedangkan
telah diketahui, suatu senyawa yang berinteraksi dengan enzim Inh A
tidak selalu berikatan dengan NADH.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
53
Tabel 4.13 Senyawa ligan yang akan di-docking
No.
Nama Senyawa (IUPAC)
Kode
Senyawa
(2E)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide
1
Amida_1
(2E)-N-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide
2
Amida_2
(2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N-methylprop-2-enamide
3
Amida_3
(2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N,N-dimethylprop-2-enamide
4
Amida_4
(2E)-N-(hydroxymethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide
5
Amida_5
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
54
(2E)-N,N-bis(hydroxymethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2enamide
6
Amida_6
(2E)-N-(2-hydroxyethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide
7
Amida_7
(2E)-N,N-bis(2-hydroxyethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2enamide
8
Amida_8
(2E)-N-benzyl-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide
9
Amida_9
ethyl (2E)-3-(4-aminophenyl)prop-2-enoate
10
Amida_10
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
55
(2E)-N,N-dibenzyl-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide
11
amida_11
ethyl (2E)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate
12
EPHS
Isoniazid
13
INH
Senyawa tersebut dibuat dengan menggunakan aplikasi Marvin
sketch, setelah proses pembuatan selesai, struktur yang dibuat kemudian
dilakukan clean 3D, dengan cara, pilih structurepilih cleaning
method fine with hydrogenizeclean in 3D. Struktur kemudian
disimpan dalam format .mol. Untuk bisa dilakukan optimasi ligan
dengan
menggunakan
program
autodocktools,
maka
dilakukan
perubahan format .mol menjadi .pdb dengan menggunakan program
open babel.
Struktur dengan format .pdb kemudian dioptimasi number of active
torsion-nya. Proses ini berfungsi untuk menentukan ikatan-ikatan aktif
pada ligan yang dapat diputar selama proses docking berlangsung.
Proses pengoptimasian dengan cara, pilih ligandtorsion treeset
number of torsiondismiss. Kemudian di simpan dalam format .pdbqt,
dengan cara pilih ligandoutputsave as pdbqt.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
56
4.2.4 Penambatan molekul dengan Autodockvina
Setelah data makromolekul dan ligan selesai di optimasi dan di
ubah format file menjadi .pdbqt. Kedua data tersebut kemudian di
pindahkan ke dalam folder vina yang terdapat pada local disc (C:).
Dalam folder vina kemudian juga ditambahkan file konfigurasi
menggunakan notepad, proses konfigurasi dapat dilihat pada lampiran
3. Data konfigurasi pada notepad, meliputi reseptor yang merupakan
makromolekul yang digunakan yaitu 1ENY.pdbqt dan ligan yang
merupakan senyawa uji dengan format .pdbqt. Selanjutnya data
out.pdbqt merupakan hasil dari visualisasi docking ligan pada
makromolekul dan log.txt merupakan nilai energi bebas (ΔGbind) yang
akan keluar setelah proses docking selesai. Dan terakhir adalah data
center_x, center_y, center_z, size_x, size_y, dan size_z yang
merupakan grid box parameter yang sudah diatur sebelumnya. File
konfigurasi ini disimpan dengan nama ‘conf.txt.’
Setelah semua data yang ada difolder vina sudah lengkap, yaitu
1ENY.pdbqt, Ligand.pdbqt, dan conf.txt, maka proses docking dapat
dimulai. Proses docking dijalankan dengan program Command Prompt.
Melalui Command Prompt, masuk kedalam folder vina kemudian
dilakukan perintah dengan mengetik:
Vina --config conf.txt --log log.txt
Proses docking pada penelitian ini berjalan selama 2-5 menit,
kecepatan dari proses docking dipengaruhi oleh spesifikasi computer
dan bentuk ligan yang ditambatkan. Semakin tinggi spesifikasi atau
semakin sederhana bentuk ligan, maka semakin cepat proses docking
berlangsung. Setelah proses docking selesai, akan muncul data baru
pada folder vina, yaitu log.txt dan out.pdbqt. Data log.txt memberikan
hasil nilai afinitas/energi bebas (ΔGbind) dan RMSD dari hasil docking.
Sedangkan data out.pdbqt merupakan bentuk hasil konformasi
ligan dengan ruang tambatnya pada makromolekul. Data tersebut dapat
divisualisasi dengan program autodock tools, Pymol, dan Ligplot, untuk
dilihat interaksi ligan dengan asam amino pada makromolekul.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
57
4.2.5 Analisa dan Visualisasi Penambatan Molekuler
Hasil yang didapat dari proses penambatan molekuler adalah nilai
ΔGbind dan RMSD, serta visualisasi interaksi ligan dengan asam amino
pada enzim Inh A. Nilai ΔGbind merupakan energi konformasi hasil
docking antara ligan dan makromolekul, energi konformasi tersebut
merupakan kontribusi dari ikatan van der waal, hidrofobik, ikatan
hidrogen dari atom-atom netral, ikatan hidrogen atom-atom bermuatan,
dan jumlah ikatan berotasi (Adelin et al., 2013). Sedangkan RMSD
(root mean square deviation), merupakan nilai validasi dari hasil
ΔGbind, semakin kecil nilai RMSD maka konformasi yang terbentuk
semakin baik, sehingga nilai RMSD yang diambil adalah mendekati
atau sama dengan 0.
Interaksi ligan dan asam-asam amino pada enzim Inh A yang
terlihat melalui progam ligplot adalah adanya ikatan hidrogen dan
interaksi hidrofobik secara 2 dimensi, sedangkan pada program Pymol
visualisasi yang terlihat adalah tempat penambatan ligan pada
makromolekulnya yang disebut dengan binding pocket secara 3
dimensi. Proses visualisasi pada Ligplot adalah dengan cara membuka
file ligan hasil docking dan makromolekul dengan format .pdb, dengan
cara, filepdb filecari file yang akan divisualisasiOkRun.
Kemudian, visualisasi pada pymol dengan cara membuka file ligan
out.pdbqt dan makromolekul (1ENY.pdbqt). Prosesnya dengan cara
pilih openpilih file out.pbqt dan 1ENY.pdbqtok, dan untuk
melihat daerah binding pocket ligan dengan makromolekul dengan
cara allactionpresetligand sitepilih tampilan yang diinginkan
(misalkan, solid better)klik kiri. Hasil visualisasi dengan program
Ligplot dan Pymol dapat dilihat pada Lampiran 4.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
58
Tabel 4.14 Hasil Penambatan molekuler
Struktur
∆Gbind
Ikatan Hidrogen
Amida_11
-9.4
Gly96
Amida_9
-8.4
Thr39
Amida_2
Amida_7
Amida_5
-7.2
-7.1
-6.9
Thr39, Gly14
Gly14, Ala22, Ser94
Ile21, Ala22, ser94
Amida_3
-6.7
Thr39
Amida_1
-6.6
Thr39, Gly14
Amida_4
-6.6
Thr39
Amida_8
-6.5
Gly14, Ala22, Ser94
Amida_6
-6.4
Amida_10
EPHS
Isoniazid
Jenis asam amino
Ikatan Hidrofobik
Thr39, Val65, Gly14, Ala198, Ser13, Leu63, Ile95,
Asp42, Ile15, Phe41, Ile47, Ile16
Leu63, Gly14, Ser13, Ile95, Val65, Phe97, Gly96,
Asp42, Ile15, Ile16, Phe41, Met130
Phe97, Phe41, Ser13,Ile95, Leu63, Ile122
Phe41, Val65, Gly96, Ile16, Ser20, Ile21, Ile95, Asp64
Asp64, Ile95, Gly96, Ile16, Ser20, Gly14, Phe41
Leu63, Val65, Phe41, Phe97, Gly96, Ile95, Ser13,
Gly14, Met130
Phe97, Phe41, Ser13,Ile95, Leu63, Ile122
Ser13, Gly14, Leu63, Phe41, Ile16, Ile95, Val65, Met130
Ile95, Ile122, Gly96, Ile16, Ser20, Thr196, Ile21, Phe41,
Val65
-6.1
Gly14, Ala22, Ser94,
Ile21, Gly96
Thr39
Ile95, Leu63, Phe41, Phe97, Gly14, Val65
-6.1
-6
Thr39
Thr39, Gly14
Gly14, Phe41, Phe97, Val65, Ile95, Leu63
Ile22, Ser13, Gly40, Ile95, Leu63, Phe41, Val65
Ile16, Phe41, Ile95, Ser20, Ile15, Asp42
Dari tabel 4.14 nilai ∆Gbind tiga senyawa terkecil adalah senyawa
dengan kode Amida_11, Amida_9, dan Amida_2, dengan nilai energi
-9,4 kcal/mol, -8,4 kcal/mol, dan -7,2 kcal/mol. Nilai ∆Gbind kecil
menandakan bahwa konformasi yang terbentuk antara ligan dengan
makromolekul merupakan kompleks yang stabil. Selain itu, bisa dilihat
bahwa isoniazid yang merupakan kontrol positif pada docking memilki
nilai ∆Gbind besar yaitu -6, hal ini membuktikan bahwa isoniazid
memang harus berikatan dengan NADH untuk membentuk konformasi
yang stabil dengan enzim Inh A.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
59
Senyawa
Visualisasi Ligplot
Visualisasi Pymol
INH
Amida_11
Amida_9
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
60
Amida_2
Keterangan:
C=hitam,
O=Merah,
N=biru, ikatan hidrogen=garis hijau,
Keterangan: C=hijau, O=merah, N=biru,
H=putih, P=jingga
dan ikatan hidrofobik= garis merah
menyerupai alis
Gambar 4.3 Visualisasi interaksi Makromolekul dan Ligan (Isoniazid dan 3
senyawa uji dengan ∆Gbind terendah)
Dilihat dari residu asam amino yang berinteraksi, isoniazid
berikatan hidrogen dengan Thr39 dan Gly14, sedangkan untuk yang
berikatan hidrofobik adalah dengan asam amino Ile22, Ser13, Gly40,
Ile95, Leu63, Phe41, Val65.
Selanjutnya pada 3 senyawa dengan ∆Gbind terendah. Amida_11
dan Amida_9 memilki jumlah residu asam amino yang sama yaitu 13
asam amino dan lebih banyak dari amida_2. Amida_11 berikatan
hidrogen dengan Gly96, dan berikatan hidrofobik dengan Thr39, Val65,
Gly14, Ala198, Ser13, Leu63, Ile95, Asp42, Ile15, Phe41, Ile47, Ile16.
Amida_9 berikatan hidrogen dengan Thr39, dan berikatan hidrofobik
dengan Leu63, Gly14, Ser13, Ile95, Val65, Phe97, Gly96, Asp42, Ile15,
Ile16, Phe41, Met130. Sedangkan pada Amida_2 hanya berikatan
dengan 8 asam amino, yaitu Thr39 dan Gly14 yang berikatan hidrogen,
serta Phe97, Phe41, Ser13,Ile95, Leu63, Ile122 yang berikatan
hidrofobik.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
61
Ikatan hidrogen merupakan ikatan antara atom H yang mempunyai
muatan positif parsial dengan atom lain yang bersifat elektronegatifan
dan mempunyai sepasang oktet lengkap, seperti O, N, dan F. Adanya
ikatan hidrogen dapat mempengaruhi sifat fisika kimia obat, sehingga
berperan penting terhadap aktivitas biologis obat.
Sedangkan ikatan hidrofobik adalah ikatan yang menggambungkan
daerah non polar molekul obat dengan daerah non polar pada reseptor
biologis (Siswando, 2008). Oleh karena itu, ikatan hidrogen dan ikatan
hidrofobik mempengaruhi kestabilan konformasi yang terjadi antara
ligan dan makromolekul. Dari hasil penelitian yang dilakukan oleh
Eghdami, et al (2015) tentang target ikatan isoniazid dengan enzim Inh
A, menyatakan bahwa situs aktivitas enzim Inh A, dicirikan dengan
adanya 5 asam amino, yaitu G1y14, Thr39, Phe41, Leu63 and Ile95.
Berdasarkan hal tersebut, Senyawa dengan nilai ∆Gbind terendah yaitu
amida_11 telah tepat menambat pada binding pocket enzim Inh A untuk
memberikan aktivitas anti-tuberkulosis.
Tabel 4.15 Perbanding ∆Gbind dan MIC prediksi
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Struktur
Amida_11
Amida_9
Amida_2
Amida_7
Amida_5
Amida_3
Amida_1
Amida_4
Amida_8
Amida_6
Amida_10
EPHS
Penambatan
molekuler
∆Gbind (Kcal/mol)
-9.4
-8.4
-7.2
-7.1
-6.9
-6.7
-6.6
-6.6
-6.5
-6.4
-6.1
-6.1
HKSA
MIC prediksi (μM)
0.008
8.249
601.082
8619.5
4519.21
3856.26
3530.95
2518.77
18581.1
7410.95
4587.2
292.434
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
62
Dari tabel 4.15 terlihat bahwa senyawa dengan kode amida_11
selain memiliki nilai ∆Gbind terendah (-9,4 Kcal/mol), juga memiliki
MIC prediksi terkecil yaitu 0,008 μM. Diketahui bahwa MIC Isoniazid
yang merupakan pengobatan lini pertama tuberkulosis adalah 0,03–0,06
μg/ml (Zhang et al, 2005), bila dikonversikan dalam satuan molar yaitu
membagi dengan berat molekulnya (137,14 g/mol) (Depkes, 1995),
maka didapat MIC isoniazid adalah 0,219-0,438 μM. Berdasarkan hal
tersebut, nilai MIC prediksi amida_11 memiliki aktivitas sekitar 100
kali lebih baik dari isoniazid.
Walaupun MIC prediksi amida_11 lebih kecil dari isoniazid, nilai
tersebut hanya didapat dari perhitungan aktivitas senyawa yang
dibandingkan dengan sifat fisika-kimianya, sehingga perlu dilakukan uji
selanjutnya, seperti uji in-vitro senyawa dengan kode amida_11 pada
Mycobacterium tuberculosis langsung. Karena tujuan dari penggunaan
model HKSA adalah proses awal dalam rancangan obat dalam usaha
mendapatkan suatu obat baru dengan aktivitas yang lebih besar,
keselektifan yang lebih tinggi, toksisitas atau efek samping sekecil
mungkin dan kenyamanan yang lebih besar, dengan biaya yang lebih
ekonomis, waktu yang lebih singkat, dan dapat menekan faktor cobacoba sekecil mungkin dalam sintesis kandidat senyawa uji, sehingga
jalur sintesis menjadi lebih pendek (Siswandono, 2008).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
a.
Hasil analisa hubungan kuantitatif struktur-aktivitas (HKSA) pendekatan
Hansch, deskriptor yang mempengaruhi aktivitas anti-tuberkulosis adalah
LogD, energi HOMO, energi LUMO, Randic Index, Harary Index, dan
Molar refractitvity. Dengan persamaan:
Log(1/MIC) = -18.7 + 0.298(logD) -1.22(Energi HOMO) - 2.812(Energi
LUMO) + 0.034(Harary Index) - 1.106(Randic Index) + 0.243(Molar
Refractivity).
b. Hasil penambatan molekuler dan persamaan HKSA, senyawa dengan
kode amida_11 yaitu ((2E)-N,N-dibenzyl-3-(4- methoxyphenyl)prop-2enamide) memiliki nilai ΔGbind terendah yaitu, -9,4 dengan MIC prediksi
0,008 μM.
5.2 Saran
Hasil data aktivitas anti-tuberkulosis (MIC) yang didapat merupakan nilai
prediksi yang dilihat dari sifat fisika-kimia senyawa dan penambatan
molekuler pada enzim Inh A Mycobacterium tuberculosis. Sehingga
dibutuhkan pengujian lebih lanjut seperti uji in-vitro dan in-vivo terhadap
senyawa Amidasi EPMS dengan aktivitas anti-tuberkulosis terbaik.
63
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR PUSTAKA
Accelrys Enterprise Platform. (2005). Introduction to the Discovery Studio
Visualizer. San Diego, California, U.S.A: Accelrys Software Inc
Adelin, et al (2013). Penambatan molekuler kurkumin dan analognya pada enzim
Siklooksigenase-2. Jurnal Medika Veterinaria. Vol. 7, No. 1, Februari
2013
Barus, rosbiana. (2009).
Amidasi Etil p-metoksisinamat yang diisolasi dari
Kencur (Kaempheria Galanga, Linn),USU Repository
Bultink, P., Winter, H. D., Langenaeker, W. dan Tollenaere, J. P., 2004,
Computational Medicinal Chemistry for Drug Discovery, Marcel Dekker,
Inc., New York
Chemaxon, (2014) Log P and Log D Calculation. ChemAxon docs.
https://docs.chemaxon.com/display/CALCPLUGS/LogP+and+logD+calcu
lations
Cohen et al. (2011). Effect of the explicit flexibility of the InhA enzyme from
Mycobacterium tuberculosis in molecular docking simulations. BMC
Genomic. Ouro Preto, Brazil
Darmin Sumardjo. 2008. Pengantar Kimia. Jakarta: EGC.
Dash, Pritesh Ranjan , et al. (2014). In vivo cytotoxic and In vitro antibacterial
activities of Kaempferia galangal.
Journal of Pharmacognosy and
Phytochemistry 2014; 3 (1): 172-177
DBM, Virupakshaiah, et al. In Silico Designing of Methicillin Antibiotic Analog
for The Treatment of Staphylococcus aureus. Journal of Advanced
Bioinformatics Applications and Research ISSN 0976-2604.Online ISSN
2278–6007 Vol 5, Issue1, 2014, pp33-36
De, et al (2011). Design, Synthesis, and Biological Evaluation of New Cinnamic
Derivatives as Antituberculosis Agents. Journal of medicinal chemistry.
France
DeLano, W. L., & Bromberg, S. (2004). PyMOL User's Guide. San Carlos,
California, U.S.A: DeLano Scientific LLC.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia (1995), Farmakope Indonesia. Edisi
IV. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan.
64
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
65
Depkes RI. (2005). Pharmaceutical Care untuk Penyakit Tuberkulosis. Direktorat
Bina Farmasi Kominitas dan Klinik: Jakarta.
Depkes RI. (2011). Pedoman Nasional Pengendalian Tuberkulosis, Edisi 2
Cetakan Tahun 2011: Jakarta.
Eghdami, et al (2015). Investigation of Physicochemical Properties of Isoniazid
and
its
Target
Protein-Ligand
Docking.
Biological
Forum–An
International Journal 7(1): 1248-1255(2015).
Fatimah, Nur Fitri. (2008). Aplikasi Metode MLR dan PCR pada Analisis
Hubungan Kuantitatif Struktutr dan Aktivitas Antitoksoplasma Senyawa
Turunan Kuinolon Berdasarkan Deskriptor Teoritik. Jurusan Kimia
FMIPA UGM: Yogyakarta.
Fessenden, R. J., Fessenden, J. S. (1999), Kimia Organik, Jilid 1, Edisi ketiga,
Penerbit Erlangga, Jakarta.
Funkhouser, T. (2007). Protein-Ligand Docking Methods. Princeton, New Jersey,
U.S.A: Princeton University.
Goodman and Gilman. (2005). Dasar Farmakologi Terapi Edisi 10. Jakarta: EGC
Gusmita, W., Mustafa, D., & Emdeniz. (2013). Studi Toksisitas Nitro Anilin
Berdasarkan Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA) Toksis
Amina Aromatik. Jurnal Kimia Unand (ISSN No. 2303-3401), Volume 2
Nomor 1, Maret 2011.
Guzman, et al, (2014). 2-Hydroxy-substituted cinnamic acids and acetanilides are
selective growth inhibitors of Mycobacterium tuberculosis. Med. Chem.
Commun., 2014, 5, 47.
Pranowo, Harno D. 2009. Peran Kimia Komputasi dalam Desain Molekul Obat.
Yogyakarta : Universitas Gadjah Mada.
He, xin, et al. (2007). Inhibition of the Mycobacterium tuberculosis enoyl acyl
carrier protein reductase InhA by arylamides. Bioorg. Med. Chem. 15
(2007) 6649–6658.
Katritzky, A.R., Karelson, M., dan Lobanov, V.S., 1996, Quantum-Chemical
Descriptors in QSAR/QSPR Studies, J. Am. Chem. Soc. 96, 3, 1027 -1044.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
66
Katzung, Bertram G. (2004) Farmakologi Dasar dan Klinik edisi 4. Alih bahasa :
Staf Dosen Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya.
Jakarta : EGC.
Kolyva, A.S., Karakousis, P.C. (2012). Old and New TB Drugs: Mechanisms of
Action and Resistance . USA: Johns Hopkins University Center for
Tuberculosis Research Baltimore, M.D.,
Kubinyi, H. (1993). QSAR: Hancsh Analysis and Related Approaches, VCH
Verlaggesellschaft, Wienhem.
Lakshmanan et al, (2011). Ethyl pmethoxycinnamate isolated from a traditional
anti-tuberculosis medicinal herb inhibits drug resistant strains of
Mycobacterium tuberculosis in vitro. Fitoterapia. In Press, Corrected
Proof.
Mukesh, B., & Rakesh, K. (2011). Molecular Docking : A Review. IJRAP.
Nofriyanda. (2010). Analisis Molekuler Pada Proses Resistensi Mikrobakterium
tuberculosis terhadap Obat-Obat Anti Tuberkulosis. Bagian Pulmonologi
dan Ilmu Kedokteran Respirasi FK UNAND dan RS.DR.M.DJAMIL
PADANG.
Patrick, G. (2001). Instant Notes in Medicinal Chemistry. Oxford: BIOS Scientific
Publisher.
Poeloengan, M, I. Komala and S.M. Noor ( 2007). Bahaya dan Penanganan
Tuberculosis.Lokakarya Nasional Zoonosis . Balai Penelitian Veteriner
Bogor.
Rifai, et al. (2014). Kajian HKSA Senyawa Turunan Deoksibenzoin terhadap
Aktivitas Antioksidan Menggunakan Analisis Regresi Multilinier. Indo. J.
Chem. Sci. 3 (3) (2014) Indonesian Journal of Chemical Science.
Robitzek, E. H. and I. J. Selikoff (1952). "Hydrazine derivatives of isonicotinic
acid (rimifon marsilid) in the treatment of active progressive caseouspneumonic tuberculosis; a preliminary report." Am Rev Tuberc 65(4):
402-428.
Siswandono, (2008). Kimia Medisinal edisi 2 cetakan 2 jilid 1. Surabaya:
Airlangga University Press.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
67
Techaprasan J, Klinbunga S, Ngamriabsakul C, Jenjittikul T (2010). Genetic
variation of Kaempferia (Zingiberaceae) in Thailand based on chloroplast
DNA (psbA-trnH and petA-psbJ) sequences. Genet. Mol. Res., 9: 19571973.
Todeschini et al.,(2009) Molecular descriptor for Cheminformatics. Volume I &
II. Wiley-VCH
Umar, et al. (2011) Phytochemistry and medicinal properties of Kaempferia
galanga L. (Zingiberaceae) extracts African Journal of Pharmacy and
Pharmacology Vol. 5(14), pp. 1638-1647, 15 October, 2011.
WHO,2015,
Health
Topics
Tuberculosis
http://www.who.int/topics/tuberculosis/en/.
Yanuar, Arry. 2012. Penambatan molekular: Praktek dan Aplikasi Virtual
Screening. Depok: Fakultas Farmasi UI.
Zhang, Y.et al. ( 2005 ). Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium
tuberculosis. In Tuberculosis and the Tubercle Bacillus, 2nd edn, pp. 115–
140. Edited by S. T. Cole and others. Washington, DC: American Society
for Microbiology.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN
Lampiran 1. Alur Penelitian
1.1 Hubungan Kuantitatif Struktur Aktivitas Model Pendekatan Hansch
Pencarian literatur data anti-tb (MIC)
turunan asam sinamat beserta
strukturnya (Data sets)
Training sets
Pemilihan dan Perhitungan
deskriptor
Membangun
persamaan HKSA
Struktur senyawa
amidasi EPMS
Test sets
Pemilihan dan
Perhitungan deskriptor
Pemilihan dan
Perhitungan
deskriptor
Validasi Persamaan
HKSA
Persamaan HKSA
Prediksi aktivitas anti-tb senyawa
amidasi Etil p-Metoksisinamat
68
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
69
1.2 Penambatan Molekul
Penyiapan struktur molekul enzim InhA, dengan
v
mengunduh struktur dari Bank Data Protein
(http://www.rcsb.org/pdb/).
Penyiapan struktur ligan. Ligan yang
digunakan adalah struktur senyawa
amidasi EPMS. Struktur 3D dibuat dengan
program MarvinSketch, simpan dalam
format .pdb
Output berupa file 1ENY.pdb
Pemisahan dari pelarut dan ligan atau residu non
standar dengan Discovery Studio 4.0 Visualizer.
Output berupa file ligan.pdb
Pemisahan dari pelarut dan ligan atau residu non
standar dengan Discovery Studio 4.0 Visualizer.
Output berupa file 1ENY.pdb
Pengoptimasian dengan Autodock
Tools, yaitu pengaturan number of
active torsion.
Pengoptimasian dengan Autodock Tools yang
meliputi : penambahan atom hidrogen dan
pengaturan grid box parameter.
Output berupa file ligan.pdbqt
Output berupa file 1ENY.pdbqt
Penambatan molekul dengan program autodock vina
Analisis hasil pada nilai log.txt dan visualisasi hasil pada out.pdbqt dengan program Pymol serta
Ligplot
Output berupa nilai:
1.
Pose: Posisi dan Orientasi Ligan terhadap Asam Amino Protein
2. ΔGbind
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
70
Lampiran 2 Prosedur Kerja HKSA
2.1 Pembuatan struktur pada marvin sketch
Setelah struktur dibuat, kemudian dilakukan clean 3D dengan cara: pilih
structureclaening methodfine with HydrogenizeClean in 3D
2.2 Perhitungan deskriptor Log D
Proses perhitungan dengan pilih toolspartitioningLogDklik kiri. Akan didapat hasil
seperti gambar diatas, kemudian pilih nilai Log D pada pH 7,4
2.3 perhitungan deskriptor Harary dan Randic index
Pilih toolsGeometryTopology Analysisklik kiriOk. Akan muncul hasil nilai
Randic dan Harary index (lingkaran merah) seperti pada gambar diatas
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
71
2.4 Pembuatan struktur pada Hyperchem
Struktur yang telah dibuat kemudian ditambahkan atom hidrogen dengan cara:
buildadd H & model buildklik kiri
2.5 Optimasi struktur pada Hyperchem
optimasi dengan cara pilih setupsemiempiricalklik kirikemudian pilih AM1Ok
2.6 Perhitungan deskriptor energi HOMO dan LUMO
Pilih computeGeometry Optimizationklik kiriPilih pada semiempirical
optimization “Polak Ribere” Ok
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
72
Setelah optimasi selesai pilih computeOrbitalsklik kiripilih energi HOMO
dan LUMO
2.7 Perhitungan deskriptor momen dipole
Pilih computesingle pointproperties akan didapat tampilan diataspilih momen
dipoleok
2.8 Perhitungan deskriptor Molar refractivity
Pilih computeQSAR propertiesPilih RefractivityComputeAkan didapat
nilai Molar refractivity
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
73
2.9 Rekapitulasi Data Deskriptor Training dan Test sets pada Microsoft excel
2.10 Membangun persamaan HKSA
Setelah semua data training set telah di input ke dalam program SPSS, kemudian pilih
analyzeRegressionLinierakan muncul tampilan pada gambar disamping.
Masukkan data dependent variabel: Log(1/MIC) dan Independent variabel:7 data
deskriptorganti method: BackwardOk
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
74
2.11 Hasil Validasi HKSA pada SPSS
Variables Entered/Removed
b
Variables
Model
1
Entered
Variables Removed
Method
Molar_Refractivit
y, MomenDipole,
LogD, E_LUMO,
. Enter
E_HOMO,
Harary_Index,
a
Randix_Index
2
Backward (criterion: Probability of F-to-remove >=
. MomenDipole
3
.100).
Backward (criterion: Probability of F-to-remove >=
. Harary_Index
.100).
a. Tolerance = .000 limits reached.
b. Dependent Variable: Log(1/MIC)
Model Summary
Model
R
Adjusted R
Std. Error of the
Square
Estimate
R Square
1
.994
a
.988
.908
.083051
2
.992
b
.985
.938
.067998
3
.988
c
.976
.937
.068409
a. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, MomenDipole, LogD,
E_LUMO, E_HOMO, Harary_Index, Randix_Index
b. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, LogD, E_LUMO,
E_HOMO, Harary_Index, Randix_Index
c. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, LogD, E_LUMO,
E_HOMO, Randix_Index
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
75
d
ANOVA
Model
1
2
3
Sum of Squares
df
Mean Square
Fhitung
Regression
.590
7
.084
Residual
.007
1
.007
Total
.597
8
Regression
.588
6
.098
Residual
.009
2
.005
Total
.597
8
Regression
.583
5
.117
Residual
.014
3
.005
Total
.597
8
Sig.
12.218
.217
a
21.179
.046
b
24.906
.012
c
a. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, MomenDipole, LogD, E_LUMO, E_HOMO,
Harary_Index, Randix_Index
b. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, LogD, E_LUMO, E_HOMO, Harary_Index,
Randix_Index
c. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, LogD, E_LUMO, E_HOMO, Randix_Index
d. Dependent Variable: Log(1/MIC)
Coefficients
a
Standardized
Unstandardized Coefficients
Model
1
B
(Constant)
Coefficients
Std. Error
Beta
-14.130
8.466
.251
.094
E_HOMO
-.693
E_LUMO
t
Sig.
-1.669
.344
1.278
2.677
.228
.955
-.535
-.726
.600
-3.027
.793
-.871
-3.817
.163
MomenDipole
-.068
.116
-.320
-.584
.664
Harary_Index
.044
.044
2.104
.992
.503
Randix_Index
-1.364
.569
-18.640
-2.398
.252
.294
.122
17.387
2.400
.251
LogD
Molar_Refractivity
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
76
2
(Constant)
-18.700
2.637
-7.092
.019
.298
.039
1.518
7.655
.017
E_HOMO
-1.220
.253
-.943
-4.832
.040
E_LUMO
-2.812
.575
-.809
-4.890
.039
Harary_Index
.034
.034
1.637
1.018
.416
Randix_Index
-1.106
.292
-15.108
-3.781
.063
.243
.070
14.353
3.475
.074
-19.106
2.622
-7.286
.005
.302
.039
1.543
7.789
.004
E_HOMO
-1.226
.254
-.947
-4.824
.017
E_LUMO
-2.828
.578
-.814
-4.889
.016
Randix_Index
-1.083
.293
-14.804
-3.693
.034
0.265
.067
15.681
3.978
.028
LogD
Molar_Refractivity
3
(Constant)
LogD
Molar_Refractivity
2.12 Nilai Ftabel
Nilai Ftabel model persamaan 1 (lingkaran merah), nilai Ftabel model persamaan 2
(lingkaran biru), dan nilai Ftabel model persamaan 3 (lingkaran hijau)
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
77
2.13 Perhitungan Log(1/MIC)prediksi dengan Microsoft Excel
Pada cell K3, ketik persamaan HKSA yang sudah tervalidasi (persamaan HKSA 2)
seperti pada lingkaran warna merahUbah deskriptor yang digunakan sesuai letak cellnyakemudian enterdrag kebawah cell K3 untuk melihat data Log(1/MIC)prediksi
senyawa lain
Lampiran 3. Prosedur Penambatan Molekuler
3.1 Penyiapan Makromolekul Enzim Inh
Enzim Inh A di unduh dari situs http://www.rcsb.org/pdb/, dengan kode 1ENY. Data
enzim yang di dunduh adalah dalam bentuk 3D dengan format .pdb.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
78
3.2 Proses penghilangan molekul non standar pada Makromolekul
dengan Discovery studio
Pilih scriptselectionSelect water molecule dan Select ligandeletesave as
1ENY.pdb
3.3 Optimasi penambahan atom hidrogen pada makromolekul dengan
Autodock tools
Pilih
editHydrogenAddall
hydrogenOk
3.4 Optimasi Grid Box parameter makromolekul
Pilih GridMacromolecule
Choose pilih 1ENYselect
moleculeSave as
1ENY.pdbqt
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
79
Kemudian atur grid option sesuai pada gambar di
sampingpilih fileClose saving current
3.5 Konversi format ligan (sampel uji) menjadi .pdb dengan Open Babel
Pada ‘input format’ pilih ‘…’ kemudian dipilih ligan yang akan digunakan. Pada ‘output
format’, pilih ‘…’ kemudian pilih destinasi tempat menyimpan. Pastikan format dalam
bentuk .pdb. Klik ‘Convert’
3.6 Optimasi number of active torsion pada ligan dengan program Autodock
tools
pilih ligandinputopenpilih ligan yang akan dioptimasiTorsion treeSet number
of torsionpilih fewest atomsdismisssave as .pdbqt
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
80
3.7 Penambatan molekul dengan Autodock vina
Proses penambatan molekul dimulai dengan menyalin data ligan.pdbqt dan
makromolekul 1ENY.pdbqt yang telah di optimasi pada folder vina di Local Disc (C:).
Kemudian ditambah data config file (conf.txt) dengan notepad, pengaturan conf.txt sesuai
pengaturan gridbox parameter
3.8 Proses penambatan dengan menggunakan Command prompt
Masuk kedalam folder vina cd “C:\vina” enterketik: vina -–config conf.txt -–log
log.txtenter.
3.9 Hasil penambatan molekuler
Akan muncul file baru log.txt dan out.pdbqt. Log.txt merupakan hasil nilai ∆Gbind dan
out.pdbqt visualisasi hasil docking ligan dengan makromolekul
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
81
Lampiran 4. Hasil penambatan molekul dan visualisasinya
1. Isoniazid
Ligplot
2. Amida_11
Ligplot
3. Amida_9
Ligplot
Pymol
Nilai RMSD
Pymol
Nilai RMSD
Pymol
Nilai RMSD
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
82
4. Amida_2
Ligplot
Pymol
Nilai RMSD
5. Amida_7
Ligplot
Pymol
Nilai RMSD
Pymol
Nilai RMSD
6. Amida_5
Ligplot
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
83
7. Amida_3
Ligplot
8. Amida_1
Ligplot
9. Amida_4
Ligplot
Pymol
Nilai RMSD
Pymol
Pymol
Nilai RMSD
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
84
10. Amida_8
Ligplot
11. Amida_6
Ligplot
12. Amida_10
Ligplot
Pymol
Pymol
Pymol
Nilai RMSD
Nilai RMSD
Nilai RMSD
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
85
13. EPHS
Ligplot
Pymol
Nilai RMSD
Keterangan: C=hitam, O=Merah, Keterangan: C=hijau, O=merah,
N=biru,
ikatan
hidrogen=garis N=biru, H=putih, P=jingga
hijau, dan ikatan hidrofobik=
garis merah menyerupai alis
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta