ii. metode penelitian - Fakultas Biologi

II. METODE PENELITIAN
A. Materi dan Deskripsi Lokasi
1. Bahan
Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini adalah daun 10 kultivar kacang
tanah (kultivar Bima, Hypoma1, Hypoma2, Kancil, Kelinci, Talam, Tuban, Domba,
Jerapah, dan Bison). Kemikalia yang diperlukan xylol, alkohol 96%, ethanol, asam
asetat glasial, parafin, formalin, gliserin, albumin, safranin 1% dalam alkohol 70%,
akuades, entellan, dan kutek bening (Lampiran 1).
2. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikroskop binokuler, kamera
digital, gelas ukur, gelas Beaker, gelas Erlenmeyer, oven, pipet, pinset, silet, botol vial,
rotary microtom, penggaris, holder, baki, mikrometer obyektif, mikrometer okuler,
kertas karton, square micrometer, gelas benda, gelas penutup, hot plate dan kertas
label (Lampiran 1).
3. Deskripsi Lokasi
Daun kacang tanah diambil di persawahan Sumampir, Kecamatan Purwokerto
Utara, Kabupaten Banyumas. Pengamatan dilakukan di Laboratorium Struktur dan
Perkembangan Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. Penelitian
ini dilaksanakan selama 4 bulan, dimulai pada bulan November 2013-Februari 2014.
B. Bagan Alir Penelitian
Penanaman bibit kacang tanah
Pemeliharaan tanaman kacang tanah
Pengambilan sampel daun kacang tanah umur 2 bulan
Pembuatan preparat awetan daun
Pembuatan preparat segar daun
Menghitung jumlah stomata dan trikomata
serta ukuran stomata (panjang dan lebar)
Mengukur tebal daun dan tebal
mesofil
Hasil berupa data karakter anatomi yang diamati
1. Langkah Pembuatan Preparat Awetan Menggunakan Metode Parafin
5
Sampel daun kacang tanah dipotong 1x1 cm
Fiksasi
Larutan Fiksatif FAA dalam alkohol 70% @ 24 jam
Dehidrasi
Alkohol bertingkat 70%, 80%, 96% dan ethanol @ 30 menit
Dealkoholisasi
Alkohol/xylol 3:1, 1:1, 1:3 @ 30 menit
Infiltrasi
Xylol/paraffin 1:9 @ 24 jam, paraffin murni @ 2 jam suhu 57 oC
Penyelubungan
Dicetak dalam kotak dari kertas karton
Pengirisan
Ditempel pada holder, diiris menggunakan rotary microtom dengan tebal irisan 10 µm
Perekatan
Pita paraffin diletakkan diatas gelas benda yang telah diolesi gliserin/albumin 1:1
dan diolesi air
Pewarnaan
Gelas benda berisi potongan organ dimasukkan ke:
 Xylol 2, xylol 1
@ 3 menit
 Alkohol/xylol 1:3, 1:1, 3:1
@ 3 menit
 Ethanol, alkohol 96%, 80%, 70%
@ 3 menit
 Safranin 1% dalam alkohol 70%
@ 2 jam
 Alkohol 70%, 80%, 90%, ethanol
@ 3 menit
 Alkohol/xylol 3:1, 1:1, 1:3
@ 3 menit
 Xylol 1, xylol 2
@ 3 menit
Penutupan
Ditetesi entellan dan ditutup gelas penutup, dikeringkan diatas hot plate
Pemberian nama dengan kertas label
Hasil berupa data karakter anatomi tebal daun dan tebal mesofil
6
2. Langkah Pembuatan Preparat Segar Daun
Sampel daun kacang tanah
Diolesi kutek bening hingga kering
Lapisan kutek dilepas kemudian diletakkan di atas
gelas benda dan ditutup dengan gelas penutup
Dihitung jumlah stomata per mm2 dan
ukuran stomata (panjang dan lebar)
Dihitung jumlah trikomata per
mm2
Hasil berupa data karakter anatomi yang diamati
C. Metode Penelitian
1. Metode penelitian
Metode yang digunakan adalah metode survei dengan teknik
pengambilan sampel terpilih (purposive sampling).
2. Variabel Penelitian
Variabel yang digunakan penelitian ini ada 2 macam yaitu variabel bebas dan
variabel tergantung. Variabel bebas adalah kultivar kacang tanah yang digunakan
sedangkan variabel tegantung adalah karakter anatomi daun kacang tanah yang
diamati.
3. Parameter Penelitian
Parameter yang diamati meliputi tebal daun, tebal mesofil daun, jumlah
stomata dan trikomata per mm2, serta ukuran stomata (panjang dan lebar).
4. Cara Kerja Penelitian
4.1. Prosedur Umum
Bibit tanaman kacang tanah dipilih kemudian ditanam di lahan
persawahan. Pemeliharaan tanaman dilakukan sesuai prosedur standar Dinas
Pertanian.
7
4.2. Pembuatan Preparat Anatomi Daun
Pembuatan preparat awetan daun dengan metode parafin adalah
sebagai berikut:
a. Daun dipotong ± 1 cm menggunakan pisau silet yang tajam.
b. Potongan daun tersebut difiksasi menggunakan larutan fiksatif FAA selama
24 jam. Larutan FAA terdiri dari :
Alkohol .............................................................
90 ml
Asam asetat glasial............................................
5 ml
Formalin ...........................................................
5 ml
c. Dehidrasi : Fiksatif diganti berturut – turut dengan :
Alkohol 70% ....................................................
30 menit
Alkohol 80% ....................................................
30 menit
Alkohol 96% ....................................................
30 menit
Alkohol 100% ..................................................
30 menit
d. Dealkoholisasi : Alkohol diganti berturut – turut dengan :
Campuran alkohol/xylol 3 : 1 ..........................
30 menit
Campuran alkohol/xylol 1 : 1 ..........................
30 menit
Campuran alkohol/xylol 1 : 3 ..........................
30 menit
Xylol I ..............................................................
30 menit
Xylol II ............................................................
30 menit
e. Infiltrasi : potongan daun dimasukkan ke dalam campuran xylol/parafin 1 : 9
dengan temperatur 57o C selama ± 24 jam. Campuran xylol/parafin diganti
dengan parafin murni pada temperatur 57o C selama 2 jam.
f.
Penyelubungan : dibuat kotak – kotak kecil dari kertas karton kemudian
parafin cair dituang ke dalam kotak – kotak yang telah diolesi dengan
gliserin. Potongan daun dimasukkan ke dalam kotak sehingga tepat di
tengah selubung parafin dan dibiarkan membeku.
g. Pengirisan : blok berisi jaringan dipotong sedemikian rupa, ditempel pada
holder mikrotom. Pemotongan jaringan menggunakan mikrotom dengan
tebal 10 µm.
h. Perekatan : irisan dilekatkan pada gelas benda dengan campuran
gliserin/albumin 1:1 yang telah dibubuhi air. Kemudian gelas benda
diletakkan di atas pemanas (hot plate).
i.
Pewarnaan : gelas benda berturut – turut dimasukkan ke dalam :
Xylol II .............................................................
8
3 menit
j.
Xylol I ..............................................................
3 menit
Campuran alkohol/xylol 1 : 3 ..........................
3 menit
Campuran alkohol/xylol 1 : 1 ..........................
3 menit
Campuran alkohol/xylol 3 : 1 ..........................
3 menit
Alkohol 100% ..................................................
3 menit
Alkohol 96% ....................................................
3 menit
Alkohol 80% ....................................................
3 menit
Alkohol 70% ....................................................
3 menit
Safranin ............................................................
2 jam
Alkohol 70% ....................................................
3 menit
Alkohol 80% ....................................................
3 menit
Alkohol 96% ....................................................
3 menit
Alkohol 100% ..................................................
3 menit
Campuran alkohol/xylol 3 : 1 ..........................
3 menit
Campuran alkohol/xylol 1 : 1 ..........................
3 menit
Campuran alkohol/xylol 1 : 3 ..........................
3 menit
Xylol I ..............................................................
3 menit
Xylol II .............................................................
3 menit
Penutupan : irisan diberi entellan dan ditutup dengan gelas penutup.
Kemudian dikeringkan di atas pemanas (hot plate) hingga entellan cukup
kering.
k. Pemberian nama : di sebelah kiri gelas penutup dilekatkan label/etiket
dengan diberi keterangan nama, spesies, organ, dan arah irisan.
4.3. Menghitung Jumlah Stomata dan Trikomata per mm2
Penghitungan jumlah stomata dan trikomata sebagai berikut:
a. Permukaan daun bagian bawah (abaksial) diberi kutek bening dan didiamkan
hingga kutek mengering. Kutek kemudian diangkat secara hati - hati agar
stomata menempel pada lapisan kutek tersebut. Permukaan daun yang
terdapat stomata diletakkan di atas gelas benda, ditetesi air kemudian
ditutup gelas penutup.
b. Stomata dan trikomata diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran
400X.
c. Jumlah stomata dan trikomata yang terlihat dalam bidang hitung, sehingga
didapat jumlah stomata dan trikomata per luas bidang pdanang tersebut.
9
d. Diameter bidang pdanang pada perbesaran 400X diukur menggunakan
mikrometer untuk menghitung luas bidang pandang tersebut.
e. Luas bidang pandang dihitung dengan rumus :
A = π r2
(2-1)
Keterangan :
A = Luas bidang pandang
π = tetapan (3.14)
r = diameter bidang pandang : 2
f.
Kerapatan stomata dan trikomata = jumlah stomata dan trikomata per luas
bidang pandang.
4.4. Mencari Nilai Skala Mikrometer Okuler
Mencari nilai skala okuler yaitu:
a. Mikrometer okuler diletakkan pada lensa okuler mikroskop, dilihat hingga
bayangan skala mikrometer okuler jelas.
b. Mikrometer objektif diletakkan di atas meja objek, dicari bayangan yang
jelas dari skala mikrometer objektif tersebut bersama – sama dengan
bayangan skala mikrometer okuler.
c. Kedua bayangan skala tersebut dibuat sejajar dengan memutar tabung
okuler. Titik 0 dari kedua skala tersebut diletakkan sama tinggi dengan
menggunakan mikrometer objektif.
d. Bayangan garis skala kedua mikrometer dicari yang berhimpit. Jumlah bagian
skala pada masing – masing mikrometer dihitung dari titik 0 sampai garis
skala yang berhimpit tadi.
e. Jarak sesungguhnya antara kedua garis skala mikrometer objektif diketahui
sehingga nilai skala mikrometer okuler dapat dihitung dengan rumus : X Sob
= Y Sok
Sob = Y
Sok
X
Sok = × Sob
Keterangan :
Sob = Skala mikrometer objektif
Sok = Skala mikrometer okuler
10
(2-2)
4.5. Mengukur Tebal Daun, Mesofil Daun, dan Ukuran (Panjang dan Lebar)
Stomata
Mengukur tebal daun, mesofil daun, dan ukuran stomata dilakukan
dengan tahapan berikut:
a. Mikrometer objektif diambil, diganti dengan preparat.
b. Bayangan preparat dicari. Kombinasi objektif, okuler serta panjang tubus
sama dengan waktu mencari nilai skala okuler.
c. Bayangan skala mikrometer okuler ditempatkan pada bayangan preparat
sedemikian rupa hingga arah bayangan skala itu sesuai dengan arah panjang
atau lebar sel. Nilai panjang dan lebar stomata jumlah bagian skala dikalikan
dengan nilai skala mikrometer okuler.
D. Metode Analisis
Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif untuk mengetahui perbedaan
karakter anatomi daun dari 10 kultivar kacang tanah yang diamati.
11