Sinergisitas efek sitotoksik kombinasi arekolin dan doxorubicin pada
advertisement
Majalah Farmasi Indonesia, 22(4), 265 – 272, 2011 Sinergisitas efek sitotoksik kombinasi arekolin dan doxorubicin pada sel kanker serviks HeLa Sinergisitas efek sitotoksik kombinasi doxorubicin pada sel kanker serviks HeLa arekolin dan Astrid Ayu Maruti, Rahmi Khamsita, Suven, Dyaningtyas Dewi Pamungkas Putri dan Edy Meiyanto* Cancer Chemoprevention Research Center Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Abstrak Arekolin, alkaloid utama tumbuhan pinang (Areca cathecu L) telah terbukti memiliki aktivitas sitotoksik pada berbagai jenis sel kanker. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari aktivitas sitotoksik arekolin tunggal dan kombinasi arekolin dengan doxorubicin pada sel kanker serviks HeLa. Pada perlakuan tunggal, arekolin di inkubasi pada kultur sel HeLa dalam berbagai konsentrasi, diikuti dengan pemaparan kombinasi arekolin dengan doxorubicin. Viabilitas sel sebagai parameter diukur dengan metode MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazolium bromide) assay. Efek induksi apoptosis diamati dengan metode pengecatan double staining menggunakan etidium bromida-akridin oranye. Arekolin tidak menunjukkan aktivitas sitotoksik yang poten terhadap sel HeLa karena memiliki nilai IC50 sebesar 462µM. Kombinasi arekolin dan doxorubicin menunjukkan sinergisitas dengan nilai IK optimum 0,48 yaitu pada pemberian 30µM arekolin dikombinasikan dengan doxorubicin 125nM. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa arekolin berpotensi untuk dikembangkan sebagai agen ko-kemoterapi pada kanker serviks. Walaupun demikian, diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai mekanisme molekularnya. Kata kunci: arekolin, sinergisitas, doxorubicin, metode MTT, sel HeLa Abstract Arecoline, the main alcaloid of Areca cathecu L has been proven to posses cytotoxic activity against various cancer cell lines. The research conducted to examine the cytotoxic activity of arecoline alone and its combination with doxorubicin against HeLa cervical cancer cell line. Single treatment of arecoline in various concentration on HeLa cancer cell were done followed by the combinational treatment with doxorubicin. The cell viability as the parameter of cytotoxicity was measured using MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difeniltetrazolium bromide) assay. The apoptotic effect was examined by double staining assay using etidium bromide – acridin orange. Arecoline did not show potent cytotoxicity effect against HeLa since the value of IC50 is 462µM. The combinational treatment of arecoline and doxorubicin showed synergicity with the optimum CI value is 0,48 given by the treatment of 30mM arecoline combined with 125 nM doxorubicin. The result of this study shows that arecoline has potential to be proposed as co-chemotherapeutic agent for cervical cancer. However, further study on its molecular mechanism needs to be conducted. Key words : arecoline, synergicity, doxorubicin, MTT assay, HeLa cell line Pendahuluan Arekolin dengan rumus molekul C8H13NO2 merupakan alkaloid utama dari buah pinang (Areca catechu L). Beberapa penelitian in vitro menunjukkan arekolin Majalah Farmasi Indonesia, 22(4) memiliki aktivitas sitotoksik pada sel kanker oral dan sel kanker hati serta merangsang apoptosis pada sel kanker basal (Chang, et al., 2001 and Cheng, et al., 2007). Berdasarkan penelitian tersebut, arekolin menunjukkan 265 Sinergisitas efek sitotoksik kombinasi………… prospek yang menjanji-kan untuk dalam terapi kanker. Salah satu jenis kanker dengan prevalensi terbesar adalah kanker serviks atau kanker leher rahim. Kanker leher rahim merupakan penyebab kematian yang terbesar pada wanita di negara-negara berkembang, bahkan tiap tahunnya sekitar seperempat juta wanita meninggal karena penyakit ini (Gracia, 2007). Di Indonesia, insidensi kanker serviks mencapai 13.762 kasus atau 8,8% dari total penderita kanker (IARC, 2008). Kondisi ini menunjukkan bahwa diperlukan pengembangan terhadap terapi kanker serviks. Arekolin merupakan salah satu senyawa yang menjanjikan untuk diteliti lebih lanjut dalam usaha pencarian agen terapi bagi kanker serviks. Senyawa ini menghambat daur sel pada KB cell line, sel kanker epitelial mulut, melalui pembentukan reactive oxygen species dan perubahan potensial membran mitokondria. Pada penelitian lain, arekolin dilaporkan menurunkan produksi interleukin-6 dan menghambat fosforilasi STAT3 sehingga produksi protein Bcl-XL dan Bcl-2 menurun (Chang, et al., 2004). Selain itu, arekolin juga terbukti menginduksi apoptosis dengan meningkatkan ekspresi p53, meningkatkan aktivitas caspase 3, dan menginduksi pelepasan sitokrom c oleh mitokondria pada sel hepatoma HA22T/VGH (Cheng, et al., 2007). Sehingga dimungkinkan arekolin juga bersifat sitotoksik dan mampu menginduksi apoptosis pada sel kanker serviks HeLa. Pada penelitian ini dilakukan pengamatan dampak pemberian arekolin terhadap sel kanker serviks HeLa. Selain sitotoksisitas arekolin terhadap sel kanker HeLa, juga dilakukan pengamatan dampak pemberian arekolin terhadap aktivitas doxorubicin, suatu agen kemoterapi yang digunakan pada pengobatan kanker serviks. Perlakuan kombinasi ini merupakan suatu usaha untuk mencari agen kokemoterapi yang sesuai bagi doxorubicin sebab penggunaan doxorubicin tunggal sebagai agen terapi menimbulkan efek samping yang besar bagi pasien, antara lain nausea, kerontokan rambut, serta kerusakan jaringan tubuh. Penggunaan agen ko-kemoterapi mampu menurunkan resistensi terhadap doxorubicin dan meningkatkan aktivitasnya sehingga dosis 266 doxorubicin yang diperlukan dapat diturunkan dan efek samping tersebut dapat ditekan. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi dasar pengembangan arekolin sebagai agen kokemoterapi dalam pengobatan kanker leher rahim. Metodologi Bahan Bahan uji utama yaitu Arekolin hidrobromida (VETRANAL® Sigma Aldrich No. Katalog 46063) diperoleh dari Warista, Yogyakarta. Agen kemoterapi doxorubicin dalam bentuk injeksi dengan konsentrasi 50 mg/25 mL (Kalbe Farma) diperoleh dari Rumah Sakit Dr. Sardjito Yogyakarta. Sel kanker serviks HeLa koleksi Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC) UGM diperoleh dari Prof. Takeya, Nara Institute of Science and Technology (NAIST), Jepang. Sel dikultur dalam media kultur DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (Gibco) yang mengandung Fungison 0,5% (Gibco), Fetal Bovine Serum (FBS) 10% (Gibco), penisilin-streptomisin 1% (Gibco), dan Tripsin EDTA 2,5% (Gibco). DMSO (Dimethyl Sulfoxide) (Sigma) digunakan untuk melarutkan senyawa uji. Reagen MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolium bromida] (Sigma), dengan konsentrasi 5 mg/mL. Reagen stopper yang digunakan adalah SDS 10% dalam 0,1N HCl. Etidium bromida-akridin oranye untuk mewarnai sel pada uji double staining. Selain bahan-bahan di atas juga digunakan 2,5% tripsin-EDTA (Gibco) untuk melepas sel yang melekat pada flask maupun plate dan PBS yang digunakan untuk mencuci sel. Bahan–bahan yang digunakan selama penelitian apabila tidak dikatakan lain berarti berderajat proanalisis. Prosedur penelitian Kultur Sel Sel HeLa (koleksi Cancer Chemoprevention Research Center, Fakultas Farmasi UGM) ditumbuhkan dalam media DMEM 1640 (Gibco) yang mengandung 10% v/v Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco) dan penisillin-streptomisin 100 μg/mL (Gibco) diinkubasi dalam inkubator CO2 (Herceus) pada suhu 37C dengan aliran 5% CO2. Uji Sitotoksisitas terhadap Sel HeLa Uji sitotoksisitas menggunakan MTT assay. Sel HeLa didistribusikan ke dalam 96 well plate (Nunc) dengan jumlah 5000 sel per sumuran dan diinkubasi bersama arekolin baik aplikasi tunggal dan kombinasi menggunakan pelarut DMSO selama 24 jam pada inkubator CO2 (Herceus). Pada akhir inkubasi sel HeLa, ke dalam masing-masing Majalah Farmasi Indonesia, 22(4) Astrid Ayu Maruti Tabel I. Interpretasi nilai IK (Indeks kombinasi) IK <0,1 0,1–0,3 0,3–0,7 0,7–0,9 Interpretasi sinergis sangat kuat sinergis kuat sinergis sinergis ringan-sedang sumuran ditambahkan 100 µL MTT (Sigma) dalam media DMEM (Gibco). Kemudian, plate diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37°C hingga terbentuk kristal formazan (dilihat di bawah mikroskop inverted (Olympus CH-2)). Setelah 4 jam, reaksi MTT dihentikan dengan menambahkan reagen stopper SDS 10%, 100 µL pada masing-masing sumuran, lalu diinkubasi selama semalam pada suhu kamar dengan ditutup oleh aluminium foil. Intensitas absorbansi warna ungu yang terbentuk dibaca dengan ELISA reader (Bio-Rad microplate reader Benchmark serial no. 11565, Jepang) pada panjang gelombang 595 nm. Pengamatan Apoptosis Metode Double Staining Interpretasi mendekati additif antagonis ringan-sedang antagonis antagonis kuat-sangat kuat Kemudian dicari persamaan regresi linearnya dan dihitung konsentrasi IC50 yaitu konsentrasi yang menyebabkan kematian 50% populasi sel sehingga dapat diketahui potensi sitotoksisitasnya (Doyle, and Griffiths, 2000) Uji Kombinasi Sitotoksisitas sinergistik ditetapkan dengan menghitung indeks interaksi antara agen kemoterapi doxorubicin dan arekolin, dengan menggunakan persamaan: Menggunakan Kultur sel HeLa yang telah konfluen dipanen dan didistribusikan dengan konsentrasi 5 x 104 sel/sumuran dalam 1000 μL ke dalam 24 well plate (Nunc) yang telah diberi cover slip (Nunc). Setelah itu sel diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2 agar sel teradaptasi dan normal kembali. Selanjutnya sel diberi perlakuan kontrol sel, IC50 arekolin, IC50 arekolin, IC50 doxorubicin, kombinasi IC50 arekolin dengan IC50 doxorubicin, serta kombinasi IC50 arekolin dengan IC50 doxorubicin, lalu diinkubasi kembali selama 24 jam. Pada akhir inkubasi media kultur DMEM dicuci dengan PBS dan cover slip diangkat dari sumuran serta diletakkan di atas obyek gelas lalu ditetesi dengan pereaksi etidium bromidaakridin oranye sebanyak 10 μL. Pengamatan morfologi sel dilakukan dengan mikroskop fluoresens (Zeiss MC 80). Analisis hasil Uji Sitotoksisitas Data yang diperoleh berupa absorbansi masing-masing sumuran dikonversi ke dalam persen viabilitas sel. Persen viabilitas sel dihitung menggunakan rumus: Majalah Farmasi Indonesia (22)4 IK 0,9–1,1 1,1–1,45 1,45–3,3 >3,3 Dx1 dan Dx2 adalah konsentrasi dari satu senyawa tunggal yang dibutuhkan untuk memberikan efek (dalam hal ini adalah IC50 terhadap pertumbuhan sel kanker leher rahim), sedangkan D1, dan D2 adalah besarnya konsentrasi kedua senyawa untuk memberikan efek yang sama. Indeks kombinasi (IK) yang diperoleh diinterpretasikan seperti pada tabel I (Reynolds and Maurer, 2005). Pengamatan poptosis Sel hidup akan berfluorosensi hijau terang (dengan akridin oranye), sel yang mengalami apoptosis tahap awal akan mengalami kondensasi kromatin dan masih berwarna hijau, sel yang mengalami apoptosis pada tahap akhir akan terpecah-pecah menjadi bagian yang lebih kecil dan berwarna oranye (dengan etidium bromida) (Renvoize, et al., 1998). Hasil dan Pembahasan Hasil Percobaan Uji Sitotoksik Arekolin terhadap Sel HeLa Uji sitotoksik dilakukan untuk mengetahui potensi ketoksikan dari bahan uji berupa arekolin yang dinyatakan dalam parameter IC50. Perlakuan arekolin dengan seri kadar 1 µM, 10 µM, 50 µM, 100 µM, 250 µM, 267 Sinergisitas efek sitotoksik kombinasi………… Gambar 1. Efek perlakuan arekolin terhadap pertumbuhan sel HeLa. Sel HeLa diinkubasi sebanyak 5000 sel/sumuran dalam plate 96 sumuran, kemudian diberi perlakuan arekolin (1-1000 µM). 500 µM, 750 µM, dan 1000 µM terhadap sel HeLa menunjukkan pertumbuhan sel menurun seiring peningkatan dosis. Nilai IC50 perlakuan tunggal arekolin pada sel HeLa diperoleh sebesar 462 µg/mL (Gambar 1). Pengamatan terhadap morfologi sel setelah perlakuan arekolin tunggal menunjukkan jumlah sel yang mengalami kematian (sel berbentuk bulat dan melayang) meningkat seiring meningkatnya konsentrasi arekolin yang diberikan (Gambar 2). Doxorubicin telah diketahui memiliki efek sitotoksik pada sel HeLa dengan IC50 sebesar 1000nM (Larasati, 2010). Oleh karena itu, perlu dilakukan pengamatan terhadap aktivitas sitotoksik kombinasi kedua senyawa tersebut. Uji Kombinasi Arekolin dan Doxorubicin pada Sel HeLa Untuk mengetahui potensi penggunaaan arekolin sebagai agen ko-kemotrapi bagi doxorubicin pada sel kanker serviks HeLa dilakukan pemaparan kombinasi arekolin konsentrasi IC50, IC50, IC50 IC50 dengan IC50, IC50, IC50 IC50 doxorubicin. Hasil perlakuan berupa viabilitas sel (Gambar 3) dikuantifikasi menggunakan metode perhitungan indeks kombinasi (IK). Berdasarkan tabel III, nilai IK yang diperoleh optimum pada kombinasi IC50 arekolin dengan IC50 doxorubicin yaitu IK = 0,48, IC50 arekolin dengan serta kombinasi IC50 doxorubicin yaitu IK = 0,52 (Tabel II). Sinergisitas efek doxorubicin dengan arekolin ini diduga melalui mekanisme induksi apoptosis 268 sehingga perlu dilakukan pengamatan induksi apoptosis oleh kedua senyawa tersebut. Untuk mengetahui efek pemacuan apotosis kombinasi arekolin dengan doxorubicin pada sel HeLa dilakukan uji apoptosis dengan metode double staining. Hasil uji apoptosis menunjukkan kombinasi arekolin dengan doxorubicin dapat menginduksi apoptosis lebih baik daripada perlakuan tunggal masing – masing senyawa. Efek apoptosis tersebut terlihat dari adanya beberapa sel berfluoresensi oranye yang menandakan mulai hilangnya permeabilitas membran sel. Beberapa sel mulai mengalami fragmentasi inti sel dan membentuk badan-badan apoptosis (Gambar 4). Melalui hasil penelitian ini, dapat dikaji diketahui pengaruh pemberian arekolin terhadap pertumbuhan sel kanker serviks HeLa. Uji sitotoksik tunggal arekolin pada sel HeLa menunjukkan bahwa aktivitas sitotoksik arekolin terhadap sel HeLa meningkat seiring peningkatan dosis. Uji ini menghasilkan IC50 yang besar yaitu sebesar 462 μM. Nilai IC50 ini menunjukkan bahwa arekolin tidak memiliki efek sitotoksik yang kuat terhadap sel HeLa seperti alkaloid lain skimmianin, flindersin, dan haplopin (Jansen, et al., 2006). Walaupun memiliki efek sitotoksik yang rendah, tidak menutup kemungkinan arekolin dapat digunakan sebagai agen ko-kemoterapi untuk doxorubicin. Majalah Farmasi Indonesia, 22(4) Astrid Ayu Maruti Gambar 2. Efek perlakuan tunggal arekolin pada morfologi sel HeLa. Masing-masing sel diinkubasi sebanyak 5000 sel/sumuran dalam plate 96 sumuran. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop inverted perbesaran 100x. kontrol sel HeLa (A), sel HeLa setelah perlakuan arekolin konsentrasi 1 µM (B), 10 µM (C), 50 µM (D), 100 µM (E), 250 µM (F), 500 µM (G) ,750 µM (H), dan 1000 µM (I). Sel hidup sel mati Sel HeLa diketahui mengekspresikan 2 onkogen, yaitu E6 dan E7. E6 berikatan dengan p53 yang terfosforilasi sedangkan E7 berikatan dengan protein pRb (Jansen, et al., 2006). Pengikatan p53 oleh E6 mengakibatkan degradasi peningkatan kecepatan degradasi protein tersebut. Arekolin mampu meningkatkan ekspresi p53 serta meningkatkan ekspresi gen pengkode p21WAF1(Chou, et al., 2009). Selain itu, arekolin juga dapat menginduksi peningkatan ekspresi Bax, protein proapoptosis, dan menghambat Bcl-2, suatu protein antiapoptosis pada sel hepatoma HA22T/VGH (Cheng, et al., 2010). Pada sel epitelial dan endometrial, arekolin juga menginduksi anoikis kematian sel akibat terlepas dari matriks ekstraselular dengan adanya penurunan ekspresi protein Z0-1 yang berfungsi menjaga integritas sel (Giri, et al., 2011). Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan penurunan viabilitas sel setelah pemaparan arekolin tunggal. Pada pengamatan apoptosis menggunakan pengecatan double staining, arekolin menunjuk-kan kemampuan untuk Majalah Farmasi Indonesia (22)4 menginduksi apoptosis terlihat dengan adanya sel yang berfluoresensi oranye (Gambar 4C dan 4D). Dimungkinkan induksi apoptosis oleh arekolin pada sel HeLa terjadi melalui mekanisme p53 dependent dan mekanisme fisik yaitu anoikis. Sel HeLa memiliki kurang sensitif terhadap agen kemoterapi doxorubicin. Hal ini terlihat pada nilai IC50 doxorubicin terhadap HeLa yang relatif tinggi yaitu 1000 nM. Nilai IC50 tersebut jauh lebih tinggi jika dibandingkan nilai IC50 doxorubicin pada sel kanker yang sensitif terhadap doxorubicin yaitu T47D yang memiliki IC50 sebesar 43 nM (Larasati, 2010, Jenie and Meiyanto, 2006) Resistensi ini disebabkan adanya ekspresi protein antiapoptosis pada sel HeLa, ARC (apoptosis repressor with caspase recruitment domain) dan efflux doxorubicin dari sel HeLa (Wang, et al., 2009, Bravo-Cuellar, et al., 2009). Oleh karena itu, diperlukan alternatif agen ko-kemoterapi untuk meningkatkan sensitivitas sel HeLa terhadap doxorubicin. 269 Sinergisitas efek sitotoksik kombinasi………… Gambar 3. Efek Perlakuan Kombinasi Arekolin dengan Doxorubicin terhadap viabilitas Sel Kanker Serviks HeLa. Sel diinkubasi selama 24 jam kemudian diberi perlakuan kombinasi arekolin dan doxorubicin masing - masing IC50, IC50, IC50 IC50. Grafik menunjukkan viabilitas sel HeLa perlakuan kombinasi arekolin dengan doxorubicin (p<0,05) Gambar 4. Efek Arekolin dan Doxorubicin dalam Penghambatan Apoptosis sel HeLa. Kontrol sel (A), Doxorubicin 125 nM (B), Arekolin 175 μM (C), dan kombinasi 175 μM arekolin dengan 125 nM doxorubicin (D). sel hidup berfluoresensi hijau sel mati berfluoresensi oranye Hasil uji kombinasi arekolin dan doxorubicin menunjukkan sinergisitas dengan nilai IK terbaik 0,48 (Tabel II). Berdasarkan tabel 1, nilai IK antara 0-0,9 menunjukkan aktivitas yang sinergis. Nilai IK tersebut diberikan oleh dosis 125 nM doxorubicin dengan 30µM arekolin. Hasil pengecatan dengan akridin orange dan etidium bromida menunjukkan efek induksi apotosis kombinasi arekolin dengan doxorubicin lebih kuat dibandingkan masing-masing senyawa tunggal. Penggunaan doxorubicin pada kanker serviks memerlukan dosis tinggi dan menimbulkan efek samping seperti nauesea, kerontokan rambut, 270 serta ketoksikan pada jantung. Sinergisitas arekolin dengan doxorubicin menyebabkan penggunaan dosis doxorubicin dapat diturunkan untuk memperoleh potensi yang sama. Sehingga dosis penggunaan lebih kecil dan efek samping dapt ditekan. Doxorubicin dapat menginduksi DNA strand break atau pemecahan untai ganda DNA pada sel sehingga memicu terjadinya apotosis (Drummond, 2007). Arekolin juga dapat menginduksi DNA strand break pada sel mammalian (Chang, et al., 2009). Kombinasi Sehingga dimungkin-kan sinergisitas doxorubicin dan arekolin pada sel HeLa terjadi melalui mekanisme DNA strand break. Majalah Farmasi Indonesia, 22(4) Astrid Ayu Maruti Tabel II. Nilai Indeks Kombinasi (IK) Arekolin dengan Doxorubicin pada Sel HeLa Konsentrasi Arekolin 30 60 120 175 6,25 0,76 0,79 0,62 0,56 Konsentrasi Doxorubicin (nM) 125 250 0,72 0,48 1,17 0,84 1,72 0,81 1,06 0,52 Data yang dihasilkan melalui penelitian ini menunjukkan aktivitas sitotoksik dari arekolin dan sinergisitas aksi arekolin dengan doxorubicin di sel HeLa. Perlu adanya penelitian lebih lanjut untuk menjelaskan mekanisme molekular yang memperantarai aktivitas sitotoksik arekolin pada sel HeLa dan sinergisitasnya dengan doxorubicin. 375 0,88 1,83 1,77 1,39 Hasil penelitian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa arekolin berpotensi sebagai agen ko-kemoterapi bagi doxorubicin pada sel kanker serviks HeLa. Mekanisme antikanker arekolin adalah melalui induksi apoptosis. Namun masih diperlukan penelusuran mekanisme molekular lebih lanjut untuk mengembangkan arekolin sebagai agen kokemoterapi. DAFTAR PUSTAKA Bravo-Cuellar A, Ortiz-Lazareno PC, Lerma-Diaz, JM, Dominguez-Rodriguez, JR, Jave-Suarez LF, Aguilar-Lemarroy A, del Toro-Arreola S, Celis-Carrillo R, Sahagun-Flores JE, de AlbaGarcia JE, Hernandez-Flores G. Sensitization of cervix cancer cells to Adriamycin by Pentoxifylline induces an increase in apoptosis and decrease senescence. Molecular Cancer 2010; 9:114. Chang MC, Ho YS, Lee PH, Chan CP, Lee JJ, Hahn LJ, Wang YJ, Jeng JH. Areca Nut Extract and Arecoline Induced The Cell Cycle Arrest But Not Apoptosis of Cultured Oral KB Epithelial Cells : Association of Glutathione, reactive Oxygen Species and Mitochondrial Membrane Potential. Carcinogenesis 2001; 22(9):1527-1535. Chang MC, Wu, HL, Lee JJ, Lee PH, Chang HH, Hahn LJ, Lin BR, Chen YJ, Jeng JH. The Induction of Prostaglandin E2 Production, Interleukin-6 Production, Cell Cycle Arrest, and Cytotoxicity in Primary Oral Keratinocytes and KB Cancer Cells by Areca Nut Ingredients is Differentially Regulated by MEK/ERK Activation. J Biol Chem 2004; 279:50676-50683 Cheng HL, Shu JS, Huang LW, Hsieh BS, Hu YC, Hung TC, Chang KL. Arecoline Induces HA22T/VGH Hepatoma Cells to Undergo Anoikis-Involvement of STAT3 and RhoA Activation. Molecular Cancer 2010; 9:126. Chou WW, Guh JY, Tsai JF, Hwang CC, Chiou SJ, Chuang LY. Arecoline-induced phosphorylated p53 and p21WAF1 protein expression is dependent on ATM/ATR and phosphatidylinositol-3-kinase in clone-9 cells. Journal of Cellular Biochemistry 2009; 107(3):408–417. DeFillippis RA, Goodwin EC, Wu L, DiMaio D. Endogenous Human Papillomavirus E6 and E7 Proteins Differentially Regulate Proliferation, Senescence, and Apoptosis in Hela Cervical Carcinoma Cells. Journal of Virology 2003; 77(2):1551-1563. Doyle A, and Griffiths JB. Cell and Tissue Culture for Medical Research. New York: John Willey and Sons Ltd. 2000. Majalah Farmasi Indonesia (22)4 271 Sinergisitas efek sitotoksik kombinasi………… Drummond C. The Mechanism of Anti-tumour Activity of the DNA Binding Agent SN 28049. Thesis. University of Auckland. New Zealand. 2007; Giri S, Poindexter KM, Sundar SN, Firestone GL. Arecoline Induced Disruption of Expression and Localization of The Tight Junctional Protein ZO-1 is Dependent on The HER 2 Expression in Human Endometrial Ishikawa Cells. BMC Cell Biology 2010; 11:53. Gracia. 2007. Periksa Dini! Cegah Kanker Mulut Rahim!. Tersedia di: http://www.tanyadokteranda.com. Diakses pada tanggal 27 Desember 2010. IARC. 2008. Cancer Incidence and Mortality Worldwide. Tersedia di: http://globocan.iarc.fr/. Diakses pada tanggal 27 Desember 2010. Jansen O, Akhmedjanova V, Angenot L, Balansard G, Chariot A, Ollivier E, Tits M, and Frédérich M. Screening of 14 alkaloids isolated from Haplophyllum A. Juss. for their cytotoxic properties. Journal of Ethnopharmacology 2006; 105(1-2):241-245 . Jenie RI, Meiyanto E. Efek antiangiogenik ekstrak etanolik daun sambung nyawa (Gynura procumbens (Lour.) Merr.) pada membran korio alantois (CAM) embrio ayam. Indon. J. Pharm (MFI) 2006; 17(1):50-55. Larasati, Naringenin Enhances The Antitumor Effect of Doxorubicin on Hela Cervical Cancer Cell Through Cytotoxic Activity and Apoptosis Induction. Cancer Chemoprevention Research Center Yogyakarta. 2010;. unpublished data. Renvoize, C., Biola, A., Pallardy, M., and Breard, J., Apoptosis: Identification of Dying Cells. Cell Biology and Toxicology 1998; 14:111-120. Reynolds CP and Maurer BJ. Evaluating Response to Antineoplastic Drug Combinations in Tissue Culture Models. Methods in Molecular Medicine 2005; 110:173-183. Wang JX, Li Q, Li PF. Apoptosis repressor with caspase recruitment domain contributes to chemotherapy resistance by abolishing mitochondrial fission mediated by dynaminrelated protein-1. J. Cancer Res 2009; 69(2):492-500. *Korespodensi :Edy Meiyanto Fakultas Farmasi UGM /CCRC Fakultas Farmasi UGM e-mail: [email protected] 272 Majalah Farmasi Indonesia, 22(4)
